CN113484207A - 颗粒物检测装置及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种颗粒物检测装置及检测方法，具体提供了一种基于介电泳和电阻抗测量技术的检测装置及检测方法，更具体的涉及一种使用微流控芯片的电阻抗检测装置，以及其检测目标粒子的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用介电泳和电阻抗测量检测颗粒物的装置和方法，特别涉及一种利用介电泳增强的电阻抗测量微流控芯片和利用该芯片的检测方法。
背景技术
电阻抗测量技术，大多经由微流控芯片或电场聚焦使颗粒物呈现单一粒子流并通过测量电极，随后基于颗粒物对测量电压或电流产生的阻碍和抵抗作用进行颗粒物检测及计数。但是在实际检测样本(比如血液)时，由于目标颗粒物(如循环肿瘤细胞，CTC)与非目标颗粒物如血细胞(特别是巨噬细胞、单核细胞等白细胞)的尺寸相当，所产生的电阻抗信号相当接近，仅依据电阻抗信号很难将不同的颗粒物进行区分。因此通常需要对目标颗粒物如细胞进行荧光染色或采用检测抗体等额外的细胞标记手段，才能够对目标颗粒物加以区分，但同时也增加了额外的步骤和成本，因此本领域迫切需要一种无需添加标记的能够区分不同种类颗粒物的电阻抗检测技术。
发明内容
本发明人出乎意料地发现，如果在电阻抗测量设备中，加入介电泳发生装置，介电场在特定频率(separation frequency window)下会对不同的细胞施加不同的影响，例如，对目标细胞(如CTC)产生正介电力，从而向DEP电极表面移动；同时对其他血细胞产生负介电力，使之被DEP电极排斥远离电极表面，就可以使流道中原本混合在一起的两种或多种细胞，依据细胞种类和/或特性的不同，被排列在不同的垂直高度。由于目标细胞更接近电极表面，因而可测量到更加明显的阻抗信号；相反，杂质细胞离电极表面较远，无法测量到明显的阻抗信号，从而提高了信号的分辨力。在上述发现的基础上，发明人完成了本发明。
在第一个方面中，本发明提供了一种分离和检测颗粒物的微流控芯片，其包括进样部、主通道(3)、介电泳电场发生部和电阻抗检测部。
在一个实施方案中，所述进样部包括1个或更多个样品通道(1)，以及任选地1个或更多个鞘液通道(2)，例如1、2或3个样品通道和1、2、3、4、5或6个鞘液通道，更例如1个样品通道和2个鞘液通道，所述1个或更多个样品通道(1)与任选地所述1个或更多个鞘液通道(2)在一端汇合，并与主通道(3)连接，从而使样品流与任选地鞘液流汇聚后注入主通道(3)；
所述主通道(3)上依次设置有介电泳电场发生部与电阻抗检测部；
所述介电泳电场发生部包括在主通道(3)上部或下部设置的介电泳发生电极(4)，所述介电泳发生电极用于产生在垂直于主通道的方向上不均匀的电场，从而使主通道(3)液流中的颗粒物在垂直于主通道的方向发生介电泳；
所述电阻抗检测部包括在主通道(3)上部或下部设置的电阻抗检测电极(5)，能够响应于流经主通道(3)的颗粒物并产生电阻抗检测信号。
在另一个实施方案中，所述微流控芯片包括一个或更多个所述介电泳电场发生部，例如1、2、3、4或5个；特别地当包括2个或更多个所述介电泳电场发生部时，优选地所述介电泳发生电极分别设置在主通道上部和下部。
在另一个实施方案中，其中至少一个所述介电泳发生电极(4)设置在主通道(3)下部，例如设置于芯片的基片上。
在另一个实施方案中，其中至少一个所述介电泳发生电极(4)设置在主通道(3)上部，例如设置于覆盖在微流控芯片之基片上方的盖片上。
在另一个实施方案中，其中所述电阻抗检测电极(5)设置在主通道(3)下部，优选设置于芯片的基片上。
在另一个实施方案中，其中所述电阻抗检测电极(5)设置在主通道(3)上部，优选设置于覆盖于微流控芯片之基片上方的盖片上。
在另一个实施方案中，其中所述介电泳发生电极(4)是导电金属电极或具有光导电效应的光电材料，例如非晶硅(Amorphous silicon)或氧化锌(ZnO)等，其可经由局部光照产生非均匀电场进而产生介电泳力。
