CN113544274A - 多核酸载体的组合物和其用途 - Google Patents

多核酸载体的组合物和其用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了目的载体和进入载体的组合物。本文还公开了目的载体和进入载体在甲基化妨碍的组装反应中的用途，其中组装的序列可用作后续组装反应中的进入载体。

Description

多核酸载体的组合物和其用途
相关申请
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求于2019年1月9日提交的美国临时申请系列号62/790,343的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本文公开了目的载体和进入载体的组合物。本文还公开了目的载体和进入载体在甲基化妨碍的组装反应中的用途，其中组装的序列可在随后的组装反应中用作进入载体。
背景技术
先前已经描述了各种克隆策略。传统上，限制性连接克隆用于将感兴趣的核酸片段插入到载体中。因为该传统方法的局限性，比如与限制性内切核酸酶切割位点、“疤痕”的引入、限制性内切核酸酶的选择以及克隆的低效率相关的那些，开发了其他方法，以分层方式克隆更大的多核酸。例如，IIS型分层克隆策略包括MoClo(Addgene)和Golden Gate(NEB)，并且基于重组的分层克隆策略包括Gateway Cloning(Thermo)。
发明内容
在一些方面中，本公开涉及目的载体。在一些实施方式中，多核酸目的载体包括骨架组分和插入位点组分，其中：(a)骨架组分包括选择标记的核酸序列、复制起点以及包括共同识别位点和对应的切割位点的至少一个IIS型限制酶切位点，其中共同识别位点与甲基化位点重叠；和(b)插入位点组分包括5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点，任选地，其中5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点由至少一个核苷酸分开；其中每个IIS型双限制酶切位点包括：(i)第一共同识别位点和对应的切割位点，其中第一共同识别位点与形成插入位点组分和骨架组分之间的边界的甲基化位点重叠，和(ii)第二共同识别位点和对应的切割位点，其中第二识别位点缺少重叠的甲基化位点，其中与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点二者都位于第一共同识别位点和第二共同识别位点之间，其中：在与甲基化位点重叠的共同识别位点处的目的载体的甲基化阻碍与该共同识别位点对应的切割位点的切割；当甲基化时，将目的载体暴露于识别目的载体的共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶，生成两个多核酸片段，其中包括骨架组分的片段的5’端核酸突出端或3’端核酸突出端的核苷酸序列不同；并且(a)中的IIS型切割位点与(b)中的IIS型切割位点的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点或3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由至少一个核苷酸分开。在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由至少一个核苷酸彼此分开。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点以及3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由不同的核苷酸序列彼此分开。在一些实施方式中，不同的核苷酸序列包括不同的核酸长度。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点以及3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由相同的核苷酸序列彼此分开。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点和/或3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点为共享的切割位点。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点由编码视觉读出标记(visual readout)或自杀盒的核酸序列分开。在一些实施方式中，视觉读出标记选自由下述组成的组中：荧光蛋白、显色蛋白、LacZ或LacZα。在一些实施方式中，自杀盒包括ccdB的核酸序列。
在一些实施方式中，结合共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶选自由下述组成的组中：BsaI、BsmBI、BtgZI、Esp3I、FokI、HphI、BcgI、AlwI、MboII、MmeI、BsmFI、BceAI、BcoDI、BfuAI、BsmAI、EarI、EciI、FauI、HgaI、HpyAV、PleI、BbsI、SapI和SfaNI。在一些实施方式中，IIS型限制性内切核酸酶是高保真限制性内切核酸酶。在一些实施方式中，(a)的骨架组分中的至少一个IIS型限制酶切位点位于选择标记或复制起点内或侧翼。在一些实施方式中，(a)的骨架组分中的至少一个IIS型限制酶切位点的切割位点包括低连接效率序列内容(sequence content)。在一些实施方式中，选择标记包括抗生素抗性基因。
在一些实施方式中，(a)和(b)的甲基化位点由相同的甲基转移酶甲基化。
在一些实施方式中，甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在一些实施方式中，当未甲基化时，将目的载体暴露于识别目的载体的共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶生成至少三个多核酸片段，其中每个多核酸包括5’端核酸突出端或3’端核酸突出端，并且其中包括5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点的第二共同识别序列的片段的5’端核酸突出端或3’端核酸突出端的核苷酸序列不同。
在其他方面中，本公开涉及进入载体。在一些实施方式中，多核酸进入载体包括骨架组分和插入组分，其中(a)骨架组分包括如本文公开的多核酸目的载体的骨架组分；(b)插入组分从5’至3’包括第一IIS型限制酶切位点、插入序列和第二IIS型限制酶切位点；其中第一IIS型限制酶切位点和第二IIS型限制酶切位点各自包括：(i)与甲基化位点重叠的共同识别位点，其中甲基化位点形成插入组分和骨架组分之间的边界，和(ii)对应的切割位点，其中第一IIS型限制酶切位点和第二IIS型限制酶切位点的切割位点的切割生成5’突出端或3’突出端，其中第一IIS型限制酶切位点的5’突出端或3’突出端和第二IIS型限制酶切位点的5’突出端或3’突出端的核苷酸序列彼此不同。在一些实施方式中，插入序列是在组装反应中组合的核酸序列。
在仍其他方面中，本公开涉及将多核酸组装成预定序列的方法。在一些实施方式中，方法包括：(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)如本文公开的目的载体，其中目的载体的骨架组分和插入位点组分二者的甲基化位点被甲基化；(ii)如本文公开的至少一种进入载体，其中至少一个进入载体中的每一个的骨架组分和插入组分的甲基化位点是未甲基化的；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中IIS型限制性内切核酸酶识别目的载体和进入载体的共同识别位点；和(iv)连接酶；(b)将反应混合物孵育足够用于目的载体和至少一个进入载体的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；(c)将反应混合物孵育的足够用于使连接酶将至少一个进入载体中的每一个的插入序列连接到目的载体的骨架组分中的时间，从而生成环状多核酸；并且其中目的载体的骨架组分的5’突出端或3’突出端和至少一个进入载体中的每一个的插入组分唯一地彼此互补，以便形成包括步骤(a)(i)的目的载体的骨架组分和步骤(a)(ii)的至少一个进入载体中的每一个的插入组分的预定序列。
在一些实施方式中，目的载体在体外被甲基化。在一些实施方式中，目的载体在体内被甲基化。在一些实施方式中，目的载体在表达甲基转移酶的细菌菌株中被甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在一些实施方式中，方法进一步包括将含有插入序列的连接目的载体与反应混合物的其他组分分离。在一些实施方式中，通过用反应混合物转化细菌并且筛选存在正确连接的组装的细菌来分离连接的目的载体。
