CN113474866A - 电子显微镜网格 - Google Patents

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J-P·蒂默曼斯
J·范弗莱特伦
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Abstract

在第一方面，本发明涉及一种电子显微镜(EM)网格(100)，包括：(i)穿孔基板(200)，(ii)穿孔基板(200)上的支撑膜(300)，支撑膜(300)具有
Figure DDA0003227526960000011
或更小、优选地
Figure DDA0003227526960000012
或更小、更优选地
Figure DDA0003227526960000013
或更小、最优选地
Figure DDA0003227526960000014
或更小的厚度，以及(iii)附着在支撑膜(300)顶部的链接器(400)，所述链接器(400)包括用于固定分析物(500)的至少一个亲和基团(410)；其中链接器(400)在支撑膜(300)上形成非随机图案。

Description

电子显微镜网格
技术领域
本发明涉及用于固定分析物的电子显微镜(EM)网格以及用于形成和使用此类电子显微镜网格的方法。
背景技术
在过去，高分辨率蛋白质结构测定主要使用X射线晶体学且其次使用核磁共振来完成。然而，电子显微镜硬件和图像处理软件的最新近进展导致低温电子显微镜(cryo-EM)和单颗粒分析的使用，以可视化高分辨率蛋白质结构。此外，cryo-EM具有足够的潜力成为蛋白质结构测定的高吞吐量方法，其因此可被用于药物开发。
这方面的主要瓶颈之一是样品制备，它包括从蛋白质纯化到电子显微镜网格玻璃化的整个过程。具体而言，使用亲和层析的标准蛋白质纯化策略并不总是适用于诸如不稳定的蛋白质复合物或膜蛋白之类的特定蛋白质目标，并且需要优化缓冲液成分(例如，洗涤剂、辅助因子、盐、pH值，等等)。另外，使用感兴趣的蛋白质启动电子显微镜网格然后进行纸吸墨术和浸入式冷冻的典型方法，通常会导致具有次优蛋白质颗粒分布(例如，过于拥挤，蛋白质在水-空气界面处降解，过稀，位于边缘，优先取向)的劣质网格或非无定形冰(例如，六角或立方冰)。这些参数难以控制，这就是在找到最优条件之前通常需要筛选大量EM网格的原因。此外，最优条件(一旦找到)通常难以再现。因此，更好地控制影响EM网格质量的不同步骤将极大地改善cryo-EM的总体工作流，并且如此将有助于通过cryo-EM进行高吞吐量蛋白质结构测定。已提出多种新技术来优化电子显微镜样品制备过程，诸如新型网格类型和基于新型沉积方法的无印迹网格启动规程。具体而言，对于电子显微镜网格，可以区分用于网格优化的两种主要策略：(i)使用包括石墨烯或其衍生物的附加支撑层，或(ii)使用包含经官能化表面的亲和网格。前者使用石墨烯的优势来开发具有增强电子导电性、强度和附着蛋白质能力的网格(参见PASSMORE，Lori A.；Lori A.；RUSSO,ChristopherJ.Specimen preparation for high-resolution cryo-EM(用于高分辨率cryo-EM的样品制备)，Methods in enzymology(酶学方法)，Academic Press(学术出版社)，2016年，第51-86页)，而后者侧重于携带或具有使其能够相对于其他污染物选择性地固定的特定标签或特征的特定蛋白质的网格上纯化(参见KELLY，Deborah F.等人，The Affinity Grid:apre-fabricated EM grid for monolayer purification(亲和网格：用于单层纯化的预制EM网格)，Journal of molecular biology(分子生物学杂志)，2008年，382.2：423-433)。然而，这些办法都有各自的挑战和缺点。
Liu等人通过揭示氧化石墨烯(GO)与链霉亲和素的官能化来组合这两种方法的优点(Liu，Zunfeng，等人，A graphene oxide streptavidin complex for biorecognition–towards affinity purification(用于生物识别的氧化石墨烯链霉亲和素复合物——亲和纯化，Advanced Functional Materials(高级功能材料)，2010年，20.17:2857-2865)。所得的GO-链霉亲和素复合物被沉积在连续碳网格上并暴露于生物素化金纳米颗粒(NP)溶液中，以捕获金NP。透射电子显微镜图像显示出金NP在表面上的随机扩散。作者得出结论，他们设计的GO-链霉亲和素复合物可被用于生物素化蛋白质复合物的亲和纯化。
然而，仍然需要更好的办法将分析物加载到EM网格上，这些办法例如更灵活(例如，允许不同种类的标签)并解决限制低温电子显微镜的吞吐量的进一步问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种良好的电子显微镜网格。本发明的另一目的是提供一种制造和使用此类电子显微镜网格的良好方法。该目的通过根据本发明的产品和方法来达成。
