CN113543821A - 包含碱性磷酸酶的血液处理装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种血液处理装置，其被配置成在体外血液回路中对有需要的患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化，其中，所述装置包括其上固定有碱性磷酸酶(AP)的基质。本发明还涉及包括本发明的血液处理装置的体外血液回路和血液处理装置作为药物的用途或治疗感染、优选血液或全身感染如败血症的方法，和/或用于治疗败血症相关的急性肾损伤(AKI)。

Description

包含碱性磷酸酶的血液处理装置

技术领域

本发明涉及患者血液的体外处理领域以及相关的滤血器(hemofilter)和吸附剂筒(adsorber cartridge)装置。特别地，本发明涉及碱性磷酸酶(AP)辅助的连续性肾脏替代疗法(APA-CRRT)以治疗败血症或败血症相关的急性肾损伤(AKI)。

因此，本发明涉及一种血液处理装置，其被配置成在体外血液回路中对有需要的患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化，其中，所述装置包括其上固定有碱性磷酸酶(AP)的基质(matrix)。本发明还涉及包括本发明的血液处理装置的体外血液回路和血液处理装置作为药物的用途或治疗感染、优选血液或全身感染如败血症的方法，和/或用于治疗败血症相关的急性肾损伤(AKI)。

背景技术

尽管使用了现代抗生素和复苏疗法，败血症仍是危重患者发病率和死亡率的主要原因之一。败血症的结果总体上有所改善，但死亡率仍然高得令人无法接受。败血症是美国最昂贵的医疗保健问题，花费超过200亿美元(Martin GS等人2000.N Engl J Med 2003；348:1546-54)。败血症是重症监护病房(ICU)中最常见的死亡原因之一，其发病率在过去10年中增加了两倍以上(Kumar G等人，Chest 2011；140：1223-31)。根据生存败血症运动(Surviving Sepsis Campaign)的数据，败血症死亡率在欧洲为41％，在美国为28.3％(Levy MM等人，Lancet Infect Dis 2012；12:919-24)。

急性肾损伤(AKI)或急性肾衰竭(ARF)是肾脏过滤功能的快速丧失，其特征是代谢性酸中毒、高钾水平和体液失衡。AKI发生在55～60％的危重患者中，并且败血症是最常见的潜在原因。AKI/ARF的总体死亡率约为45％，然而，败血症引起的ARF的死亡率约为70％(Acute Blood Purification,Suzuki和Hirasawa；Septic Acute Renal Failure,Mori等人，Contrib Nephrol.Basel,Karger，2010,vol 166,pp 40-46)。

败血性KI的血液净化疗法通常包括消除病原体，如导致AKI的内毒素或介质，以及肾脏替代疗法(RRT)。使用多粘菌素-B固定化纤维(PMX-DHP)通过直接血液灌注吸附内毒素可增加尿排出量，同时改善肾功能(Mori等人，2010)。然而，目前还没有建立治疗败血症相关的急性肾损伤(SA-AKI)的药物疗法；只有支持性肾脏替代疗法(RRT)可用。AKI与通过炎症、免疫失调和氧化损伤发生的微血管失调和细胞损伤的复杂级联有关。一系列针对参与这些途径的特定酶或分子的新型疗法正处于不同的发展阶段(Bajwa A.等人，Curr DrugTargets 2009:10:1196-1204)。尽管取得了这些进展，但仍迫切需要治疗AKI的手段。

临床开发中用于治疗或预防败血症相关的急性肾损伤(SA-AKI)的一种新候选药物是碱性磷酸酶(AP)。AP是一种去磷酸化、膜结合的内源性酶，通过内毒素的去磷酸化而发挥解毒作用，涉及败血症发病机制和其他促炎化合物，包括细胞外ATP。当脂质A分子磷酸化时，AP通过循环中脂多糖的去磷酸化在败血性AKI期间赋予肾脏保护作用，循环中脂多糖的去磷酸化会激活炎性途径。此外，AP将ATP转化为腺苷，这对肾小管细胞具有保护作用。在败血症中，线粒体释放大量ATP以响应细胞因子和缺氧。

以前，在患有或没有AKI的健康志愿者和败血症患者中进行的临床试验已经确定了纯化牛肠AP的耐受性和潜在功效(Pickkers P等人，Eur J Clin Pharmacol 2009；65:393-402；Heemskerk S等人，Crit Care Med 2009；37:417–23)；Pickkers P等人，CritCare 2012；16:R14)。在SA-AKI患者中，根据内源性肌酐清除率、肾脏替代治疗(RRT)的需求和RRT持续时间的综合终点，牛肠AP显著改善了肾功能。根据这些结果，人类重组AP已被开发为牛源AP的药学上可接受的替代品。为了提高酶稳定性，同时保持催化功能，人类肠道AP的冠域被人类胎盘AP的冠域取代(Kifer-Moreira T等人，PLoS ONE 2014；9：e89374)。

US 6290952还公开了包含AP的药物组合物，其适用于(全身)治疗由感染(包括败血症)引起的临床并发症。

不管在AKI治疗中给药AP的进展和临床潜力如何，AP在作为药剂给药于受试者时在其药代动力学方面表现出许多缺点。AP会迅速从血液中清除，导致4小时后仅约10％的初始给药活性存在。因此，AP必须反复给药，并且水平波动很大，在整个治疗过程中达到次优水平。考虑到上述困难，本领域非常需要开发AKI治疗的改进手段，以提供稳定的生理改善，而没有这种病症的药物治疗中明显的困难。

因此，本发明涉及一种血液处理装置，其包括固定有碱性磷酸酶(AP)的基质。之前已经描述了固定于固相的AP(EP3110977、WO2013012924、WO9955828和Chelpanova等人，Applied Biochemistry and Microbiology,vol.52,no.1,p.36-42,2016)。然而，在适用于治疗败血症或AKI的体外血液处理装置的背景下，尚未描述或建议固定化AP。

发明内容

鉴于现有技术，本发明根本的技术问题是提供用于治疗感染例如败血症和/或与其相关的肾衰竭的替代的和/或改进的机构。本发明的一个目的是提供用于感染或肾衰竭治疗的改进的或替代的机构，其提供稳定的生理学改善而没有这些病症的药理学治疗中明显的困难。本发明的一个目的是提供用于对有需要的患者的血液中的胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化的机构(means)。

本发明试图提供这样的机构，同时避免现有技术中已知的缺点。

该问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方式由从属权利要求提供。

因此，本发明涉及一种血液处理装置，其被配置成在体外血液回路中对有需要的患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化，其中，所述装置包括其上固定有碱性磷酸酶(AP)的基质。

在一种实施方式中，所述血液处理装置位于体外血液回路中，所述患者的血液通过该体外血液回路，并且该体外血液回路包括用于以限定的流速将血液从所述患者的血管系统输送到所述血液处理装置并且将处理过的血液回输给所述患者的机构。

在另一方面，本发明因此涉及患者的血液通过的体外血液回路，包括如本文所述的血液处理装置和用于以限定的流速将血液从患者的血管系统输送到血液处理装置，然后将处理过的血液回输给患者的机构。

将AP直接并入血液处理装置(如透析器或滤血器(膜))的主要优点是增加了固定化AP的稳定性，并且身体不会清除AP。AP作为药理学制剂的目前动力学涉及AP的快速清除和/或失活，导致AP活性在4小时后仅降低至初始给药活性的10％。通过将AP固定在体外血液处理装置内，活性剂的清除受到限制或消除，随着时间的推移没有活性损失或只有非常小的活性损失。

本文描述的方法的另一个显著优点是不需要任何额外的治疗或给药。通过将AP加入适合患者血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)的体外去磷酸化的血液处理装置中，RRT或其他透析一旦开始，治疗就会自动合并。患有肾衰竭的患者通常立即开始透析治疗以补偿衰竭的肾功能。这发生在大量败血症病例中，其中，治疗速度对于降低死亡风险至关重要。因此，本发明允许将活性剂并入已经为受试者启动的可能已经建立的RRT治疗中。

本发明与注射AP相比能够显著降低成本，因为结合到体外血液处理装置中所需的AP量与静脉注射相比要少得多，这是由于静脉内给药的AP的快速清除和连续多次给药的要求。

因此，血液处理装置中固定有AP的基质具有多种优势，包括：增加了有毒底物与AP接触持续的时间，避免了全身给药时AP从血液中快速清除，避免了AP在身体其他器官中的脱靶效应(因为使用体外系统将AP仅给药用于血液)，避免了额外治疗的必要性(因为AP治疗可以与RRT或其他透析的开始同时发生)，从而同时使毒性底物去磷酸化并且去除例如患有肾功能衰竭的患者的血液中的尿毒症毒素、过量离子和水，以及更快的治疗，这在败血症的背景下尤为重要(因为治疗速度对于避免死亡至关重要)。

如下实例所示，AP固定已实现用于多种基质类型，包括但不限于：PES/PVP膜、PES/PVP/马来酸酐膜、PES/PVP/壳聚糖膜、环氧官能化吸附树脂、氨基官能化吸附树脂和聚丙烯腈AN69膜。出乎意料的是，固定在所述基质上的AP显示出良好的活性，长时间冲洗后没有浸出或浸出可忽略不计，并且，无论是在缓冲液中还是在人血浆中，在与临床透析方法相关的延长时间范围内保持出色的稳定性。使用体外方法的优势与固定化AP出乎意料的良好酶特性的结合代表了优于现有技术的有益且令人惊讶的有效发展。

在一种实施方式中，所述血液处理装置是滤血器或透析器。

这样的实施方式提供了两种功能的组合并且可以有利地用作通过本文所述的体外血液回路对有需要的人的血液或血浆中的靶蛋白进行去磷酸化的装置，因为该装置同时对靶蛋白进行去磷酸化并且去除例如肾衰竭患者血液中的尿毒症毒素、过量离子和水。因此，仅需要一种装置来治疗患有感染或肾衰竭疾病的患者。因此，体外回路与用于在肾衰竭治疗中进行血液透析的标准体外回路没有根本区别。因此，显著简化了患有肾衰竭和感染(如败血症)的此类患者的治疗，并且可能有助于降低患者累积治疗的费用并且增加患者和主治医师的治疗选择。

在一种实施方式中，所述血液处理装置是包含中空纤维束的滤血器，并且所述碱性磷酸酶(AP)至少固定在管腔上，并且任选地，在所述束的中空纤维的孔上。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于：该装置的基质为中空纤维膜、纤维垫或平板膜，其由至少一种多糖衍生物或合成聚合物组成(其实例为下面提供)，AP固定在其上。

在一些实施方式中，AP也被固定到孔表面，尤其是在较大孔膜(如血浆分离膜或HCO膜)的情况下。

在一些实施方式中，血液处理装置通常可设计为中空纤维膜过滤器(滤血器)或透析器，其中，膜构成支撑物，AP(至少)结合在与血液接触的中空纤维的管腔侧的支持物上。该膜可以是：用于治疗肾衰竭的血液透析膜，其在其管腔侧额外地用所述AP功能化；或者血浆分离膜，其在其管腔侧或可选地在中空纤维的外侧和/或其孔隙也额外地用AP进行功能化。

本发明的一个目的是提供一种用于血液净化的滤血器或血液透析器，其可用于同时治疗患有感染(如败血症)或肾衰竭(如SA-AKI)的患者。由于这种组合方法，滤血器功能与AP治疗结合并可能协同作用，从而产生患者急需的RRT，并且同时治疗与感染性疾病如LPS有关的病因。

在一种实施方式中，该装置可以是用于治疗肾衰竭和感染的滤血器，其中，该过滤器在至少一个端盖中还包括树脂(例如海绵形式)或无纺布(用AP进行功能化)，以对感兴趣的靶标进行去磷酸化。感兴趣的靶标优选是细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和/或脂多糖(LPS)。

在一种实施方式中，血液处理装置是吸附剂筒。

在一种实施方式中，血液处理装置位于如本文所述的体外血液回路中，其中，该回路还包括位于吸附剂筒上游或下游的(单独的)滤血器。

在一种实施方式中，吸附剂筒包括其上固定有碱性磷酸酶(AP)的基质。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述基质包括结合AP的支撑物，其中，所述支撑物包括以下材料或由以下材料组成，该材料选自由中空纤维膜、平板膜、纤维垫、树脂、无纺布和开孔泡沫(如聚氨酯(PU)泡沫)所组成的组。

在一种实施方式中，本文所述的血液处理装置的特征在于，所述支撑物为树脂，并且该树脂由以下材料组成：选自由海藻酸盐、壳聚糖、甲壳素、胶原蛋白、角叉菜胶、明胶、纤维素、淀粉、果胶和琼脂糖所组成的组中的至少一种聚合物；选自由沸石、陶瓷、硅藻土、二氧化硅、玻璃、活性炭和木炭所组成的组中的无机材料；或合成聚合物，其实例在下面提供。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，所述支撑物是树脂，并且所述树脂由至少一种合成聚合物组成，其实例在下面提供。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于：该支撑物是无纺布，并且该无纺布由以下材料组成：选自由多糖、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)和蛋白质所组成的组中的至少一种生物聚合物，或选自由TiO₂、SiO₂或Al₂O₃组成的组中的至少一种无机材料，或至少一种合成聚合物，其实例在下面提供。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于，该血液处理装置是包括基质的吸附筒(adsorption cartridge)，AP固定在该基质上并且灌注有全血。

因此，该装置可以是或包括包含选自树脂或无纺布材料的基质的吸附筒，其中用AP功能化的任一种配置成对感兴趣的靶标(细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和/或脂多糖(LPS)，也称为靶蛋白)进行去磷酸化。这种装置可以是用于血液处理的体外回路的部件，其被配置成提供血液透析、血液透析滤过、血液滤过或血浆置换。

该装置可以是血液回路内的唯一血液处理装置，或者可以位于例如血液透析、血液透析滤过或血液滤过回路中的额外滤血器或透析器的上游或下游，或者可以替代地在血液入口或出口处立即连接到透析器，其中，该装置被配置成用全血灌注。该装置还可以是体外血浆置换回路的部件，其中，该装置灌注有血浆或其组分。

该装置还可以是混合过滤装置，其将中空纤维膜和过滤器的滤液空间中的基质组合在一起(WO 2014/079680 A1)，其中，所述基质优选包括用AP官能化的树脂。这种过滤器可以是被配置用于进行血液透析、血液透析滤过或血液滤过的体外回路的部件，其中，所述过滤器位于滤血器或透析器的上游或下游，用于血液透析、血液透析滤过或血液滤过，或者它在没有这种透析器的情况下可被用作所述回路内的唯一过滤装置。这种装置可与全血一起使用。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的特征在于体外血液回路，位于其中的血液处理装置还包括血浆透析器或者基于离心机的血浆分离系统，其允许从血液中分离血浆部分，并且其中，该血液处理装置位于血浆透析器的血浆出口的下游。在另一方面，本发明涉及包括如本文所述的血液处理装置的体外血液回路，其中，该体外血液回路包括用于以限定的流速将血液或血浆从患者的血管系统输送到血液处理装置的机构以及将处理过的血液或血浆回输给患者的机构。

本发明的活性剂是碱性磷酸酶(AP)。

AP以各种形式已知，每一种形式均不限制本发明。本文描述的装置的特征在于：其能够展示AP的功能，即，对有需要的患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化。特定类型的AP仅在实现所需功能的范围内受到限制。AP对醇、胺、焦磷酸盐和酚的磷酸酯具有广泛的特异性。它通常用于对蛋白质和核酸进行去磷酸化，并且已知可以使LPS、ATP和ADP去磷酸化。

