CN113552359A - 一种同时检测谷物中AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条 - Google Patents

一种同时检测谷物中AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测谷物中AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条，属于免疫分析快速检测技术领域。本发明中制备双联荧光免疫定量试纸条的方法，包括如下步骤：将0.01‑1.0mg/mL AFB1完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜上作为检测线T1，将0.1‑1.0mg/mLCd完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜上作为检测线T2，将0.05‑1mg/mL羊抗鼠二抗溶液涂到硝酸纤维素膜上作为质控线C，干燥；之后将样品垫、含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上组装成试纸条。本发明的双联荧光免疫定量试纸条具有灵敏度高、成本低廉、操作简便、快速定量检测、稳定性好，市场前景广阔，易推广使用。

Description

一种同时检测谷物中AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条
技术领域
本发明涉及一种同时检测谷物中AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条，属于免疫分析快速检测技术领域。
背景技术
谷物作为人类食物与鱼禽饲料的重要来源，从种植管理到储藏及加工的各个环节，其安全品质不可避免的会受到各种不利因素的影响。我国作为产粮大国，谷物的品质安全问题更是不容忽视。谷物安全问题包括重金属、真菌毒素和农药残留超标严重等问题。重金属污染的谷物在被人食用后会产生急性中毒、亚急性中毒或慢性中毒，对人体造成很大的伤害。真菌毒素污染的谷物被人或动物食用后可能引发多种中毒症状，严重时可危及到人或动物的生命安全。
粮食安全问题事关国计民生。而粮食污染主要是土壤和环境中的铅、镉、汞、砷等重金属及真菌代谢产生的次级代谢产物所导致。其中黄曲霉毒素B1污染的粮食、饲料最为常见。土壤被重金属污染后，重金属不会降解。土壤中重金属离子如Pb(II)、Cd(II)、Hg(II)的污染已经引起了全世界的关注。Cd(II)的蓄积会引起人体多种急性和慢性疾病，例如Cd(II)可导致DNA损坏和酶活性受到干扰，最终导致心脏、肺、肝脏和肾脏衰竭。黄曲霉毒素(aflatoxins，AFs)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉等真菌产生的有毒次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)是国际癌症研究机构划分的1A类强致癌物，其毒性分别为砒霜和氰化钾的68倍和10倍。AFB1具有致畸形、致癌性、致突变性、神经毒性和肾脏毒性，对人体和动物均会产生不同程度的危害。
AFB1的检测方法主要有薄层层析法(TLC)、荧光分光光度法、液相色谱-串联质谱法及包括酶联免疫分析、免疫层析、免疫传感器在内的免疫学检测方法，其中免疫层析法因快速、简便和经济在AFB1的筛查中表现出了较强的优势。TLC法的不足是样品处理繁琐，过程复杂，且提取和净化效果不够理想，双向展开增加了操作步骤和时间，对人和环境污染系数较大。而免疫学检测方法操作简单、灵敏可靠，可快速检测多种牛奶样品，是理想的检测方法。
谷物中重金属的实验室检测方法很多，原子吸收、原子荧光分光光度计、电感耦合等离子体-质谱(ICP-BS)、电感耦合等离子体-发射光谱仪(ICP-OES)。然而，随着近年来快速检测技术的发展，酶分析法、生物传感器分析、X-射线荧光法、免疫分析法随之快速发展起来，检测方法多样化，检测灵敏度极高，检测结果也很准。
目前，免疫色谱法在单一样品检测方面已经很成熟，但不能实现同时检测多种分析物。如果需要检测多种分析物则需要更多的试纸条，这样会增加检测成本和时间。因此，单型试纸条无法满足同时、快速、低成本检测两种或多种物质；基于此，亟需开发一种一测多评的多重免疫色谱法。
已经报道了几种一测多评的同时检测多种毒素或多种重金属的免疫色谱法，这些免疫侧吸试纸条采用了不同的纳米材料，包括金纳米颗粒、量子点、荧光微球等。尽管这些研究使用了不同的纳米材料，但是仍然存在一些明显的缺陷，例如，采用金纳米颗粒进行标记的研究只能实现定性和半定量检测。因此，建立一种更加灵敏、快速、可实现大通量、同时检测谷物中AFB1和Cd的方法成为了当务之急。
发明内容
[技术问题]
常规的检测方法都是单独检测谷物中的重金属、真菌毒素和有机磷农药残留，工序繁琐；用于试纸条同时检测，需要分两次操作，操作步骤繁琐。
单型试纸条无法满足同时、快速、低成本检测两种或多种物质；同时已有的检测多种毒素或多种重金属的免疫色谱法只能实现定性和半定量检测，或者检测灵敏度低。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明采用荧光微球替代传统胶体金，用荧光微球标记黄曲霉毒素B1、Cd-EDTA的抗体复合物，利用竞争免疫法，将其作为荧光探针用于免疫层析，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，可以对样品中的黄曲霉毒素B1和Cd进行同时快速定量分析。
