CN113509551A - 一种槲皮素铁离子胶束及其在肿瘤光热免疫治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤光热治疗的光热剂，有效成分为槲皮素与铁离子或者亚铁离子通过配位键形成的复合物包裹在双亲性聚合物形成的胶束(QFM)中，具有较好的光热效应，用于光热治疗肿瘤能够有效地杀伤肿瘤细胞。从胶束中释放的槲皮素能够降低肿瘤细胞的程序性死亡配体1(PD‑L1)的表达，显著地促进了淋巴细胞浸润到肿瘤内部对残余的肿瘤细胞进行杀伤，并且在瘤内注射后部分QFM也能够靶向到淋巴结，释放的槲皮素能够显著地降低树突状细胞表面的PD‑L1，使得树突状细胞呈递肿瘤细胞抗原的能力增强。经过治疗后小鼠脾脏中的记忆T细胞数量显著增加，使得机体对肿瘤细胞形成长期免疫记忆，有效地防止肿瘤复发。

Description

一种槲皮素铁离子胶束及其在肿瘤光热免疫治疗中的应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物技术领域，更具体地，涉及一种槲皮素铁离子胶束制剂的制备方法和应用。
背景技术
相比于传统化疗，肿瘤光热治疗具有系统毒副作用小，治疗的部位和持续时间易于控制等优点，为一些存在于浅表部位的肿瘤如黑色素瘤的治疗带来了曙光。但是目前可用的光敏剂依旧很少，主要包括吲哚菁绿(ICG)、金纳米粒、聚多巴胺等。由于光穿透效率的限制，光照光敏剂产生的热量很难杀灭所有肿瘤细胞，因而一些恶性肿瘤如黑色素瘤在传统的光热剂介导的光热治疗后往往会复发，急需一种能够降低肿瘤复发率的新型光热剂。
肿瘤细胞经过光热治疗后被报道能够诱发免疫源性死亡，释放的肿瘤相关抗原能够被淋巴结中的树突状细胞摄取并呈递给T淋巴细胞，引起抗肿瘤的细胞毒性T细胞的激活，激活的细胞毒性T细胞进入肿瘤后能够对残余的肿瘤细胞进行杀伤。然而，当细胞毒性T细胞表面的程序性死亡受体1(PD-1)与肿瘤细胞表面大量表达的程序性死亡配体1(PD-L1)结合时细胞毒性T细胞的抗肿瘤活性被极大地降低。此外，树突状细胞(DCs)表面表达的PD-L1在与T细胞表面的PD-1结合时，DCs对T细胞的活化作用也受到抑制。抑制或者阻断PD-1/PD-L1的抗体或者小分子抑制剂被报道能够有效增强T细胞杀伤肿瘤的效果。
光热治疗联合PD-1或者PD-L1的抗体有望改善治疗肿瘤的效果，激活细胞毒性T细胞的活性有助于清除肿瘤光热治疗后残余的肿瘤细胞，从而降低肿瘤的复发率。但是这些联合方法所使用的抗体往往非常昂贵且不稳定，并且这种多组分的组合也使得制剂变得更复杂，制剂在工业上的生产和质量控制都非常困难，制剂的生物安全性也值得担忧。因此急需一种能够有效解除肿瘤免疫抑制微环境的制备工艺简单的安全的光热剂。
现有专利CN109847062A公开了一种槲皮素、铁离子与聚乙烯吡咯烷酮复合形成的纳米粒具有光热效应，能够在一定程度上杀伤肿瘤，但由于剂型因素的影响，所制备得到的纳米粒并不具有降低肿瘤细胞的PD-L1的能力，也不能够有效地靶向淋巴结中的树突状细胞和降低树突状细胞的PD-L1的表达，所制备纳米制剂在本质上仍属于传统光热剂，因此研发新的能够解除肿瘤部位免疫抑制微环境的制剂是一个亟待解决的问题。
本发明人创造性地将槲皮素、铁离子和双亲性聚合物复合形成胶束，所形成的胶束的光热效应能够杀死大部分肿瘤细胞。槲皮素铁离子胶束(QFM)能够靶向淋巴结中的树突状细胞，释放的槲皮素能够降低树突状细胞表面的PD-L1，促进树突状细胞对肿瘤抗原的摄取和对细胞毒性T细胞的激活，QFM也能够有效地降低肿瘤细胞表面的PD-L1，增强细胞毒性T细胞对光热治疗后残余的肿瘤细胞的免疫杀伤作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种简单、安全、高效、经济的槲皮素铁离子胶束用于肿瘤光热免疫治疗的方法，其产品制备方法简单，质量易于控制，易于工业化生产，治疗效果显著，抑制了肿瘤在光热治疗后的复发并使得机体对肿瘤细胞形成了长期免疫记忆。
本发明的第一个目的是提供一种槲皮素铁离子胶束。
本发明的第二个目的是提供一种槲皮素铁离子胶束的制备方法。
本发明的第三个目的是提供上述方法制备得到的槲皮素铁离子胶束。
本发明的第四个目的是提供上述槲皮素铁离子胶束的应用。
为解决上述克服现有的技术的不足，本发明提供的技术方案是：
本发明提供了所述槲皮素铁离子胶束的制备方法，将槲皮素、铁离子源、双亲性分子溶解于溶剂中，在溶剂中搅拌混匀，然后注入搅拌中的水中，在水中搅拌，即可得槲皮素铁离子胶束。
优选地，所述槲皮素、铁离子源、双亲性分子的质量比为1-1000：1-1000：1-10000。
更优选地，所述槲皮素、铁离子源、双亲性分子的质量比为1-100：1-100：1-100。
更优选地，所述槲皮素、铁离子源、双亲性分子的质量比为1：1：2。
优选地，所述溶剂为乙醇、异丙醇中的任意一种。
更优选地，所述溶剂为乙醇。
优选地，所述双亲性分子为DSPE-PEG和/或PEG-PLGA。DSPE-PEG和/或PEG-PLGA材料可含有肿瘤微环境敏感(如对活性氧敏感和对基质金属蛋白酶敏感的键)、选择性结合肿瘤的能力(如叶酸、RGD和铁蛋白)等的官能团，以实现肿瘤靶向、控制释放等目标。
更优选地，所述的双亲性分子为DSPE-PEG2000。
优选地，所述的在乙醇或者异丙醇中的搅拌混匀的时间为1min-20h。
更优选地，所述的搅拌混匀时间为15min。
优选地，所述的在乙醇或者异丙醇中的搅拌混匀的速度为10-1000r/min。