本发明实施例的优点是可以改进与EM网格上分析物的图像采集和图像处理相关的若干不同阶段和方面。
本发明实施例的优点是可以制造更好(例如，更可再现)的亲和EM网格，其中对分析物的扩散有更好的控制。本发明实施例的另一优点是图像采集可以因此得到改进(例如，使其更加可靠和/或加速)，并且可以显著降低对大量网格筛选的需求。
本发明实施例的优点是可以以更高的保真度从污染物中辨别分析物。本发明实施例的又一优点是图像处理可以因此得到改进(例如，使其更加可靠和/或加速)。
本发明实施例的优点是，在成像之前可以改变固定化分析物上的缓冲溶液，而没有冲走分析物。本发明实施例的又一优点是，这允许将分析物被应用于网格的条件与分析物被可视化的条件分开；例如，通过使用促进良好固定条件的第一缓冲液和促进分析物采用特定感兴趣配置的第二缓冲液。本发明实施例的又一优点是，缓冲液的这种变化使得能够研究网格上的分析物-分析物相互作用，例如通过固定蛋白质并随后将小分子药物结合到蛋白质上。
本发明实施例的优点是，EM网格可在EM成像中具有低背景信号。
本发明实施例的优点是，EM网格的生产和使用方法可以相对简单和经济。
本发明实施例的又一优点是便于EM网格的高吞吐量成像和图像处理。
本发明实施例的优点是，可在单个EM网格上以不同取向来固定分析物。
本发明实施例的优点是，可在单个EM网格上组合链接器(linker)与不同亲和基团。这使得能够使用不同分析物来进行多重实验。
本发明实施例的优点是，可在单个EM网格上组合多重实验，这些多重实验使用不同分析物与其他分析物相互作用。
在第一方面，本发明涉及一种电子显微镜(EM)网格，包括：(i)穿孔基板，(ii)穿孔基板上的支撑膜，支撑膜具有
Figure BDA0003227526940000031
或更小、优选地
Figure BDA0003227526940000032
或更小、更优选地
Figure BDA0003227526940000033
或更小、最优选地
Figure BDA0003227526940000034
或更小的厚度，以及(iii)附着在支撑膜顶部的链接器，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团；其中链接器在支撑膜上形成非随机图案。
在第二方面，本发明涉及一种用于形成电子显微镜网格的方法，该电子显微镜网格包括在其上具有支撑膜的穿孔基板，该方法包括：(a)以非随机图案将链接器附着在支撑膜顶部，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团，所述支撑膜具有
Figure BDA0003227526940000035
或更小、优选地
Figure BDA0003227526940000036
或更小、更优选地
Figure BDA0003227526940000037
或更小、最优选地
Figure BDA0003227526940000038
或更小的厚度；其中，支撑膜在穿孔基板上或者该方法进一步包括在步骤(a)之后执行的在穿孔基板上提供支撑膜的步骤(b)。
在第三方面，本发明涉及一种用于形成电子显微镜网格的零件套件，包括：(i)穿孔基板，(ii)支撑膜，所述支撑膜具有
Figure BDA0003227526940000041
或更小、优选地
Figure BDA0003227526940000042
或更小、更优选地
Figure BDA0003227526940000043
或更小、最优选地
Figure BDA0003227526940000044
或更小的厚度，并且其上以非随机图案附着有链接器，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团。
在第四方面，本发明涉及具有在其上形成非随机图案的链接器的支撑膜的、用于通过电子显微镜对分析物成像的用途，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团。
在第五方面，本发明涉及一种用于处理固定在第一方面的任何实施例中定义的电子显微镜网格上的分析物的电子显微镜图像的方法，包括：(a)从电子显微镜图像中选择图像区域，每一所选图像区域与形成非随机图案的链接器之一相对应；以及(b)处理所选图像区域。
在第六方面，本发明涉及一种用于采集和处理在第一方面的任一实施例中定义的电子显微镜网格的电子显微镜图像的方法，所述电子显微镜网格包括根据所述非随机图案固定在其预定位置的分析物，所述方法包括：(a)从电子显微镜网格中选择网格区域，每一所选网格区域与形成非随机图案的链接器之一相对应；以及(b)采集每一所选网格区域的图像。
在第七方面，本发明涉及一种系统，该系统包括用于执行根据第五或第六方面的任何实施例的方法的装置。
在第八方面，本发明涉及一种包括指令的计算机程序产品，当该程序由计算机执行时使计算机执行根据第五或第六方面的任何实施例的方法。
在第九方面，本发明涉及一种包括指令的计算机可读存储介质，当该指令由计算机执行时使计算机执行根据第五或第六方面的任何实施例的方法。