本发明的第一个目的是提供一种制备同时检测AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条的方法，包括如下步骤：
将0.01-1.0mg/mL AFB1完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线T1，将0.1-1.0mg/mLCd完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线T2，将0.05-1 mg/mL羊抗鼠二抗溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为质控线C，其中检测线T1和检测线T2之间的距离为3-5mm，检测线T1和质控线C的距离为3-5mm，检测线T2和质控线C 在检测线T1的两边，干燥；之后将样品垫、含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上组装成试纸条。
在本发明的一种实施方式中，所述双联荧光免疫定量试纸条中，样品垫和含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜的一端部分相互重叠，重叠区域的长度为2-4mm；吸水纸和含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜的另一端部分相互重叠，重叠区域的长度为2-4mm；所述吸水纸、样品垫与含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜相互重叠的部分位于含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜的上方。
在本发明的一种实施方式中，检测线T2距样品垫的距离为4-6mm，质控线C距吸水纸的距离为4-6mm。
在本发明的一种实施方式中，所述的检测线T1、检测线T2和质控线C的宽度为1.5-2.5 mm。
在本发明的一种实施方式中，每厘米的硝酸纤维素膜上检测线宽度AFB1完全抗原溶液和Cd完全抗原溶液的喷涂量分别为1-2μL；当硝酸纤维素膜宽度为0.4cm时，喷涂量分别为0.4-0.8μL。
在本发明的一种实施方式中，每厘米的硝酸纤维素膜上质控线宽度喷涂量为1-3μL/cm；当硝酸纤维素膜宽度为0.4cm时，喷涂量为0.4-1.2μL。
在本发明的一种实施方式中，所述的干燥是将涂好的硝酸纤维素膜置于37℃真空干燥箱中烘干备用。
在本发明的一种实施方式中，所述AFB1和Cd的完全抗原用0.02mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液(PBS)分别稀释至终浓度为0.01-1.0mg/mL和0.1-1.0ng/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述羊抗鼠二抗用0.02mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液稀释至终浓度0.05-1mg/mL。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的同时检测AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条。
在本发明的一种实施方式中，所述AFB1的检测浓度为0.01-30ng/mL，Cd的检测浓度为 0.01-60ng/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述双联荧光免疫定量试纸条的宽度为3-5mm。
本发明的第三个目的是提供一种同时检测谷物中AFB1和重金属Cd的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取谷物中AFB1和重金属Cd，得到待测溶液；
(2)将待测溶液、PBS缓冲液、经Eu3+-荧光微球标记的AFB1的单克隆抗、Eu3+-荧光微球标记的Cd的单克隆抗体混合均匀，得到预处理之后的待测溶液；
(3)将预处理的待测溶液加入本发明所述的双联荧光免疫定量试纸条的样品垫上进行层析，之后利用免疫定量分析仪测定样品在检测线C和质控线T1、质控线T2处相应的荧光强度值C值、AFB1的T1值、Cd的T2值；
(4)将得到的C值、T1值、T2值代入AFB1和Cd的标准曲线，得到待测样品中AFB1 和Cd的浓度。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述提取具体包括如下步骤：
将谷物粉碎过筛，得到粉碎后的谷物；按照甲醇和硝酸溶液体积比为85：15，配制得到提取液；之后在粉碎后的谷物中添加提取液进行提取、离心，得到含有Cd和黄曲霉毒素B1 的溶液；其中过筛是过80目筛，硝酸溶液的浓度为1.2mol/L，粉碎后的谷物和提取液的比例以mL/g计为3：1，提取是在25℃下超声提取25min，离心是在4000rpm离心5min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述待测溶液、Eu3+-荧光微球标记的AFB1的单克隆抗体、Eu3+-荧光微球标记的Cd的单克隆抗体和PBS缓冲液的体积比为5：3-5：5-10：85-95，进一步优选为5：3：5：87。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述混合均匀是在20-37℃孵育10-20min，使其充分竞争反应。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述预处理的待测溶液的用量为30-50μL/cm2。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述标准曲线的构建方法包括如下步骤；