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌外膜的一部分，其在严重感染(如败血症)期间观察到的炎性级联反应中起主要作用。LPS通过其模式识别受体Toll样受体4(TLR4)的信号传导诱导全身和肾脏炎症，模式识别受体Toll样受体4(TLR4)定位于免疫细胞和近端小管上皮细胞(PTEC)，导致上皮炎症、内皮炎症和缺氧。由于败血症的病理生理学复杂，其涉及全身性和肾脏炎症以及肾缺氧，想要有效，治疗应旨在靶向所有这些过程或这些过程的组合。碱性磷酸酶(AP)，一种去磷酸化酶，是一种发挥这种双重作用机制的分子。

AP可以解毒LPS，LPS由寡糖核心组分、多糖链和具有两个磷酸基团的有毒脂质A部分组成。AP去除这两个磷酸基团中的一个会产生无毒的LPS分子，该分子仍可与TLR4结合，但随后可作为拮抗剂。

AP的另一种保护机制是ATP的去磷酸化，ATP是例如由炎症和缺氧等诱导的细胞应激期间释放的内源性信号传导分子。排泄的ATP吸引吞噬细胞并激活血小板和NLRP3炎性体，进一步加剧炎症和组织损伤。在被外源性AP去磷酸化后，ATP产生ADP、AMP和腺苷，其中后者通过与四种腺苷受体A1、A2A、A2B和A3中的一者结合发挥肾脏保护和抗炎作用。AP可能促进ATP转化为ADP、AMP并最终转化为腺苷，从而增加腺苷水平并发挥其抗炎和组织保护作用。因此，AP对ADP的作用是有益的，因为相同的酶催化ATP转化为ADP，并进一步催化ADP转化为AMP和腺苷。

从上文可以明显看出，有需要的患者血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)的去磷酸化代表了对抗这些病理信号传导和细菌分子的负面影响的有效手段。

在一种实施方式中，碱性磷酸酶(AP)是牛肠碱性AP。

牛肠AP已被证明对受试者具有良好的耐受性，并且在各种临床环境中显示出潜在的疗效。在SA-AKI患者中，根据内源性肌酐清除率、肾脏替代治疗(RRT)的需求和RRT持续时间的综合终点测量结果，牛肠AP显著改善了肾功能。

在一种实施方式中，碱性磷酸酶(AP)是重组和/或嵌合形式的AP。

在一些实施方式中，如本文所述的重组AP被采用于本发明中。优选的AP变体对LPS表现出增强的稳定性和良好的选择性(Kifer-Moreira T等人，PLoS ONE 2014；9：e89374)。

对胎盘AP(PLAP)结构的早期研究揭示了具有两个活性Zn²⁺残基(Zn1和Zn2)的活性位点和由Mg²⁺占据的第三金属离子位点。虽然Zn2被埋在分子内，但Zn1很容易接近并且其反应性可以调节。Zn1和Zn2都与高度保守的氨基酸相协调，并且诱变研究揭示了残基E429在确定Zn1的亲和力、PLAP活性位点的稳定性和催化特性以及确定酶的整体热特性方面的主要作用。将具有关键E429残基的PLAP的表征良好的冠域引入人体肠道AP结构提高了酶稳定性，同时保留或增强所得嵌合酶的催化功能。与亲本人肠道AP同工酶相比，所产生的重组AP显示出大大增加的热稳定性、增加的Zn²⁺结合亲和力、增加的转磷酸化、更高的转换数和更窄的底物特异性，对细菌LPS具有相当的选择性(Kifer-Moreira T.等人，PLoS ONE 2014；9:e89374)。

本发明装置上的基质材料基本上可以是任何适合与人体血液接触并且可以固定AP的材料。

在一种实施方式中，碱性磷酸酶(AP)固定到其上的基质，优选中空纤维膜，包括或由以下组成：聚砜、聚(醚)砜(PES)和/或聚芳基(醚)砜(PAES)，以及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

在一种实施方式中，碱性磷酸酶(AP)固定到其上的基质，优选中空纤维膜，包括或由以下组成：具有选自壳聚糖和/或马来酸酐-1-十八碳烯(maleic anhydride-alt-1-octadecene)交替共聚物的添加剂的聚砜、PES和/或PAES，以及PVP。

因此，该装置是设计用于血液透析的中空纤维膜透析器，并且其中，血液透析器的中空纤维的管腔侧用碱性磷酸酶(AP)功能化。

根据本发明的一方面，所述血液透析器基于由聚合物和聚合物共混物制备的膜。膜材料(

除外)主要是疏水性的，因此与亲水性添加剂(如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或PEG)结合或与亲水性共聚物如甲基烯丙基磺酸盐一起处理。

根据本发明可使用的市售材料和透析器的实例包括例如下表所列的那些。由疏水/亲水聚合物共混物制备的膜是合成聚合物膜的主要类型。它们的疏水基材料是聚砜或聚醚砜(聚芳醚砜)，并且它们还包含亲水组分，其通常是PVP。聚醚砜和聚砜基膜含有少量水，并且与其他膜相比不含孔稳定剂。根据本发明，这些膜是特别合适的，含有聚丙烯腈的膜也是如此。

表：滤血器膜材料及制造商

根据本发明的一方面，使用聚砜/PVP膜。所有基于聚砜的透析膜都具有泡沫状支撑结构，其旨在实现特定的分离特性。泡沫状支撑结构的增加的液压阻力通过壁厚的减少而得到部分补偿。这种类型的膜的实例是例如上表中提到的那些，例如来自费森尤斯医疗的Helixone膜。

根据本发明的另一方面，使用聚醚砜/PVP/聚酰胺膜。所谓的Polyamix膜具有独特的不对称三层结构，其中，外层(被称为支撑层)的特征是：非常开放的手指状形态。该膜的实际内部分离层由被中间层支撑的极薄内皮组成。此中间层形成了一种非常具有渗透性的泡沫状结构。因此，确保了对流和扩散的低阻力。外层提供了高机械稳定性。

根据本发明的另一方面，使用聚醚砜/PVP或聚(芳基)醚砜膜。由聚醚砜和聚乙烯吡咯烷酮制成的大多数膜的特征在于：不对称结构、与血液接触的致密选择性内皮和支持性多孔外层。通过适当调整制膜参数，以及使用不同分子量的PVP，可以改善底层膜的理化性质、形态结构、溶质排斥行为和过滤性能。

聚砜/PVP基膜(包括由PES或PAES制造的膜)的制造可与其他中空纤维膜的制造相媲美，并且基本上是本领域已知的(参见，例如Boschetti-de-Fierro等人，MembraneInnovation in Dialysis,Ronco(ed):Expanded Hemodialysis-Innovative ClinicalApproach in Dialysis.Contrib Nephrol.Basel,Karger,2017,vol 191,pp 100-114)。对于优化应用，中空纤维膜的内径范围为170～220μm。合成聚合物膜具有25～55μm的壁厚。选择用于治疗患者的透析器的有效膜表面积必须根据患者的体型进行调整。儿科过滤器(适用于小患者)具有0.01～0.6m²的表面积，并且成人的标准过滤器具有1.0～2.4m²的表面积。

在一种实施方式中，碱性磷酸酶(AP)固定到其上的基质，优选中空纤维膜，包括或由以下组成：丙烯腈与甲代烯丙基磺酸钠的共聚物。

因此，血液净化装置优选地包括聚丙烯腈(PAN)膜，其包含i)丙烯腈与甲代烯丙基磺酸钠的共聚物，ii)聚乙烯亚胺，和iii)其上已经固定有AP的肝素。聚丙烯腈是第一种开发用于透析膜的合成材料。Hospal开发的老式AN69膜的材料是丙烯腈与甲代烯丙基磺酸钠的共聚物。这种组合至关重要，并且包括添加影响膜结构的甲代烯丙基磺酸钠。WO 2007/148147 A1描述了在优选基于丙烯腈和甲代烯丙基磺酸钠的共聚物的膜上使用胶体形式的带有阴离子或可阴离子化基团的聚合物的溶液，特别是通过混合例如带有阴离子或可阴离子化基团的聚合物的溶液与相对于所述聚合物的特定比例的有机多元酸溶液，这导致接枝到膜表面的聚合物的数量和该膜涂层表面的游离阳离子或可阳离子化基团的可利用性增加。所述膜允许结合大量带有阴离子或可阴离子化基团的化合物。

在一种实施方式中，碱性磷酸酶(AP)固定于其上的基质，优选中空纤维膜，包括或由以下组成：聚甲基丙烯酸甲酯。

根据该实施方式，优选使用聚甲基丙烯酸甲酯中空纤维膜。这种高通量膜由改性聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成。基于PMMA的滤血器可商购并已用于治疗败血症诱发的AKI。已知的包含PMMA膜的滤血器是，例如，由Toray(Sakai,in:High Performance MembraneDialyzers.Saito等人，eds.Contributions to Nephrology,Vol 173.Basel:Karger；2011:137-147)提供的

NF(Nf)和传统的

BG(BG)。

根据本发明，AP固定在本发明的装置的基质上。本发明设想了基本上任何用于固定到基质上的手段。在一些实施方式中，AP被固定在基质上，使得它在体外血液回路的情况下用血液灌注期间保持稳定连接，如将在肾衰竭的治疗中所采用的。在AP和基质之间提供稳定连接的任何形式的固定都是合适的，优选地在血液回路中使用本文所述的装置期间导致基质中的AP没有损失或损失可忽略不计的固定形式。

在本发明的进一步实施方式中，设想了共价(例如交联)和非共价(例如离子相互作用)形式的连接。

其中的数量和化学能够有进一步的创造性。这些固定手段取决于装置中采用的特定基质材料和装置在体外血液处理回路中的特定位置。

在一种实施方式中，通过由聚砜、聚(醚)砜(PES)和/或聚芳(醚)砜(PAES)的OH基团与AP的COOH基团之间的反应产生的酯键碱性磷酸酶(AP)被固定到基质上，优选使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)处理。

在一种实施方式中，通过由壳聚糖的NH₂基团与AP的COOH基团之间的反应产生的肽键，碱性磷酸酶(AP)被固定到基质上，优选使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)处理。

在一种实施方式中，通过由马来酸酐-1-十八碳烯交替共聚物的COOH基团与AP的NH₂基团之间的反应产生的肽键，碱性磷酸酶(AP)被固定到基质上，优选使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)处理。

1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是本领域已知的可用于产生OH和COOH基团之间或者NH₂与COOH基团之间的交联的试剂。由于蛋白质富含NH₂和COOH基团，EDC化学代表了将AP固定到基质上的有效手段。技术人员将根据装置中使用的特定基质(膜)材料调整固定条件和方法。

羧酸(-COOH)存在于每条多肽链的C端以及天冬氨酸(Asp,D)和谷氨酸(Glu,E)的侧链中。与伯胺一样，羧基通常位于蛋白质结构的表面。羧酸对碳二亚胺如EDC具有反应性。

EDC和其他碳二亚胺是零长度交联剂。它们通常会导致羧酸根(-COOH)与伯胺(-NH₂)直接结合，而不会成为靶分子之间最终酰胺键交联的一部分。由于肽和蛋白质含有多个羧基和胺，直接EDC介导的交联会导致多肽的随机聚合。然而，这种反应化学广泛用于固定程序。

EDC与羧酸基团反应，形成活性O-酰基异脲中间体，其很容易被反应混合物中的伯氨基的亲核攻击所取代。伯胺与原始羧基形成酰胺键，并且EDC副产物作为可溶性尿素衍生物释放。O-酰基异脲中间体在水溶液中不稳定。不与胺反应会导致中间体水解、羧基再生并且N-未取代的脲释放。EDC交联在酸性(pH 4.5)条件下有效，通常用于不含外来羧基和胺的缓冲液。MES缓冲液(4-吗啉代乙磺酸)是合适的碳二亚胺反应缓冲液。磷酸盐缓冲液和中性pH(高达7.2)条件与化学反应兼容，但效率较低。增加反应溶液中EDC的量可以补偿降低的效率。

在一些实施方式中，固定涉及将来自基质材料或表面的OH基团交联至AP的COOH基团。在另一实施方式中，这种固定涉及交联壳聚糖的NH₂基团与AP的COOH基团。在另一实施方式中，这种固定涉及交联由马来酸酐-1-十八碳烯交替共聚物产生的COOH基团与AP的NH₂基团。

将AP交联到装置基质的替代手段是技术人员可获得的，并且无需过度努力即可使用。根据基质，可以使用合适的化学物质。一些基质材料可以被激活以直接偶联到AP。其他支撑物由亲核试剂或其他官能团制成，这些官能团可以使用交联剂连接到蛋白质上。碳二亚胺(如DCC和EDC)对于将蛋白质偶联到羧基和胺活化的玻璃、塑料和多糖支撑物上而言非常有用。碳二亚胺程序通常是一步法；然而，如果反应在有机溶剂中进行，或者如果使用NHS或Sulfo-NHS化学来增强反应，则两步法是可能的。在一些实施方式中，可以使用间隔物。有用的间隔物是二氨基二丙胺(DADPA)、乙二胺、己二胺、6-氨基-己酸和几种氨基酸或肽中的任何一种。当AP固定得太靠近基质以允许AP接近其靶标时，间隔物臂有助于克服空间效应。

本发明的另一方面涉及如本文所述的血液处理装置的制造方法，其中，所述装置被配置成对有需要的患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化，该方法包括将碱性磷酸酶(AP)固定到基质上。

在该方法的一种实施方式中，该血液处理装置是包含中空纤维束膜的滤血器，并且该碱性磷酸酶(AP)至少固定在管腔上，并且任选地，在所述束的中空纤维的孔上。

在该方法的一种实施方式中，该碱性磷酸酶(AP)共价结合到所述基质，该方法包括使用碳二亚胺化合物，优选地使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，处理所述基质和/或AP。在下面的实例中更详细地公开了采用特定EDC化学物质和方案的合适方法。

本发明的方法非常有利，因为生产该装置不需要对标准血液处理装置如吸附剂或滤血器的结构、功能或可用性进行任何根本改变。现有的血液处理吸附剂或滤血器也可以随后(在制造后)用AP进行处理，以固定活性剂并制备该装置用于使用。由于透析器不会在结构上发生变化，而只是在制造后进行修改，因此对额外制造的投资需求是有限的。

在一些实施方式中，使用本文所述的方法生产的包含固定化AP的用于体外治疗的装置可优选填充或储存在缓冲液或其他溶液中，其中，包含固定化AP的基质被浸入所述缓冲液或溶液中，而Mg²⁺的浓度为0.1至2，优选0.1至1mmol/L，并且Zn²⁺的浓度为5至150，优选10至100μmol/L。取决于所采用的AP，所述值的一些变化是可能的，同时保持所需的AP活性。

在一些实施方式中，如本文所述的血液处理装置的制造方法包括：膜(优选聚丙烯腈膜，更优选AN69膜或中空纤维束)的PEI涂覆过程，优选使用酸性溶液，更优选使用柠檬酸溶液，然后进行戊二醛处理和AP固定。

如下面的实施例所示，已开发出一种在后续GA/AP功能化和AP活性方面特别有效的PEI涂覆过程。在一种优选的实施方式中，聚丙烯腈膜，优选AN69膜或中空纤维束，在酸性溶液中使用PEI进行处理(优选PEI在100～300或约200mg/kg，在柠檬酸溶液中，优选10～300，优选200mg/g)。

在一种实施方式中，采用0.5至5，优选1～3μmol/g的中空纤维膜的最佳PEI密度(在GA与AP处理之前)。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的制造方法包括：对经PEI处理的膜进行GA处理，其中，将所述GA在碱性pH、优选7.1～11pH、更优选7.3～10.5pH，更优选约7.4或9.9pH下施加到膜上。这些pH值导致有效的GA处理和随后出乎意料的稳定的且活性固定化的AP。

在一种实施方式中，如本文所述的血液处理装置的制造方法包括：对经PEI和GA处理的膜进行AP处理，其中，将所述GA在碱性pH、优选7.1～11pH、更优选7.3～10.5pH，更优选约7.4或9.9pH下施加到溶液中的膜上。这些pH值导致出乎意料的稳定的且活性固定化的AP。

