CN113549680B - 一种金针菇二维码分子鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金针菇二维码分子鉴定方法，包括(1)提取金针菇基因组DNA，获得多态性片段；(2)将多态性片段按照分子量大小的顺序进行梯度排列，以阿拉伯数字1‑9进行编码，9以上排名以字母A‑Z进行编码；(3)统计SSR核心引物对应的特异性等位基因在其相应的多态性片段中的排名，并以排名进行编号，获得分子指纹码；每组核心引物对应2个编码；(4)将品种来源地域信息、子实体性状信息和栽培类型信息，分别进行编码后，与分子指纹码共同组成金针菇分子身份证号，最后，将数字+字母编码的金针菇分子身份证号转换为二维码。

Description

一种金针菇二维码分子鉴定方法
技术领域
本发明属于金针菇分子鉴定技术领域，具体涉及一种金针菇二维码分子鉴定方法。
背景技术
金针菇(Flammulina filiformis)是一种普遍栽培的食用菌，通常分为白色和黄色品种。其栽培历史悠久，生产总量逐年提升，目前已成为我国工厂化食用菌企业中发展速度最快、规模最大的一个品种。我国工厂化栽培金针菇的日产量约占我国食用菌工厂化总产量的47.12％。金针菇营养丰富、味道鲜美且兼具药用价值，不仅富含蛋白质、矿物质和维生素等各种营养成分，而且具有抗肿瘤、增强免疫调节、抗病毒、降血脂、抗疲劳和护肝等多种药用保健作用，深受消费者喜爱。
品种是决定金针菇产量和品质的内在因素，优质菌种在金针菇单产和质量中的贡献率举足轻重。近年来，尽管金针菇的产量和农艺性状都有了较大的进步，但栽培菌种多样性低导致的产品同质化问题日益突出，一些自主选育的品种由于缺乏高效、精准、直观的鉴定技术而得不到有效保护。上述现象不仅影响了企业的经济效益，也打击了食用菌育种工作者的信心。
SSR分子标记是一种共显性标记，具有遗传方式简单、操作简便、多态性好、重复性好、稳定可靠、检测遗传变异的能力强等特点，被广泛应用于食用菌的遗传作图构建、基因型鉴定与品种保护、种子纯度鉴定和种质保护、多样性研究、基因和QTL定位分析、系谱分析和分子标记辅助选择育种等研究领域。随着SSR技术的出现以及指纹鉴定技术的日益完善，构建食用菌品种分子身份证，为品种的区别、鉴定和对比提供了方便。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
本发明提供一种金针菇二维码分子鉴定方法，其特征在于：
(1)提取金针菇基因组DNA，分别利用金针菇SSR标记核心引物进行PCR扩增，将扩增产物进行毛细管电泳分析，并读取条带大小数据，获得多态性片段；
(2)将多态性片段按照分子量大小的顺序进行梯度排列，以阿拉伯数字和字母进行编码；
(3)统计SSR核心引物对应的特异性等位基因在其相应的多态性片段中的排名，并以排名进行编号，获得分子指纹码；每组核心引物对应2个编码；
(4)将品种来源地域信息、子实体性状信息和栽培类型信息，分别进行编码后，与分子指纹码共同组成金针菇分子身份证号，最后，将数字和字母编码的金针菇分子身份证号转换为二维码。
作为本发明所述的金针菇二维码分子鉴定方法：所述金针菇SSR标记核心引物，分别为：
SSR1：F：TCTGAATGTCCCGGAGCGT
R：GATACGAGCAGCACTCGCG
SSR2：F：TCTTCTTGGGTGGAAGACG
R：CTGAGCTAGGTTCCTCTAC
SSR3：F：CGTGCGCGTTACAATCCAT
R：TAGGCCCCCCAAGAAACAT
SSR4：F：GAAGGTGTGTTCGCTGTTC
R：CATTGGAGTGGGTAAAGAG
SSR5：F：CCTAATGGCGTTCAGCCAA
R：CTCTGAATCGGATGCCTTC
SSR6：F：GTCTTTCGCGCAGGTT
R：TGAGGGGACGGGTATGAGA
SSR7：F：TCTTCCTGTCACCACTGTTT
R：CGTCTCGACCATCGTTGGA
SSR8：F：CATGGATGTTGACGGGAA
R：CTGGAACGGTGGTAGACTCTC
SSR9：F：CTCCCAGCTTCAGGATACCT
R：GGTATGAGATGGAATCGCGA
SSR10：F：GGTGCACGCTCCTAAACCTA
R：CTTGTCGAGGAAGATCCATG
SSR11：F：AGTGATGACGAGGACAGTGA
R：CCTTCCTCCTCCATAGCAAA
SSR12：F：ATGCGGCGGTTTGTCAGAAC
R：AACCACAACCTTCCTTCCCC
SSR14：F：CAGATGATGCTGCAATGCTC
R：CTTTGTGGCACTATCTGCTG
SSR16：F：AGACCCAACACCGGACATAT
R：GGTTAGGGATGTGACGCGGT