用阴性谷物样品配制成AFB1/Cd浓度分别为0/0、0.01/0.01、0.03/0.03、0.05/0.05、0.5/0.1、 1/1、3/3、5/6、10/10、20/30、30/60ng/mL标准溶液用于双联荧光免疫定量试纸条检测，其中标准品释液为含5％甲醇(v/v)的0.01M pH 7.0的PBS溶液；
将Eu3+-荧光微球标记的AFB1单克隆抗体(AFB1荧光探针)和重金属Cd单克隆抗体(Cd-EDTA荧光探针)作为荧光探针，将3μL AFB1荧光探针、5μL Cd-EDTA荧光探针、 87μL的PBS缓冲液和5μL标准溶液均匀后室温孵育10min，缓慢滴入双联荧光免疫定量试纸条的样品垫，加样量为50μL/cm2，37℃层析15min后，用HG-98免疫定量分析仪记录双联荧光免疫定量试纸条的检测线T1和T2荧光值；每个浓度测定六个平行，设定浓度为0ppb 标准液的T线荧光值为T0，其他加标浓度的检测线T1和T2荧光值为T1和T2，以各个AFB1 标准品浓度的对数值为横坐标，T1/T0×100(％)为纵坐标绘制标准曲线，竞争抑制率设为 (1-T1/T0)×100％；以各个Cd标准品浓度的对数值为横坐标，T2/T0×100(％)为纵坐标绘制标准曲线，竞争抑制率设为(1-T2/T0)×100％。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述标准曲线具体为：当AFB1的浓度为0.01-30 ng/mL时，AFB1浓度的对数值与T1/T0成线性关系，线性方程为Y＝-25.531Logx+42.719，x 为AFB1浓度，Y为T1/T0，R2＝0.9946，检测限可达到0.021ng/mL；Cd的浓度范围为0.01-60 ng/mL时，其浓度对数值与T2/T0呈线性关系，线性方程为Y＝-21.009Logx+59.428，x为Cd 浓度，Y为T2/T0，R2＝0.9955，检测限可达到0.024ng/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)的待测溶液中AFB1和Cd的浓度范围为0/0-30/60 ng/mL，如果浓度过高，超出试纸条的线性检测范围，则检测出来的结果无使用价值，需要以PBS缓冲液为溶剂进行稀释；浓度太低，低于国标，也就不需要进行检测了。
本发明的第四个目的是本发明所述的双联荧光免疫定量试纸条在食品检测领域的应用。
本发明的第五个目的是本发明所述的一种同时检测谷物中AFB1和重金属Cd的方法在食品检测领域的应用。
[有益效果]
(1)本发明所述的从取谷物中一步提取AFB1和Cd的方法，时间短(1h以内)，回收率高(90-110％)，操作简单，条件温和，为同时检测AFB1和Cd、简化操作流程提供了技术支持。
(2)本发明所述的方法能够实现快速定量同时检测谷物样品中AFB1和Cd的含量，特异性强、灵敏度高，其中当AFB1的浓度范围为0.01-30ng/mL时，其浓度的对数值与T2/T0成线性关系，线性方程为Y＝-25.531Logx+42.719，R2＝0.9946，检测限可达到0.021ng/mL；重金属Cd的浓度范围为0.01-60ng/mL时，其浓度对数值与T1/T0呈线性关系，线性方程为 Y＝-21.009Logx+59.428，R2＝0.9955，检测限可达到0.024ng/mL。本发明提供的检测方法的检测范围广，检测方法稳定可靠，样品添加回收率为90％-110％，变异系数均小于8％。
(3)本发明所述的方法以AFB1和Cd单克隆抗体作为识别靶点，以时间分辨荧光微球为信号源，荧光微球的体积远大于荧光染料分子的体积，不但可以有效消除非特异性荧光干扰，粒径均一，如图1所示，表面功能基团稳定可控，实验重复性较好，检测特异性强，可实现快速定量检测，且灵敏度高、误差小，为即时检测提供了极大的便捷。
(4)本发明的双联荧光免疫定量试纸条具有灵敏度高、成本低廉、操作简便、快速定量检测、稳定性好、适合工商部门、第三方检测机构、各级政府监管部门、乳制品企业等使用，市场前景广阔，易推广使用。
附图说明
图1为Eu3+-荧光微球标记的AFB1单克隆抗体(AFB1荧光探针)和重金属Cd单克隆抗体(Cd-EDTA荧光探针)透射电镜图。
图2为AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条结构图。
图3为标记荧光微球免疫层析法检测AFB1的标准曲线(A)、重金属Cd的标准曲线(B) 及紫外灯下的双联荧光免疫定量试纸条图(C)。
图4为AFB1免疫层析法的检测线(T1线)完全抗原浓度的优化(A)和Cd免疫层析法的检测线(T2线)完全抗原浓度的优化(B)。
图5为不同待测样品的加入量对于荧光强度和T/T0的影响；其中(A)为不同待测样品的加入量对于荧光强度T1和T1/T0的影响；(B)为不同待测样品的加入量对于荧光强度T2和T2/T0的影响。