在一种优选的实施方式中，进行PEI处理，优选使用聚丙烯腈膜，更优选AN69膜或中空纤维束，在pH为7.1～7.8，更优选为约7.4下进行PEI处理，然后在pH为8.5～10.5、更优选为约9.9的溶液中进行AP处理。

在一些实施方式中，具有固定化的AP的基质随后被灭菌。令人惊讶的是，下面测试的基质的灭菌不会导致AP活性的显著降低，这对于临床应用来说是有问题的。在一种实施方式中，采用伽马灭菌。在一种实施方式中，采用EtO气体灭菌。在一种实施方式中，不采用热灭菌(蒸汽灭菌)。

在另一方面，本发明涉及如本文所述的血液处理装置作为治疗感染(优选血液或全身感染)的药物的用途。

在另一方面，本发明涉及如本文所述的血液处理装置作为治疗与细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和/或脂多糖(LPS)的病理水平相关的任何疾病的药物的用途。LPS通常被称为与多种感染性疾病相关的病理分子。采用本发明的LPS的去磷酸化和分子的解毒能够有效地对抗LPS的病理作用。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的血液处理装置用作治疗败血症或败血症性休克的药物的用途。

在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的血液处理装置用作治疗感染相关的肾功能障碍的药物的用途。在一种实施方式中，感染相关的肾功能障碍是败血症相关的急性肾损伤(AKI或SA-AKI)。

在一种实施方式中，该处理包括在急性情况下，优选在重症监护病房(ICU)中的连续性肾脏替代疗法。

根据一个方面，本发明提供了一种治疗或改善这种疾病的至少一种症状的方法。

因此，本发明的另一个目的是提供一种治疗或改善与患者体内的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)的病理学水平相关的疾病的至少一种症状的方法，其中，该方法包括：通过使患者的血液或血浆通过如本文所述配置的基质然后将处理过的血液回输给患者，对患者血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行体外去磷酸化的步骤。

因此，本发明的一个目的是提供治疗或预防感染，优选血液或全身感染、败血症或败血性休克、感染相关的肾功能障碍或败血症相关的急性肾损伤(AKI)的装置、体外回路和方法，其中，该装置被放置在体外血液处理回路中并且被配置成对细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化。

具体实施方式

专利和非专利文献的所有引用文件均通过引用整体并入本文。除非本文另有说明，否则所有术语将被赋予其普通技术含义。

本发明基于使用固定到血液治疗装置(如固定有碱性磷酸酶(AP)的滤血器或吸附剂筒)中的基质的AP，然后将处理过的血液回输给患者，对患者血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行体外去磷酸化。

体外循环和治疗：

可以将本发明的新型血液处理装置集成到其中的体外系统是现有技术中已知的。体外程序或系统是在体外执行或定位的医疗程序或系统。这涉及一种常见的程序，在该程序中，血液从患者的循环中取出，在血液返回循环之前对其进行任何给定的过程。在体外携带血液的设备称为体外血液回路。技术人员可获得合适的设备组件，如管道、连接器、泵等。

根据本发明，表述“体外血液净化”优选地是指通过将物质从患者体外的分流回路中的流动血液中清除而从体液中去除物质的过程(体外)。所述物质可包括内源性毒素(即，尿毒症毒素)、外源性毒素(即，乙二醇或真菌毒素)、给药的药物、病毒、细菌、抗体和蛋白质(即，IMHA、重症肌无力)、异常细胞(即，白血病)，以及过量的水。治疗程序包括血液透析，其包括间歇性血液透析(HD、HDF、HF)和连续性肾脏替代疗法(CRRT)；血液灌流；和治疗性单采。

如本文所用，表述“血液”是指包含生物体的血液的所有组分的全血，包括悬浮在血浆中的红细胞、白细胞和血小板。表述“血浆”是指由约92％的水、7％的蛋白质(例如白蛋白、丙种球蛋白、纤维蛋白原、补体因子、凝血因子)和1％的矿物盐、糖、脂肪、电解质、激素和维生素组成的流体，血浆构成全血的一部分但不再含有红细胞、白细胞和血小板。在本发明的上下文中，表述“血浆”也是指上述定义的血浆以其标准含义表示的特定部分，例如血清。

根据一个方面，体外血液净化回路中的血液流速为20ml～700ml/min。除了根据本发明的血液处理装置的情况或在另外配置血液透析器以固定靶蛋白质的情况，包括用于治疗肾衰竭的血液透析器的体外回路中的典型透析液流速为0.5l/h～800ml/min。

在血液透析中，血液在体外回路中循环，并且其成分通过溶质和水跨界面半透膜的扩散和/或对流力的传质而改变。溶质转移的幅度和频谱取决于跨膜施加的力的性质、溶质的化学和物理特性，尤其还包括尺寸和膜的结构特性。血液透析是肾衰竭患者的标准治疗。

血液灌流是一种体外吸附疗法，用于治疗血液透析无法有效清除的内源性和外源性中毒。吸附是溶质如蛋白质分子连接到材料表面(基质)的原理。与血液透析期间发生的血液和透析液之间的物理分离相反，在血液灌流期间，血液直接暴露于吸附剂，该吸附剂具有选择性或非选择性结合血液路径内的溶质的能力。

在治疗性单采血液中，例如通过离心或通过质膜或过滤器将血液分成其组成部分，并且含有应被去除的溶质的部分(通常是血浆部分)在返回患者之前经过专门处理。本发明提供了一种单采治疗，其中，从患者流动的血液中去除血浆(含有靶蛋白)，并在与根据本发明的装置或基质接触后回输给患者(图5)。在体外回路(其中血液处理装置被血浆灌注)中的典型血浆流速在7ml/min～250ml/min的范围内。

根据一个方面，根据本发明的体外血液回路被配置成进行血液透析。在这种情况下，根据本发明的装置是例如血液透析仪，其另外被配置成固定根据本发明的靶蛋白。该回路可以根据医疗需要在不同的处理模式(包括血液透析、血液透析滤过、血液滤过模式)下运行。

根据一个方面，该装置被配置成执行“肾脏替代疗法”(RRT)，其涉及一种用于替代肾脏的正常血液过滤功能的疗法。血液透析、血液滤过和血液透析滤过可以是连续的或间歇的，并且可以使用动静脉途径(血液从动脉离开并通过静脉返回)或静脉途径(血液从静脉离开并通过静脉返回)。这导致了各种类型的RRT。

例如，肾脏替代疗法可以选自但不限于以下疗法的组：连续性肾脏替代疗法(CRRT)、连续性血液透析(CHD)、连续性动静脉血液透析(CAVHD)、连续性静-静脉血液透析(CVVHD)、连续性血液滤过(CHF)、连续性动静脉血液滤过(CAVH或CAVHF)、连续性静静脉血液滤过(CVVH或CVVHF)、连续性血液透析滤过(CHDF)、连续性动静脉血液透析滤过(CAVHDF)、连续性静静脉血液透析滤过(CVVHDF)、间歇性肾脏替代疗法(IRRT)、间歇性血液透析(IHD)、间歇性静静脉血液透析(IVVHD)、间歇性静脉血液滤过(IHF)、间歇性静静脉血液滤过(IVVH或IVVHF)、间歇性血液透析滤过(IHDF)和间歇性静静脉血液透析滤过(IVVHDF)。

根据优选实施方式，根据本发明的体外血液回路被配置成提供连续性肾脏替代疗法(CCRT)。连续性肾脏替代疗法(CRRT)是缓慢的透析治疗，其每天24小时提供连续疗法，主要用于ICU环境中的危重患者。与慢性肾衰竭患者的间歇性HD一样，CRRT的溶质去除是通过对流(血液滤过)、扩散(血液透析)或这两种方法的组合(血液透析滤过)来实现的。这个过程需要使用置换液来防止医源性酸中毒和电解质消耗以及过多的液体去除。CRRT以及如何使用它是本领域已知的。

根据另一方面，根据本发明的体外血液回路被配置成进行血液灌注。因此，根据本发明的血液处理装置灌注有全血并且位于体外回路内(图3)。根据本发明的一个方面，该装置是包括已经结合有AP的膜、无纺布或树脂的筒。根据一个方面，当筒的基质包括与AP结合的中空纤维束膜时，处理模式可以是具有封闭透析液/滤液端口的血液灌流。根据又一方面，该筒可以位于血液透析器的下游或上游，该血液透析器被配置成对患者的血液进行血液透析(图4A和4B)并且可以在选自血液透析、血液透析滤过和血液透析的不同治疗模式下操作。

根据一个方面，血液处理装置是过滤器，其在如上所述的过滤器的滤液空间中包括中空纤维和树脂。过滤器可以在血液灌注模式下操作，或者如果与可以位于根据本发明的装置的上游或下游的血液透析器结合，则处理模式可以是血液透析、血液透析滤过或血液滤过。根据本发明的又一实施方式，根据本发明的装置可以在处理之间再生。

根据一个方面，所述装置的中空纤维膜是血浆分离膜，其允许血浆连同其中包含的靶标一起通过膜并与滤液空间中的基质相互作用，从而允许靶标被AP去磷酸化。净化后的血浆将重新进入同一装置内的中空纤维膜，并且血液可以回输给患者。这种装置可以位于血液透析器上游或下游的体外回路中，如在WO 2014/079681 A2中描述的，或者它可以用作回路内的唯一血液灌注装置。在另一个方面，AP还可以或专门结合到如上所述的血浆分离膜，例如结合到膜的外部和/或孔。在一个方面，滤液空间中的树脂可以被配置成去除相同或不同的靶蛋白。

通常，根据本发明的装置被设计成具有圆柱形外壳的圆柱体，其具有用于用其处理的血液或血浆的至少一个入口和至少一个出口。当该装置是血液透析器时，除了去除至少一种靶蛋白之外还用于治疗HD、HDF或HF中的肾衰竭，该装置还包括透析液的入口和出口。可以根据本发明使用的装置配置是公知的并且落在本发明的范围内。

根据另一种实施方式，如US 2018/0369783中所述，体外血液回路包括血液相容性吸附剂，用于分离患者血液或血浆中包含的蛋白质结合的尿毒症毒素。该血液相容性吸附剂适用于分离分子量小于500g/mol(相对于其载体蛋白而言)的蛋白质结合的尿毒症毒素，以使尿毒症毒素能够通过血液透析进行透析，其中，血液相容性材料包括基于环状寡糖的聚合物或其衍生物，其设置在至少一层中的固体载体组件上。因此，这种血液相容性吸附剂适用于选择性地有效去除具有疏水性和/或带电结构域的白蛋白结合毒素，其分子量高达约500Da(例如，硫酸吲哚酚、对甲酚、马尿酸或苯乙酸)，以支持普通的体外血液治疗(例如，血液透析或肝透析)。

碱性磷酸酶：

如本文所用，“碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)”(也称为AP、ALP、ALKP、ALPase、Alk Phos)，或碱性磷酸酶(basic phosphatase)是约86千道尔顿的同型二聚体蛋白酶，如本文更详细描述的。每个单体通常包含五个半胱氨酸残基、两个锌原子和一个对其催化功能很重要的镁原子，并且它在碱性pH环境下具有最佳活性。AP具有去磷酸化化合物的生理作用。该酶发现于多种生物体中，原核生物和真核生物等，具有相同的一般功能但具有适合它们起作用的环境的不同结构形式。该酶通常是热稳定的并且对本文公开的固定化反应化学不敏感。

AP的一种优选实施方式涉及牛肠碱性磷酸酶，其可商购获得(例如，来自Sigma-Aldrich；P0114)并且可以使用已建立的技术和本文所述的技术固定到装置基质上。

牛肠碱性磷酸酶是一种二聚体膜衍生糖蛋白。至少存在三种同种型，每个单体通常具有两个N-连接的聚糖和一个或多个O-连接的聚糖。市售产品可在pH 7.0的含50％甘油的溶液中获得，例如5mM Tris、5mM MgCl₂和0.1mM ZnCl₂。来自Sigma-Aldrich的一个DEA单元biAP通常在37℃、pH 9.8下每分钟水解1μmol的4-硝基苯基磷酸酯。

肠碱性磷酸酶(Bos Taurus)的一种示例性蛋白质序列是根据GenBank:AAA30571.1，如下面的SEQ ID NO 1所示。牛肠碱性磷酸酶的同工酶，如Besman和Coleman(JBiol Chem.1985Sep 15；260(20):11190-3)中所描述的，也被设想用于本发明。

SEQ ID NO 1:

MQGACVLLLLGLHLQLSLGLVPVEEEDPAFWNRQAAQALDVAKKLQPIQTAAKNVILFLGDGMGVPTVTATRILKGQMNGKLGPETPLAMDQFPYVALSKTYNVDRQVPDSAGTATAYLCGVKGNYRTIGVSAAARYNQCKTTRGNEVTSVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGAYAHTVNRNWYSDADLPADAQMNGCQDIAAQLVNNMDIDVILGGGRKYMFPVGTPDPEYPDDASVNGVRKRKQNLVQAWQAKHQGAQYVWNRTALLQAADDSSVTHLMGLFEPADMKYNVQQDHTKDPTLQEMTEVALRVVSRNPRGFYLFVEGGRIDHGHHDDKAYMALTEAGMFDNAIAKANELTSELDTLILVTADHSHVFSFGGYTLRGTSIFGLAPSKALDSKSYTSILYGNGPGYALGGGSRPDVNDSTSEDPSYQQQAAVPQASETHGGEDVAVFARGPQAHLVHGVEEETFVAHIMAFAGCVEPYTDCNLPAPTTATSIPDAAHLAASPPPLALLAGAMLLLLAPTLY

碱性磷酸酶的一种示例性序列是根据GenBank:AAA51700.1的人前体蛋白，如下面的SEQ ID NO 2所示。

SEQ ID NO 2:

MQGPWVLLLLGLRLQLSLGIIPVEEENPDFWNRQAAEALGAAKKLQPAQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKKDKLGPETFLAMDRFPYVALSKTYSVDKHVPDSGATATAYLCGVKGNFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADVPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFPMGTPDPEYPDDYSQGGTRLDGKNLVQEWLAKHQGARYVWNRTELLQASLDPSVTHLMGLFEPGDMKYEIHRDSTLDPSLMEMTEAALLLLSRNPRGFFLFVEGGRIDHGHHESRAYRALTETIMFDDAIERAGQLTSEEDTLSLVTADHSHLFSFGGYPLRGSSIFGLAPGKARDRKAYTVLLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQSAVPLDGETHAGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEQTFIAHVMAFAACLEPYTACDLAPRAGTTDAAHPGPSVVPALLPLLAGTLLLLGTATAP

碱性磷酸酶的一种示例性蛋白质序列是根据GenBank:AAB59378.1的人蛋白，如下面的SEQ ID NO 3所示。替代的示例性人AP序列也以GenBank登录号AAC97139.1、AAA98616.1、CAA39425.1、AAA98617.1而为人所知。

SEQ ID NO 3:

MISPFLVLAIGTCLTNSLVPEKEKDPKYWRDQAQETLKYALELQKLNTNVAKNVIMFLGDGMGVSTVTAARILKGQLHHNPGEETRLEMDKFPFVALSKTYNTNAQVPDSAGTATAYLCGVKANEGTVGVSAATERSRCNTTQGNEVTSILRWAKDAGKSVGIVTTTRVNHATPSAAYAHSADRDWYSDNEMPPEALSQGCKDIAYQLMHNIRDIDVIMGGGRKYMYPKNKTDVEYESDEKARGTRLDGLDLVDTWKSFKPRYKHSHFIWNRTELLTLDPHNVDYLLGLFEPGDMQYELNRNNVTDPSLSEMVVVAIQILRKNPKGFFLLVEGGRIDHGHHEGKAKQALHEAVEMDRAIGQAGSLTSSEDTLTVVTADHSHVFTFGGYTPRGNSIFGLAPMLSDTDKKPFTAILYGNGPGYKVVGGERENVSMVDYAHNNYQAQSAVPLRHETHGGEDVAVFSKGPMAHLLHGVHEQNYVPHVMAYAACIGANLGHCAPASSAGSLAAGPLLLALALYPLSVLF