在所附独立和从属权利要求中阐述了本发明的特定和优选方面。来自从属权利要求的特征可以与独立权利要求的特征以及与其他从属权利要求的特征适当地结合，而不仅仅是如在权利要求中明确阐述的那样。
尽管本领域中的设备在不断地改进、改变和发展，但是相信本发明概念代表了包括偏离先前实践的充分新颖且独创的进步，从而提供了更高效、稳定和可靠的具有此性质的设备。
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述和其他特性、特征和优点将变得显而易见，附图通过示例的方式解说了本发明的原理。给出本描述仅仅是出于解说的目的，而并不限制本发明的范围。下文引用的参考图对附图进行参考。
附图说明
图1、图2和图3示出了根据本发明的示例性实施例的EM网格的示意性表示。
图4示意性地描绘了根据本发明的示例性实施例的用于在穿孔基板上提供经官能化支撑膜的策略。
图5和图6示意性地描绘了根据本发明的示例性实施例的不同亲和基团到链接器前体的附着。
图7、图8和图9示意性地描绘了根据本发明的示例性实施例的用于在穿孔基板上提供经官能化支撑膜的又一些策略。
图10和图11给出了支撑膜上的链接器的非随机图案的示例。
在不同的附图中，相同的附图标记指代相同或相似的元素。
具体实施方式
将就具体实施例并且参考特定附图来描述本发明，但是本发明不限于此而仅由权利要求书来限定。所描述的附图仅是示意性的且是非限制性的。在附图中，出于说明性目的，要素中的一些要素的尺寸可被放大且未按比例绘制。尺度和相对尺度不对应于对本发明的实施的实际减少。
此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二和第三等用于区别类似的元件，而不一定用于描述时间、空间、排列或任何其他方式的先后顺序。应理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文中所描述的本发明的实施例能够以与本文中所描述或图示的不同的顺序来进行操作。
另外，说明书和权利要求书中的术语顶部、上方、下方等等被用于描述性目的而不一定用于描述相对位置。应该理解，如此使用的这些术语在合适情况下可以与它们的反义词互换，并且本文描述的本发明的实施例能够以除了本文描述或说明的之外的其他取向来操作。
要注意，权利要求中使用的术语“包括”不应被解释为限定于其后列出的装置；它并不排除其他要素或步骤。因此，该术语应被解释为指定如所提到的所陈述的特征、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组件、或其群组的存在或添加。因此，术语“包括”涵盖了仅存在该陈述特征的情况以及这些特征和一个或多个其他特征存在的情况。因此，表述“一种包括装置A和B的设备”的范围不应当被解释为局限于仅由组件A和B构成的设备。这意味着对于本发明，设备的仅有的相关组件是A和B。
贯穿本说明书对“一个实施例”或“实施例”的引用意指结合该实施例所描述的特定的特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，短语“在一个实施例中”或“在诸实施例中”贯穿本说明书在各个地方的出现并不一定全部指代同一实施例，而是可以指代同一实施例。此外，在一个或多个实施例中，如通过本公开将对本领域普通技术人员显而易见的，特定的特征、结构或特性能以任何合适的方式进行组合。
类似地，应当理解，在本发明的示例性实施例的描述中，出于精简本公开和辅助理解各发明性方面中的一个或多个发明性方面的目的，本发明的各个特征有时被一起编组在单个实施例、附图或其描述中。然而，该公开方法不应被解释为反映要求保护的发明要求比每一项权利要求中明确记载的特征更多的特征的意图。相反，如所附权利要求所反映，发明性方面存在于比单个前述公开的实施例的全部特征更少的特征中。因此，具体实施方式之后所附的权利要求由此被明确纳入本具体实施方式中，其中每一项权利要求本身代表本发明的单独实施例。
此外，尽管本文中所描述的一些实施例包括其他实施例中所包括的一些特征但不包括其他实施例中所包括的其他特征，但是如本领域技术人员将理解的那样，不同实施例的特征的组合旨在落在本发明的范围内，并且形成不同实施例。例如，在所附的权利要求书中，所要求保护的实施例中的任何实施例均能以任何组合来使用。
进一步，实施例中的一些此处被描述为可由计算系统的处理器或实现该功能的其他装置实现的方法或方法的要素组合。因此，具有用于执行这种方法或方法的元素的必要指令的处理器形成用于执行方法或方法的元素的装置。进一步，装置实施例的此处所描述的要素是用于实现由实现本发明的目的的部件所执行的功能的装置。
在本文中所提供的描述中，阐述了众多具体细节。然而应理解，可在没有这些具体细节的情况下实施本发明的实施例。在其他实例中，公知的方法、结构和技术未被详细示出，以免混淆对本描述的理解。
如本文所使用的，除非另外指明，术语“穿孔”意指其中具有通孔。
在第一方面，本发明涉及一种电子显微镜(EM)网格，包括：(i)穿孔基板，(ii)穿孔基板上的支撑膜，支撑膜具有
Figure BDA0003227526940000071