图6为荧光探针和和待测溶液的孵育时间或加入试纸条后的层析时间对于荧光强度和 T/T0的影响；其中(A)AFB1荧光探针孵育时间；(B)Cd荧光探针孵育时间；(C)为层析时间。
图7为AFB1和重金属Cd的特异性测试结果。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例中采用的AFB1单克隆抗体、Cd单克隆抗体和羊抗鼠二抗均购自北京开园科技有限公司。
实施例1
一种制备同时检测谷物中AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条的方法，包括如下步骤：
将0.1mg/mL AFB1完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线T1，将0.3mg/mL Cd完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为检测线T2，将0.5mg/mL羊抗鼠二抗溶液涂到硝酸纤维素膜(NC膜)上作为质控线C，其中检测线T1和检测线T2之间的距离为5mm，检测线T1和质控线C的距离为5mm，检测线T2和质控线C在检测线T1 的两边，检测线T1、检测线T2和质控线C的宽度取决于喷膜仪管路的直径为2mm，37℃干燥2h；
之后将样品垫、含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上组装成试纸条；样品垫叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠3mm，类似地，吸水纸叠在含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜上，二者重叠3mm；检测线T2距离样品垫的距离为5mm，质控线C距离吸水纸的距离为5mm；
最后，用切条机将粘贴好的板切成约4mm宽的试纸条，用塑料底座和卡壳组装，得到同时检测谷物中AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条，4℃密封保存备用；结构图如图2所示，底板上从左到右依次为样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。
实施例2
Eu3+-荧光微球标记AFB1和Cd单克隆抗体的荧光探针制备方法：
活化缓冲液：pH 4.5-6.5 0.05M的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，C6H13NO4S·H2O)溶液；
偶联缓冲液：pH 7.0-8.0 0.01M的磷酸缓冲液(PBS)(避免使用存在游离胺的溶剂)；
活化剂：1mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺硝酸盐(EDC，C8H17N3·HCl) 溶液以及1mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，C4H5NO3)溶液；
封闭缓冲液：含1％BSA、0.05％Tween-20的pH 6.0-7.0 0.01M的磷酸缓冲液(PBS)；
抗体保护液：含5％海藻糖、0.1％PVPK-30、0.5％BSA、0.1％TritonX-100的pH6.0-7.0 0.05 M的Tris-HCl；
标记洗涤液：含0.1％Tween-20的pH 6.0-7.0 0.05M的Tris-HCl；
微球复溶液/反应缓释液：含有5％蔗糖，1％牛血清白蛋白，1％Tween-20的pH6.0-7.0 0.05M 的Tris-HCl；
Eu3+-荧光微球标记的AFB1单克隆抗体的制备方法，参考专利CN 110988339 A，具体如下：
(1)取4℃放置的内部包裹Eu3+、表面修饰有羧基官能团的荧光微球(购于百纳泰科新材料科技有限公司，粒径300nm)10μL(1％固形物含量)，超声分散，加入1000μL浓度为活化缓冲液，10000rpm于4℃离心15min；
(2)弃上清，加入800μL活化缓冲液，超声重悬，重复离心清洗3次；
(3)弃上清，加入200μL活化缓冲液超声重悬，加入1μL 1mg/mL EDC溶液、1μL 1mg/mL的NHS溶液作为活化剂，室温摇床500rpm避光振荡活化40min；
(4)活化完成后离心，弃上清，加入PBS缓冲液清洗3次；
(5)弃上清，加入400μL偶联缓冲液超声重悬，再加入0.5μgAFB1单克隆抗体，室温避光振荡标记2h；
(6)标记结束后加入10％(v/v)的封闭缓冲液和100μL抗体基础保护液，室温避光振荡40min；
(7)封闭后离心弃上清，用800-1000μL的标记洗涤液清洗2-3次；
(8)弃上清，加入400μL荧光微球复溶液，得到Eu3+-荧光微球标记的AFB1单克隆抗体，4℃保存备用。
Eu3+-荧光微球标记的Cd单克隆抗体的制备方法是将Eu-AFB1-单克隆抗体制备方法中的 AFB1单克隆抗体替换为Cd单克隆抗体，得到Eu3+-荧光微球标记的Cd单克隆抗体，4℃保存备用。
实施例3 AFB1和Cd双联荧光免疫定量试纸条的标准曲线的构建
标准曲线的构建方法是：
用阴性谷物样品配制成AFB1/Cd浓度分别为0/0、0.01/0.01、0.03/0.03、0.05/0.05、0.5/0.1、 1/1、3/3、5/6、10/10、20/30、30/60ng/mL含有AFB1和Cd的标准溶液用于双联荧光免疫定量试纸条检测，其中标准品释液为含5％甲醇(v/v)的0.01M pH 7.0的PBS溶液；
