CN113481282A

CN113481282A - 一种用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法

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Publication number: CN113481282A
Application number: CN202110092508.9A
Authority: CN
Inventors: 项阳; 焦瑾
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2021-01-24
Filing date: 2021-01-24
Publication date: 2021-10-08

Abstract

本发明公开了一种用于分析circRNA‑microRNA相互作用的二合一集成测定法，包括如下步骤：(1)制备功能化MB：捕获探针通过生物素和链霉亲和素之间的特异性结合固定在SA‑MB的表面上；(2)circRNA‑miRNA相互作用分析。本发明的测定方法灵敏度高，可用于分析circRNA‑miRNA相互作用(cmRRI)的方法，有望在生物医学和临床发明中为分析RNA对话系统中的cmRRIs提供一个有用的工具。

Description

一种用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法。

背景技术

RNA-RNA相互作用(RRI)在各种基本细胞生命活动中起到重要调控作用，例如，转移RNA(tRNA)与信使RNA(mRNA)相互作用以翻译遗传密码； miRNA与mRNA相互作用以促进其降解；环状RNA(circRNA)通过充当分子海绵与miRNA相互作用，被称作海绵效应。其中，海绵效应是circRNA介导的基因调控的经典模型，探索circRNA-miRNA海绵效应不仅可以扩展本发明目前对RNA相互作用基因组的认知，而且有助于理解非polyA circRNA的生物学功能和疾病发展中涉及的信号通路。CircRNA包含大量miRNA反应元件(MRE)，使它们能够竞争性地与miRNA结合，从而导致功能性miRNA下调和靶标 miRNA下游蛋白质上调。这些信号通路的失调与多种人类疾病密切相关，例如癌症，心血管疾病，神经系统疾病和2型糖尿病。然而，目前对circRNA-miRNA 相互作用(cmRRI)介导的疾病相关信号通路的发明还非常欠缺，其中的一个关键因素是缺乏可用于发明RNA相互作用的方法。因此，一种能够全面分析cmRRI 的便捷高效的方法对于理解circRNA的功能以及揭示circRNA/miRNA参与疾病发展的潜在机制至关重要。

关于circRNA和miRNA的相互作用，通常，发明人员会首先通过已开发的 circRNA分子软件，如circBase和RegRNA2.0等计算工具预测circRNA可能吸附的miRNA种类。然后，使用经典的分子生物学技术进一步确认它们的相互作用。电泳迁移率变动分析(EMSA)是检测RNA-RNA相互作用的最传统的技术。在EMSA中，circRNA-miRNA杂合体具有更大的分子量，因此在电泳凝胶中迁移的速度比未配对的单分子RNA慢。此外，RNA荧光原位杂交(FISH)是一种强大的工具，可通过分别设计与miRNA和靶标circRNA特异性结合的两种探针进行原位成像，从而在细胞内原位分析成对的RNA相互作用，若两者具有共定位，说明可能是海绵效应造成的。尽管这些经典方法已成功用于检测cmRRI，但由于灵敏度低，它们难以实现直接定量分析，并且不适用于低表达circRNA。并且FISH无法直接验证circRNA-miRNA的相互作用，因为它需要针对circRNA 和miRNA分别设计靶向探针。为了弥补这些缺点，实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 已被用作补充方法，可以通过添加抑制剂或激活剂来分别定量分析circRNA和 miRNA的表达趋势，如果两者存在相反的表达趋势，说明可能存在海绵效应。但是，qRT-PCR检测circRNA的固有缺点是在逆转录过程中，容易产生以 circRNA为模板的滚环扩增，导致假阳性结果。发明者还开发了捕捉不同RNA 分子之间的相互作用的新技术LIGR-seq，以进行ncRNAs的系统功能分析。当两个RNA分子有相匹配的序列时，它们会像尼龙搭扣一样粘在一起。然后，将成对的RNA结构从细胞移除，并采用最先进的测序方法进行分析，以精确地确定粘在一起的RNA。这种方法虽然更准确，但是RNA测序伴随着高花费和专业的测序机构。

总体而言，目前方法在实际应用中仍然会遇到一些缺点：(1)通常分别靶向两个相关的RNA分子(circRNA和miRNA)来定义它们之间的相互作用；(2) 无法检测到低表达的circRNA和miRNA的相互作用；(3)检测程序通常是费时且费力的。

在部分工作中，针对这些问题，本发明提出了一种直接揭示cmRRI的生物传感策略，而不是通过分析成对的RNA复合物来单独检测各个信号分子。在本发明的策略中，基于circRNA作为miRNA海绵的性质，只有当上游circRNA和下游miRNA共存以相互作用的复合体形式存在时，才会引发进一步的反应并最终给出输出信号。由于该测定方法简单，灵敏，操作方便，在揭示新的cmRRI 方面可能具有实际应用前景，希望能为与cmRRI相关疾病的发明提供可靠的工具。

目前，缺乏一种灵敏度高的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种灵敏度高的用于分析 circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，包括如下步骤：(1)制备功能化磁珠(MB)：捕获探针通过生物素和链霉亲和素之间的特异性结合固定在SA-MB的表面上；