还包括作为示例性实施方式的是根据GenBank参考序列NP_001622.2的人肠型碱性磷酸酶前体，如SEQ ID NO 4中所示的。

SEQ ID NO 4:

MQGPWVLLLLGLRLQLSLGVIPAEEENPAFWNRQAAEALDAAKKLQPIQKVAKNLILFLGDGLGVPTVTATRILKGQKNGKLGPETPLAMDRFPYLALSKTYNVDRQVPDSAATATAYLCGVKANFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKQAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADMPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFPMGTPDPEYPADASQNGIRLDGKNLVQEWLAKHQGAWYVWNRTELMQASLDQSVTHLMGLFEPGDTKYEIHRDPTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFYLFVEGGRIDHGHHEGVAYQALTEAVMFDDAIERAGQLTSEEDTLTLVTADHSHVFSFGGYTLRGSSIFGLAPSKAQDSKAYTSILYGNGPGYVFNSGVRPDVNESESGSPDYQQQAAVPLSSETHGGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEQSFVAHVMAFAACLEPYTACDLAPPACTTDAAHPVAASLPLLAGTLLLLGASAAP

还设想了更短的版本，如SEQ ID 5中所示的：

SEQ ID NO 5:

VIPAEEENPAFWNRQAAEALDAAKKLQPIQKVAKNLILFLGDGLGVPTVTATRILKGQKNGKLGPETPLAMDRFPYLALSKTYNVDRQVPDSAATATAYLCGVKANFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKQAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADMPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFPMGTPDPEYPADASQNGIRLDGKNLVQEWLAKHQGAWYVWNRTELMQASLDQSVTHLMGLFEPGDTKYEIHRDPTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFYLFVEGGRIDHGHHEGVAYQALTEAVMFDDAIERAGQLTSEEDTLTLVTADHSHVFSFGGYTLRGSSIFGLAPSKAQDSKAYTSILYGNGPGYVFNSGVRPDVNESESGSPDYQQQAAVPLSSETHGGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEQSFVAHVMAFAACLEPYTACDLAPPACTTDAAHPVAASLPLLAGTLLLLGASAAP

在一些实施方式中，如本文所述的重组AP被采用于本发明中。AP变体对LPS表现出增强的稳定性和良好的选择性(Kifer-Moreira T等人，PLoS ONE2014；9:e89374)。该序列列于SEQ ID NO 6。

SEQ ID NO 6:

VIPAEEENPAFWNRQAAEALDAAKKLQPIQKVAKNLILFLGDGLGVPTVTATRILKGQKNGKLGPETPLAMDRFPYLALSKTYNVDRQVPDSAATATAYLCGVKANFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKQAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADMPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFPMGTPDPEYPADASQNGIRLDGKNLVQEWLAKHQGAWYVWNRTELMQASLDQSVTHLMGLFEPGDTKYEIHRDPTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFYLFVEGGRIDHGHHEGVAYQALTEAVMFDDAIERAGQLTSEEDTLTLVTADHSHVFSFGGYPLRGSSIFGLAPGKARDRKAYTVLLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQSAVPLDEETHGGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEQSFVAHVMAFAACLEPYTACDLAPPACTTD

在一些实施方式中，所采用的AP序列在功能上等同于如本文所述的人、重组或牛AP蛋白，换言之，此类功能等同物由其对有需要的患者血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化的能力所定义。

本发明还包括本文所述的氨基酸序列长度的变化。技术人员能够提供比SEQ IDNO 1、2、3、4、5或6更长或更短的氨基酸序列变体，其仍将表现出与本文所述的AP足够的相似性以提供所需的结果。例如，如本文所述，包含比全长形式少10、20、30、40、50或高达100个氨基酸的SEQ ID NO 1、2、3、4、5或6的较短变体也可以实现有效的靶标去磷酸化。因此也考虑了AP的活性片段。此外，如本文所述，包含比AP序列多10、20、30、40、50或高达100个氨基酸的任何给定额外序列的SEQ ID NO 1、2、3、4、5或6的较长变体，也可以实现有效结果。

在本发明的其他实施方式中，所采用的AP蛋白可以包含或由以下氨基酸序列组成，其与SEQ ID NO 1、2、3、4、5或6具有至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。优选地，序列变体包含与SEQ ID NO 1、2、3、4、5或6具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且优选地表现出与本文所述的AP的功能类似。在优选的实施方式中，所采用的AP蛋白与SEQ ID NO 1、2、3、4、5或6具有至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在一些实施方式中，本发明涵盖当固定在如本文所述的膜、支撑物或其他基质上时能够对患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化的任何AP。

如本文所用，“去磷酸化”涉及如通过水解从有机化合物中去除磷酸(PO₄ ^3-)基团。磷酸化是一种可逆的翻译后修饰，其可以通过去磷酸化进行去除。去磷酸化及其对应物磷酸化通常通过分离或连接磷酸酯和酸酐来使酶激活和失活，或调节信号传导。去磷酸化的显著发生是ATP转化为ADP和无机磷酸盐。去磷酸化使用一种类型的水解酶或水解酶，其可裂解酯键。用于去磷酸化的主要水解酶亚类是磷酸酶，如AP。磷酸酶通过将磷酸单酯水解成磷酸根离子和带有游离羟基(-OH)基团的分子来去除磷酸基团。

膜材料和滤血器：

根据一个方面，该装置是设计用于血液透析的中空纤维膜透析器，并且其中，血液透析器的中空纤维的管腔侧用碱性磷酸酶(AP)功能化。根据本发明的一种实施方式，根据本发明的装置包括选自由聚砜、聚醚砜或聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮制备的血液透析中空纤维膜所组成的组中的中空纤维膜。

可有利地用于提供根据本发明的装置的中空纤维膜优选具有100～500μm的内径。根据本发明的一种实施方式，中空纤维膜具有20～150μm的壁厚。较低的壁厚是不利的，因为在生产过程中以及在其在根据本发明的装置中使用的过程中纤维的机械性能降低。较高的壁厚是不利的，因为它们需要增加的时间段来进行相转化过程，导致不稳定的过程条件和不稳定的膜。

可根据本发明使用的聚砜/PVP基膜，包括由PES或PAES制备的膜，可分为“高通量”(HF)、“中截留”(MCO)和“高截留”(HCO)膜。所有这些膜已在文献中描述。

即使涉及相同的聚合物，它们的生产也与这些膜具有的定义特性相关。如今，主要使用扩散诱导相分离过程，这允许聚合物组合以及孔径和扩散传输特性的微调。将聚合物溶解在合适的溶剂中，并且在非溶剂浴，优选水中发生沉淀。聚合物溶液中聚合物的浓度约为20wt％，这取决于具体的配方。聚合物溶液被泵送通过环形模具(喷丝头)以形成中空纤维。中空纤维的内部空隙是由孔液体(溶剂与非溶剂的混合物)形成的，其被引入到喷丝头的内部。在第三步骤中，中空纤维被引导通过非溶剂浴。非溶剂浴和孔液体需要通过扩散溶剂/非溶剂交换(浸渍沉淀)将均匀的液体聚合物溶液转化为两相系统。分层过程在富含聚合物的相的玻璃化点停止。在富聚合物相期间形成刚性膜结构，而在液体聚合物贫相期间形成膜孔。在制造过程中对膜性能的主要影响是聚合物溶液的组成、粘度和温度、添加剂的使用、结晶或聚集的能力、喷嘴设计、凝固浴的组成、喷嘴和凝固之间的条件-浴入口，特别是纺纱轴中的温度和湿度，以及可能的精加工处理，例如通过加热或辐射对膜进行干燥和/或灭菌(例如，参见Zweigart等人(2017)4.11Progress in the Development ofMembranes for Kidney-Replacement Therapy.In:Drioli,E.,Giorno,L.和Fontananova,E.(eds.),Comprehensive Membrane Science and Engineering,second edition.vol.4,pp.214-247.Oxford:Elsevier)。如EP3010629中所述，最终纤维束和过滤器的性能另外受纤维波动的影响，从而为它们提供波浪形几何形状。过滤器的最终组装被描述于Zweigart等人，2017。根据本发明的膜和过滤器可以通过几种公知的手段进行消毒。通过用伽马射线或电子束照射对根据本发明的装置进行消毒将是有利的。两者都是标准技术。伽马射线灭菌的辐射剂量为5～40kGy。也可以使用蒸汽灭菌，并且是在环境影响和患者应用方面选择的方法。尽管有各种可用的膜生产方法，但技术人员能够毫不费力地选择并且制造合适的膜。

根据本发明的一个方面，血液净化装置包括其上固定有AP的高通量膜。用于装置的高通量膜，例如

170H(Baxter)、

(Baxter)、

EMIC2(Fresenius Medical Care)或

F180NR(Fresenius Medical Care)已投放市场数年。它们的生产方法已经描述在例如US 5,891,338和EP2113298中。来自Bellco的

UP系列中使用了另一种已知的膜。这些产品基于聚苯。在本申请中提及的基于聚砜或聚醚砜的膜中，聚合物溶液通常包含10～20重量％的作为疏水性聚合物的聚醚砜或聚砜和2～11重量％的亲水性聚合物，在大多数情况下为PVP，其中，所述PVP通常由低分子和高分子PVP组分组成。所得高通量型膜通常由80～99重量％的所述疏水聚合物和1～20重量％的所述亲水聚合物组成。在膜的生产期间，喷丝头的温度通常为25～55℃。聚合物组合、工艺参数和性能数据可以从提到的参考资料中检索，也可以从公众可用的数据表中获取。如本文所用，表述“高通量膜”另外是指具有5kDa～10kDa的MWRO和25kDa～65kDa的MWCO的膜，如通过根据Boschetti-de-Fierro A等人的葡聚糖筛分测量来确定(Extendedcharacterization of a new class of membranes for blood purification:The highcut-off membranes.Int J Artif Organs 2013；36(7),455-463)。血液接触前的平均孔半径在3.5～5.5nm的范围内，其中，孔径是基于根据Boschetti-de-Fierro等人(2013)的葡聚糖筛分系数由MWCO确定的。

根据本发明的一个方面，血液净化装置包括其上固定有AP的高截留膜。这种类型的膜首先在WO 2004/056460中公开，其中，描述了某些早期的高截留膜，其已经主要用于通过消除败血症相关的炎症介质来治疗败血症。使用当前市场上的高截留型膜的先进透析器是例如septeX和Theralite(Baxter)。所述先进高截留膜的已知用途包括治疗败血症(EP2281625)、慢性炎症(EP2161072)、淀粉样变性和横纹肌溶解症以及治疗贫血症(US2012/0305487)，迄今为止探索最多的疗法是治疗骨髓瘤肾脏患者(US 7,875,183 B2)。因此，这些膜和过滤器已经很好地适用于急性环境，因此特别适用于根据本发明的治疗。如本文所用，表述“高截留膜”或“多个高截留膜”是指具有15～20kDa的MWRO和170～320kDa的MWCO的膜。膜的特征还在于在膜的选择性层表面上的孔半径在血液接触前为8～12nm。为避免疑问，对于给定的膜且本文所用的MWRO和MWCO的确定是根据Boschetti-de-Fierro等人(2013)的方法进行的。例如，在上述参考文献中已经描述了生产高截留膜的方法。如WO2004/056460中已经公开的，它们生成的关键要素是仔细控制纺丝过程的温度，即，相对于纺丝条件的喷丝头温度、纺丝轴温度和凝固浴温度，用于生产具有大致相同的聚合物组成的高通量膜。此外，对于最新的高截留膜如Theralite膜的生产，聚合物溶液中水与溶剂的比例(H₂O/溶剂)也略微变化成较低的值，而该溶液中的聚合物含量可以相似或相同地用于生产高通量膜，例如，Revaclear膜。为免生疑问，用于描述现有技术膜和根据本发明的膜的MWCO和MWRO值已在接触血液或血浆之前测量，因为合成膜的筛分特性在这种接触时可能改变。

根据本发明的一方面，血液净化装置包括其上固定有AP的中截留膜。WO 2015/118045 A1、WO 2015/118046 A1和例如Zweigart等人(2017)详细描述了MCO膜和包含其的过滤器及其生产方法。市场上第一个包含这种MCO膜的透析器是Theranova(Baxter)。所述中截留膜和透析器填补了高通量和高截留透析器之间的性能差距。如本文所用，表述“中等截留膜”是指具有通过在膜与血液或血液制品接触之前的葡聚糖筛分曲线确定的9.0kDa～14.0kDa的起始分子量保留(MWRO)和5kDa～130kDa的截留分子量(MWCO)的膜。由于这种非常独特的筛分特性，该膜极大地扩展了当前高通量膜和透析器的性能，因为它们允许去除当前高通量膜无法解决的中型和大型尿毒症溶质。因此，它们也被称为“渗透性增加的膜”。同时，此类膜能够处理此类更高分子量的化合物，而不必在处理过程中面临不可接受的白蛋白损失。因此，这些膜类型可用于急性和慢性环境。为免生疑问，本文所用的表述“具有增加的(或“扩展的”)渗透性的膜”等同于表述“中截留膜”。

根据本发明的又一实施方式，血液净化装置包括聚丙烯腈(PAN)膜，其包含i)丙烯腈与甲代烯丙基磺酸钠的共聚物，ii)聚乙烯亚胺，和iii)其上已经固定有AP的肝素。聚丙烯腈是第一种开发用于透析膜的合成材料。Hospal开发的老式AN69膜的材料是丙烯腈与甲代烯丙基磺酸钠的共聚物。这种组合很重要，并且包括添加严重影响膜结构的甲代烯丙基磺酸钠。这些膜特别适用于治疗败血症或败血症诱发的急性肾功能衰竭，特别是用于吸附生物流体中含有的内毒素，用于纯化血液或血浆中含有的某些分子(即，通过本文所述的靶分子的去磷酸化，和/或通过体外循环)，和用于在体外血液或血浆处理期间减少患者的全身抗凝作用。

WO 2007/148147 A1中还描述了一种制备合适膜的方法。在体外血液回路的一种实施方式中，血液处理装置的膜包含每平方米膜表面积量为10～100mg(例如25～50mg)的聚乙烯亚胺以及每平方米膜表面积量为1,500～10,000UI(例如3,000～6,000UI，例如4,500±1,500UI)的肝素。在一种实施方式中，血液处理装置包括内径为180～260μm(例如，210μm或240μm)的中空纤维膜。在一种实施方式中，中空纤维膜的壁强度为30～60μm，例如，40～50μm。在一种实施方式中，扩散和/或过滤装置中膜的总表面积为1～3m²，例如，1.0～2.2m²。在一种实施方式中，扩散和/或过滤装置中的中空纤维膜显示出在37℃下在具有60g/l的蛋白质含量的牛血浆中测量的筛分系数，其中菊粉大于0.95、肌红蛋白大于0.55并且白蛋白小于0.01。扩散和/或过滤装置中的膜具有通过吸附将炎症介质和内毒素固定在其表面的能力。在一种实施方式中，在QB＝400ml/min、QD＝700ml/min和UF＝100ml/min的HDF模式下IL-6的清除率为20～40ml/min。PAN膜对蛋白质(包括β2-微球蛋白、细胞因子和内毒素)具有很高的吸附能力，这使得它们特别适用于急性治疗如CRRT，特别是用于治疗败血症诱导的AKI，尽管非常需要改善这种膜类型的败血症治疗的临床结果。