将实施例2制得的Eu3+-荧光微球标记的AFB1单克隆抗体(AFB1荧光探针)和Cd单克隆抗体(Cd-EDTA荧光探针)作为荧光探针，将3μL AFB1荧光探针、5μL Cd-EDTA荧光探针5μL样品提取液和87μL的标准溶液混合均匀后室温孵育10min，缓慢滴入实施例1 的双联荧光免疫定量试纸条的样品垫，加样量为50μL/cm2，37℃层析15min后，用HG-98 免疫定量分析仪记录双联荧光免疫定量试纸条的检测线T1和T2的荧光值；每个浓度测定六个平行，设定浓度为0ppb标准液的T线荧光值为T0，其他加标浓度的检测线T1和T2荧光值为T1和T2，以各个AFB1标准品浓度的对数值为横坐标，T1/T0×100(％)为纵坐标绘制标准曲线，竞争抑制率设为(1-T1/T0)×100％；以各个Cd标准品浓度的对数值为横坐标，T2/T0×100 (％)为纵坐标绘制标准曲线，竞争抑制率设为(1-T2/T0)×100％。
从图3可以看出：随着AFB1、Cd浓度的增大，双联荧光免疫定量试纸条的检测线T1和T2线条带上的荧光会越来越浅，所以T1/T0、T2/T0会越来越小，当AFB1的浓度为0.01-30ng/mL时，AFB1浓度的对数值与T1/T0成线性关系，线性方程为Y＝-25.531Logx+42.719，x 为AFB1浓度，Y为T1/T0，R2＝0.9946，检测限可达到0.021ng/mL；重金属Cd的浓度范围为0.01-60ng/mL时，其浓度对数值与T/T0呈线性关系，线性方程为Y＝-21.009Logx+59.428， x为Cd浓度，Y为T2/T0，R2＝0.9955，检测限可达到0.024ng/mL。
实施例4
一种同时检测谷物中AFB1和重金属Cd的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取谷物中AFB1和重金属Cd：
将阴性样本大米粉碎过80目筛，得到粉碎后的大米；取1.2mL浓硝酸(14.4mol/L)加入到13.2mL的超纯水中，充分震荡，制成1.2mol/L的硝酸溶液；之后按照体积比甲醇：硝酸溶液为85：15，配制得到提取液；将1g粉碎后的大米、500ppb Cd(镉标品)、200ppb 的AFB1(AFB1固体粉末均用甲醇溶解)混合均匀，之后与1mL提取液混合后加入到固相萃取柱中，在25℃下超声提取25min，提取结束后4000rpm离心5min去除不溶性物质，得到含有Cd和黄曲霉毒素B1的待测溶液；
(2)将步骤(1)得到的待测溶液、经Eu3+-荧光微球标记的AFB1的单克隆抗体、Eu3+-荧光微球标记的Cd的单克隆抗体和PBS缓冲液按照体积比为5：3：5：87，在37℃孵育15min，得到预处理之后的待测溶液；
(3)将步骤(2)得到的预处理的待测溶液加入实施例1所述的双联荧光免疫定量试纸条的样品垫上，37℃层析15min，加样量为50μL/cm2；之后利用免疫定量分析仪测定样品在检测线T1、T2和质控线C处相应的荧光强度值：AFB1的T1值、Cd的T2值和C值；
(4)将得到的T1值、T2值和C值代入实施例3的AFB1和Cd的标准曲线，得到待测样品中AFB1和Cd的浓度。
实施例5条件优化
(1)AFB1(Cd)完全抗原的用量的影响
为了提高试纸条检测的灵敏度，研究了实验过程中不同完全抗原浓度对阴性对照组与 AFB1(Cd)含量为0.5μg/L的样本之间的竞争抑制率的影响。
具体的实验探究过程如下：
(1)制备AFB1和Cd双联免疫定量试纸条时，在检测线T1处喷涂AFB1-OVA完全抗原，AFB1-OVA浓度选自0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.7mg/mL和0.9mg/mL，选取阴性对照组(5％甲醇-PBS溶液)和阳性试验组(AFB1的浓度为0.05μg/L)进行分析，进而评价不同浓度的AFB1-OVA对AFB1和Cd双联免疫定量试纸条检测结果的影响。
(2)在步骤(1)确定好最佳AFB1-OVA喷涂浓度下，在检测线T2处喷涂Cd-EDTAP-OVA完全抗原，Cd-EDTAPOVA浓度选自0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.7mg/mL和0.9 mg/mL，选取阴性对照组(5％甲醇-PBS溶液)和阳性试验组(Cd的浓度为0.5μg/L)进行分析，进而评价不同浓度的Cd-EDTA-OVA对AFB1和Cd双联免疫定量试纸条检测结果的影响。
评价不同浓度的AFB1-OVA或Cd-EDTAPOVA对AFB1和Cd双联免疫定量试纸条检测结果的影响，方法参考实施例4。
结果图4所示，随着T1(AFB1-OVA)和T2(Cd-EDTA-OVA)线处完全抗原浓度的增加，阴性对照组(5％甲醇-PBS溶液)与阳性试验组(AFB1＝0.05；Cd＝0.5μg/L)之间的荧光强度逐渐增加后趋于稳定，当AFB1-OVA的浓度为0.1mg/mL时，阴阳样本之间的竞争抑制率(1-T/T0)达到最大值；Cd-EDTA-OVA的浓度为0.3mg/mL时，阴阳样本之间的竞争抑制率(1-T/T0)达到最大值。
(2)免疫时间对检测结果的影响
