CN113520939A - 一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法，所述方法包括原料预处理、酶解步骤、均质处理、发酵处理，所述发酵处理获得的均质物料，加入重组水蛭素酵母菌INVSc1‑Hr2进行发酵处理；所述重组水蛭素酵母菌INVSc1‑Hr2是将Hr2基因构建于质粒pYES2，通过化学转化法重组于酿酒酵母INVSc1中，获得重组菌株INVSc1‑Hr2。本发明是采用重组水蛭素对人参根提取物进行中药发酵，以前没有报道过此种发酵方法；结合人参补气和水蛭素活性的功效，达到气血双补的作用；本方案对人参提取物进一步酶解，有利于大分子的降解、吸收，人参多糖水解之后为重组水蛭素酿酒酵母提供原料；本方法相较于人参提取液，不需要用到有机溶剂，如乙醇等，对环境友好，同时不会刺激皮肤。

Description

一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，具体地说涉及一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法。

背景技术

人参具有得天独厚的滋补美容效果，作为中国传统的美容护肤佳品，其美白抗皱延缓衰老功效得到一致认可，并从20世纪80年代开始应用于化妆品中，如人参润肤霜、人参美白霜、人参面膜等多种人参化妆品，成为目前使用最为广泛的植物化妆品原料。人参美白霜中含有人参皂苷Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rh1和三七皂苷R2(金贵歆，中医药现代化，2009)。人参皂苷Rg1的剂量浓度为10～80μg/mL时，能抑制黑色素细胞增殖，减少黑色素合成(赵保胜，人参研究，2011)。人参皂苷Rb及人参皂苷Rd可抑制基质金属蛋白酶MMP-1和MMP-3表达(邓茂，皮肤性病诊疗学杂志,2010)。研究发现，在UVB诱导的成纤维细胞光老化模型中，人参提取物可同时调节MAPKs及NF-kB信号通路，抑制MMP-l与MMP-13的异常分泌，达到抗光老化作用(Yong，NutrRes,2012)。

人参是五加科人参属植物的干燥根，人参的主要活性成分为人参皂苷和人参肽，人参肽的稳定性较差，传统高温提取的方式往往得不到具有活性的人参肽。人参作为一种名贵的古老中药，被广泛应用，历代医书中都有记载。现代生物学及医学研究表明人参具有多方面的药理和生物学活性。低聚肽在人体内不需消化即可直接吸收，比单个氨基酸更易吸收，可直接参与蛋白质的合成，避免活性物质的浪费，大大提高其生理调节作用。因此，探索一种新的人参活性肽的制备方法具有重要意义。

微射流是通过高压破碎的技术，可以在常温下破碎各种生物细胞，释放胞内活性成分，广泛用于对温度敏感活性成分的提取。微射流是在超高压(310MPa)的压力作用下，经过孔径很微小的阀心，产生几倍音速的流体，从而达到分均质破碎细胞的作用。现有的超高压提取工艺是在常温下，将粉碎至～定粒度的中药材，浸泡于一定比例的提取溶液中，置于超高压反应釜中，进行受压处理。当压力升到设定值时，瞬间卸压，利用细胞壁内外巨大的压力反差将细胞组织破裂粉碎，使其有效成分全部溶于溶液中，不损害植物细胞中的热敏性物质。

公开号CN111227102A发明名称为一种人参活性肽的制备方法及其应用的发明专利申请，公开了人参活性肽的制备方法包括以下步骤：将人参预处理后，进行提取得到人参提取液，将人参提取液酶解后进行纯化处理，得到人参活性肽溶液。该方法通过提取、酶解和纯化等步骤，得到人参活性肽溶液，其提取过程在100℃左右的较高温度下进行，对固有营养物质破坏较大。

公开号CN107802670A发明名称为具有补气固脱作用的含人参活性肽的中药组合物及其制备方法和用途的发明专利申请，该申请公开的方法中包括固体部分加入水，于75～100℃下加热20～35分钟酶解；加入黄芪和白术，加热回流提取，过滤得到混合液；和混合液离心、浓缩、喷雾干燥，得到所述中药组合物。其中，灭酶步骤灭酶温度为90-125℃，灭酶时间为0.5-3h。该方法同样存在原料预处理时间长，高温提取、灭菌等操作，不利于原料中营养物质的保留。