(2)circRNA-miRNA相互作用分析：功能化MB将circRNA/miRNA复合物分离出来后，以miRNA为引物进行的滚环扩增(RCA)产物将自淬灭探针打开产生荧光信号。

进一步地，在步骤(1)中，step1将100μL的10mg/mL SA-MB用1mL 的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于500μL的生物素-链霉亲和素结合缓冲液中。

进一步地，在步骤(1)中，Step2将2μL的100μM生物素化的捕获探针添加到SA-MBs分散液中，然后将混合物在37℃的热混合器上孵育30分钟。

更进一步地，在步骤(1)中，Step3用1mL洗涤缓冲液洗涤3次以去除多余的游离探针后，将捕获探针MBs重悬于100μL杂交缓冲液中，以进行后续实验，与MBs结合的探针数量的计算：(反应前的浓度-反应后的浓度)×反应溶液的体积。

进一步地，在步骤(2)中，step1在100μL杂交缓冲液中分别混合不同浓度的circRNA(SEQ ID NO：2)，1μM的miRNA(SEQ ID NO：5)和2μL的 10mg/mL制备的带有捕获探针(SEQ ID NO：1)的磁珠，并在37℃下孵育30 分钟。

进一步地，在步骤(2)中，Step2通过磁性分离circRNA-miRNA复合物，并用洗涤缓冲液洗涤3次，以去除多余的miRNA，接下来进行滚环扩增(RCA) 反应，50μL的反应混合物包含：3μL的3μM环状DNA模板，4μL 10×Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，10mM的5μL dNTPs，2μL10×BSA，1μL DEPC水和1000U/ml的1.5μL phi29 DNA聚合酶，然后，将混合物在37℃下孵育40 分钟，并在70℃下加热10分钟以终止反应。

更进一步地，在步骤(2)中，Step3将设计好的自猝灭分子信标探针(SEQ ID NO：4)，自猝灭分子信标探针1.5uL的100uM添加到溶液中，并在室温下孵育30分钟后分装至384孔板于酶标仪测量荧光强度，将产物用于荧光显微镜成像，则不需要在高温下终止反应的步骤，并且将其直接磁分离并直接与荧光探针一起孵育。

进一步地，所述的引物Capture probe的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，所述的引物Imitated circMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2，所述的引物RCAtemplate的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3，所述的引物Fluorescent probe的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4，所述的引物miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5，所述的引物miR-218的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6，所述的引物miR-9的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7，所述的引物 miR-484的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：8，所述的引物miR-6764的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9，所述的引物miR-6824的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO：10，所述的引物Control miRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 11，所述的引物1base mutation circMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 12，所述的引物3base mutation circMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 13，所述的引物1basemutation miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：14，所述的引物3base mutationmiR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：15，所述的引物Artificial primer的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：16。

有益效果：本发明的测定方法灵敏度高，可用于分析circRNA-miRNA相互作用(cmRRI)的方法，有望在生物医学和临床发明中为分析RNA对话系统中的cmRRIs提供一个有用的工具。实验已经表明，只有海绵circRNA和被吸附的 miRNA作为复合物存在时，才能触发下游的RCA反应，然后输出荧光信号。

与传统方法相比，本发明具有如下优点：(1)本发明直接揭示了circRNA和 miRNA之间的相互作用，显示出显着的优势，用于cmRRI分析的二合一集成测定法，而不需要分别检测circRNA和miRNA；(2)以高灵敏度产生定量结果，为后续对circRNA深入的功能发明奠定了基础。可进一步用于分析circRNA与候选miRNA的亲和力，拓宽了该方法的应用范围。

(3)基于该方法的cmRRI检测的应用主要包括：a)生物信息学分析后的实验验证。b)当揭示由circRNA和miRNA介导的信号途径时，替代qRT-PCR。而且，通过简单地替换探针的捕获识别序列，该方法还可以适用于分析其它竞争性内源RNA与miRNA之间的相互作用。

附图说明

图1为本发明的磁分离操作示意图。

图2为本发明的用于分析circRNA-miRNA相互作用(cmRRI)的方法示意图。

图3为本发明的链霉亲和素磁珠的尺寸对生物传感器构建的影响图。(A) 在直径为0.3μm，1μm和2μm的MBs表面上，相同浓度的捕获探针(1μL的 10μM生物素化的捕获探针与100μL的10mg/mL SA-MBs)的修饰效率。(B) 用缓冲液中的捕获探针修饰的MBs(MBs的直径：0.3μm，1μm和2μm)对1 nM目标的荧光强度响应。(C)在添加1nM靶标的情况下，MBs(MBs的直径： 0.3μm，1μm和2μm)荧光成像。比例尺为10μm；误差值为3个独立实验的标准偏差。

图4为本发明的zeta电位和琼脂糖凝胶电泳分析。(A)从左到右依次指代的zeta电位为：修饰有DNA分子探针的MB；捕获有circRNA/miRNA复合体的MB；MB表面发生RCA反应。(B)RCA反应的琼脂糖凝胶电泳示意图，泳道1：miRNA，泳道2：线性模板，泳道3：RCA模板，泳道4：RCA产物，泳道5：无miRNA时无RCA反应的产物。