在另一个实施方案中，其中所述颗粒物是感兴趣的细胞，例如肿瘤细胞，尤其是循环肿瘤细胞。
在第二个方面中，本发明提供一种分离和检测颗粒物的电阻抗检测装置，包括前述第一方面中任选实施方案的微流控芯片。
在一个实施方案中，其中还包括与介电泳发生电极(4)连接的介电泳电场信号发生器，和/或与电阻抗检测部连接的电阻抗信号接收器，优选地还包括与进样部连接的加样器和/或与电阻抗信号接收器连接的电阻抗信号分析器。
在第三个方面中，本发明还提供一种分离和检测颗粒物的方法，其使用第一方面中所述的微流控芯片和/或第二个方面中所述的电阻抗检测装置。
在一个实施方式中，所述方法包括
a)将待测样品和任选地鞘液分别通过样品通道(1)和任选地鞘液通道(2)注入进样部，例如，所述样品源自全血、血浆、尿液、组织液、脑脊液、细胞培养液或细胞混合液；具体的，所述鞘液是蔗糖的PBS溶液，优选的，所述鞘液包含280mM蔗糖、137mM NaCl、2.7mMKCl、4.3mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH7.4；优选的，所述鞘液的电导率为10-500mS/m、30-300mS/m或50-100mS/m，更优选的，所述鞘液的电导率为50mS/m。
b)使介电泳发生电极(4)产生在垂直于主通道的方向上不均匀的电场，使样品中的目标颗粒物发生介电泳，从而使主通道(3)内的目标颗粒物与非目标颗粒物在垂直于芯片表面的方向发生分层，且目标颗粒物形成的液流靠近主通道下游的电阻抗检测电极(5)侧，而非目标颗粒物形成的液流远离主通道下游的电阻抗检测电极(5)侧；具体的，所述目标颗粒物是肿瘤细胞，优选循环肿瘤细胞；具体的，所述非目标细胞是白细胞，优选为外周血单个核细胞(PBMC)或巨噬细胞，和/或红细胞；和
c)利用电阻抗检测部对流经颗粒物进行电阻抗信号检测。
在另一个实施方案中，其中通过选择所述不均匀电场的频率，使得在特定分离频率窗口中，目标颗粒物与非目标颗粒物受到相反的介电力作用。
在第四个方面中，本发明提供了第一个方面中的微流控芯片和第二个方面中的电阻抗检测装置的用途，具体地，其用于检测肿瘤细胞，特别地所述肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。
在第五个方面中，本发明还提供了第一个方面中的微流控芯片和第二个方面中的电阻抗检测装置在制备检测肿瘤细胞的医疗器械中的应用，特别地所述肿瘤细胞是循环中肿瘤细胞。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或更多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
通过以上技术方案，本发明至少可以提供以下至少一个方面的优势和利益。本发明通过介电泳发生电极(4)对目标细胞的选择性操控，在不使用标记和抗体的情况下灵敏且精确的对样本(特别是分离的血细胞样本或PBMC样本)中的目标细胞(例如肿瘤细胞，循环肿瘤细胞)进行检测或者计数，相比于传统的细胞电阻抗检测装置，显著的提高了信噪比，也大大降低了对上机样本中目标细胞的浓度要求(非目标细胞/目标细胞数量比例大于106仍然能够用本芯片检测)。而且本发明操作简便，相比于采用荧光标记或抗体标记的方法，具有更低的检测成本，具有很好的产业应用前景。
附图说明
图1是本发明一个实施方案的微流控芯片的结构示意图，其中图1(a)是俯视图，图1(b)是侧视图。
图2是主通道(3)中PBMC和A549细胞发生介电泳时的运动轨迹图(侧视)，左图为电镜照片图，右图为示意图，其中左图中圆圈内表示的是PBMC细胞，其在负介电力(nDEP)的作用下远离下部电极，带三角箭头的圆圈内表示的是A549细胞，其在正介电力(pDEP)的作用下靠近下部电极。
图3是A549细胞样品的电阻抗信号图，其中图3(a)显示的是并未经过介电泳细胞聚焦的电阻抗信号图，而图3(b)则显示的是经过介电泳细胞聚焦后的电阻抗信号图。
图4(a)是使用1.5mL PBMC样品时，经过或不经过介电泳细胞分层时，所得到的电阻抗计数结果。