在一些实施方式中，方法进一步包括将分离的连接目的载体去甲基化，以生成第二进入载体。在一些实施方式中，分离的连接目的载体通过在缺乏甲基转移酶的细菌菌株中的复制在体内被动地去甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在其他方面中，本公开涉及克隆感兴趣的核酸序列的方法。在一些实施方式中，方法包括：(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)如本文公开的目的载体，其中骨架组分的甲基化位点是甲基化的；(ii)至少一个多核酸片段，其中每个多核酸片段包括内部序列，所述内部序列在两个末端处侧翼为共同识别位点和对应的切割位点；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中IIS型限制性内切核酸酶识别目的载体和至少一个多核酸片段的共同识别位点；和(iv)连接酶；(b)将反应混合物孵育足够用于目的载体和至少一个多核酸片段的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；和(c)将反应混合物孵育足够用于连接酶将至少一个多核酸片段中的每一个的内部核酸序列连接到目的载体的骨架组分中的时间，从而生成环状多核酸；并且其中至少一个多核酸片段的内部序列包括感兴趣的核酸序列；并且其中目的载体的骨架组分的5’突出端或3’突出端和至少一个多核酸片段的每个内部序列彼此唯一地互补，以便形成包括步骤(a)(i)的目的载体的骨架组分和感兴趣的核酸序列的预定序列。
在一些实施方式中，目的载体在体外被甲基化。在一些实施方式中，目的载体在体内被甲基化。在一些实施方式中，目的载体在表达甲基转移酶的细菌菌株中被甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在一些实施方式中，方法进一步包括将含有插入序列的连接目的载体与反应混合物的其他组分分离。在一些实施方式中，通过用反应混合物转化细菌并且筛选存在正确连接的组装的细菌来分离连接的目的载体。
在一些实施方式中，方法进一步包括将分离的连接目的载体去甲基化，以生成第二进入载体。在一些实施方式中，分离的连接目的载体通过在缺乏甲基转移酶的细菌菌株中的复制在体内被动地去甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在其他实施方式中，方法包括：(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)如本文公开的至少一种进入载体，其中骨架组分的甲基化位点是未甲基化的；(ii)多核酸片段，其中多核酸片段包括内部序列，所述内部序列在两个末端处侧翼为共同识别位点和对应的切割位点；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中所述IIS型限制性内切核酸酶识别至少一个进入载体和多核酸片段的共同识别位点；和(iv)连接酶；(b)将反应混合物孵育足够用于至少一个进入载体和多核酸片段的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；和(c)将反应混合物孵育足够用于连接酶将多核酸片段的内部核酸序列与至少一个进入载体中的每一个的插入组分连接的时间，从而生成环状多核酸；并且其中多核酸片段的内部序列包括选择标记和复制起点；并且其中至少一个进入载体中的每一个的插入组分的5’突出端或3’突出端和至少一个多核酸片段的内部序列彼此唯一地互补，以便形成包括感兴趣的核酸序列的预定序列。
在一些实施方式中，多核酸片段是PCR产物。
在一些实施方式中，多核酸片段在体外被甲基化。
在一些实施方式中，预定序列进一步包括进入载体的序列。
附图说明
下述附图形成本说明书的一部分，并且包括下述附图以进一步表明本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个并且结合本文呈现的具体实施方式的详细描述，可更好地理解本公开的某些方面。应理解，附图中阐释的数据决不限制本公开的范围。
图1示意性地描绘了目的载体的实施方式。5’IIS型限制酶切位点的核酸序列为CCGGTCTCNNNNNNGAGACC(SEQ ID NO:1)，并且3’IIS型限制酶切位点的核酸序列为GGTCTCNNNNNNGAGACCGG(SEQ ID NO:2)，其中N表示A、T、G或C。
图2示意性地描绘了进入载体的实施方式。第一IIS型限制酶切位点的核酸序列为CCGGTCTCNNNNNN(SEQ ID NO：3)，并且第二IIS型限制酶切位点的核酸序列为NNNNNNGAGACCGG(SEQ ID NO：4)，其中N表示A、T、G或C。
图3示意性地描绘了甲基化妨碍的组装反应的实施方式。限制酶切位点如图1和图2中标记。
具体实施方式
本文公开了目的载体和进入载体的组合物，以及用于组装具有预定序列的多核酸的试剂盒的组合物。本文还公开了用于组装具有预定序列的多核酸的方法，包括甲基化妨碍的组装反应，其中组装的预定序列可用作用于随后组装反应的进入载体。这些组合物和方法建立在先前描述的分层克隆策略之上。尤其，公开的组合物和方法可消除在克隆阶段之间转换限制性内切核酸酶和/或选择的机制的需要。而且，公开的方法可表现出降低的背景，因为供体载体的骨架在克隆的过程中可被降解。
目的载体和组合物
在一些方面中，本公开涉及目的载体多核酸和包括目的载体多核酸的组合物。在一些实施方式中，目的载体为线性载体。在其他实施方式中，目的载体为环状载体。目的载体包括骨架组分和插入位点组分。
如本文使用的，术语“骨架组分”指在插入组分侧翼的目的载体的部分(或在插入组分侧翼的进入载体的部分，参见下面“进入载体和组合物”)并且包括至少一个复制起点。在一些实施方式中，骨架组分进一步包括选择标记基因。
在一些实施方式中，选择标记包括可见的读出基因，比如荧光蛋白或显色蛋白。荧光蛋白的示例是本领域技术人员已知的并且包括但不限于TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、monomeric Midoriishi-Cyan、TagCFP、mTFP1、EGFP、Emerald、SuperfolderGFP、Monomeric Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、Monomeric Kusabira-Orange、mKOκ、mKOO mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby、mRuby2、mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune、NirFP、TagRFP657、IFP1.4和iRFP。显色蛋白的示例是本领域普通技术人员已知的。参见例如美国专利号9,771,402(描述了各种显色蛋白)。在一些实施方式中，选择标记包括营养缺陷型补体基因。在一些实施方式中，选择标记包括抗生素抗性基因。选择标记的示例是本领域技术人员已知的并且包括但不限于AmpR、NeoR、mFabI、ZeoR、NAT、HygR、SpcR(AadA)、Pac、Ura3、His3、Leu2和Trp1。
在一些实施方式中，骨架组分进一步包括至少一个IIS型限制酶切位点。
如本文使用的，术语“限制酶切位点”指包括识别位点和对应的切割位点的多核酸序列。如本文使用的，术语“识别位点”指被IIS型限制性内切核酸酶识别并与其特异性结合的多核酸序列。“对应的切割位点”指当IIS型限制性内切核酸酶与识别位点结合时被切割的位点。在一些实施方式中，切割位点的长度仅为两个核苷酸，并且切割发生在两个核苷酸之间(对应于平末端切割位点)。在一些实施方式中，切割位点的长度至少为3个核苷酸(对应于包括至少1个核苷酸的单链突出端的5’突出端位点或3’突出端位点)、至少4个核苷酸的长度(对应于包括至少2个核苷酸的单链突出端的5’突出端位点或3’突出端位点)、至少5个核苷酸长度(对应于包括至少3个核苷酸的单链突出端的5’突出端位点或3’突出端位点)、至少6个核苷酸的长度(对应于包括至少4个核苷酸的单链突出端的5’突出端位点或3’突出端位点)、至少7个核苷酸的长度(对应于包括至少5个核苷酸的单链突出端的5’突出端位点或3’突出端位点)、至少8个核苷酸的长度(对应于包括至少6个核苷酸的单链突出端的5’突出端位点或3’突出端位点)或至少9个核苷酸的长度(对应于包括至少7个核苷酸的单链突出端的5’突出端位点或3’突出端位点)。在一些实施方式中，切割位点的切割生成单链突出端。突出端的长度可变化(例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或至少7个核苷酸的长度)。在一些实施方式中，突出端为5’突出端。在其他实施方式中，突出端为3’突出端。