将3μL AFB1荧光探针、5μL Cd-EDTA荧光探针、5μL加标样品溶液(AFB1＝0.05μg/L和Cd＝0.5μg/L混合溶液)和87μL PBS缓冲液的混合，37℃孵育5min、10min、15min、20min、25min、30min后，将混合溶液滴加到AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的样品垫，加样量为50μL/cm2，37℃层析15min，采用HG-98免疫定量分析仪记录T线荧光强度。
将5μL加标样品溶液(AFB1＝0.05μg/L和Cd＝0.5μg/L混合溶液)、3μL的AFB1荧光探针、5μL的Cd-EDTA荧光探针和87μL的PBS缓冲液混合均匀后，37℃孵育10min，缓慢滴入AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的样品垫，加样量为50μL/cm2，37℃层析15min，用HG-98免疫定量分析仪记录每分钟的T线荧光强度变化。
以T/C(FIT/FTC，即T线与C线荧光强度的比值)为纵坐标，免疫反应时间为横坐标绘制免疫反应动力学曲线。孵育10min对比后，由图6中A和B可看出，孵育10min时曲线趋于平衡。因此选择10min作为样品加入试纸条免疫层析之前的预反应时间。
以荧光强度值为纵坐标，反应时间为横坐标绘制免疫反应动力学曲线，观察T线和C线荧光强度随时间的变化，以T线荧光值达到稳定的时间作为较佳检测时间。
结果如图6，从图6可以看出，两条线的荧光强度在5-15min内均随着时间的延长呈现增强的趋势。在15min后，T线和C线的荧光强度值不再明显变化，趋于平稳；由图6中C 可以看出：阴性对照组(5％甲醇-PBS溶液)与阳性试验组(AFB1＝0.05；Cd＝0.5μg/L)之间的竞争抑制率(1-T/T0)在15min趋于稳定，因此层析时间选择15min较为合适。
(3)样品加入量对检测结果的影响
将3μL AFB1荧光探针、5μL Cd-EDTA荧光探针、xμL待测样品(AFB1＝0.05μg/L和Cd＝0.5μg/L混合溶液)和92-xμL PBS缓冲液的混合，其中x为2、5、10、15、20，37℃孵育10min，之后缓慢滴入AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的样品垫，加样量为50μL/cm2， 37℃层析15min，用HG-98免疫定量分析仪记录每分钟的T线荧光强度变化。
结果如图5，从图5可知：样品复溶液(待测样品+PBS缓冲液)中待测样品的加入量低于10μL时，对AFB1和Cd双联免疫定量试纸条检测线上的荧光强度影响不显著，这可能是由于AFB1的醇溶性，在10μL待测样品加入量条件下保持与抗体反应所需的天然构象；但是待测样品加入量含量超过20μL时，AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的荧光信号值和竞争抑制率均受到一定程度的影响，可能是因为在高甲醇浓度下，抗体的变性可能导致其生物活性的丧失。当待测样品加入量为5μL时，竞争抑制率最高，不仅减少对抗体活性的影响，还可以获得最佳的检测结果，所以样品复溶液(待测样品+PBS缓冲液)中的待测样品加入量设定为5μL。
实施例6抗体亲和力测定
抗体亲和力指抗体的抗原结合簇同抗原的抗原决定簇之间的结合强度，其本质是一种非共价作用力，包括对氨基酸之间的吸引力、氢键、疏水性作用力等，体现了一个抗体分子和一个半抗原分子或抗原分子的一个决定簇起反应的能力。通过间接非竞争ELISA方法鉴定单克隆抗体亲和力。其原理主要是将包被原固定在96孔板底部，加入待测物和单抗，板底部的包被原与抗体结合，多余的抗体会被洗掉，截留在板底部的抗原-抗体复合物与酶标二抗相结合，加入显色液和终止液。具体操作步骤如下：
(1)包板：将包被原AFB1-OVA溶液从1μg/mL 3倍梯度稀释包被酶标板，即1μg/mL、0.33μg/mL、0.11μg/mL，每孔均加入100μL，4℃反应过夜；
(2)洗涤：将微孔板内的液体甩出，弃去包被原，每孔加入300μL PBST洗涤液，甩干后重复洗涤三次，拍干，孔底部不能有气泡；
(3)封闭：每孔加入300μL 3％的实施例4步骤(1)得到的含有Cd和黄曲霉毒素B1的待测溶液，放在37℃恒温避光封闭1h；
(4)加入抗体：按照步骤(2)进行洗涤后，将AFB1单克隆抗体从1μg/mL 3倍梯度稀释，共稀释8个抗体浓度(浓度具体是1.000μg/mL、0.333μg/mL、0.111μg/mL、0.037μg/mL、0.012μg/mL、0.004μg/mL、0.0014μg/mL、0.00046μg/mL)，每孔加入100μL，放在37℃恒温培养箱中避光孵育1h；
(5)加入酶标二抗：按照步骤(2)洗涤三次并拍干，每孔加入100μL酶标二抗(用5mL0.01M PBS稀释1μL的辣根过氧化物酶-羊抗鼠二抗)；
(6)显色：甩干孔内液体，按照步骤(2)洗板三次拍干，每孔内加入100μL的显色液(显色A液，准确称取13.6g醋酸钠、1.6g柠檬酸，超声溶解后加入0.3mL 30％的双氧水，超纯水定容至500mL，4℃储存备用；显色B液，称取柠檬酸0.95g，乙二胺四乙酸0.2g，量取50mL甘油，称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.15g，用3mL的二甲基亚砜溶解，定容至500 mL，4℃避光保存；将A液和B液1:1等体积混合)，37℃条件下避光反应15min；
(7)终止：每孔加入50μL终止液(2mol/L H2SO4)，立即检测；
(8)读数：用多功能酶标仪读取不同包被浓度下不同浓度AFB1单克隆抗体在450nm条件下的吸光度值。