图4(b)是根据本公开内容实施例5的方法检测PBMC与不同数量A549细胞混合的样品时，经过介电泳细胞分层后，A549细胞的计数结果。
图4(c)是根据本公开内容实施例5的方法检测PBMC与不同数量A549细胞混合的样品时，不经过介电泳细胞分层时，A549细胞的计数结果。
具体实施方式
除非另外说明，本公开中使用的术语具有所属领域普通技术人员理解的一般含义。下面是一些术语在本公开内容中的含义，如果跟其他定义有不一致，以以下定义为准。
定义
介电泳(dielectrophoresis,DEP)
介电泳也称双向电泳，是指非带电粒子或者介电常数较低的粒子(均称之为电介质)在非匀强电场中受力并进行定向运动的现象。通过适当的电极设计，依据生物性粒子本身的介电特性、大小与形状的不同，即可对粒子进行操控或进行不同粒子的分离。由于粒子与其周围溶液的极化程度有所差异，因此当粒子的极化能力高于液体时，产生正介电泳力(pDEP)，将使粒子受电场影响而往强电场区吸引；反之，当粒子的极化能力弱于液体时，此时将会产生负介电泳力(nDEP)，将使粒子被强电场排斥而远离强电场区。作用于均匀的圆形粒子的介电泳力，可通过下式表示：
其中εm为溶液的介电常数、a为粒子半径、E为电场强度、Re{fCM(ω)}为实部部分(real part)的Clausius Mossotti factor，其又可表示成：
εp *和εm *为粒子(particle)与溶液(medium)的介电常数的复数形式(可视为诱导产生电荷的能力)，ω为外加电场信号的角频率，σ为物质的导电系数(σm为电解液的导电系数，σp微粒子的导电系数)，ε0为真空介电常数，εr为物质相对于真空的介电常数。由上式可知，fCM(ω)值的正负决定了诱导电偶极的方向，而通过选择外加电场的频率，就可以改变其正负值，进而可以针对同一粒子在不同条件下产生正介电泳力或者负介电泳力两种模式，或者针对不同的颗粒在同一时刻产生不同极性的介电泳力从而将其分离。应当指出的是，上述理论是本领域技术人员所熟知的，并且可以通过常规的实验获得所需要的电场频率，从而利用任何外加电场实现任何目标粒子的操控和/或分离。
此外，在本发明中，还会使用“介电泳聚焦”、“介电泳细胞分层”、“DEP聚焦”、“介电泳吸引”或“介电泳牵引”的表述，有时省略称之为“聚焦”或“细胞分层”，上述表述具有相同的含义，可以互换使用，其具体代表的含义均是指通过介电泳发生电极(4)的作用，使得目标粒子或细胞在垂直于芯片的方向上靠近或远离介电泳发生电极(4)。
介电泳发生电极
介电泳发生电极是指集成于微流体芯片中用于产生不均匀电场从而引发粒子的介电泳的电极设备，可采用现有技术中已知的方法，例如光刻剥离法、或磁控溅射法等制备于芯片的基片或者盖片上，电极材料可选任意的材料，例如Pt或Au等，在本发明中，介电泳发生电极(4)位于主通道(3)下部是指：主通道(3)下部芯片基材的上表面(即主通道下壁内表面)、内部，或者下部外表面。介电泳发生电极(4)位于主通道(3)上部是指：主通道(3)上部的盖片下表面、内部或者上表面。电极通过外接信号发生器而产生电场，可以根据粒子的性质选择适当的电场大小，示例性的，对细胞分离而言，电场强度E可以选择大于105V/m即可。
在本发明的一个实施方式中，微流体芯片中包含一个介电泳发生电极。
在另一个实施方式中，在微流体芯片主通道的延伸方向依次布置两个或更多个介电泳发生电极，其中部分电极位于主通道的上部，另外一部分电极位于主通道下部，优选的，多个介电泳发生电极可分别交替设置于主通道的上部和下部。
在本发明的又一个实施方式中，介电泳发生电极(4)是由导电金属制备得到的电极；在另一个实施方式中，介电泳发生电极(4)是由具有光导电效应的光电材料制备得到的电极，例如可以由非晶硅(Amorphous silicon)或氧化锌(ZnO)等制备，这些光电材料可经由局部光照产生非均匀电场进而产生介电泳力。
分离频率窗口(separation frequency window)