IIS型限制性内切核酸酶识别不对称的DNA序列并在它们的识别序列的外侧切割。已知IIS型限制性内切核酸酶的示例包括但不限于AcuI、AlwI、BaeI、BbsI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、MphI、HgaI、MphI MnII、NmeAIII、PleI、SapI和SfaNI。在一些实施方式，IIS型限制性内切核酸酶为高保真限制性内切核酸酶。
一些IIS型限制性内切核酸酶对甲基化敏感并且包括但不限于AlwI(dam甲基化敏感)、BceAI(CpG甲基化敏感)、BcgI(dam和CpG甲基化敏感)、BcoDI(CpG甲基化敏感)、BfuAI(CpG甲基化敏感)、BsaI(dcm和CpG甲基化敏感)、BsmAI(CpG甲基化敏感)、BsmBI(CpG甲基化敏感)、BsmFI(dcm和CpG甲基化敏感)、BtgZI(CpG甲基化敏感)、EarI(CpG甲基化敏感)、EciI(CpG甲基化敏感)、Esp3I(CpG甲基化敏感)、FauI(CpG甲基化敏感)、FokI(dcm和CpG甲基化敏感)、HgaI(CpG甲基化敏感)、HphI(dam和dcm甲基化敏感)、HpyAV(CpG甲基化敏感)、MboII(dam甲基化敏感)、MmeI(CpG甲基化敏感)、SapI(CpG甲基化敏感)、PleI(CpG甲基化敏感)和SfaNI(CpG甲基化敏感)。
在一些实施方式中，识别位点为共同识别位点。目的载体(或下面“进入载体和组合物”中描述的进入载体)中的每个“共同识别位点”：(i)由相同的核酸序列组成和/或(ii)包括被相同的IIS型限制性内切核酸酶识别和结合的核酸序列(一些IIS型限制性内切核酸酶识别各种序列；例如MmeI，其识别序列5’-TCCRAC-3’，其中R表示A或G)。在一些实施方式中，骨架组分的至少一个共同识别位点与甲基化位点重叠(即，被甲基转移酶识别和甲基化的序列，比如CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶)。在一些实施方式中，甲基化位点包括dcm、dam和/或CpG甲基化位点。
在一些实施方式中，结合共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶选自由下述组成的组中：AcuI、AlwI、BaeI、BbsI、BbvI、BccI、BceAI、BcgI、BciVI、BcoDI、BfuAI、BmrI、BpmI、BpuEI、BsaI、BsaXI、BseRI、BsgI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BspCNI、BspMI、BspQI、BsrDI、BsrI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、CspCI、EarI、Eciga、FII、HII、HpyAV、MboII、MlyI、MmeI、MnII、NmeAIII、PleI、SapI和SfaNI。在一些实施方式中，结合共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶为选自由下述组成的组中的甲基化敏感性限制性内切核酸酶：AlwI、BceAI、BcgI、BcoDI、BfuAI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BtgZI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MboII、MmeI、PleI、SapI和SfaNI。甲基化敏感性限制性内切核酸酶将不切割对应于甲基化识别位点的切割位点。
在一些实施方式中，至少一个IIS型限制酶切位点位于骨架组分的选择标记和/或复制起点内或侧翼。
在一些实施方式中，骨架组分包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或大于10个IIS型限制酶切位点。在一些实施方式中，骨架组分的至少2个IIS型限制酶切位点包括共同识别位点。在一些实施方式中，骨架组分的至少2个共同识别位点中的每一个在甲基化位点侧翼。
在一些实施方式中，骨架组分中的至少一个IIS型限制酶切位点(例如，对应于共同识别位点的切割位点)的切割位点包括低连接效率序列内容。例如，在一些实施方式中，低连接效率序列包括平末端切割位点。在其他实施方式中，低连接效率序列包括两个或更少核苷酸的突出端。低效率连接序列的其他示例是本领域已知的并且包括但不限于TNNA、TTTT和AAAA。参见例如Potapov V.等人，A single-molecule sequencing assay for thecomprehensive profiling of T4 DNA ligase fidelity and bias during DNA end-joining.Nucleic Acids Res.2018年7月27日；46(13):e79；Vladimir P.等人，Optimization of Golden Gate assembly through application of ligationsequence-dependent fidelity and bias profiling.BioRxiv.2018年5月15日；doi10.1101/322297，其整体并入本文。
如本文使用的，术语“插入位点组分”指包括5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点的多核酸(参见例如图1)。如本文使用的，术语“双限制酶切位点”指包括一对向内面向的IIS型限制酶切位点的核酸序列(即，对应于每个识别位点——第一识别位点和第二识别位点的切割位点都位于两个识别位点之间)。在一些实施方式中，3’IIS型双限制酶切位点的核酸序列是5’IIS型双限制酶切位点的反向补体，一个或多个切割位点的核酸序列除外。例如，在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点的核酸序列是CCGGTCTCNNNNNNGAGACC(SEQ ID NO:1)，并且3’IIS型双限制酶切位点的核酸序列是GGTCTCNNNNNNGAGACCGG(SEQ ID NO:2)，其中N表示A、T、G或C。
在一些实施方式中，双限制酶切位点的第一识别位点和/或第二识别位点为共同识别位点。在一些实施方式中，双限制酶切位点的共同识别位点与甲基化位点重叠(即，被甲基转移酶识别并且甲基化的序列)。在一些实施方式中，甲基化位点包括dcm、dam和/或CpG甲基化位点。
在一些实施方式中，双限制酶切位点包括：(i)第一识别位点和对应的切割位点，其中第一识别位点与形成插入位点组分和骨架组分之间的边界的甲基化位点重叠，以及(ii)第二识别位点和对应的切割位点，其中第二识别位点缺少重叠的甲基化位点。
在一些实施方式中，双限制酶切位点的与第一识别位点对应的切割位点和与第二识别位点对应的切割位点彼此分开至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个核苷酸。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点或3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由至少一个核苷酸分开。在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由至少一个核苷酸彼此分开。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点以及3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由相同的核苷酸序列(即，一样的核苷酸序列)分开。
在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点以及3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点由不同的核苷酸序列分开。不同的核苷酸序列的一个或多个核苷酸的同一性可不同。在一些实施方式中，不同的核苷酸序列长度相同。在其他实施方式中，不同的核苷酸序列的长度不同。
在一些实施方式中，双限制酶切位点的与第一识别位点对应的切割位点和与第二识别位点对应的切割位点包括共享的切割位点(即，与第一识别位点结合的IIS型限制性内切核酸酶和与第二识别位点结合的IIS型限制性内切核酸酶切割相同的切割位点)。在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点或3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的酶切位点包括共享的切割位点。在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点的与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点包括共享的切割位点。