以单克隆抗体浓度(mol/L)的对数值为横坐标，吸光度值OD450nm为纵坐标，利用Origin 2021软件拟合出三条“S”型曲线，找出每条曲线的最大OD450nm，设为ODmax，然后通过拟合方程计算出ODmax/2所对应的抗体摩尔浓度，将所得到的3个不同浓度的包被原两两一组共组成3组，根据下式(1)分别计算出3个单克隆抗体亲和力常数Ka，3个亲和力常数的平均值即为抗体的亲和力常数。
Figure BDA0003166201950000121
其中，[Ab’]t、[Ab]t分别为两个不同包被浓度在ODmax/2所对应的抗体摩尔浓度(mol/L)， [Ab’]t对应相对较低的包被浓度、[Ab]t对应相对较高的包被浓度，n为两个包被浓度的比值 (n>1)，Ka为单克隆抗体的亲和力常数。
Cd-EDTA单克隆抗体的亲和力测定参照AFB1单克隆抗体的操作步骤。
测定抗体对特定抗原的亲和力，对提高AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的检测灵敏度十分重要。一般来说，常数Ka代表亲和力的大小，若Ka值<107L/mol时，表明单克隆抗体亲和力较低；若Ka值为107～1012L/mol时，表明单克隆抗体亲和力高，其特异性好。
表1、表2为Cd和AFB1单克隆抗体亲和力实验结果。从表1和表2可以看出：Cd和AFB1单克隆抗体的Ka平均值分别为7.02×107L/mol、4.25×107L/mol，说明AFB1单克隆抗体和Cd单克隆抗体均是高亲和力抗体。
表1 Cd抗体亲和力结果
Figure BDA0003166201950000122
表2 AFB1抗体亲和力结果
Figure BDA0003166201950000123
实施例7 AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的性能测试
1、精密度试验
从同一批次内取出8个AFB1和Cd双联免疫定量试纸条分别检测阴性对照组(5％甲醇-PBS)检测线处的荧光强度值(T0)和阳性试验组(AFB1＝0.05；Cd＝0.5μg/L)T线处的荧光强度值(T)分析批内差异。
实验操作同实施例4。
通过8个不同批次的AFB1和Cd双联免疫定量试纸条分别检测阴性对照组(5％甲醇-PBS)检测线处的荧光强度值(T0)和阳性试验组(AFB1＝0.05；Cd＝0.5μg/L)T线处的荧光强度值(T)分析批间差异。
由表3可知，通过变异系数计算公式分析得到T0、T和T/T0(％)的批内变异系数均小于9.01％，表明AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的批内和批间变异系数小，精密度高，准确性好，基本符合定量检测试纸条的要求。
表3 AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的精密度检测结果
Figure BDA0003166201950000131
2、准确度试验
样品处理：
将谷物样品按照国标GB 5009.22-2016方法提取样品中AFB1，按照国标CB5009.15-2014 方法提取样品中Cd，调pH至7.0后用于AFB1和Cd双联免疫层析试纸条检测。
为了验证AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的准确性与灵敏度，对几种阴性样品分别进行加标回收试验，每种样本的添加浓度均设置高、中、低三组不同的加标浓度，每组浓度梯度均设置三组平行试验。以加标回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(RSD％)作为精密度评价指标。加标回收率和相对标准偏差的计算公式如下式(2)、式(3)：
Figure BDA0003166201950000141
Figure BDA0003166201950000142
将阴性的样本分别按照0.2/0.5ng/mL，0.5/5ng/mL，1/10ng/mL(AFB1/Cd)三个浓度梯度进行加标回收实验。每个浓度重复10次，取T/T0的平均值并计算变异系数。
结果如表4所示，测定结果CV均小于9.876％，表明在线性范围内，AFB1和Cd双联免疫定量试纸条具有较好的准确性；AFB1和Cd双联免疫定量试纸条在实际样品加标回收实验中，其回收率在97.4-103.6％之间，变异系数小于9.876％，与UPLC-MS/MS法对比，结果一致性良好。
表4 AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的准确度检测结果
Figure BDA0003166201950000151
3、校准曲线
为了进一步确保实施例4的方法的准确性，以阴性的样本作为基底，向样品中加入AFB1 标准品配制含有AFB1 0μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、10μg/L的大米、玉米、小麦样品，并绘制标准曲线；向样品中加入Cd-EDTA标准品配制含有Cd-EDTA 0μg/L、0.1μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L的大米、玉米、小麦样品，并绘制标准曲线。