SSR17：F：CCCAGATGATGCTGCAATGC
R：CGCTTTGTGGCACTATCTGC
SSR18：F：AAAAATTGAGAGGGTGCATG
R：TTGGACGAATCCTCGTTGCG
SSR19：F：GGTACGCTAATCCGCTTGTT
R：CGTCACTCGTGTAAGTCAAT
SSR20：F：AAATGAACGTCGAGTGATTC
R：GACGAGTCAATCCATCCACT。
作为本发明所述的金针菇二维码分子鉴定方法的一种优选方案：所述子实体性状信息，为金针菇菇盖和菇柄的颜色信息。
作为本发明所述的金针菇二维码分子鉴定方法的一种优选方案：所述栽培类型，包括自主选育、常规栽培、工厂化栽培、野外采集。
作为本发明所述的金针菇二维码分子鉴定方法的一种优选方案：所述以阿拉伯数字和字母进行编码，为以阿拉伯数字1-9进行编码，9以上排名以字母A-Z进行编码。
本发明的有益效果：本发明金针菇二维码分子鉴定方法，该方法筛选了18对具有代表性的SSR核心引物，并以此为基础进行金针菇二维码分子身份证的构建，同时，该方法融合了品种来源地域信息、子实体颜色性状信息和栽培类型信息，最终构建获得了二维码化的真姬菇分子身份证，这些产品身份证可以有效区分不同品种的金针菇，尤其对子实体外观近似产品的区分能力强。二维码化的分子身份证能够通过信息终端直接读取，为金针菇种质的科学化鉴别和标准化管理提供便利。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为为生成的8株金针菇菌种的分子身份证二维码。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
为了更好地鉴别和比对金针菇种质资源的分子遗传背景，本发明广泛收集了包含野生和栽培品种在内的105个金针菇菌株，基于SSR分子标记构建了每个菌株的二维码分子身份证，本发明取其中的8个典型株为例。
本发明提供了一种金针菇二维码分子身份证，由数字和字母组成，包括由数字和字母组成的SSR指纹数据化编码、品种来源地域信息、子实体性状信息和栽培类型信息。SSR指纹数据化编码是通过分布在金针菇染色体上的18对SSR核心引物进行PCR扩增，根据扩增产物的带型构建获得的，每对SSR核心引物对应2个编码，该2个编码分别表示相应的SSR核心引物在金针菇基因组中扩增获得的等位基因在该SSR核心引物的扩增多态性中的排名，排名在1-9位时，以阿拉伯数字1-9编码，排名在9以上时，以英文字母A-Z编码。若该标记在某个品种中无扩增则记为0。金针菇二维码分子身份证为43位编码，其中，1-36位表示SSR指纹码，37-38表示品种来源地域，39-40位表示金针菇子实体菇盖颜色，41-42位表示金针菇子实体菇柄颜色，43位表示菌株的栽培类型。
18对SSR核心引物的序列为：
SSR1：F：TCTGAATGTCCCGGAGCGT
R：GATACGAGCAGCACTCGCG
SSR2：F：TCTTCTTGGGTGGAAGACG
R：CTGAGCTAGGTTCCTCTAC
SSR3：F：CGTGCGCGTTACAATCCAT
R：TAGGCCCCCCAAGAAACAT
SSR4：F：GAAGGTGTGTTCGCTGTTC
R：CATTGGAGTGGGTAAAGAG
SSR5：F：CCTAATGGCGTTCAGCCAA
R：CTCTGAATCGGATGCCTTC
SSR6：F：GTCTTTCGCGCAGGTT
R：TGAGGGGACGGGTATGAGA
SSR7：F：TCTTCCTGTCACCACTGTTTR：CGTCTCGACCATCGTTGGA
SSR8：F：CATGGATGTTGACGGGAA
R：CTGGAACGGTGGTAGACTCTC
SSR9：F：CTCCCAGCTTCAGGATACCT
R：GGTATGAGATGGAATCGCGA
SSR10：F：GGTGCACGCTCCTAAACCTA
R：CTTGTCGAGGAAGATCCATG
SSR11：F：AGTGATGACGAGGACAGTGA
R：CCTTCCTCCTCCATAGCAAA
SSR12：F：ATGCGGCGGTTTGTCAGAAC
R：AACCACAACCTTCCTTCCCC
SSR14：F：CAGATGATGCTGCAATGCTC
R：CTTTGTGGCACTATCTGCTG
SSR16：F：AGACCCAACACCGGACATAT
R：GGTTAGGGATGTGACGCGGT
SSR17：F：CCCAGATGATGCTGCAATGC
R：CGCTTTGTGGCACTATCTGC
SSR18：F：AAAAATTGAGAGGGTGCATG
R：TTGGACGAATCCTCGTTGCG
SSR19：F：GGTACGCTAATCCGCTTGTT