在一些实施方式中，与第一识别位点对应的切割位点和与第二识别位点对应的切割位点是相同的(即使不共享切割位点)。
在一些实施方式中，与第一识别位点对应的切割位点和与第二识别位点对应的切割位点的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，与第一识别位点对应的切割位点和与第二识别位点对应的切割位点的核苷酸长度不同。在一些实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点的与第一识别位点对应的切割位点和/或与第二识别位点对应的切割位点与3’IIS型双限制酶切位点的第一识别位点和/或第二识别位点的长度不同。
在一些实施方式中，插入位点组分的5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点由至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少2000个或至少5000个核苷酸分开。在一些实施方式中，将5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点分开的核酸序列包括反向选择标记(例如，sacB、rpsL(strA)、tatAR、pheS、thyA、lacY、lacZ、gata-1、ccdb、galK或ePheSA294G)。在一些实施方式中，反向选择标记是视觉读出标记或自杀盒(即，致死的反向选择标签)。在一些实施方式中，视觉读出标记选自由下述组成的组中：荧光蛋白或LacZ。在一些实施方式中，自杀盒包括ccdB的核酸序列。
在一些实施方式中，骨架组分中的至少一个IIS型限制酶切位点与插入组分中的至少一个IIS型限制酶切位点的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，与骨架组分中的共同识别位点对应的至少一个切割位点与来自与插入组分中的共同识别位点对应的至少一个切割位点的核苷酸序列不同。在一些实施方式中，与骨架组分中的共同识别位点对应的每个切割位点与来自与插入组分中的共同识别位点对应的每个切割位点的核苷酸序列不同。在一些实施方式中，与目的载体中的共同识别位点对应的每个切割位点是独特的。
在一些实施方式中，与目的载体中的甲基化位点重叠的每个共同识别位点的甲基化位点是相同的(即，与目的载体中的共同识别位点重叠的每个甲基化位点可被相同的甲基转移酶甲基化)。在一些实施方式中，与目的载体中的甲基化位点重叠的至少两个共同识别位点的甲基化位点是独特的(即，与目的载体中的共同识别位点重叠的至少两个甲基化位点被不同的甲基转移酶甲基化)。甲基转移酶的示例包括但不限于CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
图1提供了目的载体的一个实施方式的示意图。在该实施方式中，5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点各自包括与甲基化位点重叠的第一共同识别位点和第二共同识别位点。在该情况下，共同识别位点是BsaI的识别位点。BsaI限制酶切位点包括5’-GGTCTC-3’的识别位点和(N1)/(N5)(即5’-NNNNNN-3’，其中N表示A、T、G或C，并且在切割时生成四碱基对的5’突出端)的切割位点。在该情况下，第一共同识别位点和第二共同识别位点的切割位点是共享的切割位点。本领域技术人员将理解，5’IIS型双限制酶切位点的共享的切割位点的核酸序列和3’IIS型双限制酶切位点的共享的切割位点的核酸序列可彼此不同。本领域技术人员还将理解，BsaI共同识别位点(及其对应的切割位点)可被任何其他IIS型限制性内切核酸酶识别位点替换。而且，本领域技术人员将理解，5’IIS型双限制酶切位点和/或3’IIS型双限制酶切位点的第一共同识别位点的切割位点和第二共同识别位点的切割位点不必是共享的切割位点。另外，该实施方式描绘了与BsaI识别位点重叠的MspI甲基化位点。本领域技术人员将理解，MspI甲基化位点可被本领域已知的任何其他甲基化位点替换。
在一些实施方式中，当甲基化时，将目的载体暴露于识别目的载体的共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶，生成至少两个多聚核酸片段，其中包括骨架组分的片段的5’端核酸突出端或3’端核酸突出端的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，当未甲基化时，将目的载体暴露于识别目的载体的共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶生成至少三个多核酸片段，其中每个多核酸包括5’端核酸突出端或3’端核酸突出端，并且其中包括5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点二者的第二共同识别序列的片段的5’端核酸突出端或3’端核酸突出端的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，多核酸目的载体包括骨架组分和插入位点组分，其中：(a)骨架组分包括选择标记的核酸序列、复制起点以及包括共同识别位点和对应的切割位点的至少一个IIS型限制酶切位点，其中共同识别位点与甲基化位点重叠；和(b)插入位点组分包括5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点，任选地，其中5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点由至少一个核苷酸分开；其中每个IIS型双限制酶切位点包括：(i)第一共同识别位点和对应的切割位点，其中第一共同识别位点与形成插入位点组分和骨架组分之间的边界的甲基化位点重叠，以及(ii)第二共同识别位点和对应的切割位点，其中第二识别位点缺少重叠的甲基化位点，其中与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点二者都位于第一共同识别位点和第二共同识别位点之间，其中：在与甲基化位点重叠的共同识别位点处的目的载体的甲基化阻碍与该共同识别位点对应的切割位点的切割；当甲基化时，将目的载体暴露于识别目的载体的共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶，生成两个多核酸片段，其中包括骨架组分的片段的5’端核酸突出端或3’端核酸突出端的核苷酸序列不同；并且(a)中的IIS型切割位点与(b)中的IIS型切割位点的核苷酸序列不同。
进入载体和组合物
在一些方面中，本公开涉及进入载体多核酸包括进入载体多核酸和包括的组合物。在一些实施方式中，进入载体为线性载体。在其他实施方式中，进入载体为环状载体。进入载体包括骨架成分(如上面在“目的载体和组合物”中描述的)和插入组分。
如本文使用的，术语“插入序列组分”指包括第一IIS型限制酶切位点、插入序列和第二IIS型限制酶切位点的多核酸(参见例如图2)。如本文使用的，术语“插入序列”指侧翼为第一IIS型限制酶切位点和第二IIS型限制酶切位点的核酸序列。插入序列的核苷酸长度可不同。例如，插入序列的长度可为至少20个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少5000个、至少10,000个或至少20,000个核苷酸。
在一些实施方式中，插入组分的第一IIS型限制酶切位点和第二IIS型限制酶切位点是向内面向的(即，与第一识别位点和第二识别位点对应的切割位点位于两个识别位点之间)。在一些实施方式中，第一IIS型限制酶切位点的识别位点和第二IIS型限制酶切位点的识别位点都是共同识别位点。
在一些实施方式中，插入组分的第一IIS型限制酶切位点的切割位点和插入组分的第二IIS型限制酶切位点的切割位点的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，除了切割位点的序列之外，第一限制酶切位点的核酸序列是第二限制酶切位点的反向互补序列。例如，在一些实施方式中，第一IIS型限制酶切位点的核酸序列是CCGGTCTCNNNNNN(SEQ ID NO:3)，并且第二IIS型限制酶切位点的核酸序列是NNNNNNGAGACCGG(SEQ ID NO:4)，其中N表示A、T、G或C。
在一些实施方式中，进入载体的骨架成分中的至少一个IIS型限制酶切位点与进入载体的插入组分中的至少一个IIS型限制酶切位点的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，与骨架组分中的共同识别位点对应的至少一个切割位点和与插入组分中的共同识别位点对应的至少一个切割位点的核苷酸序列不同。在一些实施方式中，与骨架组分中的共同识别位点对应的每个切割位点和与插入组分中的共同识别位点对应的每个切割位点的核苷酸序列不同。在一些实施方式中，与共同识别位点对应的每个切割位点是独特的。