如表5所示，当AFB1的浓度范围为0.05ng/mL-10ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系；当Cd的浓度范围为0.1ng/mL-00ng/mL时，其浓度的对数值与T/T0成线性关系。
表5校准曲线参数
Figure BDA0003166201950000161
4、交叉反应试验
选取与AFB1具有类似结构或者类似功能的类似物(AFG1、AFG2、AFM1和AFB2)和Cu2+，Pb2+、Al3+、Mn2+、Zn2+进行评价双联荧光免疫定量试纸条的特异性。
具体步骤如下：
分别配制浓度为30ng/mL的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1单一溶液；浓度为 60ng/mL的Cu2+，Pb2+、Al3+、Mn2+、Zn2+单一溶液。
将3μL AFB1荧光探针、5μL Cd-EDTA荧光探针、5μL上述10个单一溶液和87μL PBS缓冲液的混合，37℃孵育10min后，将混合溶液滴加到AFB1和Cd双联免疫定量试纸条的样品垫，加样量为50μL/cm2，37℃层析15min，采用HG-98免疫定量分析仪记录10个双联荧光免疫定量试纸条上T线的荧光强度。
测试结果如图7，从图7可以看出：AFB1与其结构类似物AFB2具有一定的交叉反应，而与其他结构类似物的交叉反应较低，表明双联荧光免疫定量试纸条性能稳定，符合市场需求，具有广阔的市场前景。

Claims (10)

1.一种制备同时检测AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将0.01-1.0mg/mL AFB1完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜上作为检测线T1，将0.1-1.0mg/mLCd完全抗原溶液涂到硝酸纤维素膜上作为检测线T2，将0.05-1mg/mL羊抗鼠二抗溶液涂到硝酸纤维素膜上作为质控线C，其中检测线T1和检测线T2之间的距离为3-5mm，检测线T1和质控线C的距离为3-5mm，检测线T2和质控线C在检测线T1的两边，干燥；之后将样品垫、含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC底板上组装成试纸条。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双联荧光免疫定量试纸条中，样品垫和含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜的一端部分相互重叠，重叠区域的长度为2-4mm；吸水纸和含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜的另一端部分相互重叠，重叠区域的长度为2-4mm；所述吸水纸、样品垫与含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜相互重叠的部分位于含有检测线、质控线的硝酸纤维素膜的上方。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，检测线T2距样品垫的距离为4-6mm，质控线C距吸水纸的距离为4-6mm；所述的检测线T1、检测线T2和质控线C的宽度为1.5-2.5mm。
4.权利要求1-3任一项所述的方法制备得到的同时检测AFB1和Cd的双联荧光免疫定量试纸条。
5.一种同时检测谷物中AFB1和重金属Cd的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取谷物中AFB1和重金属Cd，得到待测溶液；
(2)将待测溶液、PBS缓冲液、经Eu3+-荧光微球标记的AFB1的单克隆抗、Eu3+-荧光微球标记的Cd的单克隆抗体混合均匀，得到预处理之后的待测溶液；
(3)将预处理的待测溶液加入权利要求4所述的双联荧光免疫定量试纸条的样品垫上进行层析，之后利用免疫定量分析仪测定样品在检测线C和质控线T1、质控线T2处相应的荧光强度值C值、AFB1的T1值、Cd的T2值；
(4)将得到的C值、T1值、T2值代入AFB1和Cd的标准曲线，得到待测样品中AFB1和Cd的浓度。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述待测溶液、Eu3+-荧光微球标记的AFB1的单克隆抗体、Eu3+-荧光微球标记的Cd的单克隆抗体和PBS缓冲液的体积比为5：3-5：5-10：85-95。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述提取具体包括如下步骤：
将谷物粉碎过筛，得到粉碎后的谷物；按照甲醇和硝酸溶液体积比为85：15，配制得到提取液；之后在粉碎后的谷物中添加提取液进行提取、离心，得到含有Cd和黄曲霉毒素B1的溶液；其中过筛是过80目筛，硝酸溶液的浓度为1.2mol/L，粉碎后的谷物和提取液的比例以mL/g计为3：1，提取是在25℃下超声提取25min，离心是在4000rpm离心5min。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述预处理的待测溶液的用量为30-50μL/cm2。
9.权利要求4所述的双联荧光免疫定量试纸条在食品检测领域的应用。
10.权利要求5-8任一项所述的方法在食品检测领域的应用。
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