R：CGTCACTCGTGTAAGTCAAT
SSR20：F：AAATGAACGTCGAGTGATTC
R：GACGAGTCAATCCATCCACT。
本发明金针菇二维码分子鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取金针菇基因组DNA，分别利用所述18对SSR核心引物进行PCR扩增，将扩增产物进行毛细管电泳分析，并由软件直接读取条带大小数据，获得18组多态性片段；
(2)将18组多态性片段分别按照分子量大小的顺序进行梯度排列，以阿拉伯数字1-9进行编码，9以上排名以字母A-Z进行编码；
(3)统计18组SSR核心引物对应的特异性等位基因在其相应的多态性片段中的排名，并以排名进行编号，获得分子指纹码；每组核心引物对应2个编码，因此，所述分子指纹码为36个数字或字母组成的编码；
(4)将品种来源地域信息、子实体性状信息和栽培类型信息。分别进行编码后，与分子指纹码共同组成金针菇分子身份证号，最后，将数字+字母编码的金针菇分子身份证号转换为二维码。
本发明提供了一种金针菇二维码分子身份证及其构建方法，该方法筛选了18对具有代表性的SSR核心引物，并以此为基础进行金针菇二维码分子身份证的构建，同时，该方法融合了品种来源地域信息、子实体颜色性状信息和栽培类型信息，最终构建获得了二维码化的真姬菇分子身份证，这些产品身份证可以有效区分不同品种的金针菇，尤其对子实体外观近似产品的区分能力强。二维码化的分子身份证能够通过信息终端直接读取，为金针菇种质的科学化鉴别和标准化管理提供便利。
实施例1：
(1)菌丝培养：将金针菇菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基(PDA)上，25℃培养7d后收集菌丝；
(2)基因组DNA的提取：用TAKARA公司的TaqHotStart扩增试剂盒提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；
CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：
①将菌丝样本加入液氮充分研磨；
②向研磨好的粉末中迅速加入360μL BufferSTE和40μL Buffer SDS，迅速涡旋混匀后，将离心管放在65℃水浴15min，水浴过程中颠倒离心管以混合样本数次；
③加入5μL RNase Solution至裂解液中，涡旋混匀，室温静置15-30min；
④加入140μL Buffer PS，涡旋震荡30s，冰上放置10min；
⑤室温下，13000g离心5min，小心转移400μL上清液至新的离心管中；
⑥加入600μL Buffer PBD(已用无水乙醇稀释)至样品中，，涡旋混匀30s；
⑦把DNA结合柱装在收集管，转移一半混合液至柱子中，8000g离心1min；
⑧倒弃滤液把柱子装回收集管，转移剩余混合液至柱子中，8000g离心1min；
⑨倒弃滤液把柱子装回收集管，加入600μL Buffer GW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中，8000g离心1min；
⑩重复步骤9；
Figure GDA0003205663300000071
倒弃滤液把柱子装回收集管，10000g离心2min去除柱子中残留的乙醇；
Figure GDA0003205663300000072
将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入30μL预热至65℃的Buffer AE至柱子的膜中央，室温静置2min，10000g离心1min；
Figure GDA0003205663300000073
取2μL DNA用于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，取2μL DNA用于NanoDrop分光光度计测浓度，剩余DNA保存于-20℃。/>
(3)SSR分子标记的检测：对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；
PCR扩增体系为：总体积10μL，包括：10×PCR buffer 1μL，2.5mmol/LdNTP 0.8μL，5U/μL HSTaq DNA酶0.1μL，5μmol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各0.6μL，浓度20ng～30ng/μL提取的模板DNA 1μL，ddH2O 5.9μL；
PCR反应条件：95℃5min；95℃30second，60℃30second，72℃30second，35个循环；60℃30min。