图5为检测cmRRI方法的一些条件优化图。图5A为本发明的捕获探针的有效序列区域与MB之间的距离对检测效率的影响图。图5B为本发明的荧光强度随RCA时间的变化。实验均采用低盐杂交缓冲液中添加100pM的circRNA和 100nM的miRNA。误差值为3个独立实验的标准偏差。

图6为本发明的可行性逻辑分析图。图6A为本发明的“与”逻辑门的真值表图。图6B为本发明的生物传感器对缓冲液中circRNA，miRNA和circRNA/ miRNA的荧光响应图。图6C为本发明的对照组和实验组的荧光强度比(F/F0)： (a)对照，(b)在circRNA存在下，(c)在miRNA存在下，(d)在circRNA/ miRNA存在下。图6D为本发明分别输入miRNA，circRNA和circRNA/miRNA 的磁珠荧光成像。比例尺为10μm；误差值为3个独立实验的标准偏差。

图7为本发明的传感器的灵敏度分析图。图7A为本发明的在低盐杂交缓冲液中对各种浓度circRNA的荧光光谱响应，此时miRNA浓度为100nM。图7B 为本发明的荧光强度与circRNA浓度之间呈线性关系。误差值为3个独立实验的标准偏差。

图8为本发明的传感器的特异性分析图。图8A为本发明的三种circRNA (cM0，cM1和cM3)和四种miRNA(mM0，mM1，mM3和对照)的12种交叉组合。c指的是circRNA，m指的是miRNA，M指的是突变。下图：该方法对突变circRNA，突变miRNA和对照miRNA不同组合下的选择性响应。图8B 为本发明的热图描绘了circRNA(10nM)和miRNA(50nM)的12种组合下的荧光强度(M表示碱基突变)。误差值为3个独立实验的标准偏差。

图9为所提出方法对不同cmRRIs亲和力的分析图。图9A为本发明的靶标 circMTO1与不同候选miRNAs结合亲和力的示意图。图9B为本发明的circMTO1 分别与miR-218，miR-9，miR-484，miR-760，miR-6764和miR-6824结合的荧光强度及最大能量的趋势图。误差值为3个独立实验的标准偏差。图9C为将六种miRNA的互补序列与circMTO1的吸附位点处的序列进行比对。最大能量的单位是Kcal/mol。

图10A为本发明的circMTO1/miRNA-760分别在缓冲液，1％血清，10％血清，1％细胞裂解液和10％细胞裂解液样品中的荧光响应图。稀释的溶剂是低盐杂交缓冲液。图10B为本发明的5种介质中的靶标回收率。误差值为3个独立实验的标准偏差。

图11为本发明的在HCC肿瘤组织和正常组织中分别检测circMTO1/ miRNA-9和circMTO1/miRNA-21的相互作用图。从左到右的患者编号依次为：1147868、1145974、1147666和1147852。误差值为3个独立实验的标准偏差。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1

本发明的一种用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，包括如下步骤：(1)制备功能化磁珠(MB)：捕获探针通过生物素和链霉亲和素之间的特异性结合固定在SA-MB的表面上；step1将100μL的10mg/mL SA-MB用1mL的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于500μL的生物素-链霉亲和素结合缓冲液中。Step2将2μL的100μM生物素化的捕获探针添加到SA-MBs 分散液中，然后将混合物在37℃的热混合器上孵育30分钟。Step3用1mL洗涤缓冲液洗涤3次以去除多余的游离探针后，将捕获探针MBs重悬于100μL杂交缓冲液中，以进行后续实验，与MBs结合的探针数量的计算：(反应前的浓度- 反应后的浓度)×反应溶液的体积。

step1在100μL杂交缓冲液中分别混合不同浓度的circRNA(SEQ ID NO：2)， 1μM的miRNA(SEQ ID NO：5)和2μL的10mg/mL制备的带有捕获探针(SEQ ID NO：1)的磁珠，并在37℃下孵育30分钟。

Step2通过磁性分离circRNA-miRNA复合物，并用洗涤缓冲液洗涤3次，以去除多余的miRNA，接下来进行滚环扩增(RCA)反应，50μL的反应混合物包含：3μL的3μM环状DNA模板，4μL 10×Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液， 10mM的5μL dNTPs，2μL 10×BSA，1μL DEPC水和1000U/ml的1.5μL phi29 DNA聚合酶，然后，将混合物在37℃下孵育40分钟，并在70℃下加热 10分钟以终止反应。

Step3将设计好的自猝灭分子信标探针(SEQ ID NO：4)，自猝灭分子信标探针1.5uL的100uM添加到溶液中，并在室温下孵育30分钟后分装至384孔板于酶标仪测量荧光强度，将产物用于荧光显微镜成像，则不需要在高温下终止反应的步骤，并且将其直接磁分离并直接与荧光探针一起孵育。

所述的引物Capture probe的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，所述的引物Imitated circMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2，所述的引物RCA template的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3，所述的引物Fluorescent probe 的核苷酸序列如序列表SEQID NO：4，所述的引物miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5，所述的引物miR-218的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO： 6，所述的引物miR-9的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7，所述的引物miR-484 的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：8，所述的引物miR-6764的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9，所述的引物miR-6824的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：10，所述的引物Control miRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：11，所述的引物1basemutation circMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：12，所述的引物3base mutationcircMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：13，所述的引物1base mutation miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：14，所述的引物3base mutation miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：15，所述的引物Artificial primer的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：16。