或更小、优选地
Figure BDA0003227526940000072
或更小、更优选地
Figure BDA0003227526940000073
或更小、最优选地
Figure BDA0003227526940000074
或更小的厚度，以及(iii)附着在支撑膜顶部的链接器，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团；其中链接器在支撑膜上形成非随机图案。
电子显微镜网格可替代地被称为电子显微镜样品支撑。在各实施例中，电子显微镜可以是透射电子显微镜(TEM)。因而，EM网格可以是TEM网格。在诸实施例中，电子显微镜网格可用于低温电子显微镜和/或负染色电子显微镜，优选用于低温电子显微镜。当在低温电子显微镜中使用时，分析物通常可(例如通过亲和基团)结合至链接器，并且EM网格上可存在玻璃状冰层以固定分析物的结构。在诸实施例中，玻璃冰层可具有300nm或更低、优选地150nm或更低、更优选地100nm或更低的厚度。
在诸实施例中，穿孔基板可包括：(ia)网状结构和(ib)网状结构上的穿孔片(例如箔)。在诸实施例中，网状结构可包括金属(或由金属组成)。在诸实施例中，金属可从Cu、Ni、Ti、Si、Au、CuRh、Mo、Al和W的列表中选择。在诸实施例中，穿孔片(例如箔)可包含选自无定形碳、Au、TiSi、SiN、SiO2和SiC的材料。在诸实施例中，穿孔箔的厚度可以是1至50nm，例如5至30nm。在诸实施例中，穿孔板(例如箔)可以是有花边箔(例如有花边碳箔)、有孔箔(例如有孔碳箔)或多孔箔。这些穿孔箔本身以及其EM网格(即，在网状结构上具有所述穿孔箔)有利地可在市场上买到。在诸实施例中，穿孔基板和/或穿孔片(例如箔)可包括(例如，如在有花边箔或有孔箔中的)随机穿孔或(例如，如在多孔箔中的)规则图案穿孔。
在诸实施例中，支撑膜可选自石墨烯、氧化石墨烯和石墨。在其他实施例中，支撑膜可由另一2D材料(例如过渡金属二氯化硼或六角氮化硼)、另一碳基材料(例如无定形碳、金刚石或类金刚石碳)、半导体材料(例如硅或二氧化硅薄层)、有机分子(例如自组装单层，SAM)或生物分子形成。在诸实施例中，支撑膜可以薄如分子或原子，优选地薄如原子。在诸实施例中，支撑膜可以是分子单层(例如SAM)或原子单层(例如单层石墨烯或其他2D材料)；优选地是原子单层。较薄的支撑膜有利地较少干扰EM成像；由趋于零地薄(例如薄如原子)的支撑膜来产生的EM信号(即对振幅和相位对比度的影响)例如是可忽略的。在诸实施例中，EM网格可以用于(即适用于)蛋白质结构测定。在诸实施例中，蛋白质结构测定可具有
Figure BDA0003227526940000081
或更小的分辨率；即，这可以是高分辨率蛋白质结构测定。蛋白质结构测定通常取决于良好的分析物EM信号——来自EM网格的干扰最小。在这方面，厚度为
Figure BDA0003227526940000082
或更小的支撑膜通常产生合适的信噪比，对于厚度为
Figure BDA0003227526940000083
或更小的支撑膜而言，该信噪比进一步提高；因此，越来越优选地采用这种厚度。为了比较，单石墨烯层具有约
Figure BDA0003227526940000084
(例如
Figure BDA0003227526940000085
)的厚度。在诸实施例中，支撑膜可以是有序(例如晶体)支撑膜。有序支撑膜有利地产生可从总体EM信号中减去的EM信号(例如，规则EM信号)，从而降低或消除有序支撑膜对EM成像的影响。在优选实施例中，支撑膜可以是导电支撑膜。导电支撑膜有利地提供用于消散载流子的途径，从而抵消可能发生且可能影响EM信号的(例如，在分析物上的)局部充电效应。
在诸实施例中，至少一个亲和基团可从脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、糖、肽、蛋白质(例如抗体或纳米体)、脂质、硝基三乙酸镍(Ni-NTA)、硝基三乙酸钴(Co-NTA)、
Figure BDA0003227526940000086
Ligand(
Figure BDA0003227526940000087
配体，例如从Promega获得)、
Figure BDA0003227526940000088
Ligand(例如从NEB获得)、SpyTag、SpyCatcher、由Sortase A标识和连接的肽序列、或可被用于选择性结合特定分析物的任何其他天然或合成化学探针的列表中选择。在诸实施例中，亲和标签可从如下列表中选择：HisTag、
Figure BDA0003227526940000089
