CN113481239A - 一种通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法及其细胞系 - Google Patents

一种通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法及其细胞系 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法及其细胞系。该方法包括以下步骤：(1)利用不同种属来源tRNA启动子构建含有多拷贝tRNA的质粒；(2)构建靶向Rose26位点并包含识别不同非天然氨基酸的改造氨酰tRNA合成酶系统的质粒；(3)构建在Rosa26位点引入非天然氨基酸(Uaa)编码体系的小鼠胚胎干细胞细胞系，并用于干细胞中Uaa的引入。本发明通过采用不同种属来源的tRNA启动子，能够有效的避免使用相同启动子时存在的重复序列容易被沉默的问题。同时，通过靶向Rose26位点引入氨酰tRNA合成酶系统克服转座子随机插入的缺点，降低细胞毒性并提升非天然氨基酸的引入效率。

Description

一种通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系 的方法及其细胞系
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法及制备得到的小鼠胚胎干细胞细胞系。
背景技术
遗传密码扩展使用正交氨基酰基tRNA合成酶/tRNACUA对，在感兴趣的基因中的琥珀色终止密码子对应的特定位置引入非天然氨基酸。非天然氨基酸具有特殊功能团，如具有共价反应，模拟翻译后修饰等功能，赋予蛋白新的功能。截至目前，许多有用的非天然氨基酸(>200种)被遗传编码到细菌，病毒，哺乳动物细胞，模式生物等，成为生物学研究及应用的杰出新方法。引入非天然氨基酸可用于蛋白药物改造及各种生物学研究。
组蛋白含有大量的翻译后修饰蛋白，受修饰酶和去修饰酶动态调控而动态变化，其修饰改变了氨基酸残基的电性、疏水性以及空间结构，调控组蛋白与DNA的结合状态，影响DNA复制、DNA损伤修复和基因转录等重要生物学过程。组蛋白修饰可招募其特异性结合蛋白，开启生理或病理状态下相关基因转录激活的关键分子事件。研究表明，表观遗传调控通过高度动态化、可逆性机制更为有序、更为特异地实现了胚胎干细胞(Embryonic stemcell，ESC)命运决定过程中自我更新相关基因和分化基因的选择性激活与抑制，在维持ESC的自我更新和多向分化之间的精密平衡中发挥非常重要的作用。围绕着发掘调控ESC命运决定过程的新型表观机制。深入掌握胚胎干细胞的命运决定规律一直是国际干细胞研究的前沿，也是实现胚胎干细胞安全化转化应用的关键。然而，组蛋白修饰由于种类繁多、形式多样、动态变化等特点，其修饰鉴定及功能研究具有挑战性。另外，其结合蛋白丰度较低，与组蛋白修饰结合力弱，在复杂体系中的有效鉴定也一直未得到妥善处理。而遗传编码近距离自我反应及模拟翻译后修饰非天然氨基酸(Unnatural Amino Acid,Uaa)技术，可共价结捕捉活体细胞中的瞬时、表达量低的组蛋白修饰酶及特异结合蛋白。从而阐明ESC中富集的组蛋白球状结构域赖氨酸乙酰化修饰酶及结合蛋白的动态调控网络是如何影响ESC的命运决定过程。
目前在哺乳动物细胞中引入非天然氨基酸的方法主要基于瞬时转染，限制了大多数非天然氨基酸突变实验对可有效转染的细胞系的范围。干细胞系顺转效率很低，目的蛋白中引入非天然氨基酸效率受到很大限制。2016年英国Jason Chin团队发表在NatureMethods上的文章利用转座子构建了用于编码非天然氨基酸的稳定小鼠干细胞系。然而，转座子靶向位点不确定且不单一，并能够进行自我复制，并能在生物染色体间移动，具有扰乱被介入基因组成结构的潜在可能性，细胞系不稳定。且多拷贝tRNA使用的启动子相同，重复序列易被沉默。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种构建了一种特定位点引入遗传编码体系的稳定小鼠胚胎干细胞系。目前使用的转座子能够进行自我复制，并能在生物染色体间移动，扰乱被介入基因组成结构，导致细胞系不稳定。且多拷贝tRNA使用的启动子相同，重复序列易被沉默。因此我们使用不用种属来源的启动子表达多拷贝tRNA。与转座子方法相比，Rosa26定点引入的遗传编码体系具有更高的非天然氨基酸引入效率。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，包括以下步骤：
(1)构建含有不同种属来源tRNA启动子的多拷贝tRNA质粒；
(2)构建包含改造的氨酰-tRNA合成酶系统，且靶向插入Rosa26位点的质粒；
(3)将步骤(2)所得质粒转染至胞细胞系中，并筛选出阳性克隆；
(4)筛选步骤(3)克隆得到高效引入非天然氨基酸的细胞系，用于将非天然氨基酸引入目的蛋白。
进一步地，步骤(2)中质粒包括pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒、pPiggy-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒、pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒和pPiggy-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒。
进一步地，pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒的构建方法为：
以PaA063为模板扩增EF1α启动子，在引物5’端加入BsrGI-NotI-PacI和HindIII，用BsrGI和HindIII双酶切PCR产物以及pCMV-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒，将启动子克隆到pCMV-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA构建pEF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒；以pEF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒为模板扩增pEF1α-DiZPKRS-mbp片段，在引物中加入NheI和SalI酶切位点，并用NheI和SalI双酶切PCR产物；将4×tRNACUA用PacI和NheI从pEF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA切下并回收，以PaA036_Ai65，PacI和SalI双酶切，产物与NheI、SaII和PacI、NheI的酶切产物进行连接，得到pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒；以PaD005质粒为模板扩增出Hygro片段，通过同源重组的方法把质粒pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA的抗性从G418换成Hygro。