试验例1

如图1-3所示，本发明的实验部分

1.1仪器

将反应产物分装到黑色的384孔板(Fluotrac 200，Greiner，德国)中，然后放入荧光酶标仪(BioTek Instrument，Winooski，VT，美国)在488nm的激发波长下测量FAM染料的荧光发射光谱。在IX73荧光显微镜(Olympus，东京，日本)下观察磁珠(MBs)的荧光成像。HC-100恒温混匀仪(Thermo，中国上海)用于混合反应试剂。

1.2材料和试剂

链霉亲和素修饰的MBs(SA-MBs；300nm，10mg/mL)从苏州海狸生物有限公司购得。表1中列出了该发明中使用的所有寡核苷酸序列。其中RNA序列由Takara生物公司合成，DNA序列由生工生物公司合成，经HPLC纯化。本发明中使用的缓冲液如下：用于结合生物素和磁珠上链霉亲和素的缓冲液由10 mM的Tris-HCL，1mM的EDTA，1M的NaCl和0.05％Tween-20(pH：7.4) 组成；核酸低盐杂交缓冲液由10mM的Tris-HCL，1mM的EDTA和150mM 的NaCl(pH：7.4)组成；洗涤缓冲液由10mM的Tris-HCL，1mM的EDTA 和0.01％Tween-20(pH：7.4)组成。用于配置缓冲液的所有试剂均购自 Sigma-Aldrich Trading公司。本发明中使用的超纯水由Milli-Q仪器生产，电阻率为18.2MΩ·cm。本发明中所用到的所有核酸序列如表1所示：

表1

1.3制备功能化MB

捕获探针通过生物素和链霉亲和素之间的特异性结合固定在SA-MB的表面上。首先，将100μL的10mg/mL SA-MB用1mL的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于500μL的生物素-链霉亲和素结合缓冲液中。随后，将2μL的100μM 生物素化的捕获探针添加到SA-MBs分散液中，然后将混合物在37℃的热混合器上孵育30分钟。最后，用1mL洗涤缓冲液洗涤3次以去除多余的游离探针后，将捕获探针MBs重悬于100μL杂交缓冲液中，以进行后续实验。与MBs结合的探针数量的计算：(反应前的浓度-反应后的浓度)×反应溶液的体积。

1.4circRNA-miRNA相互作用分析

首先，在100μL杂交缓冲液中分别混合不同浓度的circRNA，1μM的miRNA 和2μL的10mg/mL制备的带有捕获探针的磁珠，并在37℃下孵育30分钟。然后，通过磁性分离circRNA-miRNA复合物，并用洗涤缓冲液洗涤3次，以去除多余的miRNA。接下来进行滚环扩增(RCA)反应，50μL的反应混合物包含：3μL环状DNA模板(3μM)，4μL 10×Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，5μL dNTPs(10mM)，2μL 10×BSA，1μL DEPC水和1.5μL phi29 DNA聚合酶(1000U/ml)。然后，将混合物在37℃下孵育40分钟，并在70℃下加热10分钟以终止反应。最后，将设计好的自猝灭分子信标探针(1.5uL的100uM)添加到溶液中，并在室温下孵育30分钟后分装至384孔板于酶标仪测量荧光强度。如果将产物用于荧光显微镜成像，则不需要在高温下终止反应的步骤，并且将其直接磁分离并直接与荧光探针一起孵育。操作的具体步骤磁分离操作示意图如图1 所示。

试验例2

1.5实际样本分析

肝细胞癌细胞系(HepG2)在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中于 5％CO₂的湿箱中于37℃培养。其中，DMEM中添加100μg/mL链霉素和10％的胎牛血清。细胞长到合适的密度(80％左右)后，将细胞悬浮于PBS缓冲液中，然后反复冻融以获得细胞裂解物用于后续实验。根据当地伦理委员会的规定，从南京医科大学附属第一医院(中国南京)获得健康人的全血，以3000rpm 离心后，收集试管上层的血清用于后续实验。

本发明中，首先进行加标实验以评估该方法在实际生物样品中的潜力，通过将circRNA和miRNA标准品掺入细胞裂解液和血清中，用所提出的方法进行检测，测量荧光强度，转换成浓度后与加入的标准品作对比。

肝癌组织由南京医科大学第一附属医院提供。该发明得到南京大学伦理委员会和南京医科大学的批准。使用TRIzol试剂(美国Invitrogen)提取组织中的总 RNA。