更优选地，所述的搅拌混匀的速度为120r/min。
优选地，所述的在水中的搅拌速度为6-1000r/min。
更优选地，所述的在水中的搅拌速度为200-400r/min。
另外，上述方法制备得到的槲皮素铁离子胶束，也应在本发明的保护范围之内。
上述槲皮素铁离子胶束与抗肿瘤药物中的联合应用，也应在本发明的保护范围之内。
上述槲皮素铁离子胶束与药学上可接受的光敏剂如聚多巴胺、吲哚菁绿、碳纳米管等联合应用于肿瘤的光热或光动力治疗，也应在本发明的保护范围之内。
所述肿瘤为良性肿瘤或者恶性肿瘤。
本发明所述的槲皮素铁离子胶束通过静脉注射、瘤内注射或者其它药学上可行的给药方式给药，随后给予肿瘤606nm、808nm、1050nm或者其它可以产生光热治疗效果的光照。
本发明还提供了一种肿瘤光热免疫治疗剂，其包含上述槲皮素铁离子胶束和药学上可接受的光敏剂联合使用。
优选地，所述药学上可接受的光敏剂选自聚多巴胺、吲哚菁绿、碳纳米管中的一种或多种。
所述光热免疫治疗剂应用于肿瘤光热免疫治疗。
本发明所述槲皮素铁离子胶束介导的光热治疗可与其他肿瘤治疗方案联合应用，如手术切除、放疗、化疗、光动力治疗以及免疫治疗等。
与现有技术相比，本发明的优越性在于：
(1)槲皮素铁离子胶束的制剂的成本低，稳定性好，生产工艺简便，生产流程易于自动化，适合工业化生产。
(2)槲皮素铁离子胶束的生物安全性好，在体内可降解，长期给药未见毒性。
(3)本发明提供了一种简单高效、能够降低肿瘤细胞PD-L1的抑制剂，增强了细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
(4)槲皮素铁离子胶束在注射进入肿瘤后，部分胶束转移靶向到淋巴结中的树突状细胞，释放的槲皮素显著地降低了树突状细胞表面的PD-L1，促进了树突状细胞对肿瘤细胞抗原的呈递和对免疫T细胞的激活。
(5)经过槲皮素铁离子胶束介导的光热治疗后，肿瘤内的CD8+T细胞和CD4+T细胞显著增多，脾脏中的记忆T细胞显著增多，有效地抑制了光热治疗后肿瘤的复发，治愈后的机体对肿瘤形成了强大的免疫记忆，有效地抑制了同种肿瘤在机体的再次发生。
附图说明
图1是QFM的表征和光热效应；其中，图a是实施例1制备的槲皮素铁离子胶束的SEM图；图b是实施例2制备的槲皮素亚铁离子胶束的SEM图；图c是实施例3制备的胶束的SEM图；图d是槲皮素铁离子胶束的温度与激光照射时间的关系图；图e是实施例1-3制备的胶束的温度与激光照射时间的关系图；图f是不同质量比的槲皮素与氯化铁形成的胶束的温度与激光照射时间的关系图；图g是细胞经过槲皮素胶束、槲皮素铁离子胶束和槲皮素铁离子胶束介导的光热治疗后用台盼蓝对肿瘤细胞进行染色的结果图。
图2是QFM对肿瘤细胞的免疫原性死亡和PD-L1的表达的影响；其中，图a是槲皮素胶束、槲皮素铁离子胶束和QFM介导的光热治疗对B16F10细胞的钙网蛋白CRT的表达影响的免疫荧光染色图和半定量结果图；图b是槲皮素胶束和QFM对肿瘤细胞的PD-L1的表达的蛋白免疫印迹的结果图和半定量的结果图；图c是对照组细胞和用CRISPR技术敲除PD-L1的肿瘤细胞中的PD-L1的表达的蛋白免疫印迹图；图d是活化的CD8+T细胞和肿瘤细胞共孵育后用结晶紫染色对残留在培养皿底部的B16F10细胞进行染色的结果图；图e是活化的CD8+T细胞和肿瘤细胞共孵育后用CCK-8测得的肿瘤细胞的存活率的结果图；图f是槲皮素胶束和QFM对肿瘤的PD-L1的表达的影响的蛋白免疫印迹的结果图和半定量的结果图；图g是用DiD标记的QFM和游离的DiD经瘤内注射后在腹股沟淋巴结的分布的荧光图和半定量的结果图；图h是用DiD标记的QFM和游离的DiD经瘤内注射后在腹股沟淋巴结中的DCs细胞中的分布图；图i是QFM经瘤内注射后对腹股沟淋巴结中的DC细胞表面的PD-L1的表达的影响的结果图；图j是用DiD标记的不同配比的QFM在淋巴结中的分布和半定量的结果图。
图3是槲皮素胶束、QFM和QFM介导的光热治疗对小鼠肿瘤内的免疫微环境的影响和对肿瘤生长以及小鼠生存期的影响；其中，图a是小鼠肿瘤内的CD8+T细胞和CD4+T细胞的含量测定的结果图；图b是小鼠肿瘤内的TNFα、IFNγ的免疫荧光染色的结果图和荧光半定量的结果图；图c是小鼠肿瘤的HE染色的结果图；图d是小鼠的肿瘤的生长曲线图；图e是小鼠的生存曲线图。
图4是荷瘤小鼠在经过治疗后对肿瘤的免疫记忆实验和QFM在小鼠体内的安全性评价；其中，图a是小鼠脾脏细胞中的记忆T细胞的含量测定的结果图；图b是培养上清中的TNFα、IFNγ和IL-6的含量测定的结果图；图c是小鼠肿瘤内的CD8+T细胞的免疫荧光染色的结果图；图d是小鼠的肿瘤的生长曲线图；图e是小鼠的生存曲线图；图f是小鼠血液中的红细胞、粒细胞、淋巴细胞和白细胞的含量检测的结果图；图g是小鼠血清的生化指标AST、ALT、LDH、CREA和铁离子的含量测定的结果图；图h是小鼠的体重测定的结果图；图i是小鼠的心肝脾肺肾和脑的HE染色的结果图。
图5是用DiD标记的QFM和QFM-RGD经静脉注射后在小鼠肿瘤部位的分布的结果图。
