CN113527478A

CN113527478A - Abrin抗体及其应用

Info

Publication number: CN113527478A
Application number: CN202110764514.4A
Authority: CN
Inventors: 徐华; 乔春霞; 李治; 张平平; 彭静怡; 赵勇; 郭磊; 冯健男; 杨瑞馥; 谢剑炜
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-07-06
Also published as: CN113527478B

Abstract

本发明公开了一种Abrin抗体，包括重链和轻链，其中所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。还提供了编码该抗体的核酸分子。以及抗体在制备用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物、癌症靶向药物和/或免疫毒素、在制备Abrin中毒检测试剂上的应用。本发明的抗体对Abrin可以特异性识别，在体外能显著地抑制Abrin‑a诱导的细胞死亡，对细胞具有保护作用，在体内可显著提高小鼠存活率，使100％的小鼠免于死亡。

Description

Abrin抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及Abrin抗体及其应用。

背景技术

相思子毒素(Abrin)是从豆科藤本植物相思子(Abrus Precatorius L.)的种子中分离得到的一种剧毒高分子糖蛋白，分子量约65kDa，等电点约6.2，含糖量约3.3％。相思子也称相思豆，所以相思子毒素也称相思豆毒素。相思子毒素有四种毒素亚型，即abrin-a、abrin-b、abrin-c和abrin-d，彼此有高达78％的氨基酸序列同源性，其中以abrin-a最为常见且毒性最强。相思子毒素属于Ⅱ型核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，由A和B两条多肽链组成，肽链间靠一个二硫键相连。其A链是毒性单位，分子量为30000Da，能够抑制蛋白质合成导致细胞死亡。B链为结合单位，有2个半乳糖结合位点，分子量约35000Da，具有细胞凝集活性，可促进A链进入细胞质，发挥毒性作用。单独的A链毒性较弱，B链则无毒性，只有双链聚合才显示强烈的毒性作用。相思子毒素有极强的细胞毒性，小鼠的LD₅₀为0.04μg/kg，成年人摄入的致死剂量为5.0-7.0μg/kg，其毒性强度是蓖麻毒素(小鼠LD₅₀ 3.0μg/kg)的70多倍。

相思子毒素可能的接触途径包括摄入、吸入和注射。相思子毒素中毒后通常要经过数小时甚至数天的潜伏期才会出现综合征。中毒表现为黏膜发绀、视网膜出血、口腔灼烧感、瞳孔散大、食欲不振、吞咽困难、恶心、呕吐、腹泻、血痢、腹部痉挛性疼痛、血尿、少尿、定向障碍、惊厥、昏睡、昏迷、循环衰竭等症状，一般常因呼吸困难或内脏溃烂而死。由于相思子毒素的毒性高、纯化相对容易、易获得等特点，被列为潜在的重要生化战剂和生物恐怖病原物质之一。

因此，针对相思子毒素的鉴定、预防及解毒药的研究均具有十分重要的军事和社会意义。相思子毒素中毒，目前尚无完善的预防疫苗、特异性抗毒素和解毒药。通过分析现有的研究进展和成果发现，中和抗体是对抗其中毒的有效手段。再者，对于相思子毒素的检测和鉴定方面，发展和建立多重、特异、灵敏的相思子毒素检测方法也离不开新抗体的研究与开发。

随着对相思子毒素的毒性作用机理研究的深入，人们对相思子毒素毒性作用有了进一步的认识，发现将相思子毒素或其A链与抗体或靶向载体分子连接制成的免疫毒素或靶向药物，可用于特异性杀伤各种癌瘤细胞，进行癌症的靶向治疗。目前相思子毒素作为靶向药物和免疫毒素中最常应用的毒素之一，对移植性动物肿瘤具有明显抑制作用，抗瘤谱较广，对鳞癌和腺癌均有效。伴随着靶向治疗的研究，相思子毒素日益受到了国内外的重视，对其毒性作用的认识也不断深化。因此，研发新的相思子毒素抗体对研究与开发新的治疗癌症的免疫毒素或靶向药物亦具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种Abrin抗体及其在制备用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物以及制备Abrin中毒检测试剂上的应用，为以上领域在抗体选择上提供了新的方向。

首先本发明提供了一种Abrin抗体，包括重链和轻链，其中所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示。

本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子包含编码以上所述抗体的核苷酸序列，所述核酸分子如序列表中SEQ ID NO:3和序列表中SEQ ID NO:4所示。

以上所述核酸分子的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。

以上所述的抗体在制备用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物中的应用。

以上所述的抗体在制备Abrin中毒检测试剂上的应用。

本发明进一步提供了一种用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物，所述药物的活性成分包括以上所述的抗体。