1.6结果与讨论

1.6.1传感器的设计

用于分析circRNA-miRNA相互作用(cmRRI)的方法示意图如图2所示，图2简要展示了本工作分析cmRRI的原理。由于生物样品中有丰富的circRNA 的同源异构体，这些分子以线性RNA的形式存在。也正因为这些同源物的存在，若不经分离，利用目前使用的方法分析circRNA时经常会观察到假阳性。因此，为了准确捕获circRNA/miRNA复合物，本发明首先设计了一种DNA探针，它可以特异性的识别靶标circRNA的反向剪接连接位点(BSJ)，BSJ位点的序列是circRNA的保守区域，在探针的一端修饰了生物素分子。由于生物素分子与磁珠上的链霉亲和素相互作用，使得这些DNA探针成功组装在磁珠上。在样品中，当靶标circRNA充当miRNA的海绵，就会对miRNA相起到吸附作用。此时未与circRNA完全结合的游离部分的miRNA会与溶液中的滚环扩增(RCA) 杂交，从而充当RCA的引物，引发后续的扩增反应，RCA的产物是大量包含重复片段的长链DNA。此时通过加入可以与该串联重复序列互补的信号探针，产生荧光信号。所有的磁分离步骤均在发生RCA以前，以保证尽管RCA之后有从磁珠表面脱落的DNA，也不会影响信号的输出。值得注意的是，一个circRNA 可能包含多个miRNA吸附位点，再结合强大而通用的RCA技术，两者可以显着增强信号。

此外，该分析在逻辑上可用于cmRRI的综合分析。如方案1所示，在存在唯一的circRNA的情况下，由于缺少引物而不会发生RCA反应，而在仅存在 miRNA的情况下，MB不能捕获miRNA，也不会发生后续的RCA反应。仅在 circRNA/miRNA复合体存在的情况下，才能进行RCA辅助的信号放大。以这种方式，可以实现cmRRI的直接，灵敏和特异的分析目标，并且在分析过程中还可以获得目标circRNA的定量信息，为后续工作提供了基础。

1.6.2不同尺寸磁珠作为传感器元件的分析

图3链霉亲和素磁珠的尺寸对生物传感器构建的影响。(A)在直径为0.3 μm，1μm和2μm的MBs表面上，相同浓度的捕获探针(1μL的10μM生物素化的捕获探针与100μL的10mg/mL SA-MBs)的修饰效率。(B)用缓冲液中的捕获探针修饰的MBs(MBs的直径：0.3μm，1μm和2μm)对1nM目标的荧光强度响应。(C)在添加1nM靶标的情况下，MBs(MBs的直径：0.3μm，1μm和2μm)荧光成像。比例尺为10μm；误差值为3个独立实验的标准偏差。

为了达到最好的分析效果，本发明选择了三种不同直径(0.3μm，1μm和2 μm)的链霉亲和素磁珠，分别探究了它们对生物传感器检测效果的影响。首先，在同一条件下将DNA探针与链霉亲和素包被的磁珠共孵育40min，通过磁分离后测试溶液中的探针余量与开始加入的作对比，计算出结合在磁珠上的探针量。结果如图3A所示，直径为0.3μm的磁珠对DNA探针具有最大的载量。紧接着本发明向3种磁珠溶液中加入同样浓度的circRNA/miRNA复合体，在反应完成后分别测试了荧光信号强度，结果表明直径为0.3μm的磁珠产生了最强的荧光信号(图3B)，这可能是由于较小尺寸的磁珠吸附了更多地DNA探针，从而捕获了更多地靶标复合体造成的。同样的结论在荧光显微镜下也得到了进一步验证(图3C)。

1.6.3传感器分析cmRRI的可行性发明

图4.zeta电位和琼脂糖凝胶电泳分析。(A)从左到右依次指代的zeta电位为：修饰有DNA分子探针的MB；捕获有circRNA/miRNA复合体的MB；MB 表面发生RCA反应。(B)RCA反应的琼脂糖凝胶电泳示意图，泳道1：miRNA，泳道2：线性模板，泳道3：RCA模板，泳道4：RCA产物，泳道5：无miRNA 时无RCA反应的产物。

作为概念验证，本发明选择circMTO1作为模式circRNA，circMTO1的异常表达是肝细胞癌(HCC)患者生存不良的预后指标。Zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差，它可以通过电动现象直接测定，本发明在这里利用zeta的测试来表征该传感器的检测过程。如图4A所示，只有 DNA探针修饰的磁珠到捕获靶标复合物之后，表面电势从-23mV到-38mV呈负向变化，这是可能是由捕获探针和靶标复合体的杂交导致核酸的量增加引起的。在磁珠表面发生了RCA反应之后电位继续负迁移至-51mV，证实了扩增反应的成功进行。同时，从琼脂糖凝胶电泳的结果(图4B)可以看出，泳道3表明RCA环状模板的成功合成，泳道4表明发生了滚环扩增反应，泳道5说明在 miRNA不存在的情况下，不能进行扩增。上述结果均证明了在靶标circRNA和 miRNA共存时可以发生RCA扩增反应。图5(A)捕获探针的有效序列区域与MB之间的距离对检测效率的影响。如示意图所示，间隔分别设计为0、16、 26和36个poly-T碱基。(B)荧光强度随RCA时间的变化。实验均采用低盐杂交缓冲液中添加100pM的circRNA和100nM的miRNA。误差值为3个独立实验的标准偏差。