图6是槲皮素胶束和TFN、PDA、CNTS和ICG联合应用于肿瘤治疗的结果图；其中，图a是QFM、TFN、PDA、CNTS和ICG的温度与激光照射时间的关系图；图b是槲皮素胶束和光热剂联合用于肿瘤治疗的给药方案示意图；图c是QFM、TFN、PDA、CNTS和ICG在小鼠的肿瘤经过激光照射后的温度图；图d是小鼠肿瘤细胞的PD-L1的表达的测定的结果图；图e左边是小鼠的淋巴结的形貌，右边是淋巴结的重量；图f是小鼠淋巴结中的CD11c+D80+细胞的含量的测定的结果图；图g是小鼠肿瘤中的CD3+CD4+细胞的含量的测定的结果图；图h是小鼠肿瘤中的CD8+Granzyme B+细胞的含量测定的结果图；图i是小鼠肿瘤中的CD8+IFNγ+细胞的含量测定的结果图；图j是小鼠肿瘤的生长曲线图；图k是小鼠的生存曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规的试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1槲皮素铁离子胶束的制备
将5mg槲皮素、5mg氯化铁(FeCl3)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例2槲皮素亚铁离子胶束的制备
将5mg槲皮素、5mg四水合氯化亚铁(FeCl2.4H2O)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌45min，搅拌速度为100r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为200r/min)，即得分散于水中的槲皮素亚铁离子胶束。
实施例3槲皮素铁离子复合物与PEG-PLGA形成的胶束的制备
将5mg槲皮素、5mg氯化铁(FeCl3)、100mg PEG-PLGA溶解于2mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为1000r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为1000r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例4槲皮素铁离子胶束的制备
将1mg槲皮素、1mg氯化铁(FeCl3)、100mg DSPE-PEG2000溶解于2mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例5槲皮素铁离子胶束的制备
将1mg槲皮素、1mg氯化铁(FeCl3)、50mg DSPE-PEG2000溶解于2mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例6槲皮素铁离子胶束的制备
将1mg槲皮素、50mg氯化铁(FeCl3)、100mg DSPE-PEG2000溶解于2mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例7槲皮素铁离子胶束的制备
将1mg槲皮素、100mg氯化铁(FeCl3)、100mg DSPE-PEG2000溶解于1mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例8槲皮素铁离子胶束的制备
将50mg槲皮素、1mg氯化铁(FeCl3)、100mg DSPE-PEG2000溶解于1mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例9槲皮素铁离子胶束的制备
将100mg槲皮素、1mg氯化铁(FeCl3)、100mg DSPE-PEG2000溶解于1mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例10槲皮素和氯化铁的质量比为16：8
将5mg槲皮素、2.5mg氯化铁(FeCl3)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例11槲皮素和氯化铁的质量比为16：4
将5mg槲皮素、1.25mg氯化铁(FeCl3)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例12槲皮素和氯化铁的质量比为16：2
将5mg槲皮素、0.625mg氯化铁(FeCl3)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例13槲皮素和氯化铁的质量比为16：1
将5mg槲皮素、0.313mg氯化铁(FeCl3)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束。
实施例14槲皮素和氯化铁的质量比为16：0
将5mg槲皮素、0mg氯化铁(FeCl3)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素胶束。
实施例15QFM的形貌观察
(1)实验方法
用扫描电镜(SEM)对实施例1制备得到的槲皮素铁离子胶束、实施例2制备得到的槲皮素亚铁离子胶束和实施例3制备得到的槲皮素铁离子复合物与PEG-PLGA形成的胶束进行观察和拍照。
(2)实验结果
SEM的结果表明，槲皮素铁离子胶束(图1a)和槲皮素亚铁离子胶束(图1b)和槲皮素铁离子复合物与PEG-PLGA形成的胶束(图1c)都呈圆球形，大小较为均一，尺寸在80nm左右。
实施例16QFM的光热性能测试
(1)实验方法
将实施例1获得的槲皮素铁离子胶束用纯水配置为250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL和31.2μg/mL的浓度，将实施例2获得的槲皮素亚铁离子胶束和槲皮素铁离子与实施例3获得的PEG-PLGA形成的胶束用纯水配置为250μg/ml的浓度，用808nm的激光照射(1.0W/cm2)，记录溶液温度与激光照射时间的关系。