在发展初期存在的膜的某些缺点今天通过用聚阳离子聚乙烯亚胺涂覆膜表面来克服，其中聚阳离子聚乙烯亚胺具有结合肝素的额外好处，从而允许在透析过程中给予较低的肝素剂量，这是在危重患者中重要的优势。今天，这种膜可作为AN69ST获得，并用于商业透析器，例如Evodial和oXiris，它们以用于CRRT而闻名。AN69膜非常适合共价结合任何类型的蛋白质，例如配体或酶，其可用于改变生物流体的活性或组成(参见，例如，US 6,260,715 B1)。通过将AP固定在所述膜上，膜的这种特性可有利地用于制备根据本发明的装置。

根据又一方面，其中，所述膜具有允许较大蛋白质通过的孔径，例如，如WO 2008/003610 A1中描述的血浆分离膜，中空纤维膜的外表面和/或孔用AP功能化。或者，只有这种血浆分离中空纤维膜的管腔侧用AP功能化。

根据又一方面，该装置可以是用于治疗肾衰竭的血液透析器，其中，过滤器在至少一个端盖中还包括树脂(例如海绵形式)或无纺布(用AP进行功能化)。

可以用根据本发明的装置间歇地或连续地治疗患者。持续治疗排他地用于急性肾衰竭(ARF)。与间歇疗法相比，其优点包括因溶质和水的去除速度较慢而提高了耐受性。处理在血液透析模式下以200～500mL/min的血流量进行。

在本发明的一种实施方式中，其中，用于提供根据本发明的装置的膜是血浆分离膜或以其他方式配制成允许根据本发明的靶标以高于0.5并且优选地高于0.7或高于0.9的筛分系数的显著量通过，中空纤维的内层或管腔(通常是血液接触层)未功能化且不携带任何AP。AP反而经由连接体偶联到中空纤维的外层，并且任选地也偶联到连接内层与外层的层的至少一部分，即，膜的孔。因此，用AP进行功能化仅存在于外滤液层上并且任选存在于连接膜的外层和内层的孔表面结构的至少一部分上。例如，这种配置可以用于全血中靶标的去磷酸化，由于它们的尺寸能够从内层传递到外层，而较大的血液蛋白质保留在膜的管腔侧。随着包括靶标在内的血液组分传递到膜的外层，它们被AP修饰(去磷酸化)。

吸附剂材料和吸附剂筒：

该装置还可以是包含选自树脂或无纺材料的基质的吸附筒，其用AP进行功能化。这种装置可以是用于血液处理的体外回路的部件，其被配置成提供血液透析、血液透析滤过、血液滤过或血浆置换。该装置可以是血液回路内的唯一血液处理装置，或者可以位于例如血液透析、血液透析滤过或血液滤过回路中的透析器的上游或下游，或者可以替代地在血液入口或出口处立即连接到透析器，其中，该装置被配置成用全血灌注。该装置还可以是体外血浆置换回路的部件，其中，该装置灌注有血浆或其成分。该装置还可以用于治疗性血浆交换(TPE)治疗，其中，血浆从患者体内取出，然后被替代品代替，例如新鲜冷冻血浆。

该装置还可以是混合过滤装置，其结合了中空纤维膜和过滤器滤液空间中的基质，如(WO 2014/079680 A1)中所述。在本发明中，该基质由用AP官能化的树脂组成，用于使本文所述的靶标去磷酸化。这种过滤器可以是被配置用于进行血液透析、血液透析滤过或血液滤过的体外回路的部件，其中，所述过滤器位于透析器的上游或下游，用于血液透析、血液透析滤过或血液滤过，或者它在没有这种透析器的情况下可被用作所述回路内的唯一过滤装置。这种装置可用于全血。

之前已经描述了用于从患者的血液中去除靶标组分的体外装置和方法。例如，WO2013/020967 A1公开了用于固定和去除患者的血型抗体的装置和基质的用途。US 8,969,322 B2描述了一种通过包含硫酸葡聚糖的装置从患者血液中去除可溶性Flt-1受体的体外血液分离术程序。与这些方法类似，本发明采用将AP固定到血液处理装置上及其在治疗感染(如败血症)和肾衰竭(优选SA-AKI)中的适用性。

因此，在一个方面，本发明公开了包含基质的装置，其被设计用于对患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行特异性去磷酸化。根据另一方面，本发明公开了包括所述装置的体外回路并且描述了应该如何配置这种回路以有效地处理有需要的患者的血液。根据又一方面，本发明提供了一种降低患者血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和/或磷酸化脂多糖(LPS)的水平的方法，包括通过使患者的血液或血浆通过根据本发明的装置来从患者体外去除靶蛋白质的步骤。

根据一个方面，包括吸附剂(例如珠子的形式)的根据本发明的装置当用于全血灌注(血液灌注)时具有每装置0.5至50000m2的活性表面。根据另一方面，当用于全血浆灌注(治疗性血液分离术)时，根据本发明的所述装置具有每个装置为0.5～50000m²的活性表面。根据又一个方面，用于血液灌注和/或全血浆灌注的所述装置具有每个装置为0.5～10000m²的活性表面积。

因此，如本文所用，表述“基质”是指可用于根据本发明固定AP的材料。在本发明的上下文中使用的这种基质在一些实施方式中可以包括AP所结合的支撑物。因此，该支持物充当AP的载体，即使它也必须完成其他功能。

根据本发明的一种具体实施方式，AP包括用于将其固定在支撑物上的亲和标签。亲和标签可用于在蛋白质生产过程中纯化蛋白质和/或用于将它们固定在本发明的基质的支撑物上。亲和标签可以是短的多肽序列或完整的蛋白质，其作为与靶蛋白质的融合配偶体共表达。除了促进纯化和快速固定外，融合标签有时也有利于提高重组蛋白的表达和溶解度。亲和标签可用于确保蛋白质的正确取向，或者可以使用各种取向，从而使功能域可用于交互。不同类型的亲和标签是本领域众所周知的(Terpe,Appl Microbiol Biotechnol(2003)60:523-533)，其中，多组氨酸或His₆-标签被特别详细地描述并且是将根据本发明的AP结合到支撑材料的一种选择。能另外用于将AP结合到支撑物的亲和标签可以选自由包括C-myc-标签、FLAG-标签和血凝素(HA)-标签所组成的组。

根据本发明的另一种实施方式，AP蛋白也可以通过使用第二配体吸附AP而固定在支撑物上。这可以通过使用已经与生物素反应或生物素化的AP来实现，然后吸附到含有固定化亲和素或链霉亲和素的支撑物上。一种可能的生物素化技术是在pH 9下将AP与N-羟基琥珀酰亚胺-D-生物素一起孵育。然后可以使用生物素与链霉亲和素或亲和素的非共价连接来固定这些蛋白质。这些连接具有10¹³～10¹⁵M^-1的关联平衡常数。

根据本发明的另一种实施方式，如下文进一步详述和/或如现有技术所述(Cuatrecasas,J Biol Chem(1970)245:3059-3065；Nisnevitch等人，J Biochem BiophysMethods(2001)49:467-480)，AP蛋白共价连接至支持物。共价偶联通常包括基于利用支撑物和/或蛋白质上的官能团的蛋白质的共价非定点连接(Nisnevitch等人，J BiochemBiophys Methods(2001)49:467-480,Section 2.3)。根据本发明的另一种实施方式，蛋白质的共价连接是蛋白质的定点连接(Nisnevitch等人，J Biochem Biophys Methods(2001)49:467-480,Section 2.4；Makaraviciute等人，Biosensors and Bioelectronics(2013)50:460-471)。本质上，将抗体连接到基质上的技术指导(通常在免疫亲和方法中进行)可用于将AP蛋白固定在支撑物上。本文公开的关于将抗体固定到支撑物或基质上的参考文献也被认为可能与固定单体AP变体相关。

如本文所用，表述“支撑物”是指用作结合根据本发明的AP的“底物”或“支撑物材料”的基质部分。此类支撑物或支撑物材料有时也称为“吸附材料”或“吸附剂”，并且此类表述应包含在本文所用的表述“支撑物”中。

在其他实施方式中，对“支撑物”的提及，例如当提及用于固定AP的固定方法时，也适用于膜，如本文公开的滤血器的膜。

根据本发明的合适的支撑物应该是均匀的、亲水的、在相关的pH范围和温度下机械和化学稳定的，在使用过程中没有或可忽略不计的AP浸出、选择性、表现出最小的非特异性吸收，否则应该是血液相容的，即，不会引起不良反应(包括补体系统或其他免疫途径的激活)、对全血和/或血浆具有良好的流动特性，并且为AP附着提供大的表面积。

支撑物可以是树脂、膜或无纺布。如本文所用，表述“树脂”是指可呈半透明凝胶或凝胶珠形式或呈具有孔隙且外观不透明的微孔珠形式或者可呈海绵形式的不溶性材料。这种树脂可以是天然或生物聚合物、合成聚合物和无机材料。琼脂糖、葡萄糖和纤维素珠是常用的天然支撑物。合成聚合物或有机支撑物主要基于丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯衍生物，而多孔二氧化硅和玻璃是一些常用的无机支撑物。可以根据本发明使用的其他材料描述如下。

根据本发明的一种实施方式，树脂由以下材料组成：聚合物，选自由海藻酸盐、壳聚糖、甲壳素、胶原蛋白、卡拉胶、明胶、纤维素、淀粉、果胶和琼脂糖所组成的组；无机材料，选自由沸石、陶瓷、硅藻土、二氧化硅、玻璃、活性炭和木炭所组成的组；或合成聚合物，选自由聚乙烯(PE)、聚甲醛(POM)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚醋酸乙烯酯(PVA)、聚偏二氯乙烯(PVDC)、聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯酸酯(PAA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚丙烯腈(PAN)、聚酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酰胺、聚芳酰胺、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PEAS)、乙烯醋酸乙烯酯(EVA)、乙烯乙烯醇(EVOH)、聚酰胺酰亚胺、聚芳醚酮(PAEK)、聚丁二烯(PBD)、聚丁烯(PB)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚己内酯(PCL)、聚羟基链烷酸酯、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮酮(PEKK)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚酰亚胺、聚乳酸(PLA)、聚甲基戊烯(PMP)、聚(对苯醚)(PPE)、聚氨酯(PU)、苯乙烯丙烯腈(SAN)、聚丁烯酸、聚(4-烯丙基苯甲酸)、聚(丙烯酸缩水甘油酯)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚二乙烯基苯(PDVB)、聚(烯丙基缩水甘油醚)、聚(乙烯基缩水甘油醚)、聚(乙烯基缩水甘油氨基甲酸酯)、聚烯丙胺、聚乙烯胺所组成的组，所述聚合物的共聚物以及通过引入官能团改性的这些聚合物的任何共聚物。根据本发明的一种具体实施方式，该支撑物选自由苯乙烯二乙烯基苯(DVB)和衍生物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和衍生物以及聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)和衍生物组成的组。

根据本发明的又一实施方式，支撑物是无纺布。如本文所用，表述“无纺布”是指广泛定义为通过机械、热或化学方式但不通过编织或针织来缠结纤维或长丝(以及通过穿孔膜)而结合在一起的片材、织物或网状结构的材料。它们形成多孔结构，由于它们的高过滤效率、高表面积和高渗透性，可以有效地用作根据本发明的装置中的支撑材料。无纺布及其生产方法(包括熔喷无纺布和纺粘无纺布，以及包含此类无纺布的装置)在本领域中是已知的并且被描述在例如EP 1 922 097 A1、WO 2007/025738 A2和Zhao等人，J Mem Sci(2011),369:5-12中。无纺布可由以下材料构成：生物聚合物，选自由多糖、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)和蛋白质所组成的组；无机材料，选自由TiO₂、SiO₂或AlO₂所组成的组；或合成聚合物，选自由聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚丙烯腈(PAN)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚酰胺酰亚胺(PAI)、聚氨酯(PUR)、聚醚砜(PES)、聚丙烯酸(PAA)、聚环氧乙烷(PEO)、聚苯乙烯(PS)和聚偏二氟乙烯(PVDF)所组成的组。

根据另一方面，根据本发明的装置可以是如WO 2014/07680 A1中公开的过滤装置，其包括中空纤维束膜和在装置的滤液空间中的树脂，其中，树脂优选由珠子组成。通过选择允许至少相关靶标通过膜壁的膜，这种装置可被配置成用作根据本发明的用于使靶标去磷酸化的装置。该装置的滤液空间中的树脂用作基质并且包括树脂支撑物，如本文或WO2014/07680 A1中公开的，AP通过本文公开的方法或本领域已知的其他方法结合到树脂支撑物上。

AP的固定：

如上所述，根据本发明的AP可以与支撑物或膜共价结合。在这方面，对基质的支撑物的参考也可应用于滤血器的膜，这取决于膜的特定材料和对所采用的固定策略的适用性。

形成AP可以共价连接的基质的产生基础的支撑物必须提供或促进化学活化，从而允许AP的化学偶联。许多用于固定其他配体如抗体或其片段的偶联方法是本领域众所周知的并且可用于固定AP。一般而言，活化化学品应该在很宽的pH值、缓冲条件和温度范围内保持稳定，从而导致结合蛋白质或配体(在这种情况下为AP)的浸出可以忽略不计。偶联方法应避免AP的不正确定向、多位点连接或空间位阻，这可能导致活性酶位点或口袋的掩蔽，从而导致活性损失。可以考虑定点连接和/或间隔物将AP固定到支撑物上。可以优化每体积基质的AP密度以促进靶标的可及性和活性。

偶联可以通过常见的官能团(包括胺、醇、羧酸、醛和环氧基)来进行(图6A和图6B)。制备根据本发明的支撑物的方法是本领域已知的并且描述于例如US 8,142,844 B2、US 2015/0111194 A1和US 2014/0166580 A1中。这些参考文献还描述了可用于产生根据本发明的基质的间隔基团(或“连接体”基团)。

根据本发明的一种实施方式，AP直接偶联或通过胺官能团在添加间隔物的情况下偶联。在第一步骤中，胺基被引入到支撑物上。许多方法可用于将胺基团引入根据本发明的基底。例如，在膜沉淀之前将胺化聚合物(例如，胺化聚乙烯醇)添加到聚合物溶液中，或使用APTMS((3-氨基丙基)三甲氧基硅烷-四甲氧基硅烷)、将PEI(聚(乙烯亚胺))或其他聚合物简单吸附到膜表面上，或者用铵或其他有机胺蒸气对膜进行等离子体处理，都可以有效地将胺基团引入到膜上。在第二步骤中，碳二亚胺化合物可用于激活蛋白质的羧基，以通过酰胺键直接与膜表面的伯胺结合。最常用的碳二亚胺是用于水性交联的水溶性EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)和用于非水性有机物的不溶于水的DCC(N',N'-二环己基碳二亚胺)合成方法。根据本发明的另一种实施方式，可以将羟基引入到支撑物中。基于多糖的基底，例如纤维素或纤维素衍生物，其表面已经带有OH基团。羟基也可被引入到基底中，例如通过用氧气或空气进行等离子体处理。在用琥珀酸酐酰化羟基后，所得的O-琥珀酸酯可以在碳二亚胺或其他偶联剂的存在下与蛋白质的胺反应，以形成酰胺键。根据本发明的又一种实施方式，可以将羧酸基引入到支撑物中。通过用二氧化碳进行等离子体处理，可以将羧酸根引入基底上。对于蛋白质固定，碳二亚胺/琥珀酰亚胺偶联化学可用于通过AP的胺基团进行的表面连接。根据本发明的又一种实施方式，可以引入羰基(醛、酮)用于随后的AP偶联。通过使用高碘酸氧化OH基团，可以在基于多糖的固体基底上产生醛。蛋白质的伯胺(多肽的N端和赖氨酸的侧链)可以通过还原胺化和形成席夫碱而与醛反应。所形成的席夫碱然后在水溶液中水解并且必须还原成烷基胺键以便稳定。氰基硼氢化钠是一种温和的还原剂，其可在不还原蛋白质的其他化学基团的情况下诱导该反应。根据本发明的另一种实施方式，可以将环氧基引入到支撑物中。几种表面涂有高密度环氧官能团的预活化树脂可商购，见下文。例如在WO 2005/026224 A1中描述了在膜上引入环氧基团。在开环过程中与亲核试剂反应的环氧基分别与蛋白质的伯胺、硫醇或羟基反应，以形成稳定的仲胺、硫酯和醚键。环氧基团很容易与硫醇基团反应，并且需要接近生理pH值(pH 7.5～8.5)的缓冲系统。环氧基团需要高pH条件(pH 11～12)才能与羟基反应，并需要中等碱性条件(pH>9)才能与胺基反应。在每种情况下，可以在支撑物与AP之间引入不同链长的间隔物。