捕获探针的有效序列区域与MB之间的距离(称为接头)可能影响靶标的捕获效率进而影响荧光信号的强度。本发明已经比较了4种具有不同长度接头的探针，如图5A所示，较短的接头导致荧光信号低，这可能是由于DNA探针与 MB之间产生空间位阻所导致的。因此，后续实验均选择产生最大信号的26bp 接头长度得探针。此外，通过对不同RCA反应时间下的荧光进行测试可知在65 分钟左右时得到最大的荧光信号(图5B)。图6可行性逻辑分析。(A)“与”逻辑门的真值表。(B)生物传感器对缓冲液中circRNA，miRNA和circRNA/miRNA的荧光响应。(C)对照组和实验组的荧光强度比(F/F0)：(a)对照，(b)在 circRNA存在下，(c)在miRNA存在下，(d)在circRNA/miRNA存在下。(D) 分别输入miRNA，circRNA和circRNA/miRNA的磁珠荧光成像。比例尺为10 μm；误差值为3个独立实验的标准偏差。

为验证所提出传感器的可行性，首先在低盐杂交缓冲液中通过逻辑分析发明该方法的检测能力。在链霉亲和素磁珠上修饰好捕获探针，如图6B所示，在仅 miRNA存在，仅circRNA存在得情况下的荧光光谱趋势与未添加靶标时几乎相同，而当circRNA与miRNA同时存在时，荧光光谱具有较高的的峰值。经分析可知，在circRNA和miRNA共存时荧光强度增加了8.36倍(图6C)。此外，如图6D所示，用荧光显微镜直接观察不同输入情况反应后的磁珠，获得与上述结果一致的趋势。这些结果表明，只有靶标circRNA和miRNA共存时，该测定法才会执行“AND”逻辑门操作并最终输出荧光信号。这是因为磁珠上修饰的 DNA探针能够特异性的捕获靶标circRNA，而circRNA特异性的吸附miRNA，此时充当引物的miRNA才能够引发下游的RCA反应，进而产生荧光响应。因此，该方法可以通过分析circRNA/miRNA复合体而不是单个RNA来直接整体检测cmRRI。

1.6.4传感器的性能分析

图7传感器的灵敏度分析。(A)在低盐杂交缓冲液中对各种浓度circRNA 的荧光光谱响应，此时miRNA浓度为100nM。(B)荧光强度与circRNA浓度之间呈线性关系。误差值为3个独立实验的标准偏差。

在确定了该方法的可行性之后，本发明进一步从灵敏度和特异性方面发明了其分析性能。首先，为了探索该方法的检测灵敏度，于缓冲液中测试了0,10 pM,100pM,1nM,5nM,10nM,50nM等不同浓度的circRNA。结果表明，随着 circRNA浓度的增加，荧光强度逐步增强，并且通过曲线拟合可知荧光强度与 circRNA浓度成正比，检出限接近1.2pM。该传感器能够检测到低浓度靶标的原因可能是：首先，MBs的表面覆盖有高密度捕获探针，提高了目标分子识别的效率；其次，RCA过程有效地产生了大量可与荧光探针杂交的重复片段。

图8传感器的特异性分析。(A)上图：三种circRNA(cM0，cM1和cM3) 和四种miRNA(mM0，mM1，mM3和对照)的12种交叉组合。c指的是circRNA， m指的是miRNA，M指的是突变。下图：该方法对突变circRNA，突变miRNA 和对照miRNA不同组合下的选择性响应。(B)热图描绘了circRNA(10nM) 和miRNA(50nM)的12种组合下的荧光强度(M表示碱基突变)。误差值为3个独立实验的标准偏差。

为了测试该方法用于分析cmRRI的特异性，本发明随机突变了circRNA和 miRNA结合位点的几个碱基，参见表1。同时，干扰miRNA已被引入作为对照。如图8A所示，对三种circRNA和四种miRNA共12种组合进行交叉分析，结果可以看出当circRNA与miRNA都没有突变时产生的荧光强度是最高的。当 circRNA有一个碱基突变(miRNA无突变)，或者miRNA有一个碱基突变 (circRNA无突变)时，荧光强度就下降了近50％左右。当有3个碱基突变时荧光强度与对照组相仿。图8B通过热图更直观的展示了传感器的特异性，只有在circRNA和miRNA完美配对的情况下产生最大的荧光值。上述结果表明该传感器可用于海绵circRNA与其相对应miRNA的相互作用分析时单碱基突变带来的影响。

1.6.5传感器对cmRRI亲和力的分析

图9(A)靶标circMTO1与不同候选miRNAs结合亲和力的示意图。(B) circMTO1分别与miR-218，miR-9，miR-484，miR-760，miR-6764和miR-6824 结合的荧光强度及最大能量的趋势图。误差值为3个独立实验的标准偏差。(C) 将六种miRNA的互补序列与circMTO1的吸附位点处的序列进行比对。最大能量的单位是Kcal/mol。