在本发明中，分离频率窗口是指在外加交流不均匀电场(即通过介电泳发生电极(4)施加的电场)的作用下，能够对目标细胞与非目标细胞产生不同极性的介电泳力，从而将目标细胞流与非目标细胞流分离的特定频率或频段。从上述定义可以看出，分离频率窗口有时候是一个特定的频率值，但也可以是一个特定的频率范围或者叫做“频段”，因此在本发明中，“分离频率窗口”，“分离频率”或者“分离频段”在指代分离频率窗口所指代的含义时可互换使用，其具有实质性相同的含义。
在一个实施方式中，微流控芯片包含一个介电泳发生电极，通过选择特定的分离频率窗口，可以实现对目标颗粒物的吸引或排斥，而对标杂质产生相反的作用，从而将目标颗粒物与杂质相分离。
例如，可选择适当的分离频率窗口利用正介电泳力将全血样本中的循环肿瘤细胞(CTC)向介电泳发生电极(4)表面移动，同时产生负介电泳力将血细胞排斥远离电极表面，示例性的分离频率例如本发明所使用的150kHz，当电阻抗检测电极与介电泳发生电极设计于同一表面时，CTC更接近于电阻抗检测电极表面，从而可测量到明显的电阻抗变化。或者，利用负介电泳力使全血样本中的循环肿瘤细胞(CTC)远离介电泳发生电极(4)表面，同时利用正介电泳力吸引血细胞靠近电极表面，此时可将电阻抗检测电极与介电泳发生电极设计于微流道中之相对的表面。此时，CTC与血细胞因介电泳现象被排列于不同高度，再流经后方的电阻抗检测电极(5)时，由于CTC更接近于电极表面，因而可测量到明显的电阻抗变化，而血细胞由于被排列于离检测电极较远的高度，因而几乎测量不到明显的由血细胞通过而产生的信号变化。如此，经由本发明芯片的阻抗变化次数，可精准明确的测量到纯CTC的信号而计算血液样本中的CTC数量，而无任何血球信号的干扰。
在另一个实施方式中，微流控芯片包含两个或更多个介电泳发生电极，此时不同的介电泳发生电极可以选择不同的分离频率窗口，对目标颗粒物施加相反的介电力作用，但通过介电泳电极安装位置的调整，保证目标颗粒物能够保持向同一个方向的偏离。例如，微流控芯片包含两个介电泳发生电极，第一个介电泳发生电极设置于主通道上部，可选择一个分离频率窗口使电极对目标颗粒物产生排斥作用，并对杂质产生吸引作用，从而使目标颗粒物更靠近下侧；第二个介电泳发生电极设置于主通道下部，可选择一个分离频率窗口对目标颗粒物产生吸引作用，并对杂质产生排斥作用，从而使目标颗粒物进一步靠近下侧。
分离频率窗口因外加不均匀电场的分布、目标粒子和非目标粒子的种类、大小、介电性等性质的差异而变化，因此并不存在普适固定的频率或频段，但在知晓本发明之后，针对目标粒子通过调整外加电场频率从而获得所需的分离频率窗口属于本领域技术人员的能力范围。因此，对于特定的目标颗粒物以及所处条件，本发明并不需要对如何针对目标颗粒物得到适当的分离频率窗口进行详细阐述。
微流控芯片
微流控芯片(microfluidics)，又称芯片实验室(lab on chip)、微流体或微流体芯片，可将一个特定操作流程的各个基本操作单元集成到几个平方厘米大小的具有微米级通道结构的芯片上。本发明中，“微流控芯片”，“微流体芯片”，“微流体”，“微流体芯片”和“芯片”在指代微流控芯片时具有相同的含义，可以互换使用。微流控芯片可以仅包括集成了通道和/或电极的基片，也可以同时包括基片和盖片，其中盖片上可以集成电极，也可以和基片形成通道。在基片和/或盖片上，集成了样品通道(1)、鞘液通道(2)、主通道(3)、介电泳发生电极(4)以及电阻抗检测电极(5)等元件，上述元件均可通过现有技术的常规工艺进行制备，例如光刻法、刻蚀法等。各元件的尺寸以及相对比例也是本领域技术人员根据基片和/或盖片的大小，以及目标粒子的尺寸而自行定制的。示例性的，本发明制备的样品通道(1)和鞘液通道(2)的宽度均为60μm，主流道的宽度为125μm，高度为120μm。
本发明中，微流控芯片的材料可以选择任何常规的材料，例如各类适合的刚性材料和/或弹性材料，刚性材料可以是无机刚性材料，如单晶硅、无定形硅、玻璃、石英等，也可以是刚性有机聚合物材料如环氧树脂、聚脲、聚氨酯、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等；适合的弹性材料主要包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