上面和下面提到的几种类型的支撑物可以有利地用于偶联，例如，用于亲和层析的蛋白质。亲和性支撑物可以基于诸如多糖的材料。合适的多糖是例如纤维素、硝化纤维素、壳聚糖、胶原、淀粉和交联的多糖凝胶，如琼脂糖、Sephadex或Sepharose。制备多糖基质衍生物的方法早已为人所知，并且被描述于例如US 4,411,832或US 3,947,352中。支撑物也可以基于合成有机支撑物。合成聚合物基质包括亲水性和疏水性合成聚合物及其组合。合成支撑物包括选自例如由聚丙烯酰胺支撑物或其衍生物；聚甲基丙烯酸酯支撑物或其衍生物；聚苯乙烯支撑物或其衍生物；或聚醚砜支撑物或其衍生物所组成的支撑物的组中的支撑物。另外，衍生的二氧化硅、玻璃或二氢唑酮珠可用于根据本发明的装置中。这种装置优选使用有机支撑物。在本发明的上下文中，珠子的使用可能是有利的。

根据本发明的一种实施方式，支撑物材料应该是多孔的，其中，孔径为10至200nm。对于亲和应用，已发现孔径在30～200nm或60～200nm的范围内是最佳的。然而，其他孔径也可能是有利的，这取决于所使用的偶联化学品、间隔物和AP类型，也取决于去磷酸化的靶标。如果支撑物以珠子的形式使用，这种珠子的直径可以在一定范围内变化。使用直径为50至1000μm的珠子可能是有利的。使用直径为60至800μm、100至700μm、120至800μm的珠子可能是进一步有利的。

根据本发明的一方面，支撑物带有偶联连接体和/或AP所需的特定官能团。例如，许多官能化树脂是可商购的并且是本领域技术人员已知的。已经带有用于偶联AP的反应性基团的有或没有间隔物的预活化树脂支撑物是可商购的，并且去除了在使用之前(即在偶联AP之前)对支撑物进行化学活化的许多步骤。这种支撑物通常是如前定义的树脂，而对于膜和/或无纺布支撑物而言，活化步骤通常必须在偶联之前进行。包括伯胺、巯基、醛、羟基和羧酸在内的多种偶联化学可在所述商业支撑物中获得，用于共价连接AP。市售活化树脂的实例有UltraLink碘乙酰树脂、CarboLink偶联树脂、Profinity^TM环氧树脂、Affi-Gel 10和15、环氧活化的Sepharose^TM6B、三氟代乙烷磺酰氯活化的琼脂糖、Tosoh

AF氨基或环氧树脂650-M、ChiralVision Immobead^TM 350、Resindion ReliZyme^TM EXE 135或SEPABEADS^TM以及用环氧基团官能化的

Lifetech^TM甲基丙烯酸酯聚合物。

根据本发明的一种实施方式，用于偶联AP的支撑物是环氧官能化的，因为环氧基团与不同的蛋白质基团，例如赖氨酸或亲核试剂(氨基、硫醇、酚类)中的-NH₂形成非常稳定的共价键并且可以在温和的pH和温度条件下进行固定化。

根据本发明的另一种实施方式，支撑物采用珠子的形式。根据本发明的又一种实施方式，支撑物是环氧官能化的甲基丙烯酸酯聚合物。根据本发明的又一种实施方式，支撑物选自由Tosoh

Epoxy 650-M、ChiralVision Immobead^TM 350、ResindionReliZyme^TM EXE 135、Resindion SEPABEADS^TM和

Lifetech^TM所组成的组。根据一个方面，使用

Lifetech^TMECR8209FF环氧甲基丙烯酸酯珠子，其带有环氧基团作为AP可以结合的官能团。它们具有

的平均孔径和150～300μm的粒径。根据另一方面，使用

Lifetech^TMECR8215M环氧甲基丙烯酸酯珠子，其带有环氧基团作为AP可以结合的官能团。它们具有

的平均孔径和300～710μm的粒径。根据另一方面，使用

Lifetech^TMECR8215F环氧甲基丙烯酸酯珠子，其带有环氧基团作为AP可以结合的官能团。它们具有

的平均孔径和150～300μm的粒径。

根据本发明的另一种实施方式，还能够例如以离子方式或通过络合将AP非共价地固定到支撑物上。然而，优选共价结合以避免AP从基质浸出到患者的血液或血浆中的风险。

根据本发明的另一种实施方式，该支撑物是膜。根据本发明的一种实施方式，该支撑膜是中空纤维膜。根据本发明的另一种实施方式，多个中空纤维膜形成为中空纤维束并嵌入外壳中，从而形成过滤器或过滤装置。根据一种实施方式，该支撑物包括血液透析中空纤维膜透析器，其中，该过滤器是血液透析器或滤血器。

在根据本发明的装置中用作支撑物的中空纤维或平板膜可以由以下聚合物、所述聚合物的组合和通过引入官能团改性的这些聚合物中的任一种组成，该聚合物为纤维素、纤维素酯(醋酸纤维素和三醋酸纤维素)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚酰胺(PA)、其他含氮聚合物(聚苯并咪唑、聚丙烯腈(PAN)、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)。根据本发明的一种实施方式，根据本发明的膜支撑物包括以下聚合物、所述聚合物的组合和通过引入官能团改性的这些聚合物中的任一种，该聚合物选自由聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚酰胺(PA)、聚丙烯腈(PAN)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)所组成的组。根据本发明的另一种实施方式，根据本发明的膜支撑物包括以下聚合物、所述聚合物的组合和通过引入官能团改性的这些聚合物中的任一种，该聚合物选自由聚酰胺(PA)、聚丙烯腈(PAN)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)、聚芳醚砜(PAES)所组成的组。根据本发明的又一种实施方式，根据本发明的膜支撑物包括以下聚合物、所述聚合物的组合和通过引入官能团改性的这些聚合物中的任一种，该聚合物选自由聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚砜(PS)、聚醚砜(PES)和聚芳醚砜(PAES)所组成的组。

为了进行偶联反应以随后在膜表面上结合AP，需要聚合物官能化步骤。可以使用已知方法，例如在US 2015/0111194 A1和US 2014/0166580 A1中描述的方法。例如，由烷烃链如聚乙烯制成的合成材料不包含用于将分子与其偶联的合适官能团。因此，必须在聚合物合成后化学引入合适的官能团。改性聚合物的一种可能性是已知的等离子体官能化方法，其允许通过选择合适的气体等离子体将官能团引入聚合物中。该方法包括例如使用氨等离子体，其中，氨基官能团形成在处理过的聚合物的表面上。因此，处理例如带有氨等离子体的聚乙烯产生了带有一定量氨基官能团的聚乙烯基体。这些氨基随后可以与连接体的合适的官能团(例如羧基)反应。或者，基体聚合物可以通过等离子体活化来官能化以获得羧基。例如，在US 2007/0296105 A1中进一步描述了以连续方式官能化中空纤维膜的方法。在所述方法中，由前体气体引入的官能团可以是氨基、羧基、醛基、酯基、环氧基、羟基或磺酸基。可用作本发明支撑物的膜包括例如本领域已知的血浆分离膜和血液透析膜，包括但不限于：众所周知的高通量膜、高截留膜或中等截留膜。血浆分离的目标是具有在分离的血浆部分中含有血液的总血浆蛋白，而血液中较大的微粒组分(如血细胞和细胞碎片)被膜保留。此外，这样的血浆分离膜应该表现出膜的高表面孔隙率和总孔隙率以实现高过滤性能。它还应具有亲水性、自发可润湿性膜结构、长期稳定过滤的低污染特性和低蛋白质吸附性。这种血浆分离膜优选具有与血液接触的光滑表面，从而避免或最小化血液处理期间的溶血。在整个处理期间，膜应显示出恒定的筛分特性和过滤行为。它还应表现出高生物相容性、低补体激活或无补体激活和低血栓形成性。可用于提供根据本发明的装置的适用于血浆分离的膜在本领域中是已知的，并且被描述于例如EP 1 875 956 A1或EP 1 875 957 A1中。EP 2 113 298 B1已经描述了可以改进并用作根据本发明的装置中的支撑物的其他膜，例如在透析器中使用的高通量膜。US 2017/0165616 A1中描述了例如在

透析器中使用的中截留膜，并且EP 1 572 330描述了例如在

透析器中使用的高截留膜A1。

医学用途、感染和败血症：

在一些实施方式中，本发明涉及如本文所述的血液处理装置作为治疗感染(优选血液或全身感染)的药物的用途。在一些实施方式中，可以治疗与磷酸化LPS或ATP或ADP相关的任何感染。还设想了相应的治疗方法。

如本文所用，本发明范围内的“感染”是指由病原体或潜在病原体、生物体和/或微生物侵入通常无菌的组织或体液引起的病理过程，并且优选地涉及由细菌、病毒、真菌和/或寄生虫引起的感染。因此，感染可以是细菌感染、病毒感染和/或真菌感染。感染可以是局部或全身感染。出于本发明的目的，病毒感染可被认为是微生物感染。

此外，患有感染的受试者可能同时患有超过一种来源的感染。例如，患有感染的受试者可能患有：细菌感染和病毒感染；病毒感染和真菌感染；细菌感染和真菌感染，以及细菌感染、真菌感染和病毒感染，或者患有包含本文所列出的一种或多种感染的混合感染，包括潜在的重复感染，例如一种或多种细菌感染，以及一种或多种病毒感染和/或一种或多种真菌感染。

如本文所用，“感染性疾病”包括与细菌和/或病毒和/或真菌感染相关的所有疾病或病症。在一些实施方式中，待治疗的疾病包括所有与磷酸化LPS、或ATP或ADP相关的感染性疾病，或将受益于用本文所述的固定化AP治疗的所有感染性疾病。

接受根据本发明的治疗的受试者也可以接受额外的感染治疗。本发明的医学治疗可以是抗生素治疗，其中，如果已诊断出感染或已确定感染性疾病感染性疾病的症状，则可以给药一种或多种“抗生素”或“抗生素剂”。针对感染或预防新感染的其他抗生素剂/治疗剂或治疗策略包括防腐剂、去污产品、抗毒剂(如脂质体)的使用；卫生；伤口护理；手术。还可以将几种上述抗生素剂或治疗策略与流体疗法、血小板输注或血液制品输注结合。

在本发明的优选实施方式中，患者被诊断为患有败血症。在一些实施方式中，患者可能已被诊断为患有重度败血症和/或败血性休克。

重症监护病房中的大量患者死于通常称为“败血症”或“败血性休克”的并发症。败血症是身体对感染的压倒性和危及生命的响应，可导致组织损伤、器官衰竭和死亡。败血症的一般参数是发烧(核心温度>38.3℃)、低体温症(核心温度<36℃)、心率>90bpm或比特定年龄的正常值高出>2SD、呼吸急促：>30bpm和改变精神状态，以及显著的水肿或体液正平衡(超过24小时>20mL kg-1)和在没有糖尿病的情况下的高血糖(血浆葡萄糖>110mg dL-1或7.7mM L-1)。当除了败血症的体征外，还存在诸如呼吸困难(肺部问题)、尿排出量少或无排出(肾脏)、肝脏检查异常(肝脏)和精神状态的变化(脑)之类的器官功能障碍的体征时，败血症会发展为重度败血症。几乎所有的重度败血症患者都需要在重症监护病房(ICU)接受治疗。

败血性休克是最严重的级别，当血压下降到危险水平时就会被诊断出来。此外，外伤、烧伤、胰腺炎和缺血-再灌注损伤属于SIRS、全身炎性反应综合征、多器官系统功能障碍综合征(“MODS”)和多器官系统衰竭(“MOSF”)的非感染性病因。SIRS的机制是宿主衍生的炎症介质的过度释放，在本文中称为毒性介质(“TM”)。TM包括各种细胞因子(肿瘤坏死因子，TNF；白细胞介素；干扰素)、各种前列腺素、各种凝血因子(血小板活化因子、PAF)、各种肽酶、活性氧代谢物，和各种引起器官功能障碍(心肌抑制剂因子，MDF)的知之甚少的肽。如果炎症反应过度，那么重要器官组织的损伤或破坏可能导致多器官功能障碍综合征(“MODS”)，包括急性肾衰竭。

败血症也可被定义为“由宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍”。败血性休克被定义为在没有血容量不足和开始血管加压药治疗以保持平均动脉压高于65mmHg的情况下乳酸水平升至高于2mmol L-1。器官功能障碍被定义为序贯器官衰竭估计(SOFA)评分系统增加两分或更多分(Gül等人，Turk J Anaesthesiol Reanim.2017Jun；45(3):129–138)。根据qSOFA评分系统，如果以下3个临床标准中有2个为阳性，则表明为败血症：1.精神状态改变(GCS评分<15)；2.收缩压<100mmHg；3.呼吸频率>22/min。

如本文所用，表述“败血症”也适用于满足前述的感染后败血症参数或前述qSOFA筛选标准的任何条件，其中，序贯器官衰竭估计(SOFA)评分系统增加两分或更多分表明败血症和/或qSOFA临床标准。对于临床操作化，器官功能障碍可以优选地表现为序贯器官衰竭估计(SOFA)评分增加2分或更多分，这与大于10％的院内死亡率相关。败血性休克可以定义为败血症的一个子集，其中，特别严重的循环、细胞和代谢异常与比单独败血症更大的死亡风险相关。败血性休克患者在临床上可以在没有血容量不足的情况下通过血管加压药需要来维持平均动脉压为65mmHg或更高和血清乳酸水平大于2mmol/L(>18mg/dL)来确定。

如本文所用，“序贯器官衰竭估计评分”或“SOFA评分”是用于跟踪患者在重症监护病房(ICU)住院期间的状态的评分。SOFA评分是一种评分系统，用于确定一个人的器官功能程度或衰竭率。该评分基于六种不同的评分，呼吸系统、心血管系统、肝脏、凝血、肾脏和神经系统各有一个评分。平均和最高SOFA评分都是结果的预测指标。在ICU的前24～48小时内SOFA评分的增加预测死亡率至少为50％～95％。低于9分预测死亡率为33％，而高于14分可能接近或高于95％。根据SEPSIS-2定义，术语“败血症”还包括重度败血症或败血性休克。术语“败血症”还包括符合SEPSIS-3定义的受试者。本文使用的术语“败血症”涉及败血症发展的所有可能阶段。

因此，本发明的一个目的是提供一种用于血液的体外净化和处理的装置，其可用于治疗患有败血症的患者，尤其是在急性情况下并且在药物没有指示或有效的情况下。本发明的另一个目的是提供一种用于血液的体外净化和处理的装置，该装置可用于治疗患有器官衰竭(特别是肾衰竭和败血症)的患者。