水蛭，俗称蚂蟥，是蛭纲动物的总称。它是我国传统名贵中药材，具有破血通经、消积散瘀、消肿解毒等功能，临床上用于治疗跌打损伤、目赤肿痛、脑出血、肝硬化、高血压、高脂血症等症，它是我国35种重要活血化瘀中药材之一。科学研究表明，吸血水蛭的唾液腺及其所分泌的唾液中含有丰富的水蛭素hirudin、透明质酸酶Orgelase以及血管扩张剂Vasolilator和麻醉剂Anaesthetic等多种生物活性物质，其中水蛭素是这些活性物质中数量最多、活性最显著和最具发展潜力的一种活性物质。水蛭素是迄今为止世界上所发现的已知物质中最强的天然抗凝血酶物质。

天然水蛭素清除DPPH·，·OH和·O₂-的IC50值分别为14.1mg/mL；4.2mg/mL；21.1mg/mL(对照VitC的IC50值分别为2.6μg/mL；0.43mg/mL；0.032mg/mL)。其抗氧化活性总体低于对照VitC，其清除DPPH·和·O₂-的能力均较VitC低，但其清除·OH能力强，仅是极强VitC的1/10倍。天然水蛭素有长效的保湿性能，有抗氧化效果。VitC对照组结果：相同添加量下，试验组减少眼部细纹、皮肤平滑感、改善黑眼圈、改善浮肿效果4个指标的有效率分别为65.0％、80.0％、45.0％、40.0％；VitC对照组分别为35.0％、60.0％、15.0％、5.0％，试验组的抗衰老和改善微循环效果显著好于对照组，也说明了天然水蛭素抗氧化功效的在体应用效果较VitC突出。市售对照组结果：试验组改善眼袋浮肿和减少细纹的效果明显优于对照组；两者均有改善黑眼圈的效果且差异不大。验证了天然水蛭素具有改善眼部微循环和抗衰老的功效，且与同类产品比较有一定优势。(谢思跃，广东工业大学硕士学位论文，2020)

公开号CN102373216B发明名称为一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺的发明专利申请，公开了一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺。其中采用汉逊多型宿主细胞株RB-11为出发菌株来构建适用于生产的含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6，并通过培养、发酵来获得高纯度和高含量的水蛭素。在本发明中，水蛭素基因以多拷贝的形式拷贝到宿主细胞的染色体上，且拷贝数保持稳定，含有水蛭素基因的外源基因表达盒完全整合到宿主细胞染色体上，种子库细胞、传代40、80代后的细胞中均无游离质粒存在，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍，特别和国内的多型汉逊酵母相比水蛭素外源蛋白的表达量高35.8％，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白；该技术方案的目的是解决重组水蛭素的工业生产问题。

公开号CN108220369B发明名称为一种生产重组水蛭素的方法，公开了一种生产重组水蛭素的方法，所述方法包括：将pBH-2工程菌(保藏号：CGMCC No.0908)接种至包含碳源物质和氮源物质的发酵培养基中，进行培养。该方法采用pBH-2工程菌(大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2003年03月19日；保藏编号：CGMCCNo.0908)，通过高密度、高表达的发酵工艺生产重组水蛭素，能够极大地提高重组水蛭素的产量。

显然，人参是名贵的具有美白、抗衰老的中药，其有效成分主要为人参皂苷和人参肽，作用机制主要通过提升人体气血，滋养肌肤。而水蛭素是最强的抗凝血活性成分，具有改善末梢微循环的作用，具有保湿抗皱、抗氧化、抗衰老、改善眼部微循环的功效。开发一种含有人参肽、人参皂苷和水蛭素发酵液产品，通过补气活血作用，可以用于化妆品制备领域，其化妆品产品会具有更加良好的美白效果。