本发明还提供了一种Abrin中毒检测试剂，包括以上所述的抗体。

本发明更进一步地提供一种人源化Abrin抗体，包括以上所述的氨基酸序列。

本发明还提供一种用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括以上所述的抗体。

有益效果

本发明提供的Abrin抗体可以特异性识别并中和Abrin，降低Abrin对细胞的毒性，提高细胞存活率，在体外能显著地抑制Abrin-a诱导的细胞死亡，对细胞具有保护作用，在体内可显著提高小鼠存活率，使100％的小鼠免于死亡。

附图说明

图1为检测10D8抗体的特异性和交叉反应性结果图(Abrin-a、Abrin-b为相思子毒素两亚型，AAG为Abrus凝集素、Ricin为蓖麻毒素、RCA120为蓖麻凝集素)；

图2为检测10D8的体外中和活性结果图；

图3 10D8在体外预防性治疗和暴露后治疗的结果图；

图4免疫荧光分析结果图；

图5免疫荧光分析结果半定量图(control组选用空白培养基，Abrin-a是经培养基稀释的Abrin 10ng/mL；Abrin-a+10D8组是除了Abrin 10ng/mL外，还加有20μg/mL 10D8抗体)；

图6无细胞翻译系统分析Abrin对蛋白质生物合成抑制活性(control组为无细胞翻译系统阳性对照体系，10D8组是单独加入10D8 10μg/mL，Abrin-a组是单独加入Abrin-a10ng/mL，Abrin-a+10D8组是Abrin-a 10ng/mL与10D810μg/mL共孵育后同时加入系统)

图7 10D8的体内中和及保护作用结果图；

图8 10D8抑制Abrin-a诱导的细胞毒性(凋亡)结果图(Abrin(10)代表：浓度10ng/mL，Abrin(100)代表：浓度100ng/mL)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本申请的研究是严格按照批准的指南进行的。实验和动物护理程序经国家药品安全性评价研究中心机构动物护理与使用委员会(IACUC)批准(IACUC 2012-12-002)。

实施例1杂交瘤的建立及筛选

1.小鼠免疫

本发明采用低剂量长周期的免疫方案。使用Abrin-a灭活蛋白作为免疫抗原，对4～6周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫。按30μg/只的免疫剂量对BALB/c小鼠进行6次免疫，最后一次免疫三天后摘取小鼠脾脏，做细胞融合。

2.细胞融合

取Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按比例均匀混合，在50％聚乙二醇1500(PEG 1500)作用下进行细胞融合，用含20％FCS和HAT的DMEM培养基在5％CO₂培养箱中培养，培养14d后，逐步用20％FCS和HT的DMEM培养基和20％FCS的DMEM培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/7时，取上清进行Abrin-a单克隆抗体检测。

3.杂交瘤筛选

用含Abrin-a的碳酸盐缓冲液做包被原，以1％BSA做封闭液，1:1000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG作为二抗，TMB-H₂O₂为底物，2M硫酸溶液为终止液，PBST做洗液，1:500稀释的阳性参考血清和1:500稀释的阴性参考血清做对照的间接酶联免疫吸附法(ELISA)，具体地，微孔板每孔涂有100μL 10μg/mL的Abrin-a、Abrin-b、Abrus凝集素(AAG)、蓖麻毒素(ricin)或蓖麻凝集素(RCA120)的0.05M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)，4℃过夜，用300μL 1％BSA在37℃下放置2小时，加入100μL 10μg/mL抗体，37℃孵育1h。用PBST洗，加100μL用1:1000稀释的HRP标记的抗鼠单克隆抗体，然后在37℃孵育40分钟。再用PBST洗，加100μL TMB底物溶液，孵育10min，加入50μL 2M的H₂SO₄终止反应。用micro-plate Reader(M1000 pro，TECAN)测量450nm处的吸光度。

对杂交瘤细胞上清中的抗Abrin-a抗体分泌情况进行检测，筛选分泌抗Abrin-a抗体的阳性杂交瘤细胞。经酶标仪测定OD₄₅₀nm值：以空白对照调零，当阳性参考血清的OD₄₅₀nm值与阴性参考血清的OD₄₅₀nm值的比值≥2.1，检测孔判为阳性，当阳性参考血清的OD₄₅₀nm值与阴性参考血清的OD₄₅₀nm值的比值＜1.5的检测孔判为阴性，比值介于中间判为可疑。

4.有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆

对于筛选所得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法进行亚克隆。首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM完全培养基稀释成120个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，0.15mL/孔，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。4～5d后，显微镜下可观察克隆细胞的形成，记录只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至所有细胞孔上清液检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性细胞扩大培养和冻存，获得稳定分泌Abrin-a单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