(2)实验结果
实验结果如图1d所示，随着QFM胶束的浓度增加溶液升高的温度逐渐增加；由图1e可知，所试的三种胶束的光热转化能力相近。
实施例17不同质量比的槲皮素和铁离子形成的胶束的光热效率
(1)实验方法
将实施例1、实施例10-13的方法制备的QFM用纯水配置为250μg/ml的浓度，以实施例14制备得到的槲皮素胶束作为对照，用808nm的激光照射(1.0W/cm2)，记录溶液温度与激光照射时间的关系。
(2)实验结果
不同质量比的QFM的光热效果如图1f所示，槲皮素胶束几乎没有光热效果；当槲皮素和氯化铁的质量比为16：2—16：16时，槲皮素铁离子胶束可以获得显著优异的光热效果；当槲皮素和氯化铁的质量比为16：16时，槲皮素铁离子胶束的光热效果最好，溶液升高的温度最大。
实施例18槲皮素胶束(Que)、QFM和QFM介导的光热效应的杀伤肿瘤细胞的效果
(1)实验方法
将黑色素瘤细胞B16F10铺于12孔板中，在细胞的培养基中加入实施例14制备的槲皮素胶束(20μg/mL)和实施例1制备的QFM(100μg/mL)共孵育8h，或者将细胞和实施例1制备的QFM(100μg/mL)共孵育8h后用808nm的激光照射5min(1.0W/cm2)，并用激光照射未经处理的细胞作为比较。用台盼蓝对各组细胞进行染色，用倒置显微镜观察和拍照。
(2)实验结果
从图1g可以看出，QFM介导的光热治疗显著地杀伤了肿瘤细胞，而槲皮素胶束、QFM或者单独的激光照射对细胞的存活率都没有显著的影响。
实施例19槲皮素胶束(Que)、QFM和QFM介导的光热效应诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡
(1)实验方法
将黑色素瘤细胞铺于激光共聚焦皿中，在细胞的培养基中加入实施例14制备的槲皮素胶束Que(20μg/mL)和实施例1制备的QFM(100μg/mL)共孵育8h，或者将细胞和实施例1制备的QFM(100μg/mL)共孵育8h后用808nm的激光照射5min(1.0W/cm2)，后用4％的多聚甲醛固定细胞24h，然后对细胞中的钙网蛋白(Calreticulin)-CRT进行免疫荧光染色。
(2)实验结果
从图2a可以看出，经过QFM介导的光热治疗后细胞膜表面表达的CRT显著增多，表明QFM介导的光热治疗诱发了肿瘤细胞发生免疫原性死亡，槲皮素胶束或者QFM处理对细胞的CRT的表达无显著性影响。
实施例20槲皮素胶束(Que)降低肿瘤细胞的PD-L1并增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
(1)槲皮素胶束和QFM降低肿瘤细胞的PD-L1
1)实验方法
将B16F10细胞培养于12孔板中，在细胞的培养基中加入实施例14制备的槲皮素胶束Que(10μg/mL)或者实施例1制备的QFM(10μg/mL)，孵育18h后收集细胞并用蛋白免疫印记(WB)的实验方法对细胞中的PD-L1的相对含量进行测定。
2)实验结果
实验结果如图2b所示，槲皮素胶束(Que)和槲皮素铁离子胶束(QFM)都能够显著降低B16F10细胞的PD-L1的表达量。
(2)槲皮素胶束增强细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用依赖于肿瘤细胞的PD-L1的表达。
1)实验方法
用CRISPR技术敲除B16F10细胞中的PD-L1，然后将对照组细胞(对照组细胞为经过对照质粒处理的细胞，对照质粒不影响细胞中的PD-L1的表达)和敲除PD-L1的细胞铺于12孔板中，加入实施例14制备的槲皮素胶束(5μg/mL)和活化的T细胞，孵育48h后用CCK8测定肿瘤细胞的存活率，用4％的多聚甲醛固定细胞，并用结晶紫对存活的细胞进行染色。
2)实验结果
由图2c可知，利用CRISPR技术成功地敲除了肿瘤细胞的PD-L1。由图2d-e可知，在对照组细胞中，槲皮素胶束显著地促进了T细胞对肿瘤细胞的杀伤，而在敲除PD-L1的细胞中槲皮素胶束不再能够促进T细胞对肿瘤细胞进行杀伤，说明槲皮素胶束增强细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用依赖于肿瘤细胞表面的PD-L1。
实施例21槲皮素胶束(Que)和槲皮素铁离子胶束(QFM)对黑色素瘤中的PD-L1的表达的影响
(1)实验方法
将B16F10细胞接种于9只小鼠背部皮下，接种后的第6天、7天和8天分别瘤内注射实施例14制备的槲皮素胶束(30μg/只)或者由实施例1制备的QFM(30μg/只)，在接种后的第10天取出肿瘤，裂解肿瘤细胞，用WB的实验方法检测细胞中的PD-L1的表达并进行半定量计算。
(2)实验结果
实验结果如图2f所示，槲皮素胶束(Que)和QFM在小鼠体内能够显著降低肿瘤细胞的PD-L1的表达，进而可以减弱肿瘤细胞对T细胞活化的抑制作用。
实施例22QFM经瘤内注射后对淋巴结中的树突状细胞的靶向作用
(1)实验方法