(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物与1μL加样缓冲液混匀，95℃变性3min，结束后置于冰水混合物中冷却3min；点样3μL于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝为商用POP7胶，电泳缓冲液为3730buffer EDTA，注入电压2000V，运行电压15000V，进样时间10s，温度60℃，毛细管长度50cm，功率200W，电泳20min，电流和功率均为动态。直接读取条带大小，获得18组SSR多态性条带。
(5)分子指纹码分析：根据20对SSR核心引物扩增出来的多态性条带，按照分子量从小到大，排列梯度，获得如下表1所示的结果，以阿拉伯数字1-9进行编码，9个以上的等位基因，以大写英文字母A、B、C代替。
表1
Figure GDA0003205663300000081
①将品种来源地域信息进行编码，具体为：SH:Shanghai中国上海；SS：中国上海师范大学；XZ:Xuzhou中国徐州；GZ:Guizhou中国贵州；SY:Shenyang中国沈阳；SM:Sanming中国三明；SD:Shandong中国山东；KM:Kunming中国昆明；ZZ:Zhengzhou中国郑州；NJ:Nanjing中国南京；WH:Wuhan中国武汉；HN:Hunan中国湖南；JS:Jiangsu中国江苏；CS:Changshan中国常山；FJ:Fujian中国福建；SX:Shanxi中国山西；JO:Jianou中国建瓯；SC:Sichuan中国四川；HB:Hubei中国湖北；CD:Chengdu中国成都；HK:Hongkong中国香港；TW:Taiwan中国台湾；US:U.S.A.美国；JP:Japan日本；SV:Slovenija斯洛文尼亚；ML:Malaysia马来西亚；UU:(unkown)未知。
②将子实体性状(菇盖和菇柄的颜色)信息进行编码，具体为：
LG:(light golden)浅金黄色；LO:(light orange)浅橘黄色；LE:(light earth-yellow)浅土黄色；EY:(earth-yellow)土黄色；LY:(light yellow)浅黄色；CC:(cream-coloured)米色；YB:(yellowish-brown)黄棕色；TC:(tawny-coloured)棕色；LT:(lighttawny)浅棕黄色；PY:(positive yellow)正黄色；BC:(brown-coloured)棕色；CF:(coffee-coloured)咖啡色；WY:(white yellow)白色泛黄；YW:(yellow white)黄色泛白；WR:(whitered)白色泛红；OC:(orange coloure)橘色；SW:(snow white)雪白色；UU:(unkown)未知。
③将栽培类型信息进行编码，具体为：
A:(Academy-autonomous breeding)中国上海市农科院自主选育；X:(Xuerong-autonomous breeding)雪榕自主选育；C:(Cultivate)常规栽培；I:(Industrialcultivation)工厂化栽培；W:(wild)野外采集；U:(unkown)未知。
④最终获得的8株金针菇的分子身份证二维码结果如图1所示。
利用信息终端直接扫描二维码，可获得各株金针菇的身份信息为：
FW178的分子指纹码125633553523113345462312454545452244SHPYYBW，品种来源地域为中国上海，品种的分子指纹码为125633553523113345462312454545452244，菌盖颜色为正黄色，菌柄颜色为黄棕色，栽培类型为野外采集。
徐金18的分子指纹码125633553523113345462312453345452255XZEYLTW，品种来源地域为中国徐州，品种的分子指纹码为125633553523113345462312453345452255，菌盖颜色为土黄色，菌柄颜色为浅棕黄色，栽培类型为野外采集。
金1754的分子指纹码225833775512112233002222554566221289USYWLTC，品种来源地域为美国，品种的分子指纹码为225833775512112233002222554566221289，菌盖颜色为黄色泛白，菌柄颜色为棕黄色，栽培类型为常规栽培。
FV1923的分子指纹码348844775522132444162312664566461277NJLYSWC，品种来源地域为中国南京，品种的分子指纹码为348844775522132444162312664566461277，菌盖颜色为浅黄色，菌柄颜色为雪白色，栽培类型为常规栽培。