实施例2单克隆抗体的制备

1.单克隆抗体的生产

对已经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体。取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵～1×10⁶/只，7-10天后抽取小鼠腹水。

2.单克隆抗体的纯化

腹水用20mM PBS(pH7.4)稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrap protein G亲和层析进行纯化。

具体的，使用Protein G柱进行纯化，新柱子先用5mL超纯水过柱，再用5mL 0.4MPB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10mL 0.4M PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；5mL 0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1M Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。获得纯化后的a型相思子毒素单克隆抗体。

共分离出11种抗体，并在初步ELISA的基础上进行抗体的结合亲和力测定，筛选出与a型相思子毒素结合活性较强的抗体10D8、10C9、5A10、5G7、MC17。

实施例3抗体的功能鉴定

一、ELISA检测a型相思子毒素抗体的结合活性

1)取酶标板，加入包被液(100μL/孔)，4℃过夜。包被液由包被原和包被缓冲液组成，包被原在包被液中的浓度为2μg/mL。包被原为Abrin-a、Abrin-b、AAG、ricin或RCA120蛋白，包被缓冲液为由Na₂CO₃、NaHCO₃配制的0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)。

2)实验当天用洗板机(BIO-TEK，405_LS)洗5次，每孔加入230μL 5％的脱脂奶粉封闭液，37℃孵箱放置1小时。

3)洗板5次，加入400ng/孔的纯化抗体(10D8、10C9、5A10、5G7、MC17)，37℃孵箱静置1小时。

4)洗板5次，将HPR标记的羊抗鼠IgG二抗(购自Abcam)以1：6000用稀释液进行稀释，每孔100μL加入到ELISA对应孔中，室温孵育45min。

5)洗板5次，每孔加入100μL的TMB单组份显色液，显色2分钟，室温避光，之后每孔加入100μL终止液终止反应。

6)用酶标仪上检测450nm波长处的OD值，保存记录原始数据。

结果：见图1，结果筛选的抗体10D8、10C9、5A10、5G7、MC17中除MC17特异性和选择性较差外，其余抗体均能识别Abrin-a和AAG，而不能识别ricin和RCA120。此外，10C9还表现出对Abrin-b的结合活性。

二、a型相思子毒素抗体体外抑制细胞毒性试验

1.细胞培养

HeLa细胞在RPMI-1640培养基中培养，培养液中添加10％胎牛血清、100单位/mL青霉素和100％μg/mL链霉素，在37℃、5％CO₂条件下孵育。

2.细胞毒性试验

HeLa细胞接种于96孔细胞培养板上，密度为1×10⁴个细胞/孔。用不同浓度的无血清RPMI-1640培养基稀释毒素，加入或不加10μg/mL单克隆抗体10D8，37℃，预孵育1小时。在中毒后1、3或6小时将单克隆抗体10D8添加到细胞中。细胞在37℃孵育24小时。每孔加入10μL的CCK-8试剂，37℃持续孵育1小时。用micro-plate Reader(M1000 pro，TECAN)测量490nm处的吸光度。细胞存活率计算为：存活率％＝(A490样品/A490对照)×100％。结果见图2和图3。图2中可看出，用不同浓度的Abrin-a处理细胞，观察10D8的体外保护作用，10μg/mL的10D8对高达100ng/mL的Abrin-a有保护作用。图3可以说明，在不同时间点用10D8处理表明，暴露前1小时的处理是最有效的。暴露后1～3h处理可抑制Abrin-a诱导的细胞死亡，6h处理无效。10D8抗体预孵育可抑制Abrin-a诱导的细胞死亡。由于10D8抗体较强的中和活性，申请人选择了10D8抗体进行进一步实验研究。

三、中和活性机制实验

1.无细胞翻译体系分析Abrin对蛋白质生物合成抑制活性

为了确定10D8是否通过抑制Abrin的A链酶活性来中和Abrin的毒性，我们用cell-free rabbit Reticulocyte Lysate System来比较存在或无10D8的情况下Abrin-a对蛋白质生物合成的抑制活性。

单独加入Abrin-a(10ng/mL)或与单克隆抗体10D8孵育后(10μg/mL)加入

T7Coupled Reticulocyte Lysate System(Promega)系统，系统中含总氨基酸、核糖核酸酶抑制剂和荧光素酶mRNA，37℃孵育1.5小时。孵育后，将1μL反应混合物(含有翻译合成的荧光素酶)与50μL预平衡至室温的荧光素酶测定试剂混合，通过测定化学发光强度确定荧光素酶的合成程度。结果见图6。与对照组相比，单独加入Abrin-a(10ng/mL)能显著抑制荧光素酶的翻译，单独加入10D8(10μg/mL)对荧光素酶合成无显著影响，而10D8与Abrin-a共孵育后能够逆转Abrin-a对荧光素酶合成的抑制作用，提示10D8可能通过抑制A链酶活性进而中和Abrin-a的毒性。