在一些实施方式中，与进入载体中的甲基化位点重叠的每个共同识别位点的甲基化位点是相同的(即，与目的载体中的共同识别位点重叠的每个甲基化位点可被相同的甲基转移酶甲基化)。在一些实施方式中，与进入载体中的甲基化位点重叠的至少两个共同识别位点的甲基化位点是独特的(即，与目的载体中的共同识别位点重叠的至少两个甲基化位点被不同的甲基转移酶甲基化)。
在一些实施方式中，进入载体在与甲基化位点重叠的共同识别位点处的甲基化阻碍与该共同识别位点对应的切割位点的切割。
在一些实施方式中，当未甲基化时，进入载体暴露于识别进入载体的共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶生成至少两个多核酸片段，其中每个多核酸片段包括5’端核酸突出端或3’端核酸突出端，并且其中至少两个多核酸片段中的一个包括进入载体的插入序列。在一些实施方式中，包括插入序列的多核酸片段的5’突出端或3’突出端的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，多核酸进入载体包括骨架组分和插入组分，其中(a)骨架组分包括如本文公开的多核酸目的载体的骨架组分；并且(b)插入组分从5’至3’包括第一IIS型限制酶切位点、插入序列和第二IIS型限制酶切位点；其中第一IIS型限制酶切位点和第二IIS型限制酶切位点各自包括：(i)与甲基化位点重叠的共同识别位点，其中甲基化位点形成插入组分和骨架组分之间的边界，以及(ii)对应的切割位点，其中第一IIS型限制酶切位点和第二IIS型限制酶切位点的切割位点的切割生成5’突出端或3’突出端，其中第一IIS型限制酶切位点的5’突出端或3’突出端和第二IIS型限制酶切位点的5’突出端或3’突出端的核苷酸序列彼此不同。
图2提供了进入载体的一个实施方式的示意图。在该实施方式中，第一IIS型限制酶切位点和第二IIS型双限制酶切位点各自包括与甲基化位点重叠的共同识别位点。在该情况下，共同识别位点是BsaI的识别位点。BsaI限制酶切位点包括5’-GGTCTC-3’的识别位点和(N1)/(N5)(即5’-NNNNNN-3’，其中N表示A、T、G或C，并且在切割时生成四碱基对的5’突出端)的切割位点。本领域技术人员将理解，BsaI共同识别位点(及其对应的切割位点)可被任何其他的IIS型限制性内切核酸酶识别位点替换。而且，本领域技术人员将理解，第一IIS型限制酶切位点的切割位点和第二IIS型限制酶切位点的切割位点不必相同。另外，该实施方式描绘了与BsaI识别位点重叠的MspI甲基化位点。本领域技术人员将理解，MspI甲基化位点可被本领域已知的任何数量的甲基化位点替换。
用于组装具有预定序列的多核酸的试剂盒的组合物
在一些方面中，本公开涉及用于组装具有预定序列的多核酸的试剂盒的组合物。在一些实施方式中，试剂盒包括目的载体的套件，如上面在“目的载体和组合物”中描述，其中：(i)目的载体的套件中的每个目的载体的5’型IIS双限制酶切位点与第一个共同识别位点对应的切割位点和3’IIS型双限制酶切位点的与第一个识别位点对应的切割位点的核苷酸序列不同；(ii)目的载体的套件中的至少一个目的载体的5’IIS型双限制酶切位点的切割位点与目的载体的套件中的至少一个其他目的载体的3’IIS型双限制酶切位点相同；并且(iii)目的载体的套件中的至少一个目的载体的3’IIS型双限制酶切位点的切割位点与目的载体的套件中的至少一个其他目的载体的5’IIS型双限制酶切位点相同。
在一些实施方式中，目的载体的套件中的每个目的载体包括骨架组分和插入位点组分，其中：(a)骨架组分包括选择标记的核酸序列、复制起点以及包括共同识别位点和对应的切割位点的至少一个IIS型限制酶切位点，其中共同识别位点与甲基化位点重叠；并且(b)插入位点组分包括5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点，任选地，其中5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点由至少一个核苷酸分开；其中每个IIS型双限制酶切位点包括：(i)第一共同识别位点和对应的切割位点，其中第一共同识别位点与形成插入位点组分和骨架组分之间的边界的甲基化位点重叠，以及(ii)第二共同识别位点和对应的切割位点，其中第二识别位点缺少重叠的甲基化位点，其中与第一共同识别位点对应的切割位点和与第二共同识别位点对应的切割位点二者都位于第一共同识别位点和第二共同识别位点之间，其中：在与甲基化位点重叠的共同识别位点处的目的载体的甲基化阻碍与该共同识别位点对应的切割位点的切割；当甲基化时，将目的载体暴露于识别目的载体的共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶，生成两个多核酸片段，其中包括骨架组分的片段的5’端核酸突出端或3’端核酸突出端的核苷酸序列不同；并且(a)中的IIS型切割位点与(b)中的IIS型切割位点的核苷酸序列不同。
在一些实施方式中，目的载体的套件包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个或大于50个不同的目的载体。在一些实施方式中，目的载体的套件中的每个目的载体包括相同的骨架组分。在一些实施方式中，目的载体的套件中的至少一个目的载体包括独特的骨架组分。
在一些实施方式中，试剂盒进一步包括至少一种反应缓冲液(例如，消化缓冲液、连接酶缓冲液、甲基转移酶缓冲液和/或通用缓冲液)、至少一种IIS型限制性内切核酸酶(例如，AlwI、BbsI、BceAI、BcgI、BcoDI、BfuAI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BtgZI、EarI、EciI、Esp3I、FauI、FokI、HgaI、HphI、HpyAV、MboII、MmeI、PleI、SapI、SfaNI和/或其功能变体)、至少一种甲基转移酶(例如，CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶、TaqI甲基转移酶和/或其功能变体)、至少一种连接酶(例如，T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、taq DNA连接酶和/或其功能变体)，和/或至少一种感受态细胞的制剂。
在一些实施方式中，试剂盒包括至少两种感受态细胞的制剂，其中至少一种感受态细胞的制剂包括表达能够在与共同识别位点重叠的甲基化位点处将目的载体甲基化的甲基转移酶的细胞，并且其中至少一种感受态细胞的制剂包括不能在与共同识别位点重叠的甲基化位点处将目的载体甲基化的细胞。在一些实施方式中，感受态细胞是原核细胞。在一些实施方式中，感受态细胞是真核细胞。
组装具有预定序列的多核酸的方法
在一些方面中，本公开涉及组装具有预定序列的多核酸的方法。在一些实施方式中，组装具有预定序列的多核酸的方法包括形成第一反应混合物，其中第一反应混合物包括至少两种多核酸和IIS型限制性内切核酸酶，其中第一反应混合物的形成使得生成包括5’突出端或3’突出端的至少两种多核酸切割产物，并且其中所述至少两种多核酸切割产物一起包括具有预定序列的多核酸。在一些实施方式中，方法进一步包括形成第二反应混合物，其中第二反应混合物包括至少两种多核酸切割产物和连接酶，其中至少两种多核酸切割产物的5’突出端或3’突出端唯一地彼此互补，以便通过连接形成预定序列。
在一些实施方式中，顺序形成第一反应混合物和第二反应混合物(即，首先形成包括IIS型限制性内切核酸酶的反应混合物，然后形成包括连接酶的反应混合物)。在一些实施方式中，在形成第二反应混合物之前纯化至少两种多核酸切割产物。在一些实施方式中，第一反应混合物和第二反应混合物相同(即，目的载体和进入载体的切割和连接发生在单个反应体积中)。
在一些实施方式中，第一反应混合物的至少两种多核酸包括如上面在“目的载体和组合物”中描述的目的载体，和如上面在“进入载体和组合物”中描述的至少一个进入载体。例如，在一些实施方式中，方法包括：(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)目的载体，其中目的载体的骨架组分和插入位点组分二者的甲基化位点被甲基化；(ii)至少一个进入载体，其中至少一个进入载体中的每一个的骨架组分和插入组分的甲基化位点是未甲基化的；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中IIS型限制性内切核酸酶识别目的载体和进入载体的共同识别位点；和(iv)连接酶；(b)将反应混合物孵育足够用于目的载体和至少一个进入载体的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；和(c)将反应混合物孵育的足够用于使连接酶将至少一个进入载体中的每一个的插入序列连接到目的载体的骨架组分中的时间，从而生成环状多核酸；并且其中目的载体的骨架组分的5’突出端或3’突出端和至少一个进入载体中的每一个的插入组分唯一地彼此互补，以便形成包括步骤(a)(i)目的载体的骨架组分和步骤(a)(ii)的至少一个进入载体中的每一个的插入组分的预定序列。