由于CircRNA通常以高亲和力充当miRNA的海绵，并间接调节下游靶基因的表达。值得注意的是， circRNA通过直接碱基互补配对吸附miRNA。因此具有强碱基相互作用的circRNA/miRNA具有更高的亲和力。因此cmRRI检测或cmRRI验证的一个重要应用是从生物信息学预测的可能与靶标circRNA具有相互作用的候选miRNA中筛选出具有更高亲和力的miRNA，以进行下游的进一步发明。Miranda软件已经预测了circMTO1(基序250-260)的目标miRNA，并筛选了6种表达和功能与HCC有关的miRNA，包括miR-218，miR-9，miR-484，miR-760，miR-6764和miR-6824。如图9A和图9B所示，通过检测每种 miRNA与circMTO1相互作用产生的荧光强度并与经RNAfold预测获得的最大能量对比，该预测最大能量表明circMTO1与靶miRNA结合的亲和力。值得注意的是，由于circRNA和miRNA的杂交反应是放热反应，因此最大能量为负，此处提及的能量是指绝对值。荧光强度与预测的最大能量之间的趋势相同，具有较高能量的miRNA会产生高荧光信号，而具有较低能量的miRNA只会伴随有较低的荧光信号。荧光强度发生这种变化的可能原因可能是能量越大，circRNA和miRNA之间的热力学稳定性就越高，进而circRNA 将吸附更多与其有很强亲和力的miRNA，并被分离以进行后续扩增。输出荧光信号最高的miR-760也具有与circMTO1结合位点序列互补最多的碱基(图9C)，这与circBase软件预测的circMTO1可以充当 miR-760的海绵结果一致。因此，当已经通过软件预测出可能与circRNA相互作用的几种miRNA时，该方法可用于测试亲和力，以进行最终的筛选和验证。

1.6.6传感器在生物样品中的检测应用；图10(A)circMTO1/miRNA-760 分别在缓冲液，1％血清，10％血清，1％细胞裂解液和10％细胞裂解液样品中的荧光响应。稀释的溶剂是低盐杂交缓冲液。(B)5种介质中的靶标回收率。误差值为3个独立实验的标准偏差。

在传统的分析方法中，从一些复杂的生物样品例如细胞裂解液，血清中对 cmRRI的分析首先需要对总RNA进行分离和纯化，该过程复杂且耗时，并且常常伴随着损失。为了探索该方法在细胞裂解液和血清中的实用性，已使用杂交缓冲液，1％血清，10％血清，1％细胞裂解液和10％细胞裂解液作为测试的样品介质。分别选择1nM和10nM的circMTO1与100nM的miRNA-760组合测试。从图10A中可以看出，与杂交缓冲液的测试结果相比，circMTO1/ miRNA-760复合物在1％血清，10％血清，1％细胞裂解液和10％细胞裂解液中的荧光信号响应显示出可忽略的差异。本发明进一步计算了这五介质中靶标的回收率(图10B)，回收率为90％-102.9％，复杂生物样本中的靶标回收率与缓冲溶液中差异较小。上述结果表明该生物传感器在细胞裂解液和血清中能够得到与在缓冲溶液中相似的检测效果。图11在HCC肿瘤组织和正常组织中分别检测circMTO1/miRNA-9和circMTO1/miRNA-21的相互作用。从左到右的患者编号依次为：1147868、1145974、1147666和1147852。误差值为3个独立实验的标准偏差。

为了进一步探究该传感器的实际应用价值，除在细胞裂解液和血清中进行测试外，本发明还在HCC肿瘤组织和正常组织中提取总RNA后，分别检测这些样本中的circMTO1/miRNA-9和circMTO1/miRNA-21的相互作用。其中，已有发明报道miRNA-9通过与circMTO1相互作用参与HCC的发展，而miRNA-21 是在多种肿瘤组织中高度表达。如11所示，circMTO1和miRNA-9的相互作用很强，而circMTO1和miRNA-21的相互作用很弱，这与以前的报道一致。 circMTO1/miRNA-9在正常组织中的相互作用力高于肿瘤组织中，这是因为在肝癌组织中circMTO1的表达量降低。结合图10与图11表明，该方法在不同的生物条件和目标浓度下均具有良好的稳定性和准确性，这表明该方法可能具有临床应用价值。

1.7总结

本发明提出了一种可用于分析circRNA-miRNA相互作用(cmRRI)的方法。实验已经表明，只有海绵circRNA和被吸附的miRNA作为复合物存在时，才能触发下游的RCA反应，然后输出荧光信号。与传统方法相比，该技术直接揭示了circRNA和miRNA之间的相互作用，显示出显着的优势：(1)它是用于cmRRI 分析的二合一集成测定法，而不需要分别检测circRNA和miRNA；(2)以高灵敏度产生定量结果，为后续对circRNA深入的功能发明奠定了基础。(3)可进一步用于分析circRNA与候选miRNA的亲和力，拓宽了该方法的应用范围。基于该方法的cmRRI检测的应用主要包括：1)生物信息学分析后的实验验证。2) 当揭示由circRNA和miRNA介导的信号途径时，替代qRT-PCR。而且，通过简单地替换探针的捕获识别序列，该方法还可以适用于分析其它竞争性内源RNA 与miRNA之间的相互作用。因此，该方法有望在生物医学和临床发明中为分析 RNA对话系统中的cmRRIs提供一个有用的工具。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法

<130> 2020

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(引物Capture probe)

<400> 1

acatctgacc caaaacaa 18

<210> 2

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(引物Imitated circMTO1)