在本发明中，微流控芯片还可以与外接的设备直接通过导管或者导线等介质连接，以实现既定的功能，例如将进样通道与加样泵或自动加样器等设备连接，用于样品和/或鞘液的连续或者自动化注入；将介电泳发生电极(4)与电信号发生器(例如直流电源、交流电源、变压器等)连接后，以产生不均匀电场，从而对粒子产生介电力作用；将电阻抗检测装置与电信号发生器和电信号接受器和分析器(例如计算机)连接后，可以实现目标粒子电阻抗信号的检测和分析处理。
电阻抗检测电极
利用电阻抗技术对粒子进行检测和计数的原理为本领域所公知，即当悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过直流或交流电场时，取代或部分取代相同体积的电解液，在电路中导致两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。由此可以用于包括血细胞在内的多种粒子的计数。
电阻抗检测电极(5)可以通过本领域公知的常规方法，如光刻剥离法、或磁控溅射法等制备于芯片的基片表面或者盖片上，电极材料可选任意的适用材料，例如Pt或Au等低阻值且不易起氧化反应的金属材料。
需要注意的是，为了实现本发明的目的，电阻抗检测电极(5)可以位于不同的位置，只要与介电泳发生电极(4)的位置，以及对目标粒子产生的介电力作用相匹配即可。例如，如果介电泳发生电极(4)集成于基片上，位于主通道(3)下部，并且对目标粒子产生吸引作用。或者，介电泳发生电极(4)集成于盖片上，位于主通道(3)上部，并且对目标粒子产生排斥作用，此时均会使目标粒子靠近主通道(3)的下侧。此时，为了获得区分的信号，电阻抗检测电极(5)可以集成于主通道(3)下方，即位于基片上。
反之，如果介电泳发生电极(4)集成于基片上，位于主通道(3)下方，并且对目标粒子产生排斥作用。或者，介电泳发生电极(4)集成于盖片上，位于主通道(3)上方，并且对目标粒子产生吸引作用，此时均会使目标粒子靠近主通道(3)的上部。此时为了获得区分的信号，电阻抗检测电极(5)可以集成于主通道(3)上方，例如盖片上。
在本发明中，电阻抗检测电极(5)位于主通道(3)下方是指：主通道(3)下部芯片基材的上表面(即主通道下壁内表面)、内部、或者下部外表面。电阻抗检测电极(5)位于主通道(3)上方是指：主通道(3)上部盖片的下表面、内部或者上表面。
不过，本发明更常见的实施方式是预先制备好特定的芯片，此时介电泳发生电极(4)和电阻抗检测电极(5)已经具有预设的排布，例如二者均位于主通道(3)下方，随后通过选择特定的分离频率窗口实现目标粒子靠近电阻抗检测电极(5)即可实现检测和/或计数的目的。
还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
实施例
实施例1微流体芯片的制备
利用本领域的常规方法制备如图1所示的微流体芯片，其中包括位于中间的样品通道(1)和两侧的鞘液通道(2)，三条通道在出口处合并形成主通道(3)，介电泳发生电极(4)和电阻抗检测电极(5)均位于主通道(3)的下方。介电泳发生电极(4)与电信号发生装置外接，电阻抗检测电极(5)与电信号发生装置与电信号接收和分析装置连接。
实施例2介电泳细胞分层有效区别A549肺腺癌细胞和PBMC细胞
构建带有GFP标记的A549细胞系
初始细胞系：从ATCC购买A549人非小细胞肺癌细胞株，该细胞系原始来源为58岁白人男性之肺癌患者，由D.J.Gard等人于1972年建立。
DNA表达载体：pLEIN载体，包含同时表达EGFP和新霉素抗性基因的双顺反子，同时含有内部核醣体进入位点(IRES)，