急性肾衰竭(ARF)和败血症相关的急性肾损伤(SA-AKI)：

急性肾衰竭(ARF)，也可互换称为急性肾损伤(AKI)，是肾脏过滤功能的快速丧失，其特征是代谢性酸中毒、高钾水平和体液失衡。这种情况通常以血清肌酐浓度或血尿素氮(BUN)浓度升高为标志。如本文所用，术语“急性肾损伤(AKI)”或“急性肾衰竭”涉及肾功能的突然持续下降。

诊断标准通常但不限于如下所示：48小时内血清肌酐升高>0.3mg/dl(26.5μmol/L)；或血清肌酐增加至基线的1.5倍，已知或推测发生在7天内；或尿排出量<0.5ml/(kg·h)达6～12h。根据严重程度，病情分为1、2、3期。肾脏疾病：改善全球成果(KDIGO)小组将这些阶段定义为：1：在6小时阻滞期间，血清肌酐增加到基线的1.5～1.9倍或增加>26.4umol/L(0.3mg/dl)或尿排出量<0.5ml/kg/h，2：在两个6小时阻滞期间，血清肌酐增加到基线的2.0～2.9倍或尿排出量<0.5ml/kg/h，以及，3：在超过24小时或无尿超过12小时期间，血清肌酐增加到基线的>3倍或增加到>353umol/L(4mg/dl)或开始肾脏替代治疗或尿排出量<0.3ml/kg/h。如本文所用，术语“感染相关的肾功能障碍”涉及患有感染的患者的任何肾功能丧失。

已知肾功能障碍自1970年代以来就与多种感染性病原体有关(Zech等人，AdvNephrol Necker Hosp.1971；1:231-58.)。非限制性地，已知在感染败血症葡萄球菌、钩端螺旋体感染和立克次体感染后的急性肾病中会发生肾脏损害。革兰氏阴性败血症，可能通过感染性休克，更容易导致肾小管病变。已知溶血性败血症会导致肾小管坏死。在严重的情况下，肺部或泌尿道感染也可能导致肾功能障碍。

如本文所用，术语“败血症相关的急性肾损伤(SA-AKI)”涉及败血症患者的AKI。败血症是ARF最常见的诱因。当血液培养物为阳性时，约19％的中度败血症患者、23％的重度败血症患者和51％的败血性休克患者会发生ARF。败血症与其病因的单一机制不同，它与整个细胞机制(适应性和适应不良)相关，它们相互增强并最终导致临床SA-AKI。微循环是重要的生理区室，其中这些机制聚集在一起并发挥其综合和有害的作用。这些机制包括内皮功能障碍、炎症、凝血障碍和对损伤的适应性细胞反应。这最终会导致肾功能衰竭，败血症期间肾脏的早期功能障碍的关键事件似乎是肾小管上皮细胞的生物能量应激，以响应肾小管周围微血管功能障碍产生的放大炎症信号。

因此，本发明解决了肾衰竭和由例如LPS引起的任何病理学负面影响。脂多糖(LPS)尤其是在败血症期间会引起多种急性病理生理效应，如发烧、致死、巨噬细胞和B淋巴细胞活化。因此，本发明提供了一种改善LPS的负面影响并同时提供RRT的方法。

附图说明

本发明通过以下附图进行进一步描述。这些旨在代表本发明的多个优选的非限制性实施方式或方面的更详细的说明，而不限制本文描述的本发明的范围。

图1：本发明的优选实施方式的示意图，表示AP偶联到中空透析膜的管腔，连接到在用于体外血液处理回路的装置中的血液处理装置中。

图2：固定化碱性磷酸酶活性测定的结果。

(A)图2A示出了用于确定AP在改性膜上的活性的去磷酸化pNPP的吸光度(405nm)的标准曲线。带有固定化AP的膜样品的测量活性以pNPP min-1的μmol为单位与每个样品的重量一起显示在表中。使用样品膜重量和整个透析器的膜重量将活性外推到整个透析器的活性。

(B)图2B示出了pNPP溶液与固定在环氧树脂(ECR8209F)和NH2(ECR8409F)珠子上的AP反应时测得的吸光度。在以1:4的比例混合树脂与商业pNPP溶液后，测量随时间推移的吸光度的发展。当未改性树脂不含AP时，根据观察到的信号校正吸光度。

图3：包括血液处理装置的体外处理回路的示意图。该装置可以是筒或过滤器，其包括已经结合有AP的基于膜、树脂或无纺布的支撑物。该回路可以在血液灌流模式下运行。在血液处理装置是中空纤维膜过滤装置的情况下，该处理模式可以是具有封闭透析液/滤液端口的过滤器的血液透析、血液透析滤过、血液滤过或血液灌流。

图4：包括血液处理装置的体外处理回路的示意图。该装置可以是包括树脂或无纺布的吸附筒或包含膜的过滤器，AP已分别结合至该膜。血液处理装置可以位于单独的血液透析器的上游(透析器前设置，图4A)或血液透析器的下游(透析器后设置，图4B)。回路中的非功能化血液透析器可以根据医疗需要在不同的治疗模式(包括血液透析、血液透析滤过或血液滤过模式)下运行。

图5：包括血液处理装置的体外处理回路的示意图。该装置灌注有血浆。在所示的实施方式中，血浆分离过滤器用于从全血中分离血浆。血浆过滤器通过0.03μm～2μm的孔径产生包含靶蛋白质的血浆部分。血浆通过血液处理装置灌注，该血液处理装置包括AP已结合到其上的基于无纺布、树脂或膜支撑物的基质。

图6：靶蛋白与环氧活化或氨基支撑物共价偶联的示意图。支撑物可以是树脂、膜，包括中空纤维膜、平板膜或纤维垫或无纺布。(A)示出了蛋白质通过蛋白质的氨基与支撑物的直接偶联(实施例6)。(B)示出了酶的共价固定是基于氨基树脂的使用。氨基树脂可以用戊二醛预活化，然后用于酶的共价固定。醛基与靶蛋白的氨基反应很快并且形成席夫碱(亚胺)，从而在酶与载体之间形成稳定的多点共价结合。亚胺双键可以用硼氢化物进一步还原。

图7：AN69中空纤维的扫描电子显微镜(SEM)图像与这种中空纤维在成束使用时如何用于透析的示意设置一起示出。

图8：微型组件伽马灭菌后的AP活性测试的结果。

实施例

本发明通过以下实施例进行进一步描述。这些旨在提供对本发明的许多优选的非限制性实施方式或方面的可操作性的支持，而不限制在本文描述的本发明的范围。

实施例1：将AP固定在滤血器膜上

膜制备：

在本发明的原理方法的证明中，碱性磷酸酶(AP)被固定到各种膜上。表描述了以浇铸膜所用溶液的百分比表示的所用膜的不同组分(括号中给出了总溶液重量为50g的重量)。

表：膜组分

*先将柠檬酸溶解在水中，然后将壳聚糖溶解过夜，然后再加入其余的混合物。

在连续搅拌下，将组分在60℃下溶解过夜。在所有组分完全溶解后，将溶液从油浴中取出并冷却1小时。使用100μm的刀在电子浇铸机上浇铸平板膜。将刀放在干净的玻璃板上，并且涂覆约10mL的聚合物溶液。然后以25mm/s的速度启动发动机，直到聚合物膜覆盖整个玻璃板。发动机返回其起始位置，去除刀，并将镀层的玻璃放入500mL的软化水浴中。在5分钟后，用清水代替水，2小时后重复此过程，将膜在水浴中再放置4小时，然后在60℃下真空放置过夜，以完全去除所有NMP。

碱性磷酸酶与膜偶联：

将膜切成小块(约1x1cm)并且确定其准确重量(通常约为3～7mg)。将总共5mg的活性为4000U/mg且蛋白质含量为24.5mg/mL的碱性磷酸酶(Santa Cruz Biotechnology)等分成5μL等分试样，每份含有100U/μL。对于每个固定实验，将5μL等分试样溶解在1mL的含有1mM CaCl₂的pH 8.5的0.5M TRIS中，以获得500U/mL的溶液。将膜置于含有900μLMillipore H₂O、100μL的500U/mLAP和2.5mg/mL的EDC的EP(Eppendorf)管中。然后将膜保持在转鼓振荡器上，在室温下保持3～4小时，并在4℃下放置过夜。在18小时后，将膜放入50mL0.5M NaCl溶液中并置于转筒振荡器(tumbler shaker)上以去除未结合的AP。在4小时后，将洗涤液替换为1x PBS，并在转筒振荡器上再放置2小时。或者，将膜放入含有1mL的含有2.5mg/mL EDC的MES缓冲液的EP管中30分钟，取出并洗涤，然后放入1mL的50U/mLAP中过夜。

固定化碱性磷酸酶的活性测定：

在最后的洗涤步骤之后，将膜放入1mL的对硝基苯磷酸(pNPP)液体底物体系(Sigma Aldrich)中。为了测定活性，去除了75μL的pNPP溶液，并且在t＝10min、20min、30min和60min时测定了吸光度。在每个时间点，再次确定前一个时间点的吸光度，并使用吸光度随时间的变化来评估碱性磷酸酶从膜中的释放(因为释放导致持续的显色并且后续时间点的读数会显示吸光度增加)。然后将吸光度与标准浓度的去磷酸化pNPP溶液的吸光度进行比较，并以每分钟转化的pNPP的μmol为单位测定膜上的碱性磷酸酶的活性。

结果：

两种不同膜的结果示出了测量的活性为0.06～0.10μmol min^-1。为了澄清结果并补偿不同样品膜的重量，将活性外推到整个透析器(包含20克的膜)的活性，这表明活性约为560μmol min^-1。碱性磷酸酶的释放在所有情况下都是最小的，除了一个例外，没有超过平均活性的标准偏差。这些实验的结果如图2A所示。

实施例2a：将AP固定到环氧官能化的吸附剂树脂上：

首先，平衡树脂。树脂用固定缓冲液洗涤并过滤。1/1(w/v)的树脂/缓冲剂比是优选的。选择与AP相容的固定缓冲液。该过程重复2～4次。AP溶液是通过将蛋白质溶解在固定缓冲液中来制备的。例如，每克湿树脂可以装载100～200mg AP。蛋白质浓度可以通过使用标准蛋白质含量测定来确定。将AP溶解在足够量的缓冲液中，以获得1:4(w/v)的树脂/缓冲液比。该比值可以根据所使用的蛋白质进行优化(范围可以在1:1～1:4之间变化)。固定化始于将含有AP蛋白的固定缓冲液转移到固定化容器中。然后加入环氧官能化树脂，例如本文描述的

Lifetech^TM树脂。将浆料以70～80rpm轻轻混合18小时，然后再静置20小时。在蛋白质固定过程中应避免磁力搅拌，因为这会损坏珠子。取决于蛋白质的稳定性，固定化可以在20℃～30℃的温度下进行。不应在高温下进行固定，因为这会导致环氧树脂环降解(水解)并促进微生物生长。最后，滤出并收集液相。确定液体中的蛋白质含量并计算固定化收率。然后用洗涤缓冲液洗涤树脂。该过程在温和搅拌或柱洗涤下重复2～4次。可以使用含有0.5M NaCl的缓冲液进行额外的洗涤步骤，以完全解吸非共价结合的蛋白质。过量的水通过过滤除去。然后可以根据水分含量和特异性结合活性来表征固定化的AP蛋白。

实施例2b：将AP固定在氨基官能化的吸附剂树脂上：

首先，平衡树脂。树脂用固定缓冲液洗涤并过滤。1:1(w/v)的树脂/缓冲剂比是优选的。选择与AP蛋白相容的固定缓冲液。在第二步骤中，从25％(w/v)戊二醛的溶液开始制备2％戊二醛缓冲液。使用固定缓冲液制备2％戊二醛(v/v)溶液。在第三步骤中，通过将步骤2中制备的2％戊二醛缓冲液添加到树脂中来活化氨基树脂。2％戊二醛缓冲液的最佳体积应在树脂/缓冲液比为1:4(w/v)的范围内。将浆料在20℃～25℃下混合60分钟。然后将珠子过滤并用固定缓冲液洗涤，树脂/缓冲液的比例为1:4(w/v)。应避免将预活化树脂储存超过48小时。然后珠子准备好进行固定步骤。在第四步骤中，制备AP蛋白溶液。为此，将蛋白质溶解在固定缓冲液中。例如，每克湿树脂可以装载1mg～100mg的AP蛋白。蛋白质浓度可以通过使用标准蛋白质含量测定来确定。

将蛋白质溶解在缓冲液中，以获得1:4(w/v)的树脂/缓冲液比。可以在进一步的试验中对该比例进行优化(范围可以在1:1–1:4之间变化)。在第五步骤中，蛋白质被固定。将固定缓冲液转移到固定容器中，并加入在步骤3中制备的预活化氨基树脂(例如来自

Lifetech^TM)。将浆料以70～80rpm轻轻混合18小时。在固定过程中应避免磁力搅拌，因为这会损坏珠子。根据AP蛋白的稳定性，固定可以在20℃～30℃下进行。固定不应在高温下进行，因为这可能会导致步骤3中形成的树脂上的醛基发生副反应。最后，滤出并收集液相。确定液体中的蛋白质含量并计算固定化收。然后用洗涤缓冲液洗涤树脂。该过程在温和搅拌或柱洗涤下重复2～4次。可以使用含有0.5M NaCl的缓冲液进行额外的洗涤步骤，以完全解吸非共价结合的蛋白质。过量的水通过过滤除去。然后可以根据水分含量和特异性酶活性来表征固定化的AP蛋白。

固定化碱性磷酸酶的活性测定：

随后将如上所述的经处理以固定AP的环氧树脂和氨基官能化树脂放入1mL的对硝基苯磷酸(pNPP)液体底物系统(Sigma Aldrich)中。

如上所述，为了测定活性，将75μL的pNPP溶液去除，并且测定随时间推移的吸光度。吸光度然后针对在未改性树脂未用AP处理时获得的任何背景信号进行校正。

结果：

环氧树脂和氨基官能化树脂的结果表明：基于该测定中使用的商业pNPP溶液，AP被有效固定并具有活性。这些实验的结果如图2B所示。

实施例3：在不同pH条件下将AP固定到膜上：

聚丙烯腈AN69膜用于确定AP与膜结合的优化pH条件，并通过随后的AP活性测试进行验证。pH优化测试使用“M-过滤器(Filter)”膜(MF150)进行，该膜被制备成“微型组件”，即通常用于测试膜特性的小型过滤器。所描述的测试是在AN69微型组件上进行的，每个组件都包含纤维束，其中，每束约存在40根中空纤维。

AN69是一种用于透析应用的已确立的聚合物，并且是丙烯腈与甲代烯丙基磺酸钠的共聚物。磺酸盐基团形成带负电荷的亲水膜，其通过保水形成水凝胶结构。膜的这种组成允许吸附中等尺寸的蛋白质。图7示出了AN69中空纤维的扫描电子显微镜(SEM)图像以及如何在透析中使用此类纤维束的示意设置。AN69微型组件的内表面每根光纤约为1cm²。这对应于每个微型组件为40cm²的内表面。

使用普通软管(Promedt)将微型组件连接到泵站，通过该泵站可以通过微型组件以可控速率泵送液体(来自Ismatec的泵)。

为了在AN69微型组件上制备固定化AP，在连接戊二醛(GA)与AP之前，用聚醚酰亚胺(PEI)涂覆微型组件。由于AN69膜上存在负电荷，因此可以通过离子相互作用连接带正电荷的聚合物。在这种情况下，使用携带有带正电荷的氨基的PEI。PEI连接通常在酸性介质中进行，因此氨基被质子化并且电荷密度增加。通过在该过程中使用柠檬酸，与碱性介质相比，可以在膜上结合更多的PEI。PEI处理的优化将在下面更详细地讨论。