SpyTag、SpyCatcher，等等。其他可使用的亲和标签和对应的亲和基团例如但不限于Kimple等人所描述的(KIMPLE，Michelle E.；BRILL，Allison L.；PASKER，Renee L.Overview of affinity tags for proteinpurification(蛋白质纯化亲和标签综述)，Current protocols in protein science(蛋白质科学的当前方案)，2013年，73.1:9.9，1-9.9.23.)，其通过援引纳入于此；例如，参见其表9.9.1。在诸实施例中，链接器可包括包含第一亲合基团的至少一个第一链接器和包含第二亲合基团的至少一个第二链接器，第二亲合基团不同于第一亲合基团。通过在单个EM网格上组合不同性质的亲和基团，例如每一亲和基团具有对不同分析物的亲和性，可以有利地进行多重测量。此外，例如当所述分析物的首选亲和基团尚未被确定时，此类EM网格还可被用于同时测试分析物对若干亲和基团的结合亲和力。此类EM网格可以例如用作药物筛选平台，以验证和标识潜在的结合伙伴(命中验证、先导化合物优化等)，并提供其结合位置的结构信息。
在诸实施例中，分析物可以是可对其执行EM成像的任何分析物。在优选实施例中，分析物可以是生物分子，优选地是蛋白质。在被提供在EM网格上之前，分析物可能已经经历了，例如基于从如下列表中选择的一个或多个参数：大小、重量、亲和力和电荷的色谱分离。
在本发明中意料之外地发现，通过按非随机图案来固定分析物，可以改进与EM网格的成像相关的若干不同阶段和方面。例如，图像采集和/或图像处理得到改进，因为可以预测分析物将被发现的位置(参见第五方面)。此外，由于分析物固定在离散的非随机位置，而污染物仍然随机地分布在整个区域，因此可以以更高的保真度来区分分析物和污染物(参见第五方面)。此外，分析物在网格上的分布和浓度受到控制，并且可被很好地优化。这进而造成更好(例如，更具再现性)的EM网格并降低对大容量网格筛选的需求(例如，通过找到最佳蛋白质浓度或允许使用更粗糙的样品)。另外，由于分析物被固定，因此将成像之前(例如，在玻璃化之前)的缓冲溶液与用于在EM网格上提供分析物的缓冲溶液进行交换是可能的。此外，第二缓冲液可包括辅助分析物，诸如可与经固定的分析物相互作用的小分子。
链接器是多个链接器。在诸实施例中，链接器可以是3个或更多个链接器，优选地5个或更多个链接器，更优选地10个或更多个链接器。链接器可以是相同的或者可以包括两个或更多个不同的链接器。
在诸实施例中，链接器可包括间隔基(spacer)(诸如举例而言，具有2至10个重复单元的乙二醇或低聚乙二醇)和附着到间隔基的亲和基团。在诸实施例中，链接器可具有100nm或以下、优选地50nm或以下(诸如在1nm和20nm之间)的长度。由于提供在EM网格上用于cryo-EM成像的玻璃冰层可例如具有约100nm的厚度，因此分析物可保留在比该厚度更靠近基板的位置是有利的。分析物由此被阻止延伸到空气-水(例如，空气-冰)界面之外，否则可能影响其结构；例如，蛋白质在与空气接触时可能会变质并部分分解。另外，通过具有较短的链接器长度，分析物被保留得更靠近链接器附着点并且具有减小的移动范围。如此，在这种情况下，链接器可以按更紧密的模式附着，而不增加相邻分析物之间交叠和/或相互作用的风险。相反，当具有较短的链接器长度时，可减少可发现分析物的取向分布。这可能对EM图像产生负面影响，因为代表分析物的投影的角度分布范围可能过于有限，从而影响分析物的3D结构图像的质量和分辨率。例如，如果分析物始终以与EM网格支撑膜类似的方式来定向，则角度信息将受到限制，从而影响导致3D蛋白质结构测定的3D重建过程。如此，通常寻求链接器长度的平衡，这取决于感兴趣的分析物的细节(例如，其大小和结构)。或者，在诸实施例中，链接器可包括不同长度和/或不同化学成分的链接器；诸如具有不同间隔基的链接器。在诸实施例中，不同化学成分的链接器可包括不同形态的链接器(例如，相对直的与成角度的，诸如弯曲的链接器)。通过在单个EM网格上具有不同的链接器，可有利地同时促进分析物的不同取向。
在诸实施例中，每一链接器可具有到支撑膜的附着点，并且正是附着点在支撑膜上形成非随机图案。
在诸实施例中，每一链接器可具有到支撑膜的附着点，并且附着点彼此之间的最小分隔距离(即，与相邻附着点的最小分隔距离)在10到300nm之间，优选地在15到100nm之间，更优选地在20到50nm之间。最小分隔距离优选地适合于分析物的大小和/或链接器的长度，使得分析物不可能彼此接触，但是彼此靠近。分析物在图像上的最佳分布是优选的，因为这将影响需要采集的图像数量并且因此影响获得用于高分辨率分析物结构测定的完整数据集所需的时间。在诸实施例中，最小分隔距离可以是分析物半径的至少1倍、优选地至少1.5倍、更优选地至少2倍、更优选地至少2.5倍。如本文所使用的，分析物的半径被取为等于分析物长度的一半，其中分析物的长度是其在支撑膜上存在的状态下的最长尺寸(例如，在分析物是蛋白质的情况下，通常是其三级(或四级)结构的长度，而不是主结构的长度)。在诸实施例中，最小分隔距离可以是形成图案的最长链接器的长度的至少1.5倍、优选地至少2倍、更优选地至少2.5倍。