细胞培养，载体生产，转染及亚克隆：表达10AI病毒包膜的NIH3T3衍生的包装细胞株PT67购自Clontech Laboratories，Inc。在补充有10％热灭活的胎牛血清(Gemini Bio-products，Calabasas，CA)的DMEM中培养PT67细胞。对于载体生产，将70％铺满的包装细胞株(PT67)与DOTAP试剂和饱和量的pLEIN质粒的沉淀混合物培养18小时，此时补充新鲜培养基。48小时后通过荧光显微镜检查细胞。将细胞于500-2000μg/ml G418(LifeTechnologies，Inc.，Grand Island，NY)中培养7天，以选择GFP阳性细胞。
逆转录病毒转染细胞：将20％铺满的A549细胞株与培养PT67细胞得到的反转录病毒沉淀混合物、和包含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(Life Technologies公司)(二者比例为1:1)培养72小时，同时补充新鲜培养基。转染72小时后利用胰蛋白酶/EDTA收获A549细胞，并以1:15的比例传代至含有200μg/ml G418的选择培养基中。G418逐渐增加到800μg/ml。利用克隆柱(Bel-Art Products.Pequannock.NJ)透过胰蛋白酶/EDTA分离表达GFP的细胞克隆，并用常规培养方法进行扩增和转移。
培养：采用常规的培养方法，具体如下：于加入10％胎牛血清的MEM-α培养基中，在二氧化碳浓度为5％，温度为37摄氏度的条件下，置于培养箱培养，经过48小时后，取出培养皿吸掉旧培养液，加入胰酶-EDTA溶液，37℃作用1分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清之新鲜培养基，以终止胰酶作用，离心后去除上清液，添加新鲜培养基后即可作为实验细胞使用。
上机试验，设置两个实验组和四个对照组，具体如下：
实验组1：取初始培养浓度为4*106个/mL的A549细胞(带有GFP标记)，以PBS连续稀释至约4000cells/ml，在800rpm(1100g)条件下离心5min，移除PBS，并使用等渗电解液进行重悬，所述等渗电解液的组成为：280mM蔗糖、137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH7.4，电导率为50mS/m。
上机：将A549细胞通过样品通道(1)注入微流控芯片，同时通过样品通道(1)两侧的鞘液通道(2)加入鞘液，鞘液的成分与前述等渗电解液成分相同，即：280mM蔗糖、137mMNaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH7.4，电导率为50mS/m；其中微流控芯片的通道尺寸为125μm，样品流速为0.5mL/hr，鞘液流速为2mL/hr，流速比为1:4，从而在鞘液流的作用下，样本流被压缩为约30μm的单颗粒流。介电泳发生电极(4)的输入电压为6V，频率为150kHz，阻抗检测电极的检测频率设置为1kHz-5MHz，电阻抗cut-off值设定为0.015mV，随后进行电阻抗细胞计数。
实验组2：首先进行细胞混合，取3mL全血样品，经过标准Ficoll离心后，获得PBMC产物(约1.5mL，含106个细胞)，离心并使用等渗电解液重悬，所述等渗电解液的组成为：280mM蔗糖、137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH7.4，电导率为50mS/m；添加一定数量(3-300个，可以是数量梯度)的A549细胞(以传统chamber counter计算初始加入量)。
上机：将混合细胞通过样品通道(1)注入微流控芯片，同时通过样品通道(1)两侧的鞘液通道(2)加入鞘液，鞘液的成分与前述等渗电解液成分相同：280mM蔗糖、137mMNaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH7.4，电导率为50mS/m；其中芯片的通道尺寸为125μm，样品流速为0.5mL/hr，鞘液流速为2mL/hr，流速比为1:4，从而在鞘液流的作用下，样本流被压缩为约30μm的单颗粒流。介电泳发生电极(4)的输入电压为6V，频率为150kHz，阻抗检测电极的检测频率设置为1kHz-5MHz，电阻抗cut-off值设定为0.015mV，随后进行电阻抗细胞计数。