在一些实施方式中，第一反应混合物包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或大于10个进入载体。
在一些实施方式中，目的载体在体外被甲基化(例如，通过形成包括目的载体和甲基转移酶的反应混合物并且将反应混合物孵育足够使甲基转移酶将目的载体甲基化时间)。在其他实施方式中，目的载体在体内被甲基化。例如，在一些实施方式中，目的载体在表达的甲基转移酶的细菌菌株中被甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在一些实施方式中，方法进一步包括将含有插入序列的连接目的载体与反应混合物的其他组分分离。在一些实施方式中，通过用第二反应混合物转化细菌并且筛选存在正确连接的组装体的细菌来分离连接的目的载体。
在一些实施方式中，方法进一步包括将分离的连接目的载体去甲基化，以生成第二进入载体。在一些实施方式中，分离的连接目的载体被动地被去甲基化。例如，目的载体可经体外扩增(例如，PCR)被动地去甲基化。可选地，目的载体可通过在缺乏甲基转移酶的细菌菌株中复制而在体内被动地去甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在一些实施方式中，目的载体的骨架和至少一个进入载体的骨架是相同的。在一些实施方式中，目的载体的骨架和每个进入载体的骨架是相同的。
图3提供了描绘一个实施方式的示意图，其中第一反应混合物的至少两种多核酸包括如上所述的目的载体和如上述的至少一个进入载体。本领域技术人员将理解，可通过使用不同的目的载体和/或进入载体来修改描绘的方法。
在其他实施方式中，第一反应混合物的至少两种多核酸包括如上面在“目的载体和组合物”中描述的目的载体，和至少一个多核酸片段(例如，PCR产物或其他合成的片段)。例如，在一些实施方式中，方法包括：(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)目的载体，其中骨架组分的甲基化位点是甲基化的；(ii)至少一个多核酸片段，其中每个多核酸片段包括在两个末端处侧翼为共同识别位点和对应的切割位点的内部序列；
(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中IIS型限制性内切核酸酶识别目的载体和至少一个多核酸片段的共同识别位点；和(iv)连接酶；(b)将反应混合物孵育足够用于目的载体和至少一个多核酸片段的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；和(c)将反应混合物孵育足够用于连接酶将至少一个多核酸片段中的每一个的插入序列连接到目的载体的骨架组分中的时间，从而生成环状多核酸；并且其中至少一个多核酸片段的内部序列包括感兴趣的核酸序列；并且其中目的载体的骨架组分的5’突出端或3’突出端和至少一个多核酸片段中的每一个的内部序列唯一地彼此互补，以便形成包括步骤(a)(i)的目的载体的骨架组分和感兴趣的核酸序列的预定序列。
在一些实施方式中，目的载体在体外被甲基化(例如，通过形成包括目的载体和甲基转移酶的反应混合物并且将反应混合物孵育足够用于甲基转移酶将目的载体甲基化的时间)。在其他实施方式中，目的载体在体内被甲基化。例如，在一些实施方式中，目的载体在表达的甲基转移酶的细菌菌株中被甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在一些实施方式中，方法进一步包括将含有插入序列的连接的目的载体与第二反应混合物的其他组分分离。在一些实施方式中，通过用第二反应混合物转化细胞(例如，细菌)并且筛选存在正确连接的组装体的细胞或细胞子代来分离连接的目的载体。
在一些实施方式中，方法进一步包括将分离的连接目的载体去甲基化，以生成第二进入载体。在一些实施方式中，分离的连接目的载体在缺乏甲基转移酶的细菌菌株中复制而在体内被动地去甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
在其他实施方式中，第一反应混合物的至少两种多核酸包括如上面在“进入载体和组合物”中描述的进入载体和多核酸片段(例如，PCR产物或其他合成的片段)。例如，在一些实施方式中，方法包括：(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)如本文公开的至少一个进入载体，其中骨架组分的甲基化位点是未甲基化的；(ii)多核酸片段，其中多核酸片段包括内部序列，所述内部序列在两个末端处侧翼为共同识别位点和对应的切割位点；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中IIS型限制性内切核酸酶识别至少一个进入载体和多核酸片段的共同识别位点；和(iv)连接酶；(b)将反应混合物孵育足够用于至少一个进入载体和多核酸片段的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；和(c)将反应混合物孵育足够用于连接酶将多核酸片段的内部核酸序列与至少一个进入载体中的每一个的插入组分连接的时间，从而生成环状多核酸；并且其中多核酸片段的内部序列包括选择标记和复制起点；并且其中至少一个进入载体中的每一个的插入组分的5’突出端或3’突出端和至少一个多核酸片段的内部序列彼此唯一地互补，以便形成包括感兴趣的核酸序列的预定序列。
在一些实施方式中，第一反应混合物包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或大于10个的进入载体。
在一些实施方式中，每个进入载体的骨架是相同的。
在一些实施方式中，多核酸片段包括如上述的目的载体或进入载体的骨架组分的序列。在一些实施方式中，多核酸片段在体外被甲基化。
在一些实施方式中，预定序列进一步包括进入载体的序列。
其他实施方式
本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可被用于相同、等效或类似目的的可选特征替换。因此，除非另外明确地叙述，否则公开的每个特征仅是等效或类似特征的通用系列的示例。
从上面的描述中，本领域技术人员可容易地确定本公开的本质特征，并且在不背离本公开的精神和范围的情况下，可对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方式也在权利要求内。
等效方案
尽管本文已经描述和阐释了数个发明实施方式，但是本领域技术人员将容易地想到用于进行本文描述的功能和/或获得结果和/或一个或多个优势的各种其他手段和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个被认为在本文描述的发明实施方式的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、维度、材料和配置旨在是示例性的并且实际的参数、维度、材料和/或配置将取决于具体的应用或使用本发明教导的应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的具体发明实施方式的许多等效方案。因此，应理解，前述实施方式仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效方案的范围内，可以不同于具体描述和权利要求保护的方式来实践本发明的实施方式。本公开的发明实施方式涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，两个或多个此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果此类特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则包括在本公开的发明范围内。
相比字典定义、通过引用并入的文档中的定义和/或定义术语的普通含义，应理解以本文定义和使用的所有定义为准。
在本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都通过引用的方式并入每个被引用的主题，在一些情况下可囊括整个文档。
在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一个(an)”，除非明确指出相反指示，否则应理解为“至少一个”。