发明内容

根据现有技术的需要，本发明的一个目的是提供一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法；通过低温酶解和发酵处理，获得含有美白效果人参水蛭素发酵液产品。

本发明所述的一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法，是通过如下技术方案实现。

将干人参或鲜人参预处理后，先通过酶解消化，然后通过微射流设备进行高压均质处理，同时用冷却水对均质机进行降温处理，使得在低温条件下充分释放人参细胞内的活性成分。经均质化处理的原料进行纯化处理，接着，通过加入经重组表达酿酒酵母菌INVSc1获得的重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2进行高密度、高表达的发酵处理，得到含人参肽、人参皂苷和水蛭素的发酵液。

进一步，所述人参肽、人参皂苷和水蛭素发酵液可以通过纯化处理，得到浓缩液产物，可以用于化妆品原料。

具体而言，本发明技术方案所述的方法，包括以下步骤：

1).原料预处理：包括将干人参或鲜人参材料处理成适当的大小，达到适合进样粒径。将粉碎的人参材料浸泡入一定的提取溶剂中，所述提取溶剂为水，优选所述提取溶剂为纯净水或去离子水。

进一步，人参与水的比例为1：6-10倍纯净水，优选6倍量，人参含量为15％左右；调节pH至7-7.5。

2).酶解步骤：在上述人参物料加入内切蛋白酶和纤维素酶，酶解3-4h，在酶解过程中定时搅拌，酶解结束后将得到的酶解液灭酶活。

进一步，所述酶解步骤中，加入的内切蛋白酶为人参原料重量0.5％-0.7％，和加入的纤维素酶为人参原料重量0.1％-0.2％，进行酶解。在酶解过程中，每隔1小时搅拌5-10分钟，使酶解均匀充分的进行。通过纤维素酶和内切蛋白酶的作用，进一步破坏人参细胞壁。

3).均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；

进一步，物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值30Mpa至40Mpa，优选35Mpa-38Mpa，更优选35.8Mpa；经过均质处理的人参均质物料，被收集到出料容器。

被增压的物料，流向具有固定几何形状的微通道并产生高速微射流，高速微射流物料在特定几何通道内，经过物理剪切，高能对撞，空穴效应等物理作用，达到超微化均质效果。

进一步，上述过程中，经过高压微射流处理的物料会出现温度瞬间升高现象，需要通过换热器进行冷却处理，在本发明的技术方案中，设定实时控温温度范围为38℃-42℃，优选38.8-40℃；

4).发酵处理

上述步骤获得的均质物料，加入重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2(序列同CN92114142中采用的序列，但是所采用的出发菌为INVSc1)进行发酵处理。

其中，以体积计，步骤3)均质物料:重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2培养液为100-150:1，在需氧条件下，在28℃-32℃的温度下培养至对数生长期结束，然后在48小时内继续进行培养至水蛭素产量达到峰值。优选，所述步骤3)均质物料:重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2培养液为110-140:1；更优选，所述步骤3)均质物料:重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2培养液为120-130:1。

待接种的菌种的制备：

将Hr2基因构建于质粒pYES2，通过化学转化法重组于酿酒酵母INVSc1中，获得重组菌株INVSc1-Hr2。接种重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2甘油保藏菌至装有种子培养基三角瓶中，于30℃，270rpm摇床培养2小时，即得待接种的菌种。

所述种子培养基包括：蔗糖(1.2g/L)、蛋白胨FP318(1.0g/L)、酵母粉FM818(0.5g/L)、氯化钠(1.0g/L)、AMP(0.01g/L)、蒸馏水；调节pH值7.2。

在所述培养过程中需要使用5-10L发酵罐时，可以采用液种进罐的接种方式。在发酵全程可用0.5N-1NHCl和0.5N-1N NaOH或10％-20％氨水调节pH值为6.5-8.0。在接种后使用较大通气量(例如控制溶氧值达40％以上)。

进一步，所述重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2接种至发酵培养基中，在25℃-32℃的温度下培养至对数生长期结束，然后继续培养48小时，然后通过补料的方式加入等体积的人参提取液进行发酵10小时。