引物具体序列如下：
NheI：catgctagcGGGTCCCgaggaatctttgcagctaatgg；
SaII：acgcGTCGACcaaactcactcgaggctgatc。
进一步地，pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒的构建方法为：
以pSupAR-Ack3RS-mbp质粒为模板PCR扩增Ack3RS-mbp片段，在引物中加入KpnI和HindIII酶切位点，用KpnI和HindIII双酶切PCR产物以及pEF1a-K*crRS-4×tRNACUA，将Ack3RS-mbp克隆到pEF1α后面构建pEF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒；以pEF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA为模板扩增pEF1α-Ack3RS-mbp片段，在引物中加入NheI和SalI酶切位点，并用NheI和SalI双酶切PCR产物；将4×tRNACUA用PacI和NheI从pEF1α-K*crRS-4×tRNACUA切下并回收；以PaA036_Ai65，PacI和SalI双酶切，与NheI、SalI酶切产物和PacI、NheI酶切产物连接，得到最终的pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA；以PaD005质粒为模板扩增出Hygro片段，通过同源重组的方法把质粒pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA的抗性从G418换成Hygro。
引物具体序列如下：
NheI：catgctagcGGGTCCCgaggaatctttgcagctaatgg；
SaII：acgcGTCGACcaaactcactcgaggctgatc。
进一步地，pPiggy-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒和pPiggy-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA的构建方法为：
以质粒pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA、pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA为模版，分别在EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA和EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA左右加上pPiggy-right和pPiggy-left臂，构建得到pPiggy-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA和pPiggy-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA。
进一步地，非天然氨基酸为DIZPK或ACK。
进一步地，构建细胞系使用的合成酶为能特异性识别DIZPK非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶和能特异性识别ACK非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶。
进一步地，氨酰-tRNA合成酶与tRNACUA对一一对应。
进一步地，氨酰-tRNA合成酶来自Methanosarcina mazei、Methanosarcinabarkeri或Methanosarcina flavescens。
上述方法制备得到的细胞系。
进一步地，细胞系为小鼠胚胎干细胞细胞系。
本发明的有益效果为：
本发明通过采用不同种属来源的tRNA启动子，能够有效的避免使用相同启动子时存在的重复序列容易被沉默的问题。同时，采用不同种属来源的tRNA启动子能够有效的提升非天然氨基酸的引入效率。
附图说明
图1为EcoRI和XhoI线性化质粒载体酶切示意图；
图2为Hygro片段PCR结果图；
图3为EcoRV和XhoI双酶切质粒示意图；
图4为EcoRV和XhoI双酶切质粒结果图；
图5为DiZPK稳定细胞系整合非天然氨基酸的情况；
图6为DiZPK稳定细胞系整合非天然氨基酸的情况；
图7为DiZPK稳定细胞系整合uaa到组蛋白点突变质粒的情况。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
本申请中未记载详细构建方法的质粒均由四川大学实验室保存。
本申请中涉及的扩增、克隆等过程均为本领域技术人员熟知的技术手段。
实施例1质粒构建
1、将质粒pRosa26-EF1a-DIZPKRS-mbp-4×tRNACUA和pPiggy-EF1a-DIZPKRS-mbp4×tRNACUA进行EcoRV、XhoI双酶切线性化以获得后续质粒构建的载体(图1)。把含3μg质粒的酶切体系置于PCR仪37℃反应3个小时。
2、将酶切后的产物用1.5％琼脂糖凝胶用80V电压电泳90分钟。
3、将电泳分离得到的琼脂糖凝胶片段按照DNA纯化回收试剂盒说明书回收核酸。
4、以PaD005质粒为模版，PCR包含Hygro在内的2100bp的核酸片段(图2)。
5、PCR获得的产物进行DpnI酶处理以及DpnI酶失活反应，接下来再进行DNA纯化回收。
6、将步骤3和5所纯化回收的DNA进行同源重组反应。
7、使用感受态大肠杆菌是XL-10Gold转化步骤6所获得的同源重组产物。42℃热激活感受态45秒后冰上静置2分钟，向感受态添加900μL的无抗性LB，37℃摇床复活菌60分钟。离心后涂Amp+抗性的板子，将板子置于37℃恒温培养箱过夜。
8、挑选单克隆菌落进行菌落PCR验证，将阳性克隆进行摇菌15小时。
9、收集菌液提取质粒进行EcoRV和XhoI双酶切验证(图3和图4)。
10、将酶切验证符合条件的质粒进行测序。
11、测序正确的质粒将用于构建干细胞稳定细胞系。
实施例2构建稳定细胞系
1、在Rosa26位点通过基因敲入技术引入实施例1构建好的质粒，再通过潮霉素抗性基因(Hygro，阳性选择标记)的筛选，通过有限稀释法获得细胞单克隆。
2、当单克隆长成细胞群落后，分别从基因、蛋白和非天然氨基酸的整合情况三个方面来判断稳定细胞系是否构建成功。
3、在E14细胞中共转pCDNA3.1-GFP-182TAG-flag点突变质粒和RS质粒，在荧光显微镜下可观察到GFP的绿色荧光(图5)，在WB水平GFP的表达较少，而DiZPK稳定细胞系在无外源DiZPKRS质粒的转染下是检测不到GFP的蛋白水平，但DiZPK稳定细胞系转入了外源的DiZPKRS质粒后，其表达的GFP蛋白水平显著提高(图6)。其中选择了pPiggy细胞株1、2、7和Rosa26细胞株4、7、10进行组蛋白点突变质粒整合效率的检测，如图7所示，Rosa26-4细胞株对于组蛋白点突变质粒整合能力优于其他细胞株。