说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意思是如此结合的要素中的“一个或两个”，即，在一些情况下结合出现而在其他情况下分开出现的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即“一个或多个”这样连接的要素。除了由“和/或”从句具体标识的要素之外，可任选地存在其他要素，无论是否与那些具体标识的要素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，当与开放式语言，比如“包括”结合使用时，提及“A和/或B”可在一个实施方式中仅指A(任选包括除B之外的要素)；在另一实施方式中，仅指B(任选包括除A之外的要素)；在仍另一实施方式中，指A和B二者(任选包括其他要素)；等等。
如本文在说明书和权利要求中使用的，“或”应理解为与如上面定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即包括至少一个，而且也包括许多要素或要素的列表中的多个要素，并且，任选地，包括另外未列出的项目。只有明确指出相反的术语，例如“仅……中的一个”或“就……中的一个”，或当在权利要求中使用时，“由……组成”将指就包括多个要素或一列要素中的一个要素。一般而言，本文使用的术语“或”当在排他性术语，比如“要么”，“……中的一个”，“仅……中的一个”或“就……中的一个”之前时，仅应解释为表示排他性的可选方案(即“一个或另一个但不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有专利法领域中的普通含义。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意思是选自要素列表中的任何一个或多个要素中的至少一个要素，但是不必包括要素列表中具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表中具体标识的要素之外的要素可任选地存在，无论与那些具体标识的要素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方式中，可指至少一个，任选地包括大于一个A，而没有B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方式中，可指至少一个，任选地包括大于一个B，而没有A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又另一实施方式中，可指至少一个，任选地包括大于一个A，和至少一个，任选地包括大于一个B(和任选地包括其他要素)；等等。
还应该理解，除非明确地相反指出，否则在本文要求保护的任何方法中，包括大于一个步骤或动作，方法的步骤或动作的顺序不必限于叙述的方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及上面的说明书中，所有的过渡短语，例如“包括(comprising)”、“包括(including)”、“携带(carrying)”、“具有(having)”、“包含(containing)”、“涉及(involving)”、“持有(holding)”、“由……组成(composed of)”等应被理解为是开放式的，即意思是包括但不限于。如在美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭式或半封闭式的过渡短语。应理解，在可选的实施方式中，本文档中使用开放式过渡短语(例如，“包括”)描述的实施方式也考虑为“由开放式过渡短语描述的特征组成”和“基本上由开放式过渡短语描述的特征组成”。例如，如果本公开描述了“包括A和B的组合物”，则本公开还考虑“由A和B组成的组合物”和“基本上由A和B组成的组合物”的可选的实施方式。

Claims (39)

1.一种包括骨架组分和插入位点组分的多核酸目的载体，其中：
(a)所述骨架组分包括选择标记的核酸序列、复制起点以及包括共同识别位点和对应的切割位点的至少一个IIS型限制酶切位点，其中所述共同识别位点与甲基化位点重叠；和
(b)所述插入位点组分包括5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点，任选地，其中所述5’IIS型双限制酶切位点和所述3’IIS型双限制酶切位点由至少一个核苷酸分开；其中每个IIS型双限制酶切位点包括：(i)第一共同识别位点和对应的切割位点，其中所述第一共同识别位点与形成所述插入位点组分和所述骨架组分之间的边界的甲基化位点重叠，和(ii)第二共同识别位点和对应的切割位点，其中所述第二识别位点缺少重叠的甲基化位点，其中与所述第一共同识别位点对应的所述切割位点和与所述第二共同识别位点对应的所述切割位点二者都位于所述第一共同识别位点和所述第二共同识别位点之间，其中：
在与甲基化位点重叠的共同识别位点处的所述目的载体的甲基化阻碍与所述共同识别位点对应的所述切割位点的切割；
当甲基化时，将所述目的载体暴露于识别所述目的载体的所述共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶，生成两个多核酸片段，其中包括所述骨架组分的片段的5’端核酸突出端或3’端核酸突出端的核苷酸序列不同；并且
(a)中的所述IIS型切割位点与(b)中的所述IIS型切割位点的核苷酸序列不同。
2.根据权利要求1所述的目的载体，其中所述5’IIS型双限制酶切位点或所述3’IIS型双限制酶切位点的与所述第一共同识别位点对应的切割位点和与所述第二共同识别位点对应的切割位点通过至少一个核苷酸彼此分开。
3.根据权利要求1所述的目的载体，其中所述5’IIS型双限制酶切位点和所述3’IIS型双限制酶切位点的与所述第一共同识别位点对应的所述切割位点和与所述第二共同识别位点对应的所述切割位点通过至少一个核苷酸彼此分开。
4.根据权利要求3所述的目的载体，其中所述5’IIS型双限制酶切位点的与所述第一共同识别位点对应的所述切割位点和与所述第二共同识别位点对应的所述切割位点以及所述3’IIS型双限制酶切位点的与所述第一共同识别位点对应的所述切割位点和与所述第二共同识别位点对应的所述切割位点通过不同的核苷酸序列彼此分开。
5.根据权利要求3所述的目的载体，其中所述不同的核苷酸序列包括不同的核酸长度。
6.根据权利要求3所述的目的载体，其中所述5’IIS型双限制酶切位点的与所述第一共同识别位点对应的所述切割位点和与所述第二共同识别位点对应的所述切割位点以及所述3’IIS型双限制酶切位点的与所述第一共同识别位点对应的所述切割位点和与所述第二共同识别位点对应的所述切割位点通过相同的核苷酸序列彼此分开。
7.根据权利要求1所述的目的载体，其中所述5’IIS型双限制酶切位点和/或所述3’IIS型双限制酶切位点的与所述第一共同识别位点对应的所述切割位点和与所述第二共同识别位点对应的所述切割位点为共享的切割位点。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的目的载体，其中所述5’IIS型双限制酶切位点和3’IIS型双限制酶切位点通过编码视觉读出标记或自杀盒的核酸序列分开。
9.根据权利要求8所述的目的载体，其中所述视觉读出标记选自由下述组成的组中：荧光蛋白、显色蛋白、LacZ或LacZα。
10.根据权利要求8所述的目的载体，其中所述自杀盒包括ccdB的核酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的目的载体，其中结合所述共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶选自由下述组成的组中：BsaI、BsmBI、BtgZI、Esp3I、FokI、HphI、BcgI、AlwI、MboII、MmeI、BsmFI、BceAI、BcoDI、BfuAI、BsmAI、EarI、EciI、FauI、HgaI、HpyAV、PleI、BbsI、SapI和SfaNI。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的目的载体，其中(a)的所述骨架组分中的至少一个IIS型限制酶切位点位于所述选择标记或所述复制起点内或侧翼。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的目的载体，其中(a)的所述骨架组分中的至少一个IIS型限制酶切位点的所述切割位点包括低连接效率序列内容。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的目的载体，其中所述选择标记包括抗生素抗性基因。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的目的载体，其中(a)和(b)的所述甲基化位点由相同的甲基转移酶甲基化。