本发明技术方案方法通过在使用重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2且在对数生长期结束后继续培养48小时，能够使得菌株特异性地且高产量地表达和分泌重组水蛭素，补料加入人参提取物可以将人参多糖、多肽进一步水解，有助于人参皂苷的溶出。

人参原料经上述步骤1)-4)处理，得到本发明技术方案的含人参肽、人参皂苷和水蛭素发酵液。

可选择的，所述含人参肽、人参皂苷和水蛭素发酵液还可以进行以下处理步骤。

5).纯化处理：依次包括膜处理、浓缩步骤，得到发酵浓缩液。

其中，膜分离步骤包括：通过多功能无机陶瓷膜分离设备进行超滤，过滤温度为48-50℃，压力为0.1MPa-0.2MPa。滤液过滤至清液储罐。

在本发明的一些优选实施例中，双效真空节能浓缩步骤包括：过滤液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为-0.06MPa、48℃-52℃，二效真空度与温度分别控制在-0.08MPa、42-46℃，以可溶性固形物含量为指标，综合控制浓缩温度、真空度及供气压力，得到浓缩液。

所述浓缩液产品，可以通过喷雾干燥等手段，制备粉末产品，例如通过高速离心喷雾干燥粒机喷粉干燥的方法。

本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：1.本发明是采用重组水蛭素对人参根提取物进行中药发酵，以前没有报道过此种发酵方法。2.结合人参补气和水蛭素活性的功效，达到气血双补的作用。3.本实施方案对人参提取物进一步酶解，有利于大分子的降解、吸收，人参多糖水解之后为重组水蛭素酿酒酵母提供原料。4.本方法相较于人参提取液，不需要用到有机溶剂，如乙醇等，对环境友好，同时不会刺激皮肤。

为使本发明具体实施方式的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明的具体实施方式的实施实例，对本发明具体实施方式的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的具体实施方式是本发明的一部分具体实施方式，而不是全部的具体实施方式。基于所描述的本发明的具体实施方式，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所制备的所有其它具体实施方式，都属于本发明保护的范围。

附图说明

图1黑色素合成途径；

图2蛭颜舒酪氨酸酶抑制率示图一；

图3蛭颜舒酪氨酸酶抑制率示图二。

具体实施方案

以下通过具体的实施例，进一步说明本发明的技术方案。在以下具体实施例中，所述原料除特别说明外，皆是市售商品，采购于相关生产企业或商业部门。所述微射流高压均质机微射流高压均质机可获得20Mpa至210Mpa均质压力。

实施例1：待接种的菌种的制备

接种重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2(保藏号：CGMCC No.0908)甘油保藏菌至装有10ml种子培养基的100mL三角瓶中，于30℃，270rpm摇床培养24小时，然后转接到500mL的摇瓶，含发酵液100mL，继续摇瓶培养4小时，得到待接种的菌种。

所述种子培养基包括：蔗糖(1.2g/L)、蛋白胨(1.0g/L)、酵母粉(0.5g/L)、蒸馏水100ml；调节pH值7.2。

实施例2：干人参原料

本实施例2具体包括以下步骤：

(1)原料预处理：挑选干燥的种植5年以上的干燥人参根茎2公斤，含水量小于5％，粉碎至200目至300目。加6倍的纯净水浸泡，调节pH至7.0。

(2)酶解步骤：加入人参原料重量0.5％的内切蛋白酶和人参原料重量0.1％的纤维素酶酶解3小时，在酶解过程中每隔1小时搅拌5分钟，使酶解均匀充分的进行。

(3)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值38Mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的人参均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在本实施例中，设定实时控温温度40℃；

4)发酵处理：

种子菌的制备：

接种重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2甘油保藏菌至装有种子培养基三角瓶中，于30℃，270rpm摇床培养24小时，然后转接到500mL的摇瓶，含发酵液100mL，继续摇瓶培养4小时，OD600到0.4-0.8之间，即得待接种的菌种。种子菌的准备量为发酵体积的5％。