在PEI处理后，AN69膜在固定化AP之前用戊二醛(GA)进行处理。戊二醛作为双功能间隔物，产生预先活化的聚合物表面以结合酶。在表面预活化之后，戊二醛的游离醛基团可用，以便能够通过相同的反应结合另一组分。在这种情况下，AP随后在第二个修饰步骤中通过游离氨基进行共价结合。

因此，AN69微型组件是：

-冲洗以去除甘油(使用反渗透水，每个微型组件以1.5mL/min的速度注入5mL，然后注入5～20mL，流速3mL/min)。视觉上调整体积以去除空气，

-用PEI处理(PEI在200mg/kg的柠檬酸溶液中，浓度为200mg/kg，每个微型组件使用20mL，流速为3mL/min)，

-冲洗(在PBS中，每个微型组件为20mL，流速为3mL/min)

-用戊二醛处理(2.5％GA溶液，每个微型组件为40mL，流速为1.5mL/min)，

-冲洗(在PBS中，每个微型组件为50mL，流速为1.5mL/min)

-用AP处理(PBS中每个微型组件为1000U AP，20mL以1.5mL/min再循环16小时)，以及

-最后漂洗(在PBS中，每个微型组件为50mL，流速为1.5mL/min)。

作为读数，评估固定化的AP活性。使用在PBS缓冲液中包含pNPP底物(对硝基苯磷酸二钠六水合物)及氯化镁和氯化锌基质的测试溶液。为了量化膜上的AP活性，从微型组件中切下单根纤维。打开组件，用PBS洗涤纤维，然后将每根纤维置于平板的孔中。将纤维切成适当尺寸的片并且施加pNPP测试溶液。在60分钟和120分钟时进行读数。像往常一样，样品针对游离酶的标准溶液进行测量，因此该结果表示为理想标准(碱性)条件下游离AP的活性。

为了评估AP固定化的最佳pH条件，修改了两个过程，即(1)用戊二醛(以下称为“GA-pH”)涂覆该膜和(2)AP的后续固定(以下称为“AP-pH”)。对于这些处理中的每一个，测试了相关溶液的多个pH值。

下表示出了几种方案(I～IV)的结果以及在60和120分钟后以U/cm²为单位的AP活性的结果。为了简化讨论，计算并显示相应的平均值。

II下的实验给出了0.38～0.45U/cm²的可重复的高AP活性，这是根据经验估计为治疗相关活性的最低限度(0.05U/cm²)的约十倍。其他pH条件似乎也有效，但重现性不如实验II。

实施例4：在不同pH条件下将AP固定到珠上：

使用氨基官能化珠(Purolite Lifetech ECR 8408F)作为固定AP的基质进行与上述实施例3类似的实验。珠在不同的pH值下使用GA进行预处理，然后在不同的pH值下用AP进行处理。

实验在96孔板中进行，在900μL的pNPP溶液中，在不断搅拌下，使用GA/AP处理过的珠。取出75μL的反应液并在10、30、60和120分钟时在单独的96孔板中使用上述光度计活性测量进行分析。

下表概述了使用珠作为固体基质10分钟后测定的AP活性。

实验	消失	活性(以U/mL计)
			参考–珠(洗过的)	0.27875	0.05
珠+GA pH 7,4+APpH 7,4	0.3505	0.62
			珠+GA pH 7,4+APpH 9,9	0.8356	4.51
珠+GA pH 9,9+AP pH 9,9	0.8938	4.98
			珠+GA pH 9,9+AP pH 7,4	0.41765	1.16
珠+APpH 7,4	0.28655	0.11
			珠+AP pH 9,9	0.26645	-0.05

从上述结果可以看出，与珠偶联后仍保持AP活性，最有效的固定化条件是GA pH9.9+AP pH 9.9或GA pH 9.9+AP pH 7.4，类似于上述AN69微型组件实验。当使用这些珠(同型双功能间隔物戊二醛)时，GA步骤很重要，因为通过将珠与AP直接放在一起，无法分别观察到酶结合活性。

实施例5：AP活性的辅因子的调整：

上述实施例中使用的AP是可商购的，并且与浓度为1mM MgCl₂和0.1mM ZnCl₂的辅因子一起运输。在上述AP的活性测试中，辅因子浓度为0.5mM MgCl₂和0.1mM ZnCl₂。在PBS模拟使用测试中，辅因子Mg²⁺和Zn²⁺也分别以0.5mmol/L和0.1mmol/L的浓度添加(模拟使用稳定性测试见下文)。

使用来自实施例3的AN69膜微型组件进行进一步的实验，以便将稀释系列中的Mg²⁺浓度从5mM滴定至0.005mM。尽管观察到AP反应有所放缓，但未观察到不同镁浓度的动力学曲线之间的明显差异，这表明固定化AP可能在人类血液样本中发现的辅因子浓度下表现出合适的活性。

健康个体的血浆浓度与血清相似，范围为0.7～1.0mM。因此，当该装置用于临床时，血液中的镁含量将足够高以支持AP活性。锌也是如此。血清锌浓度为12.4±1.4μmol/L(女性为9～22μmol/L；男性为12～26μmol/L)。

该实施例还表明：包含固定化AP的用于体外治疗的装置可优选填充或储存在缓冲液或其他溶液中，其中，包含固定化AP的基质被浸入所述缓冲液或溶液中，而Mg²⁺的浓度为0.1～2，优选0.1～1mmol/L，并且Zn²⁺的浓度为5～150，优选10～100μmol/L。

实施例6：优化膜上的PEI密度

使用APA-CRRT的“TNBS”测试最佳PEI涂层和密度。TNBS测试是技术人员已知的(基于2,4,6-三硝基苯磺酸)并且可用于氨基官能团的定量分析，例如在膜表面上。TNBS与活性胺分子反应生成高度显色(橙色)的产物，其在335～345nm处的吸光度可以用读板机或分光光度计进行测量。在本实施例中，氨基官能团源自PEI。

50g/L TNBS溶液用于测试。溶液的吸光度是在反渗透水空白的光度计上在340nm处测量的。在15mL的0.1g/L TNBS溶液中，从一个微型组件中取出所有40根纤维并以约1cm长的碎片添加到溶液中。室温下避光振荡30分钟后，除去各溶液的上清液，并且测定吸光度。吸光度的降低与活性胺的数量直接相关。膜上的最佳PEI密度为1～3μmol/g的中空纤维膜。

发现用实施例3中描述的方法涂覆的膜可以非常有效地进行AP官能化。基于柠檬酸的PEI涂覆工艺(参见实施例3；优选200mg/kg的PEI在200mg/kg的柠檬酸溶液中)是有效的。还使用基于预涂覆的(PEI涂层)ST过滤器的PEI/GA/AP功能化进行了进一步的实验，该过滤器与AN69膜相同，但在商业生产中用PEI预涂覆。AP固定化到预处理的PEI膜上也很成功。然而，那些含有AP的中空纤维显示出显著较低的酶活性，如上所述。

实施例7：AP活性在PBS和人血浆中的模拟使用和稳定性：

为了评估固定化的AP是否随时间稳定，进行了以下实验。微型组件如上文实施例3的实验II所述进行制备，然后如实施例3那样连接到泵站。

在所有实验中，微型组件在透析液侧封闭，并在管腔侧用适当的介质灌注再循环。相应地设置流量和体积以模拟72小时透析，这对应于标准透析过滤器用于急性治疗的最大允许使用时间。

对于标准透析，使用约200mL/min～500mL/min的流量和约5L的血液体积。这里使用的透析器的内表面例如为1.5m²。对于面积为40cm²的小型组件，这会导致0.5mL/min～1.3mL/min的流量和13mL的池体积。由于计算值对于实验室测试而言太低，因此将流量设置为1.5mL/min，并且将池体积设置为20mL。

使用含有0.5mmol/L MgCl₂和0.1mmol/L ZnCl₂的PBS缓冲液作为灌注介质。然后将组件在37℃的暖气罩下灌注指定的时间。在某些时候，从池中取样并测量活性，以研究可能的浸出或冲洗过程。来自相应组件的纤维然后在没有进一步处理的情况下进行上述活性测试。

活性测量结果显示，在灌注72h之前的活性为0.4U/cm²，而测试后的活性为0.7～2.0U/cm²。在洗脱液池中没有观察到活性，这表明没有发生或可以忽略的固定化AP的浸出或洗出。

当具有AP功能化膜的微型组件在存在AP辅因子的情况下用PBS灌注时，固定化活性因此可靠地保留(甚至可重复增加)超过72小时。假设灌注前的AP已经从辅因子中消耗了一些，酶随后通过缓冲液提供，因此随着时间的推移不仅保持活性而且增加活性。无论如何，中空纤维膜上的AP是高度稳定的。

在人血浆中，这种影响更为明显。使用人血浆代替PBS缓冲液重复实验。从本质上讲，人血浆已经包含所需的AP辅因子。活性测量结果显示，在血浆中灌注72h之前的活性为0.4U/cm²，而测试后的活性为1.6～2.4U/cm²。在洗脱液池中没有观察到活性，表明没有发生或可以忽略的固定化AP的浸出或洗出。

实施例8：灭菌后AP活性的稳定性：

临床产品需要灭菌技术来灭活潜在的微生物病原体。由于必需的AP活性，热处理是可能的，但不是优选的，因为蒸汽灭菌可能会损坏膜和/或使酶变性。

使用伽马辐射灭菌被评估为一种有前途的方法。在伽马灭菌过程中，伽马辐射由放射性辐射源产生，然后到达产品。伽马射线具有很高的穿透深度，因此可用于对最终包装中的产品进行灭菌。

使用约30kGy的剂量对如上所述的微型组件进行伽马灭菌。使用这种灭菌方法，仍然被改性过程弄湿的微型组件(约0.5g水分/微型组件)可以用塞子封闭，并且不需要填充甘油。在涂覆后(如实施例3)，血液和透析液侧的微型组件充满反渗透水并用塞子封闭，并送去进行伽马灭菌。

在以30.6kGy的剂量灭菌后，收集并储存微型组件中所含的水。两个微型组件91和92用MgCl₂和ZnCl₂的盐溶液预冲洗。为此，将微型组件连接到软管组并以3mL/min的流量填充。然后断开软管，让微型组件静置30分钟，然后抽空并进行活性测试。结果示于图8。

如上所述，两个微型组件89和90直接进行活性测试。两个冲洗过的微型组件91和92示出了约0.5U/cm²的活性。未冲洗的微型组件89显示出0.02U/cm²的非常低的活性。微型组件90显示出约0.3U/cm²的较高的活性。使用相同程序修改且未灭菌的微型组件示出了约0.4U/cm²的活性。因此，在评估AP活性时，充水微型组件的灭菌对4个微型组件中的3个几乎没有影响。

或者，还使用环氧乙烷(EtO)气体进行灭菌。微型组件首先填充甘油，以防止凝胶膜变干，然后使用标准技术进行处理。环氧乙烷(EtO)是用于低温灭菌的常用气体。它是一种无色有毒气体，其可攻击微生物的细胞蛋白质和核酸。它最常用于对管腔较长的医疗器械和必须灭菌但不能承受更高温度的材料进行灭菌。

如上所述，对微型组件进行了EtO灭菌，随后测定了AP的活性。EtO灭菌导致AP活性略有降低。在测试了5个微型组件(两个没有使用和三个使用EtO灭菌)后，只有一个微型组件失去了AP活性(可能是由于未知的技术错误)。在保留AP活性的两个微型组件中，初始数据显示：在活性测试120分钟后，与未灭菌的对照相比，EtO灭菌后维持了40％的AP活性。这些测试结果是初步的并且正在重复。

总之，为了保持固定在膜上的AP活性，伽马和EtO灭菌似乎都是可行的。

Claims (20)

1.一种血液处理装置，其被配置成在体外血液回路中对有需要的患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化，其中，所述装置包括其上固定有碱性磷酸酶(AP)的基质。

2.根据前述权利要求所述的血液处理装置，其中，所述血液处理装置位于体外血液回路中，所述患者的血液通过该体外血液回路，并且该体外血液回路包括用于以限定的流速将血液从所述患者的血管系统输送到所述血液处理装置并且将处理过的血液回输给所述患者的机构。

3.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述血液处理装置是滤血器。

4.根据权利要求1或2所述的血液处理装置，其中，所述血液处理装置是吸附剂筒。

5.根据前述权利要求所述的血液处理装置，其中，所述血液处理装置位于根据权利要求2所述的体外血液回路中，其中，所述回路还包括位于所述吸附剂筒的上游或下游的滤血器。

6.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述碱性磷酸酶(AP)是牛肠碱性AP。

7.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，所述碱性磷酸酶(AP)是重组和/或嵌合形式的AP。

8.根据权利要求1至3或6至7中任一项所述的血液处理装置，其中，所述血液处理装置是包含中空纤维束的滤血器，并且所述碱性磷酸酶(AP)至少固定在管腔上，并且任选地，固定在所述束的中空纤维的孔上。

9.根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置，其中，其上固定有碱性磷酸酶(AP)的所述基质，优选所述中空纤维膜，包括或由以下组成：

a.丙烯腈与甲代烯丙基磺酸钠的共聚物，

b.聚砜、聚(醚)砜(PES)和/或聚芳(醚)砜(PAES)，以及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，或

c.聚砜、PES和/或PAES，以及PVP，及选自壳聚糖和/或马来酸酐-1-十八碳烯交替共聚物的添加剂。

10.根据前述权利要求所述的血液处理装置，其中，所述碱性磷酸酶(AP)通过以下方式被固定到所述基质上，优选使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)处理被固定到所述基质上：

a.通过由聚砜、聚(醚)砜(PES)和/或聚芳基(醚)砜(PAES)的OH基团与AP的COOH基团之间的反应产生的酯键，

b.通过由壳聚糖的NH₂基团与AP的COOH基团之间的反应产生的肽键，或

c.通过由马来酸酐-1-十八碳烯交替共聚物产生的COOH基团与AP的NH₂基团之间的反应产生的肽键。

11.一种根据前述权利要求中任一项所述的血液处理装置的制造方法，其中，所述装置被配置成对有需要的患者的血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行去磷酸化，所述血液处理装置的制造方法包括将碱性磷酸酶(AP)固定到基质上。

12.根据前述权利要求所述的血液处理装置的制造方法，其中，所述血液处理装置是包含中空纤维束膜的滤血器，并且所述碱性磷酸酶(AP)至少固定在所述管腔上，并且任选地，固定在所述束的中空纤维的孔上。

13.根据权利要求11或12中任一项所述的血液处理装置的制造方法，其中，所述碱性磷酸酶(AP)共价结合到所述基质上，所述方法包括使用碳二亚胺化合物，优选地1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，处理所述基质和/或AP。

14.一种患者的血液通过的体外血液回路，包括根据权利要求1至8中任一项所述的血液处理装置和用于以限定的流速将血液从所述患者的血管系统输送到所述血液处理装置，然后将处理过的血液回输给所述患者的机构。

15.根据权利要求1至10中任一项的血液处理装置作为治疗感染、优选血液或全身感染的药物的用途。

16.根据前述权利要求所述的血液处理装置的用途，其中，所述感染是败血症或败血性休克。

17.根据权利要求1至10中任一项所述的血液处理装置作为治疗感染相关的肾功能障碍的药物的用途。

18.根据前述权利要求所述的血液处理装置的用途，其中，所述感染相关的肾功能障碍是败血症相关的急性肾损伤(AKI)。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的血液处理装置的用途，其中，所述处理包括在急性情况下，优选在重症监护病房(ICU)中的连续肾脏替代疗法。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的血液处理装置的用途，其中，所述方法包括对患者血液中的细胞外三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和/或脂多糖(LPS)进行体外去磷酸化，然后将处理过的血液回输给所述患者的步骤。

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