<400> 2

gtcagatgtc atgtaatcct tcctttgagc tgtagaagat cttattctta gcaaccagag 60

cctgaacaca ctgggaaatg ccgtgtcagt ggggttgttt tgg 103

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(引物RCA template)

<400> 3

cagacaaccc gtccccacag acccaatccc c 31

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Fluorescent probe)

<400> 4

ttttaacgtc cccacagact taaaa 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-760)

<400> 5

cggctctggg tctgtgggga 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-218)

<400> 6

cgcggtgctt gacagaacca tg 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-9)

<400> 7

tcatacagct agataaccaa aga 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-484)

<400> 8

atcgggaggg gactgagcct ga 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-6764)

<400> 9

ctgtcaagga aagaccagag a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(miR-6824)

<400> 10

ctggggtggc aagaccagag a 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物Control miRNA)

<400> 11

tagcttatca gactgatgtt ga 22

<210> 12

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(引物1 base mutation circMTO1)

<400> 12

gtcagatgtc atgtaatcct tcctttgagc tgtagaagat cttattctta gcaacgagag 60

cctgaacaca ctgggaaatg ccgtgtcagt ggggttgttt tgg 103

<210> 13

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(引物3 base mutation circMTO1)

<400> 13

gtcagatgtc atgtaatcct tcctttgagc tgtagaagat cttattctta gcaacgagta 60

cctgaacaca ctgggaaatg ccgtgtcagt ggggttgttt tgg 103

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(1 base mutation miR-760)

<400> 14

cgactctggg tctgtgggga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(3 base mutation miR-760)

<400> 15

cgaccgtggg tctgtgggga 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(引物Artificial primer)

<400> 16

taagatcttc gtctgtgggg a 21

Claims

1.一种用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备功能化磁珠(MB)：捕获探针通过生物素和链霉亲和素之间的特异性结合固定在SA-MB的表面上；

(2)circRNA-miRNA相互作用分析：功能化MB将circRNA/miRNA复合物分离出来后，以miRNA为引物进行的滚环扩增RCA产物将自淬灭探针打开产生荧光信号。

2.根据权利要求1所述的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于：在步骤(1)中，step1将100μL的10mg/mL SA-MB用1mL的洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于500μL的生物素-链霉亲和素结合缓冲液中。

3.根据权利要求2所述的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于：在步骤(1)中，Step2将2μL的100μM生物素化的捕获探针添加到SA-MBs分散液中，然后将混合物在37℃的热混合器上孵育30分钟。

4.根据权利要求3所述的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于：在步骤(1)中，Step3用1mL洗涤缓冲液洗涤3次以去除多余的游离探针后，将捕获探针MBs重悬于100μL杂交缓冲液中，以进行后续实验，与MBs结合的探针数量的计算：(反应前的浓度-反应后的浓度)×反应溶液的体积。

5.根据权利要求1所述的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于：在步骤(2)中，step1在100μL杂交缓冲液中分别混合不同浓度的circRNA，所述的circRNA的核苷酸序列如序列表为SEQ ID NO：2所示，1μM的miRNA，所述的miRNA的核苷酸序列如序列表为SEQ ID NO：5所示，和2μL的10mg/mL制备的带有捕获探针的磁珠，所述的捕获探针的核苷酸序列如序列表为SEQ ID NO：1所示，并在37℃下孵育30分钟。

6.根据权利要求5所述的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于：在步骤(2)中，Step2通过磁性分离circRNA-miRNA复合物，并用洗涤缓冲液洗涤3次，以去除多余的miRNA，接下来进行滚环扩增RCA反应，50μL的反应混合物包含：3μL的3μM环状DNA模板，4μL 10×Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液，10mM的5μL dNTPs，2μL 10×BSA，1μL DEPC水和1000U/ml的1.5μL phi29 DNA聚合酶，然后，将混合物在37℃下孵育40分钟，并在70℃下加热10分钟以终止反应。

7.根据权利要求6所述的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于：在步骤(2)中，Step3将设计好的自猝灭分子信标探针，所述的自猝灭分子信标探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4，自猝灭分子信标探针1.5uL的100uM添加到溶液中，并在室温下孵育30分钟后分装至384孔板于酶标仪测量荧光强度，将产物用于荧光显微镜成像，则不需要在高温下终止反应的步骤，并且将其直接磁分离并直接与荧光探针一起孵育。

8.根据权利要求6所述的用于分析circRNA-microRNA相互作用的二合一集成测定法，其特征在于：所述的引物Capture probe的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1，所述的引物Imitated circMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2，所述的引物RCA template的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3，所述的引物Fluorescent probe的核苷酸序列如序列表SEQID NO：4，所述的引物miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5，所述的引物miR-218的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：6，所述的引物miR-9的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7，所述的引物miR-484的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：8，所述的引物miR-6764的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9，所述的引物miR-6824的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：10，所述的引物Control miRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：11，所述的引物1base mutationcircMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：12，所述的引物3base mutation circMTO1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：13，所述的引物1base mutation miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：14，所述的引物3base mutation miR-760的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：15，所述的引物Artificial primer的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：16。