对照组1：在样品通道(1)中加入的细胞为1.5mL PBMC，上机条件同实验组1和2。
对照组2：在样品通道(1)加入的细胞为溶解于等渗电解液中的1.5mL A549细胞，介电泳发生电极(4)不予接通。上机条件同实验组1和2。
对照组3：在样品通道(1)加入的细胞为1.5mL PBMC，介电泳发生电极(4)不予接通。上机条件同实验组1和2。
对照组4：在样品通道(1)加入的细胞为1.5mL PMBC与3-300颗A549细胞的混合细胞，介电泳发生电极(4)不予接通。上机条件同实验组1和2。
结果：在实验组中，通过连续拍照可以看到PBMC细胞被逐渐推离底部电极，而A549细胞则逐渐靠近电极(图2)。
实施例3介电泳聚焦提高目标信号的稳定性
试验方法见实施例2，比较实验组1和对照组2的结果。
结果：图3显示实验组1(图3b)和对照组2(图3a)中A549细胞的电阻抗峰值图。从图中可以看出，利用介电泳发生电极(4)施加电场后，A549细胞与电阻抗测量电极更加接近，因此相比较不使用介电泳聚焦的对照组，能够产生更强的信号，并且正是由于A549细胞在竖直方向发生了一次聚焦，A549细胞在垂直于芯片表面的方向位置也较为恒定(图3b)，因此信号强度也非常稳定，而不像对照组不用介电泳聚焦时，由于A549细胞在垂直方向没有约束或者聚焦，因而细胞更加分散，导致产生的电阻抗信号大小不够稳定，同时也容易出现计算的遗漏(图3a)。
实施例4介电泳细胞分层提高检测的特异性
试验方法见实施例2，比较对照组1和对照组3的结果。
结果：经预实验(n＝20)，经介电泳细胞分层的PBMC与血球样本，有13次PBMC样本检测值皆小于0.015mV，仅7次PBMC样本结果中各自出现小于5个大于0.015mV之结果，故cut-off值设为0.015mV。经过介电泳细胞分层的对照组1在多次重复试验下平均仅能统计到了2-5个细胞，但是没有经过介电泳聚焦的对照组3却平均统计到了120个细胞(图4a)。也就是说，如果不经过介电泳细胞分层，会有更多的PBMC细胞会被误认为是目标细胞(A549)而被计算进去。
实施例5介电泳聚焦提高计数的准确性
试验方法见实施例2，比较实验组2和对照组4的结果。
结果：经预实验(n>20)，A549之信号最大为0.039mV，最小为0.018mV，故可设定信号的cut-off值为0.015mV，该值以上是A549细胞，0.015mV以下的信号被滤除。图4b和图4c的结果显示，经过介电泳聚焦后，由于细胞被吸引靠近电阻抗检测电极表面，实验组中电阻抗测量技术得到的细胞数量与初始的加入量非常接近，准确率达到了将近93％；而在不经过介电泳聚焦和分层的对照组4中，电阻抗测量技术的准确率仅能达到60-72％之间。可见通过本发明的方法大大提高了电阻抗细胞计数的准确性。
Claims (16)
1.一种分离和检测颗粒物的微流控芯片，其包括进样部、主通道(3)、介电泳电场发生部和电阻抗检测部。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中
所述进样部包括1个或更多个样品通道(1)，以及任选地1个或更多个鞘液通道(2)，例如1、2或3个样品通道和1、2、3、4、5或6个鞘液通道，更例如1个样品通道和2个鞘液通道，所述1个或更多个样品通道(1)与任选地所述1个或更多个鞘液通道(2)在一端汇合，并与主通道(3)连接，从而使样品流与任选地鞘液流汇聚后注入主通道(3)；
所述主通道(3)上依次设置有介电泳电场发生部与电阻抗检测部；
所述介电泳电场发生部包括在主通道(3)上部或下部设置的介电泳发生电极(4)，所述介电泳发生电极用于产生在垂直于主通道的方向上不均匀的电场，从而使主通道(3)液流中的颗粒物在垂直于主通道的方向发生介电泳；