所述种子培养基包括：蔗糖(1.2g/L)、蛋白胨(1.0g/L)、酵母粉(0.5g/L)、蒸馏水；调节pH值7.2。

发酵培养：所述培养过程中需要5L发酵罐，采用液种进罐的接种方式。在发酵全程可用0.5N-1NHCl和0.5N-1N NaOH或10％-20％氨水调节pH值为6.5-8.0。在接种后使用较大通气量(例如控制溶氧值达40％以上)。培养基包括：蔗糖(1.2g/L)、蛋白胨(1.0g/L)、酵母粉(0.5g/L)、蒸馏水；调节pH值7.2。

2.5L YPD培养基添加到10L发酵罐(上海保兴生物技术有限公司，上海)中，接种后，初始OD600为0.5。发酵罐温度控制在30℃，pH用5M的氨水自动控制，搅拌转速600转/min，通气速率2L/min L。在发酵的36h，500mL先期补料液加入10L罐中进行补料。待对数生长期结束，进入平台期进行发酵48小时，使得水蛭素产量达到最高。然后进入后期补料，后期补料为人参提取液，补料体积同发酵罐中水蛭素发酵液体积。在30℃，继续发酵8小时。

先期补料：48h时补5mL补料液(400g/L葡萄糖,9g/L KH₂PO₄,5.12g/L MgSO₄7H₂O,3.5g/L K₂SO₄,0.28g/L Na₂SO₄,0.5g/L腺嘌呤,0.6g/L尿嘧啶和1.2g/L赖氨酸，pH 5.5)。

后期补料：上述经过微射流破壁的人参提取物，补料体积为总体积的50％。

实施例3：鲜人参原料

本实施例3具体包括以下步骤：

(1)原料预处理：挑选新鲜的种植5年以上的鲜人参根茎2公斤，加入5倍纯净水，调节pH至7.5；匀浆粉碎，过200目至300目筛。

(2)酶解步骤：加入人参原料重量0.5％的内切蛋白酶和人参原料重量0.1％的纤维素酶酶解3小时，在酶解过程中每隔1小时搅拌5分钟，使酶解均匀充分的进行。

(3)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；人物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值35.8Mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的人参均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在本实施例中，设定实时控温温度40℃；

4)发酵处理：

种子菌的制备：

接种重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2甘油保藏菌至装有种子培养基三角瓶中，于30℃，270rpm摇床培养24小时，然后转接到500mL的摇瓶，含发酵液100mL，继续摇瓶培养4小时，即得待接种的菌种。种子菌的准备量为发酵体积的5％。

所述种子培养基包括：蔗糖(1.2g/L)、蛋白胨(1.0g/L)、酵母粉(0.5g/L)、蒸馏水；调节pH值7.2。

发酵培养：所述培养过程中需要5L发酵罐，采用液种进罐的接种方式。在发酵全程可用0.5N-1NHCl和0.5N-1N NaOH或10％-20％氨水调节pH值为6.5-8.0。在接种后使用较大通气量(例如控制溶氧值达40％以上)。培养基包括：蔗糖(1.2g/L)、蛋白胨FP318(1.0g/L)、酵母粉FM818(0.5g/L)、蒸馏水；调节pH值7.2

2.5L YPD培养基添加到10L发酵罐(上海保兴生物技术有限公司，上海)中，接种后，初始OD600为0.5。发酵罐温度控制在30℃，pH用5M的氨水自动控制，搅拌转速600转/min，通气速率2L/min L。在发酵的36h，500mL先期补料液加入10L罐中进行补料。待对数生长期结束，进入平台期进行发酵48小时，使得水蛭素产量达到最高。然后进入后期补料，后期补料为人参提取液，补料体积同发酵罐中水蛭素发酵液体积。在30度，继续发酵8小时。

先期补料：48h时补5mL补料液(400g/L葡萄糖,9g/L KH₂PO₄,5.12g/L MgSO₄7H₂O,3.5g/L K₂SO₄,0.28g/L Na₂SO₄,0.5g/L腺嘌呤,0.6g/L尿嘧啶和1.2g/L赖氨酸，pH 5.5)。