首先制备用DiD标记的QFM：将1μg DiD、5mg槲皮素、5mg氯化铁(FeCl3)、10mgDSPE-PEG溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min即得用DiD标记的槲皮素铁离子胶束。将B16F10细胞接种于6只小鼠背部皮下，接种8天后瘤内注射用DiD标记的槲皮素铁离子胶束或者游离的等量的DiD(200ng/只)，24h后处死小鼠取出小鼠靠近肿瘤的腹股沟处的淋巴结，用小动物活体成像仪检测小鼠淋巴结中的DiD的荧光强度。进行冰冻切片，用FITC标记的CD11c对淋巴结中的树突状细胞进行染色，用DAPI对细胞核进行染色，随后用激光共聚焦显微观察DiD在淋巴结中的分布。
(2)实验结果
实验结果如图2g所示，相较于游离的DiD，QFM包载的DiD能够更多地富集在小鼠的淋巴结中，表明QFM能够靶向淋巴结。由激光共聚焦显微镜观察的结果(图2h)可知，在淋巴结中DID标记的槲皮素铁离子胶束大量地被CD11c标记的树突状细胞摄取，表明QFM可靶向淋巴结中的树突状细胞。
实施例23QFM经瘤内注射后对淋巴结中的树突状细胞表面的PD-L1的表达的影响
(1)实验方法
将B16F10细胞接种于10只小鼠背部皮下，在接种细胞的第6天、7天和8天分别瘤内注射实施例1制备的QFM(30μg/只)一次，在第11天处死小鼠取出靠近肿瘤的腹股沟处的淋巴结(用荷瘤的空白小鼠作为对照组)，在70μm的细胞筛网中研磨，收集细胞，用荧光标记的CD11c、PD-L1抗体进行染色并用流式细胞仪检测。
(2)实验结果
实验结果如图2i所示，和对照组相比，经过QFM处理的小鼠的淋巴结中树突状细胞的CD11c+PD-L1+的细胞的比例显著降低，表明QFM在靶向淋巴结后释放的槲皮素能够显著降低树突状细胞中的PD-L1的表达。
实施例24用DiD标记的不同配比的QFM对淋巴结的靶向效果
(1)实验方法：
1)制备用DiD标记的不同配比的QFM
将1μg DiD、5mg槲皮素、5mg四水合氯化亚铁(FeCl2.4H2O)、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌45min，搅拌速度为100r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为200r/min)，即得分散于水中的槲皮素亚铁离子胶束，记为QFM1；将10μg DiD、1mg槲皮素、50mg氯化铁(FeCl3)、100mg DSPE-PEG2000溶解于2mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束，记为QFM2；将10μg DiD、50mg槲皮素、1mg氯化铁(FeCl3)、100mg DSPE-PEG2000溶解于1mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的槲皮素铁离子胶束，记为QFM3；将1μg DiD、10mg DSPE-PEG2000溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，搅拌速度为10r/min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min(搅拌速度为6r/min)，即得分散于水中的DSPE-PEG胶束，记为M1。
2)DiD标记的不同配比的槲皮素铁离子胶束对淋巴结的靶向效果的评价
将B16F10细胞接种于15只小鼠背部皮下，在接种的第8天瘤内注射DiD标记的槲皮素铁离子胶束QFM1、QFM2、QFM3、M1或者游离的等量的DiD(200ng/只)，24h后处死小鼠取出靠近肿瘤的腹股沟处的淋巴结，进行冰冻切片，并用FITC标记的CD11c对淋巴结中的树突状细胞进行染色，用DAPI对细胞核进行染色，随后用激光共聚焦显微观察DiD在淋巴结中的分布。
(2)实验结果
实验结果如图2j所示，和游离的DiD相比，QFM1、QFM2、QFM3、M1都能够靶向淋巴结增加DiD在淋巴结中的量。
实施例25槲皮素胶束(Que)、槲皮素铁离子胶束(QFM)以及经过QFM介导的光热治疗后小鼠体内的CD8+T细胞和CD4+T细胞在肿瘤内部的浸润
(1)实验方法
将B16F10细胞接种于20只小鼠背部皮下，在接种的第8天瘤内注射实施例14制备的槲皮素胶束(30μg/只)或者实施例1制备的QFM(30μg/只)，或者瘤内注射实施例1制备的QFM(30μg/只)后给予激光照射小鼠肿瘤(1.0W/cm2，5min)，光照8天后取出肿瘤(用荷瘤的空白小鼠作为对照组)，在70μm的细胞筛网中研磨，收集细胞并用荧光标记的CD3、CD4和CD8的抗体进行染色，用流式细胞仪检测。
(2)实验结果
实验结果如图3a所示，用槲皮素胶束(Que)和QFM处理后小鼠肿瘤中的细胞的CD8+T细胞和CD4+T细胞的数量都显著增加，经过光热治疗后肿瘤中的CD8+T细胞和CD4+T细胞的数量进一步增加，这可归因于光热治疗后大量破裂死亡的肿瘤细胞发生了免疫原性死亡，刺激了T细胞的活化。
实施例26槲皮素胶束(Que)、QFM以及经过QFM介导的光热治疗后小鼠肿瘤内TNFα和IFNγ的分布
(1)实验方法
将B16F10细胞接种于20只小鼠背部皮下，接种的8天后瘤内注射实施例14制备的槲皮素胶束Que(30μg/只)或者实施例1制备的QFM(30μg/只)，或者瘤内注射实施例1制备的QFM(30μg/只)后给予激光照射小鼠肿瘤(1.0W/cm2，5min)，光照8天后取出肿瘤(用荷瘤的空白小鼠作为对照组)，用4％的多聚甲醛固定后对肿瘤进行包埋和切片，用荧光标记的TNFα和IFN-γ的抗体对切片进行免疫荧光染色，然后用激光共聚焦显微镜观察和拍照。