显然，当说链接器形成非随机图案时，这指的是诸个体链接器的排序(即它们各自的附着点)。这要与现有技术中称为链接器/分析物的图案化区域的情形(其中链接器/分析物基本上随机分布在每一区域内)区分开。与此类现有技术相反，本发明有利地允许在纳米级控制个体分析物颗粒(在结合到链接器时)的位置。在诸实施例中，非随机图案可以是规则图案。例如，非随机图案可以由具有单个恒定节距(即一行内相邻点之间的距离)或具有离散数量的不同节距的诸行(例如，附着点的行)构成。进而，诸行可以通过单个恒定节距(例如，与行中存在的相同或不同的恒定节距)或离散数量的不同节距彼此分隔开。在诸实施例中，每行内的附着点可以与相邻行内的附着点对齐，从而形成附着点的垂直线并因此形成附着点的网格。在其他实施例中，每行内的附着点可以相对于相邻行内的附着点偏移开，从而形成附着点的对角线。在最后一种情况下，偏移量可例如等于两个附着点之间距离的一半。在这种情况下，如果行内的节距等于附着点的对角线内的节距，则可以获得六边形图案(参见图10和图11)。在诸实施例中，每一链接器可具有到支撑膜的附着点，并且附着点可形成具有10至300nm、优选地15至100nm、更优选地20至50nm的间距的规则图案。在诸实施例中，节距可对应于最小分隔距离(参见上文)。这些节距可被用于分隔行内和/或行间的相邻点。节距优选地适合于分析物的大小和/或链接器长度(参见上文)。然而，本发明并不严格要求规则图案，只要非随机图案是可预测的(在实验误差的自然范围内，也参见第二方面的实施例)；即，链接器附着到支撑层的图案是已知的。所述已知图案随后可被输入到颗粒拾取算法中。
在第二方面，本发明涉及一种用于形成电子显微镜网格的方法，该电子显微镜网格包括在其上具有支撑膜的穿孔基板，该方法包括：(a)以非随机图案将链接器附着在支撑膜顶部，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团，所述支撑膜具有
Figure BDA0003227526940000111
或更小、优选地
Figure BDA0003227526940000112
或更小、更优选地
Figure BDA0003227526940000113
或更小、最优选地
Figure BDA0003227526940000114
或更小的厚度；其中，支撑膜在穿孔基板上或者该方法进一步包括在步骤a之后执行的(b)在穿孔基板上提供支撑膜的步骤b。
在诸实施例中，将链接器附着在支撑膜顶部的步骤a可包括：(a1)在所述支撑膜顶部提供图案化掩模，所述图案化掩模中具有形成非随机图案的开口，所述开口暴露所述支撑膜并且具有20nm或更小、优选地10nm或更小的宽度；(a2)在所述开口中将所述链接器或其前体附着到所暴露的支撑膜上；(a3)移除所述图案化掩模；以及(a4)如果在步骤a2附着了前体，则将前体转化成链接器。在诸实施例中，步骤a4可以在步骤a2之后以及在步骤a3之前或之后执行。在诸实施例中，图案化掩模中的开口可通过电子束光刻或纳米压印形成。在诸实施例中，支撑膜可以是基于碳的支撑膜(例如，石墨烯、氧化石墨烯、石墨、无定形碳、金刚石或类金刚石碳)。在一些实施例中，链接器或其前体可包含用于在步骤a2中附着到所暴露的支撑膜的重氮基团。在诸实施例中，步骤a2可包括重氮基团的电化学或化学活化(例如电化学或化学还原)。在其他实施例中，链接器或其前体可以是(或包含)羧基或另一化学基团。羧基可例如通过基于KMnO4的氧化过程在石墨烯上形成，而其他化学基团可通过基于等离子体的化学官能化来被附着。在诸实施例中，将前体转化成链接器可包括将包含亲合基团的化合物偶联到前体。在诸实施例中，支撑膜可在步骤a1之前官能化(例如，用羧基或其他化学基团，参见上文)，且步骤a2可包括将链接器或其前体附着到所暴露的经官能化支撑膜。
在诸实施例中，步骤a2可在每一开口中附着链接器或其前体中的零个或一个链接器或其前体。显然，作为化学反应，不能保证每一开口中的一个链接器或其一个前体的完美官能化，特别是考虑到开口的有限大小并且因而由此暴露的支撑膜部分的有限可接近性。然而，在本发明中，只要链接器或其前体被附着在至少10％的开口中，优选地至少25％，更优选地至少50％，更优选地至少75％，最优选地至少90％(诸如95％或99％)，链接器或其前体仍被认为形成非随机图案。事实上，即使对于这种不完美的官能化，链接器的位置仍然是充分可预测的(例如，因为可能位置的数量仍然减少到离散的数量，而不是基本上无限的)和可控的(例如，在确保最小分隔距离方面)，并且仍然达到超过随机定位的链接器的相当大的优势。
在一些实施例中，当步骤a中的支撑膜在穿孔基板上时，可提供具有组装在其上的支撑膜的穿孔基板。例如，具有预组装支撑膜的穿孔基板可从市场上购得并提供以供在步骤a中使用。在其他实施例中，当步骤a中的支撑膜在辅助基板上时，在穿孔基板上提供支撑膜的步骤b可包括：将支撑膜从辅助基板转移到穿孔基板。
在一些实施例中，在执行步骤a之前，支撑膜可以形成在穿孔基板上，或者支撑膜和穿孔基板可以组装在一起。在诸实施例中，转移支撑膜可包括湿法转移、干法转移或基于夹心的转移(参见示例2b)。用于原始(即未官能化)石墨烯的此类湿法转移或干法转移由Suk等人(Suk，Ji-Won等人，Transfer of CVD-grown monolayer graphene ontoarbitrary substrates(将CVD生长的单层石墨烯转移到任意基板上)描述。ACS nano，2011年，5.9:6916-6924)，其通过援引纳入于此。尤其是用于电子显微镜网格的石墨烯到具有箔的非铜支撑上的基于夹心的转移由Passmore和Russo(PASSMORE，Lori A.；RUSSO,Christopher J.Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.(用于高分辨率cryo-EM的样品制备)，Methods in enzymology(酶学方法)，Academic Press(学术出版社)，2016年，第51-86页)描述。