后期补料：上述经过微射流破壁的鲜人参提取物。

实施例4：生化法检测人参水蛭素(蛭颜舒)的美白功效

1.实验原理

L-酪氨酸在酪氨酸酶的作用下形成多巴醌，为浅红色有色物质，可被检测。通过测OD可以评价待测样品的美白能力，合成路径如图1所示。

2.所用试剂及设备

试剂：

0.05％L-酪氨酸溶液，酪氨酸酶溶液(500U/mL)，pH值6.8的PBS(磷酸盐缓冲液)，5％熊果苷溶液，人参水蛭素发酵液(蛭颜舒)。

耗材：96孔板，EP管，枪头，冰盒(存放酶)

设备：烘箱，酶标仪

3.实验步骤

液体待测药品溶液制备

表1液体待测药品浓储液制备

PBS稀释，分别配置不同浓度待测药品溶液。

表2.酪氨酸酶活性检测，96孔板内每组设置3个副孔，按下表加样操作(μL)

注：阳性对照采用1％熊果苷溶液。即用PBS稀释5％熊果苷溶液。待测药品溶液则含4个浓度，分别为100％，75％，50％和25％。

酶标板在475nm波长下测OD

计算样品对酪氨酸酶的抑制率P＝[(A1-A2)-(B1-B2)]/(A1-A2)*100％

式中，A1为阴性对照组吸光度；A2为阴性空白组吸光度；B1为样品组吸光度；B2为样品空白组吸光度。

表3蛭颜舒抑制率

4.实验结果

人参水蛭素发酵液(蛭颜舒)在低浓度时(v/v小于50％)对酪氨酸酶没有抑制作用，甚至会促进L-酪氨酸的反应，但在高浓度时(v/v大于75％)能抑制酪氨酸酶，具有开发美白功效产品的潜力。

以上结合具体实施例，对本发明技术方案的具体实施方式进行了进一步描述，此具体实施方案是为了对本技术方案的详细描述，而不是为了限制本技术方案。以上所述的具体实施方案，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的技术构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通技术人员对本技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

1).原料预处理：包括将干人参或鲜人参材料处理成适当的大小，达到适合进样粒径。将粉碎的人参材料浸泡入一定的提取溶剂中，所述提取溶剂为水，优选所述提取溶剂为纯净水或去离子水；

2).酶解步骤：在上述人参物料加入内切蛋白酶和纤维素酶，酶解3-4h，在酶解过程中定时搅拌，酶解结束后将得到的酶解液灭酶活；

3).均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；

4).发酵处理：上述步骤3)获得的均质物料，加入重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2(序列同CN92114142中采用的序列，但是所采用的出发菌为INVSc1)进行发酵处理。

2.根据权利要求1所述的具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法，其特征在于，人参与水的比例为1：6-10倍纯净水，优选6倍量；调节pH至7-7.5。

3.根据权利要求1所述的具有美白效果人参水蛭素发酵液的制备方法，其特征在于，所述酶解步骤中，加入的内切蛋白酶为人参原料重量0.5％-0.7％，和加入的纤维素酶为人参原料重量0.1％-0.2％，进行酶解。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于酶解步骤中，每隔1小时搅拌5-10分钟，使酶解均匀充分的进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述均质处理步骤，物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值30Mpa至40Mpa，优选35Mpa-38Mpa，更优选35.8Mpa；设定实时控温温度范围为38℃-42℃，优选38.8-40℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵处理步骤包括：以体积计，步骤3)均质物料:重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2培养液为100-150:1，在需氧条件下，在28℃-32℃的温度下培养至对数生长期结束，然后在48小时内继续进行培养至水蛭素产量达到峰值。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2待接种的菌种的制备包括接种重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组水蛭素酵母菌INVSc1-Hr2接种至发酵培养基中，在25℃-32℃的温度下培养至对数生长期结束，然后继续培养48小时，然后通过补料的方式加入等体积的人参提取液进行发酵10小时。

9.根据权利要求人参水蛭素发酵所用到的菌株为酿酒酵母INVSc1或者其他类型酿酒酵母。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤4)人参提取物的补料提交为总发酵体积的5％-50％。

Images