(2)实验结果
实验结果如图3b所示，经过QFM介导的光热治疗后的肿瘤中的TNFα和IFNγ的荧光强度显著高于对照组小鼠的肿瘤，表明T细胞的活性比较高。
实施例27槲皮素胶束(Que)、QFM以及经过QFM介导的光热治疗后的肿瘤部位的Tunnel染色和苏木精-伊红染色(HE)实验。
(1)实验方法
将B16F10细胞接种于20只小鼠背部皮下，在接种的第8天瘤内注射给实施例14制备的槲皮素胶束(Que)(30μg/只)或者实施例1制备的槲皮素铁离子胶束(QFM)(30μg/只)，或者瘤内注射实施例1制备的QFM(30μg/只)后给予激光照射小鼠肿瘤(1.0W/cm2，5min)，继续饲养8天后取出肿瘤(用荷瘤的空白小鼠作为对照组)，用4％的多聚甲醛固定后进行包埋切片，然后进行Tunnel染色和HE染色。
(2)实验结果
实验结果如图3c所示，槲皮素胶束和槲皮素铁离子胶束能够诱发少量肿瘤细胞死亡，而QFM介导的光热治疗则能够诱导大量肿瘤细胞发生凋亡或者坏死。
实施例28槲皮素胶束(Que)、QFM和QFM介导的光热治疗对小鼠的肿瘤的生长和小鼠的生存期的影响。
(1)实验方法
将0.7×106个B16F10细胞接种于40只小鼠背部皮下，在接种第8天瘤内注射实施例14制备的槲皮素胶束(30μg/只)或者实施例1制备的槲皮素铁离子胶束(QFM)(30μg/只)，或者瘤内注射实施例1制备的QFM(30μg/只)后给予激光照射小鼠肿瘤(1.0W/cm2，5min)，每两天记录一次小鼠肿瘤的大小(用荷瘤的空白小鼠作为对照组)，每天统计小鼠的死亡情况。
(2)实验结果
实验结果如图3d-e所示，槲皮素胶束(Que)和槲皮素铁离子胶束(QFM)对小鼠肿瘤的生长和小鼠的生存期都有一定程度的改善作用，而经过QFM介导的光热治疗后小鼠的肿瘤完全消失，并且在100天后也未见小鼠的肿瘤复发，小鼠能够长期存活。
实施例29经过QFM介导的光热治疗治愈的小鼠的脾脏中的记忆T细胞对B16F10细胞裂解液的免疫源性反应
(1)实验方法
根据实施例28的实验，在光照结束的第50天取出经过QFM光热治愈的小鼠的脾脏(6只)，并用同种属的新的小鼠的脾脏作为对照组(6只)。在无菌条件下将脾脏在70μm的细胞筛网中研磨，收集细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞，将所得脾脏的细胞培养于12孔板(1×106个细胞/孔)，给予每个孔50μg的B16F10的裂解液(通过液氮反复冻融法得到，根据蛋白含量进行定量)，培养65h后离心取上清，用ELISA试剂盒测定其中的细胞因子IFNγ、TNFα和IL-6，并用流式细胞仪测定脾细胞中的记忆T细胞的比例。
(2)实验结果
实验结果如图4a-b所示，治愈后的小鼠的脾脏中的记忆T细胞的数量远高于对照组小鼠脾脏中的记忆T细胞的数量(图4a)，脾脏中的免疫细胞在经受B16F10细胞碎片刺激的时候释放出更多的IFNγ、TNFα和IL-6等杀伤肿瘤的细胞因子(图4b)，说明通过QFM介导的光热治疗治愈的小鼠对B16F10黑色素瘤形成了较强的免疫记忆。
实施例30经过QFM介导的光热治疗治愈的荷瘤小鼠再次接种B16F10细胞
(1)实验方法
根据实施例28的实验，在光照结束的第50天将0.7×106个B16F10细胞接种于经QFM介导的光热治疗治愈的小鼠的背部皮下(12只)，并用新买的同种小鼠作为对照组(12只)，每两天记录一次小鼠肿瘤的大小，每天统计小鼠的死亡情况。此外，在重新接种肿瘤细胞的第15天取出部分小鼠的肿瘤(每组剖取4只小鼠的肿瘤)，用冰冻切片机进行切片并用荧光标记的CD8抗体对肿瘤中的CD8+T细胞进行免疫荧光染色，通过激光共聚焦观察和拍照。
(2)实验结果
实验结果如图4c-e所示，在QFM介导的光热治疗治愈的小鼠中，重新接种形成的肿瘤内的CD8+T细胞的数量显著高于对照组小鼠肿瘤中的CD8+T细胞的数量，肿瘤的生长速度也远低于对照组小鼠的肿瘤的生长速度，而且最终有33％的小鼠即使在100天后也没有长出新的肿瘤，对照组小鼠则在30天内全部长出肿瘤并死亡，说明经过QFM介导的光热治疗治愈的小鼠对B16F10肿瘤形成了有效的免疫记忆。
实施例31QFM的生物安全性
(1)实验方法
将实施例1制备得到的QFM通过尾静脉注射到健康的小鼠体内(10mg/kg)，每三天注射一次(对照组小鼠注射生理盐水，每组8只小鼠)，连续注射20次，给药完成后将小鼠继续饲养一周，记录小鼠的体重的变化。最后收集小鼠的血液测定血常规，收集小鼠的血清测定生化指标，将小鼠的心肝脾肺肾和脑取出用多聚甲醛固定并进行HE染色。
(2)实验结果
实验结果如图4f-i所示，连续多次给药后给药组和对照组相比血常规无显著性差异(图4f)，生化指标没有显著性差异(图4g)，体重无显著性差异(图4h)，HE染色的结果也表明QFM未对小鼠的各个器官造成明显的损伤(图4i)。这些结果表明QFM的安全性较好，经过长期静脉注射给药也未引起显著的毒性。
实施例32肿瘤靶向肽RGD修饰的QFM对肿瘤的靶向性
(1)实验方法
首先将DSPE-PEG-Mal和带巯基的RGD共孵育10h制备得到RGD修饰的DSPE-PEG，然后将1μg DiD，5mg槲皮素、5mg氯化铁(FeCl3)、10mg DSPE-PEG-RGD溶解于0.5mL无水乙醇，室温下搅拌15min，然后吸取所得溶液滴注到搅拌中的25mL纯水中，继续搅拌10min即得分散于水中的RGD修饰的槲皮素铁离子胶束(QFM-Mal)。以实施例22制备的DiD标记的QFM为对照，通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内(10ng DiD/只)。12h后用小动物活体成像仪对小鼠进行拍照。