2.免疫荧光分析

HeLa细胞接种于密度为1×10⁴个细胞/孔。用Abrin(100ng/mL)处理细胞或用Abrin(100ng/mL)和10D8抗体(20μg/mL)预孵育处理细胞，在37℃条件下持续3小时。处理后的细胞用PBS洗涤3次，用4％多聚甲醛固定。将固定的细胞与0.1％的Tritonx-100共孵育30min，室温下用5％BSA封闭30min。在37℃下用10D8处理细胞2小时并洗涤三次，然后与Alexa-488标记的抗小鼠IgG(Invitrogen，USA)孵育1小时并洗涤三次。细胞经Hoescht-33342染色后，用高内涵分析系统(Phenix，PE)显示和分析。为了检测10D8是否抑制Abrin-a进入细胞，用高内涵分析系统对Abrin-a和10D8处理的细胞进行了分析。通过测定Alexaflor-488标记指示Abrin-a在细胞内的荧光强度，确定Abrin-a进入细胞的程度。结果见图4和图5。10D8对Abrin-a的荧光强度无显著影响，表明10D8不能阻止Abrin-a在细胞表面的附着和进入细胞。以上结果表明，10D8的保护作用主要是通过抑制Abrin-a的A链活性来实现的。

四、抗体的中和及保护作用

为了评价10D8的体内保护作用，三组成年BALB/c小鼠(每组8只)腹腔注射25×LD₅₀(LD₅₀＝1μg/kg)的Abrin-a(25μg/kg)，在Abrin-a激发前或后1小时通过相同途径给药10D8(3.75mg/kg)。对小鼠进行严密监测，并在注射后观察长达7天，统计小鼠存活率(结果见图7)。所有小鼠在未经10D8治疗的情况下，均在Abrin-a中毒后40小时内病重，出现体重减轻、腹泻、嗜睡、虚弱等症状。10D8使100％的小鼠免于死亡，所有小鼠在被处死前均保持健康，7天仍存活。

五、10D8抑制Abrin-a诱导的细胞毒性(凋亡)

在不同细胞死亡途径的化学抑制剂存在或不存在的情况下，用Abrin-a处理HeLa细胞。Z-VAD-FMK(pan-caspase抑制物)能显著地抑制Abrin-a诱导的细胞死亡，提示Abrin-a诱导的细胞死亡主要是凋亡，而Nec-1(RIPK1抑制物)或wortmannin(PI3K抑制物)则不能显著抑制Abrin-a诱导的细胞死亡。结果见图8。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> Abrin抗体及其应用

<130> P210090

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> Mouse BALB/c

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Val Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Trp Leu Leu Arg Asn Pro Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly

<210> 2

<211> 101

<212> PRT

<213> Mouse BALB/c

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly

100

<210> 3

<211> 339

<212> DNA

<213> Mouse BALB/c

<400> 3

caggtccagc tgcagcagtc tgggcctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg gttccggcta cacattcact gattatacta tacactgggt gaagcagagt 120

catgcaaaga gtctagagtg gattggagtt gttagtactt actatggtga tacaaactac 180

aaccagaagt ttaagggcag ggccacaatg actgtagaca agtcctccag cacagcctat 240

atggaacttg ccagattgac atctgaggat tctgccatct atttctgtgc aagagggtgg 300

ttactacgaa accccccgtt tgcttactgg ggccaaggg 339

<210> 4

<211> 303

<212> DNA

<213> Mouse BALB/c

<400> 4

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag tctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagtaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagattattt ctgtcagcaa tatagcacct atccgctcac gttcggtgct 300

ggg 303

Claims

1.一种Abrin抗体，其特征在于，包括重链和轻链，其中所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，且所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1所述抗体的核苷酸序列，所述核酸分子如序列表中SEQ ID NO:3和序列表中SEQ ID NO:4所示。

3.包含权利要求2所述核酸分子的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。

4.权利要求1所述的抗体在制备用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物中的应用。

5.权利要求1所述的抗体在制备Abrin中毒检测试剂上的应用。

6.一种用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求1所述的抗体。

7.一种Abrin中毒检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的抗体。

8.一种人源化Abrin抗体，其特征在于，包括权利要求1所述的氨基酸序列。

9.一种用于中和Abrin、治疗或预防Abrin中毒的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求8所述的抗体。