Claims (10)

1.一种通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有不同种属来源tRNA启动子的多拷贝tRNA质粒；
(2)构建包含改造的氨酰-tRNA合成酶系统，且靶向插入Rosa26位点的质粒；
(3)将步骤(2)所得质粒转染至胞细胞系中，并筛选出阳性克隆；
(4)筛选步骤(3)克隆得到高效引入非天然氨基酸的细胞系，用于将非天然氨基酸引入目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，所述步骤(2)中质粒包括pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒、pPiggy-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒、pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒和pPiggy-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒。
3.根据权利要求2所述的通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，所述pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒的构建方法为：
以PaA063为模板扩增EF1α启动子，在引物5’端加入BsrGI-NotI-PacI和HindIII，用BsrGI和HindIII双酶切PCR产物以及pCMV-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒，将启动子克隆到pCMV-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA构建pEF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒；以pEF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒为模板扩增pEF1α-DiZPKRS-mbp片段，在引物中加入NheI和SalI酶切位点，并用NheI和SalI双酶切PCR产物；将4×tRNACUA用PacI和NheI从pEF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA切下并回收，以PaA036_Ai65，PacI和SalI双酶切，产物与NheI、SaII和PacI、NheI的酶切产物进行连接，得到pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒；以PaD005质粒为模板扩增出Hygro片段，通过同源重组的方法把质粒pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA的抗性从G418换成Hygro。
4.根据权利要求2所述的通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，所述pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒的构建方法为：
以pSupAR-Ack3RS-mbp质粒为模板PCR扩增Ack3RS-mbp片段，在引物中加入KpnI和HindIII酶切位点，用KpnI和HindIII双酶切PCR产物以及pEF1a-K*crRS-4×tRNACUA，将Ack3RS-mbp克隆到pEF1α后面构建pEF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA质粒；以pEF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA为模板扩增pEF1α-Ack3RS-mbp片段，在引物中加入NheI和SalI酶切位点，并用NheI和SalI双酶切PCR产物；将4×tRNACUA用PacI和NheI从pEF1α-K*crRS-4×tRNACUA切下并回收；以PaA036_Ai65，PacI和SalI双酶切，与NheI、SalI酶切产物和PacI、NheI酶切产物连接，得到最终的pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA；以PaD005质粒为模板扩增出Hygro片段，通过同源重组的方法把质粒pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA的抗性从G418换成Hygro。
5.根据权利要求2所述的通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，所述pPiggy-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA质粒和pPiggy-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA的构建方法为：
以质粒pRosa26-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA、pRosa26-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA为模版，分别在EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA和EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA左右加上pPiggy-right和pPiggy-left臂，构建得到pPiggy-EF1α-DiZPKRS-mbp-4×tRNACUA和pPiggy-EF1α-Ack3RS-mbp-4×tRNACUA。
6.根据权利要求1所述的通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸为DIZPK或ACK。
7.根据权利要求1所述的通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，所述氨酰-tRNA合成酶系统包括能特异性识别DIZPK非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶和能特异性识别ACK非天然氨基酸的氨酰-tRNA合成酶。
8.根据权利要求1或7所述的通过Rosa26位点向细胞系中引入非天然氨基酸编码体系的方法，其特征在于，所述氨酰-tRNA合成酶来自Methanosarcina mazei、Methanosarcinabarkeri或Methanosarcina flavescens。
9.权利要求1～8任一项所述方法制备得到的细胞细胞系。
10.根据权利要求9所述的细胞细胞系，其特征在于，所述细胞系为小鼠胚胎干细胞细胞系。
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Citations (4)

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杨丹 等: "遗传密码子扩充系统表达载体及其稳定细胞系的构建", 《生物技术通讯》 *
杨丹 等: "遗传密码子扩充系统表达载体及其稳定细胞系的构建", 《生物技术通讯》, vol. 28, no. 4, 31 July 2017 (2017-07-31), pages 1 - 5 *

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