在诸实施例中，第二方面的任何实施例的任何特征可以独立地与针对任何其他方面的任何实施例的相应描述相同。
在第三方面，本发明涉及一种用于形成电子显微镜网格的零件套件，包括：(i)穿孔基板，(ii)支撑膜，所述支撑膜具有
Figure BDA0003227526940000131
或更小、优选地
Figure BDA0003227526940000132
或更小、更优选地
Figure BDA0003227526940000133
或更小、最优选地
Figure BDA0003227526940000134
或更小的厚度，并且其上以非随机图案附着有链接器，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团。
零件套件可允许用户组装如第一方面的任何实施例中所定义的EM网格。
在诸实施例中，第三方面的任何实施例的任何特征可以独立地与针对任何其他方面的任何实施例的相应描述相同。
在第四方面，本发明涉及具有在其上形成非随机图案的链接器的支撑膜的、用于通过电子显微镜对分析物成像的用途，所述链接器包括用于固定分析物的至少一个亲和基团。因此，诸个体链接器的已知图案——以及可任选地链接器的更宽区域——被用于相对于用于成像和/或图像处理的电子显微镜网格来定义特定区域/位置(参见下文)。
在诸实施例中，第四方面的任何实施例的任何特征可以独立地与针对任何其他方面的任何实施例的相应描述相同。
在第五方面，本发明涉及一种用于处理固定在第一方面的任何实施例中定义的电子显微镜网格上的分析物的电子显微镜图像的方法，包括：(a)从电子显微镜图像中选择图像区域，每一所选图像区域与形成非随机图案的链接器之一相对应；以及(b)处理所选图像区域(以提取分析物的结构信息)。
在这一上下文中，待处理的电子显微镜图像通常包含若干个链接器。相比之下，在该较大图像内选择诸图像区域，其对应于单个链接器；即所选图像区域对应于单个分析物投影图像。进而，对其进行处理以获得分析物的结构信息(例如3D结构)。
在诸实施例中，电子显微镜图像可以在这样的放大率(以及因此分辨率)下拍摄，以便最大化一个图像内可使用的分析物位置的数量。这有利地允许限制需要拍摄的图像的数量。例如，显微镜的放大率可被适配成获得每像素
Figure BDA0003227526940000141
的像素分辨率；这对应于2k x 2k检测器的200x 200nm图像。这种分辨率通常足以获得良好的结构信息。在这种情况下，进一步提高放大率具有如下缺点：需要拍摄总体上更多图像，但对所获得信息的质量影响有限。
在诸实施例中，该方法可以是颗粒拾取算法的一部分(即，用于确定图像(例如EM图像)中一个或多个分析物的位置的方法)。
在诸实施例中，本发明可涉及一种用于处理在第一方面的任一实施例中定义的电子显微镜网格的电子显微镜图像的方法，所述电子显微镜网格包括根据非随机图案固定在其预定位置的分析物，所述方法包括以下步骤：(a1)将存储在存储器中且与所述图像中存在的所述非随机图案相对应的位置的模板非随机图案叠加在所述图像中存在的所述非随机图案上并与其对齐，(a2)从所述电子显微镜图像中选择图像区域，每一所选图像区域包括所述模板非随机图案的单个位置，以及(b)处理所选图像区域以提取所述分析物的结构信息。
在诸实施例中，该方法可以是计算机实现的方法。在诸实施例中，步骤a、a1、a2和/或b可完全由通用数据处理系统来实现。
在第六方面，本发明涉及一种用于采集和处理在第一方面的任一实施例中定义的电子显微镜网格的电子显微镜图像的方法，所述电子显微镜网格包括根据所述非随机图案固定在其预定位置的分析物，所述方法包括：(a)从电子显微镜网格中选择网格区域，每一所选网格区域与形成非随机图案的链接器之一相对应；以及(b)采集每一所选网格区域的图像。
针对每一所选网格区域所采集的图像通常对应于针对第五方面所定义的图像区域，即单个分析物投影图像。
在诸实施例中，该方法可以是颗粒拾取算法的一部分(即，用于确定图像(例如EM图像)中一个或多个分析物的位置的方法)。
在诸实施例中，本发明可涉及一种用于采集并处理在第一方面的任一实施例中定义的电子显微镜网格的电子显微镜图像的方法，所述电子显微镜网格包括根据非随机图案固定在其预定位置的分析物，所述方法包括以下步骤：(a1)将存储在存储器中且与所述网格中存在的所述非随机图案相对应的位置的模板非随机图案叠加在所述电子显微镜网格中存在的所述非随机图案上并与其对齐，(a2)从所述电子显微镜网格中选择网格区域，每一所选网格区域包括所述模板非随机图案的单个位置，以及(b)采集每一所选网格区域的图像。
在诸实施例中，该方法可包括进一步的步骤c：(c)处理所采集的图像以提取分析物的结构信息。