FVCYS的分子指纹码443333175512333334113311554466662478SHSWSWI，品种来源地域为中国上海，品种的分子指纹码为443333175512333334113311554466662478，菌盖颜色为雪白色，菌柄颜色为雪白色，栽培类型为工厂化栽培。
SCY12的分子指纹码34AA44776612133334112311554466662357SCPYPYI，品种来源地域为中国四川，品种的分子指纹码为34AA44776612133334112311554466662357，菌盖颜色为正黄色，菌柄颜色为正黄色，栽培类型为工厂化栽培。
上研1号的分子指纹码443333176612333334113311554466662478SHSWSWA，品种来源地域为中国上海，品种的分子指纹码为443333176612333334113311554466662478，菌盖颜色为雪白色，菌柄颜色为雪白色，栽培类型为中国上海市农科院自主选育。
J5011的分子指纹码34AA1337661212354414231335343646115ASHSWSWA，品种来源地域为中国上海，品种的分子指纹码为34AA1337661212354414231335343646115，菌盖颜色为雪白色，菌柄颜色为雪白色，栽培类型为中国上海市农科院自主选育。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种金针菇二维码分子鉴定方法，其特征在于：
(1)提取金针菇基因组DNA，分别利用金针菇SSR标记核心引物进行PCR扩增，将扩增产物进行毛细管电泳分析，并读取条带大小数据，获得多态性片段；
(2)将多态性片段按照分子量大小的顺序进行梯度排列，以阿拉伯数字和字母进行编码；
(3)统计SSR核心引物对应的特异性等位基因在其相应的多态性片段中的排名，并以排名进行编号，获得分子指纹码；每组核心引物对应2个编码；
(4)将品种来源地域信息、子实体性状信息和栽培类型信息，分别进行编码后，与分子指纹码共同组成金针菇分子身份证号，最后，将数字和字母编码的金针菇分子身份证号转换为二维码；
所述子实体性状信息，为金针菇菇盖和菇柄的颜色信息；
所述金针菇SSR标记核心引物，分别为：
SSR1：F：TCTGAATGTCCCGGAGCGT；
R：GATACGAGCAGCACTCGCG；
SSR2：F：TCTTCTTGGGTGGAAGACG；
R：CTGAGCTAGGTTCCTCTAC；
SSR3：F：CGTGCGCGTTACAATCCAT；
R：TAGGCCCCCCAAGAAACAT；
SSR4：F：GAAGGTGTGTTCGCTGTTC；
R：CATTGGAGTGGGTAAAGAG；
SSR5：F：CCTAATGGCGTTCAGCCAA；
R：CTCTGAATCGGATGCCTTC；
SSR6：F：GTCTTTCGCGCAGGTT；
R：TGAGGGGACGGGTATGAGA；
SSR7：F：TCTTCCTGTCACCACTGTTT；
R：CGTCTCGACCATCGTTGGA；
SSR8：F：CATGGATGTTGACGGGAA；
R：CTGGAACGGTGGTAGACTCTC；
SSR9：F：CTCCCAGCTTCAGGATACCT；
R：GGTATGAGATGGAATCGCGA；
SSR10：F：GGTGCACGCTCCTAAACCTA；
R：CTTGTCGAGGAAGATCCATG；
SSR11：F：AGTGATGACGAGGACAGTGA；
R：CCTTCCTCCTCCATAGCAAA；
SSR12：F：ATGCGGCGGTTTGTCAGAAC；
R：AACCACAACCTTCCTTCCCC；
SSR14：F：CAGATGATGCTGCAATGCTC；
R：CTTTGTGGCACTATCTGCTG；
SSR16：F：AGACCCAACACCGGACATAT；
R：GGTTAGGGATGTGACGCGGT；
SSR17：F：CCCAGATGATGCTGCAATGC；
R：CGCTTTGTGGCACTATCTGC；
SSR18：F：AAAAATTGAGAGGGTGCATG；
R：TTGGACGAATCCTCGTTGCG；
SSR19：F：GGTACGCTAATCCGCTTGTT；
R：CGTCACTCGTGTAAGTCAAT；
SSR20：F：AAATGAACGTCGAGTGATTC；
R：GACGAGTCAATCCATCCACT。
2.根据权利要求1所述的金针菇二维码分子鉴定方法，其特征在于：所述栽培类型，包括自主选育、常规栽培、工厂化栽培、野外采集。
3.根据权利要求1或2所述的金针菇二维码分子鉴定方法，其特征在于：所述以阿拉伯数字和字母进行编码，为以阿拉伯数字1-9进行编码，9以上排名以字母A-Z进行编码。
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