(2)实验结果
实验结果如图5所示，QFM-RGD在肿瘤部位的荧光强度高于未经RGD修饰的QFM，表明肿瘤靶向肽的修饰有助于提高QFM的肿瘤靶向性，有利于进一步提高QFM在肿瘤部位的富集，降低其潜在的毒副作用。
实施例33QFM和PDA、TFN、CNTS和ICG的光热效果的比较
(1)实验方法
1)聚多巴胺纳米粒(PDA)的制备
将20mg盐酸多巴胺溶解在30mL的Trizma碱缓冲液中(pH＝8.5)。室温下搅拌16h，离心(40000g，30min)得到PDA纳米粒，用水洗涤，于4°c保存。
2)单宁酸铁离子复合物纳米粒(TFN)的制备
将单宁酸(5mg)和FeCl3(5mg)溶解于10ml水中，用Trizma碱调节pH值至8.5，于室温下搅拌16h，离心(40000g，30min)得到TFN纳米粒，用水洗涤，于4°c保存。
3)QFM和PDA、TFN、CNTS和ICG的光热效果的比较
将实施例1制备得到的QFM和实施例33制备得到的PDA纳米粒、TFN纳米粒、市售的吲哚菁绿(ICG)和碳纳米管(CNTS)用纯水配置，使得各个光热剂的浓度皆为250μg/mL，以纯水为对照，用808nm的激光照射(1.0W/cm2)，记录溶液温度与激光照射时间的关系。
(2)实验结果
实验结果如图6a所示，经过激光照射5min后各个光热剂的温度都显著增加，其中ICG的温度升高了62℃，QFM和CNTS的温度升高了32℃，PDA纳米粒的温度升高了24℃，CNTS的温度升高了16℃，纯水(water)的温度升高了0.3℃。
实施例34QFM和PDA、TFN、CNTS和ICG在肿瘤内的光热效果
(1)实验方法
为了便于探讨各个光热剂对肿瘤免疫微环境的调节作用，我们调整了瘤内注射的光热剂的剂量使得肿瘤经过激光照射后升高的温度相近。具体地，将B16F10细胞接种于18只小鼠背部皮下，接种的第8天将实施例1制备得到的QFM(30μg/只)和实施例33制备得到的PDA纳米粒(40μg/只)、TFN纳米粒(60μg/只)、以及市售的吲哚菁绿(ICG)(8μg/只)和碳纳米管(CNTS)(30μg/只)分散于生理盐水中，经瘤内注射给药后给予激光照射(1.0W/cm2，5min)，以未经处理的小鼠的肿瘤作为对照，用红外照相机记录肿瘤的温度。
(2)实验结果
实验结果如图6c所示，经过激光照射5min后各光热剂皆能引起小鼠肿瘤温度的显著上升，瘤内温度都上升到68℃左右。
实施例35槲皮素胶束(Que)和PDA、TFN、CNTS和ICG联合应用对肿瘤免疫细胞的影响
(1)实验方法
将B16F10细胞接种于30只小鼠背部皮下，在接种后的第8天将实施例1制备得到的QFM(30μg/只)和实施例33制备得到的PDA纳米粒(40μg/只)、TFN纳米粒(60μg/只)、以及市售的吲哚菁绿(ICG)(8μg/只)和碳纳米管(CNTS)(30μg/只)分散于生理盐水中，经瘤内注射给药后给予激光照射(1.0W/cm2，5min)。另将实施例14制备的槲皮素胶束(Que，30μg/只)和实施例33制备得到的PDA纳米粒(40μg/只)、TFN纳米粒(60μg/只)、以及市售的吲哚菁绿(ICG)(8μg/只)和碳纳米管(CNTS)(30μg/只)协同给药，经瘤内注射给药后给予激光照射(1.0W/cm2，5min)，并于第9天和第10分别瘤内注射Que一次(30μg/只)，以未经处理的荷瘤小鼠作为对照，光照8天后取出肿瘤，在70μm的细胞筛网中研磨，收集细胞并用荧光标记的PD-L1、CD44、CD3、CD4、CD8、IFNγ和Granzyme B的抗体进行染色，用流式细胞仪检测。另外，剖取小鼠靠近肿瘤部位的腹股沟处的淋巴结，拍照并称重，在70μm的细胞筛网中研磨，收集细胞并用荧光标记的CD80和CD11c抗体进行染色，用流式细胞仪检测。
(2)实验结果
图6d的实验结果表明，光热剂PDA、TFN、CNTS和ICG皆不影响肿瘤细胞的PD-L1的表达，而槲皮素胶束(Que)和PDA、TFN、CNTS和ICG联合应用后肿瘤细胞的PD-L1的表达由约30％的阳性率降到了10％；图6e的实验结果表明，经过PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗后小鼠的淋巴结的大小和重量和对照组的淋巴结的大小和重量无显著性差异，而槲皮素胶束(Que)和PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗联合应用后小鼠的淋巴结的尺寸和重量显著增大，表明槲皮素胶束(Que)的联合应用促进了淋巴结中的免疫细胞发生活化和增值，有利于促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤；图6f的实验结果表明，经过PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗后小鼠的淋巴结中的CD11c+CD80+的细胞的比例和对照组相比无显著性差异，而槲皮素胶束(Que)和PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗联合应用后小鼠的淋巴结中的CD11c+CD80+的细胞的比例都显著增加，表明槲皮素胶束(Que)的联合应用促进了淋巴结中的树突状细胞的成熟，有利于树突状细胞对肿瘤抗原的呈递；图6g-i的实验结果表明，相比于经过PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗后的小鼠，槲皮素胶束(Que)和PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗联合应用后小鼠肿瘤内的CD4+T细胞、CD8+IFNγ+T细胞和CD8+GranzymeB+T细胞都有显著的提高，表明槲皮素胶束(Que)的联合应用促进了细胞毒性T细胞在肿瘤部位的活化。