所述电阻抗检测部包括在主通道(3)上部或下部设置的电阻抗检测电极(5)，能够响应于流经主通道(3)的颗粒物并产生电阻抗检测信号。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其包括一个或更多个所述介电泳电场发生部，例如1、2、3、4或5个；特别地当包括2个或更多个所述介电泳电场发生部时，优选地所述介电泳发生电极分别设置在主通道上部和下部。
4.根据权利要求1至3任一项所述的微流控芯片，其中至少一个所述介电泳发生电极(4)设置在主通道(3)下部，例如设置于芯片的基片上。
5.根据权利要求1至4任一项所述的微流控芯片，其中至少一个所述介电泳发生电极(4)设置在主通道(3)上部，例如设置于覆盖在微流控芯片之基片上方的盖片上。
6.根据权利要求1至5任一项所述的微流控芯片，其中所述电阻抗检测电极(5)设置在主通道(3)下部，优选设置于芯片的基片上。
7.根据权利要求1至5任一项所述的微流控芯片，其中所述电阻抗检测电极(5)设置在主通道(3)上部，优选设置于覆盖于微流控芯片之基片上方的盖片上。
8.根据权利要求1至7任一项所述的微流控芯片，其中所述介电泳发生电极(4)是导电金属电极或具有光导电效应的光电材料，例如非晶硅(Amorphous silicon)或氧化锌(ZnO)等，其可经由局部光照产生非均匀电场进而产生介电泳力。
9.根据权利要求1至8任一项所述的微流控芯片，其中所述颗粒物是感兴趣的细胞，例如肿瘤细胞，尤其是循环肿瘤细胞。
10.一种分离和检测颗粒物的电阻抗检测装置，包括权利要求1至9任一项所述的微流控芯片。
11.根据权利要求10所述的电阻抗检测装置，还包括与介电泳发生电极(4)连接的介电泳电场信号发生器，和/或与电阻抗检测部连接的电阻抗信号接收器，优选地还包括与进样部连接的加样器和/或与电阻抗信号接收器连接的电阻抗信号分析器。
12.一种分离和检测颗粒物的方法，其使用权利要求1至9任一项所述微流控芯片和/或权利要求10或11所述电阻抗检测装置。
13.根据权利要求12所述的方法，其包括
a)将待测样品和任选地鞘液分别通过样品通道(1)和任选地鞘液通道(2)注入进样部，例如，所述样品源自全血、血浆、尿液、组织液、脑脊液、细胞培养液或细胞混合液；具体的，所述鞘液是蔗糖的PBS溶液，优选的，所述鞘液包含280mM蔗糖、137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4和1.47mM KH2PO4，pH7.4；优选的，所述鞘液的电导率为10-500mS/m、30-300mS/m或50-100mS/m，更优选的，所述鞘液的电导率为50mS/m；
b)使介电泳发生电极(4)产生在垂直于主通道的方向上不均匀的电场，使样品中的目标颗粒物发生介电泳，从而使主通道(3)内的目标颗粒物与非目标颗粒物在垂直于芯片表面的方向发生分层，且目标颗粒物形成的液流靠近主通道下游的电阻抗检测电极(5)侧，而非目标颗粒物形成的液流远离主通道下游的电阻抗检测电极(5)侧；具体的，所述目标颗粒物是肿瘤细胞，优选循环肿瘤细胞；具体的，所述非目标细胞是白细胞，优选为外周血单个核细胞(PBMC)或巨噬细胞，和/或红细胞；和
c)利用电阻抗检测部对流经颗粒物进行电阻抗信号检测。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中通过选择所述不均匀电场的频率，使得在特定分离频率窗口中，目标颗粒物与非目标颗粒物受到相反方向的介电力作用。
15.权利要求1至9任一项所述的微流控芯片、权利要求10或11所述的电阻抗检测装置，其用于检测肿瘤细胞，特别地所述肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。
16.权利要求1至9任一项所述的微流控芯片、权利要求10或11所述的电阻抗检测装置在制备检测肿瘤细胞的医疗器械中的应用，特别地所述肿瘤细胞是循环中肿瘤细胞。
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