16.根据权利要求15所述的目的载体，其中所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的目的载体，其中当未甲基化时，将所述目的载体暴露于识别所述目的载体的所述共同识别位点的IIS型限制性内切核酸酶生成至少三个多核酸片段，其中每个多核酸包括5’端核酸突出端或3’端核酸突出端，并且其中包括所述5’IIS型双限制酶切位点和所述3’IIS型双限制酶切位点二者的所述第二共同识别序列的片段的所述5’端核酸突出端或所述3’端核酸突出端的核苷酸序列不同。
18.一种包括骨架组分和插入组分的多核酸进入载体，其中，
(a)所述骨架组分包括根据权利要求1-17中任一项所述的多核酸目的载体的所述骨架组分；和
(b)所述插入组分从5’至3’包括第一IIS型限制酶切位点、插入序列和第二IIS型限制酶切位点；其中所述第一IIS型限制酶切位点和所述第二IIS型限制酶切位点各自包括：(i)与甲基化位点重叠的共同识别位点，其中所述甲基化位点形成所述插入组分和所述骨架组分之间的边界，和(ii)对应的切割位点，其中所述第一IIS型限制酶切位点和所述第二IIS型限制酶切位点的所述切割位点的切割生成5’突出端或3’突出端，其中所述第一IIS型限制酶切位点的所述5’突出端或所述3’突出端和所述第二IIS型限制酶切位点的所述5’突出端或所述3’突出端的核苷酸序列彼此不同。
19.根据权利要求18所述的进入载体，其中所述插入序列是在组装反应中组合的核酸序列。
20.一种用于将多核酸组装成预定序列的方法，所述方法包括：
(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)根据权利要求1-17中任一项所述的目的载体，其中所述目的载体的所述骨架组分和所述插入位点组分二者的所述甲基化位点都被甲基化；(ii)至少一种根据权利要求18-19中任一项所述的进入载体，其中所述至少一个进入载体中的每一个的所述骨架组分和所述插入组分的所述甲基化位点是未甲基化的；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中所述IIS型限制性内切核酸酶识别所述目的载体和进入载体的所述共同识别位点；和(iv)连接酶；
(b)将所述反应混合物孵育足够用于所述目的载体和所述至少一个进入载体的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；
(c)将所述反应混合物孵育足够用于使所述连接酶将所述至少一个进入载体中的每一个的所述插入序列连接到所述目的载体的所述骨架组分中的时间，从而生成环状多核酸；并且
其中所述目的载体的所述骨架组分的所述5’突出端或所述3’突出端和所述至少一个进入载体中的每一个的所述插入组分唯一地彼此互补，以便形成包括步骤(a)(i)的所述目的载体的所述骨架组分和步骤(a)(ii)的所述至少一个进入载体中的每一个的所述插入组分的预定序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述目的载体在体外被甲基化。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述目的载体在体内被甲基化。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述目的载体在表达甲基转移酶的细菌菌株中被甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，进一步包括将含有所述插入序列的连接的目的载体与所述反应混合物的其他组分分离。
25.根据权利要求24所述的方法，其中通过用所述反应混合物转化细菌并且筛选存在正确连接的组装的所述细菌来分离所述连接的目的载体。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，进一步包括将分离的连接的目的载体去甲基化，以生成第二进入载体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述分离的连接的目的载体通过在缺乏甲基转移酶的细菌菌株中的复制被动地去甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
28.一种克隆感兴趣的核酸序列的方法，所述方法包括：
(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)根据权利要求1-17中任一项所述的目的载体，其中所述骨架组分的所述甲基化位点是甲基化的；(ii)至少一个多核酸片段，其中每个多核酸片段包括内部序列，所述内部序列在两个末端处侧翼为共同识别位点和对应的切割位点；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中所述IIS型限制性内切核酸酶识别所述目的载体和所述至少一个多核酸片段的共同识别位点；和(iv)连接酶；
(b)将所述反应混合物孵育足够用于所述目的载体和所述至少一个多核酸片段的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；
(c)将所述反应混合物孵育足够用于所述连接酶将所述至少一个多核酸片段中的每一个的所述内部核酸序列连接到所述目的载体的所述骨架组分中的时间，从而生成环状多核酸；并且
其中所述至少一个多核酸片段的所述内部序列包括感兴趣的核酸序列；并且
其中所述目的载体的所述骨架组分的5’突出端或3’突出端和所述至少一个多核酸片段中的每一个的所述内部序列彼此唯一地互补，以便形成预定序列，所述预定序列包括步骤(a)(i)的所述目的载体的所述骨架组分和所述感兴趣的核酸序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述目的载体在体外被甲基化。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述目的载体在体内被甲基化。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述目的载体在表达甲基转移酶的细菌菌株中被甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，进一步包括将含有所述预定序列的所述连接的目的载体与所述反应混合物的所述其他组分分离。
33.根据权利要求32所述的方法，其中通过用所述反应混合物转化细菌并且筛选存在正确连接的组装的所述细菌来分离所述连接的目的载体。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，进一步包括将分离的连接的目的载体去甲基化，以生成第二进入载体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述分离的连接的目的载体通过在缺乏甲基转移酶的细菌菌株中的复制在体内被动地去甲基化，所述甲基转移酶选自由下述组成的组中：CpG甲基转移酶(任选M.SssI)、dam甲基转移酶、dcm甲基转移酶、GpC甲基转移酶(任选M.CviPI)、AluI甲基转移酶、BamHI甲基转移酶、EcoRI甲基转移酶、HaeIII甲基转移酶、HhaI甲基转移酶、HpaII甲基转移酶、MspI甲基转移酶和TaqI甲基转移酶。
36.一种克隆感兴趣的核酸序列的方法，所述方法包括：
(a)通过将下述组合形成反应混合物：(i)至少一种根据权利要求1-2中任一项所述的进入载体，其中所述骨架组分的所述甲基化位点是未甲基化的；(ii)多核酸片段，其中所述多核酸片段包括内部序列，所述内部序列在两个末端处侧翼为共同识别位点和对应的切割位点；(iii)IIS型限制性内切核酸酶，其中所述IIS型限制性内切核酸酶识别所述至少一个进入载体和所述多核酸片段的共同识别位点；和(iv)连接酶；
(b)将所述反应混合物孵育足够用于所述至少一个进入载体和所述多核酸片段的IIS型限制性内切核酸酶介导的切割的时间；
(c)将所述反应混合物孵育足够用于所述连接酶将所述多核酸片段的所述内部核酸序列与所述至少一个进入载体中的每一个的所述插入组分连接的时间，从而生成环状多核酸；并且
其中所述多核酸片段的所述内部序列包括选择标记和复制起点；并且
其中所述至少一个进入载体中的每一个的所述插入组分的5’突出端或3’突出端和所述至少一个多核酸片段的所述内部序列彼此唯一地互补，以便形成包括所述感兴趣的核酸序列的预定序列。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述多核酸片段是PCR产物。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述多核酸片段在体外被甲基化。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述预定序列进一步包括进入载体的序列。
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