实施例36槲皮素胶束(Que)和PDA、TFN、CNTS和ICG联合应用对荷瘤小鼠的肿瘤生长和生存期的影响
(1)实验方法
将B16F10细胞接种于30只小鼠背部皮下，在接种后的第8天将实施例1制备得到的QFM(30μg/只)和实施例33制备得到的PDA纳米粒(40μg/只)、TFN纳米粒(60μg/只)、以及市售的吲哚菁绿(ICG)(8μg/只)和碳纳米管(CNTS)(30μg/只)分散于生理盐水中，经瘤内注射给药后给予激光照射(1.0W/cm2，5min)。另将实施例14制备的槲皮素胶束(Que，30μg/只)和实施例33制备得到的PDA纳米粒(40μg/只)、TFN纳米粒(60μg/只)、以及市售的吲哚菁绿(ICG)(8μg/只)和碳纳米管(CNTS)(30μg/只)协同给药，并于第9天和第10分别瘤内注射Que一次(30μg/只)，经瘤内注射给药后给予激光照射(1.0W/cm2，5min)，以未经处理的小鼠的肿瘤作为对照，记录各组小鼠肿瘤的尺寸和小鼠的生存期。
(2)实验结果
实验结果如图6j-k所示，经过PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗后小鼠的肿瘤在光照结束后的10天内全部复发，最终小鼠在50天内全部死亡。而槲皮素胶束(Que)和PDA、TFN、CNTS和ICG介导的光热治疗联合应用后小鼠的肿瘤复发率显著降低，各组在100天后肿瘤的复发率和小鼠的死亡率都小于20％。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明地实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的替换及辅助成分添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种槲皮素铁离子胶束，其特征在于：所述胶束包含以下原料，槲皮素1-1000份，铁离子源1-1000份，双亲性聚合物1-10000份。
2.根据权利要求1所述的槲皮素铁离子胶束，其特征在于：包含槲皮素1-100份，铁离子源1-100份，双亲性聚合物1-100份，优选地，包含槲皮素1份，铁离子源1份，双亲性聚合物2份。
3.根据权利要求1所述的槲皮素铁离子胶束，其特征在于：根据权利要求1所述的槲皮素铁离子胶束，其特征在于：所述双亲性聚合物选自聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG)、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)中的一种或两种，优选为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，更优选地，所述双亲性聚合物为DSPE-PEG2000。
4.根据权利要求1所述的槲皮素铁离子胶束，其特征在于：所述铁离子源为能够与槲皮素通过配位键螯合的可溶性盐中的一种或者几种，优选自含有铁离子或者亚铁离子的盐。
5.根据权利要求1-4任一项所述的槲皮素铁离子胶束的制备方法，其特征在于：将槲皮素、铁离子源与双亲性聚合物溶解于溶剂中，在溶剂中搅拌混匀，然后将其分散于水中，在水中搅拌，即可得到槲皮素铁离子胶束。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂优选为乙醇和/或异丙醇；优选地，所述在溶剂中的搅拌混匀的时间为1min-20h；更优选地，所述在溶剂中的搅拌混匀的时间为15min；优选地，所述在溶剂中的搅拌混匀的速度为10-1000r/min；更优选地，所述在溶剂中的搅拌混匀的速度为120r/min；优选地，所述的在水中的搅拌速度为6-1000r/min；更优选地，所述的在水中的搅拌速度为200-400r/min。
7.一种肿瘤光热免疫治疗剂，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的槲皮素铁离子胶束和药学上可接受的光敏剂。
8.根据权利要求1-4任一项所述的一种肿瘤光热免疫治疗剂，其特征在于，所述药学上可接受的光敏剂选自聚多巴胺、吲哚菁绿、碳纳米管中的一种或多种。
9.根据权利要求1-4任一项所述的槲皮素铁离子胶束在肿瘤光热免疫治疗中的应用。
10.一种根据权利要求1-4任一项所述的槲皮素铁离子胶束在制备用于肿瘤的光热或光动力治疗的药物中的用途，其特征在于，所述权利要求1-4所述的槲皮素铁离子胶束与药学上可接受的光敏剂合用，优选地，所述药学上可接受的光敏剂选自聚多巴胺、吲哚菁绿、碳纳米管中的一种或多种。
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