在诸实施例中，该方法可以是计算机实现的方法。在诸实施例中，步骤a、a1、a2和/或c可完全由通用数据处理系统来实现。在诸实施例中，步骤b可进一步包括——例如与通用数据处理系统相组合——使用电子显微镜(例如，透射电子显微镜)。
在第五或第六方面的实施例中，每一图像(或网格)区域可具有1μm或以下、优选地500nm或以下、更优选地200nm或以下、更优选地100nm或以下(诸如在20和40nm之间)的宽度。在诸实施例中，每一图像(或网格)区域可具有1μm或以下、优选地500nm或以下、更优选地200nm或以下、更优选地100nm或以下(诸如在20和40nm之间)的高度。每一图像(或网格)区域可以例如具有1μm x 1μm或以下、优选地500nm x 500nm或以下、更优选地200x200nm或以下、更优选地100x100nm或以下(诸如在20x20和40x40nm之间)的大小。图像(或网格)区域的大小通常根据分析物的大小和链接器的大小来被选择，以使分析物始终能够整体地适合在图像(或网格)区域。在这一方面，较小尺寸(例如200nm或更小)通常可更适合诸如蛋白质之类的分析物，而较大尺寸(例如200nm以上)可更适合诸如例如病毒或外泌体之类的较大分析物。
在诸实施例中，每一图像(或网格)区域可以集中在模板非随机图案的单个不同位置上。因此，每一图像(或网格)区域集中在支撑膜的一个链接器的附着点上。
在上述方法中，已知的非随机图案有利地被用于丢弃落在该非随机图案之外的其他颗粒(例如污染物)。更具体而言，通过仅选择对应于非随机图案的图像区域，即预期可以在其中找到分析物的图像区域，通过布置EM图像中的污染物(其没有示出与链接器的亲和力并且因此随机分布在EM图像上，从而具有相对低概率出现在所选图像区域中)，整个EM图像被有利地有效过滤，同时选择在所选EM图像区域中的分析物(其确实示出与链接器的亲和力并且因此被固定在非随机模式中，从而具有相对高概率出现在所选图像区域中)。在这样做时，替代现有已知方法或与现有已知方法结合使用(例如，基于机器学习来学习识别EM图像中的分析物分子并基于此来选择分析物)，可以使颗粒拾取更加可靠，并且其速度可以显著提高且因此图像处理可以显著改进。事实上，这种污染物投影否则会干扰良好的2D和3D类平均值的形成，并且因此需要通过多个图像处理步骤来移除。从污染物中预过滤分析物的这一优势在处理粗略的未经纯化的蛋白质混合物时尤为有意义。
类似地，通过仅选择与可有用于高分辨率信息的非随机图案相对应的网格区域，即预期可在其中找到分析物的网格区域，整体EM图像采集过程受到有利影响，因为可以优化用于获得必要数量的分析物盒(即颗粒)的图像数量，因为可以估计每一图像的颗粒数量。
注意，本发明的方法依赖于链接器的已知非随机图案，并从而将它们与其他自动图像采集和图像处理技术(其中缺少颗粒位置的此类先验知识)区分开。此外，后者与经官能化石墨烯EM网格(其中具有不同官能团的不同链接器被定位在网格的不同区域或局部图案(参见示例1b)中)相组合将使得能够在处理成像数据时立即子选择(sub-select)不同的链接器基团。
在诸实施例中，第五或六方面的任何实施例的任何特征可以独立地与针对任何其他方面的任何实施例的相应描述相同。
在第七方面，本发明涉及一种系统，该系统被适配成(例如包括用于如此的装置)执行根据第五或第六方面的任何实施例的方法。
在诸实施例中，该系统可包括数据处理设备，其被适配成执行(计算机实现的)根据第五方面的任何实施例的步骤a、a1、a2和/或b，和/或根据第六方面的任何实施例的步骤a、a1、a2和/或c。在诸实施例中，该系统还可以包括用于执行根据第六方面的任何实施例的步骤b的电子显微镜(例如透射电子显微镜)。
该系统还可包括如第一方面的任何实施例中所定义的电子显微镜网格。
在诸实施例中，该系统可包括图像采集单元和/或图像处理单元，其被适配成仅采集和/或处理包括非随机图案的单个位置的图像区域。换言之，该系统可包括图像采集单元和/或图像处理单元，其被适配成仅采集和/或处理由形成非随机图案的链接器所固定的分析物的图像。
在诸实施例中，图像处理单元可包括：存储模板非随机图案的存储器、用于将模板非随机图案与图像中存在的非随机图案叠加和对齐的叠加和对齐单元、用于从电子显微镜图像中选择图像区域的选择单元、以及用于处理所选图像区域以提取分析物的结构信息的处理器，每一所选图像区域包括模板非随机图案的单个位置。
在诸实施例中，图像采集单元可包括：存储模板非随机图案的存储器、用于将模板非随机图案与图像中存在的非随机图案叠加和对齐的叠加和对齐单元、用于从电子显微镜图像中选择图像区域的选择单元、以及用于采集每一所选网格区域的图像的采集设备，以及用于处理所采集的图像以提取分析物的结构信息的处理器，每一所选图像区域包括模板非随机图案的单个位置。
在诸实施例中，第七方面的任何实施例的任何特征可以独立地与针对任何其他方面的任何实施例的相应描述相同。
在第八方面，本发明涉及一种包括指令的计算机程序(产品)，当该程序由计算机执行时使计算机执行根据第五或第六方面的任何实施例的方法。
在诸实施例中，第八方面的任何实施例的任何特征可以独立地与针对任何其他方面的任何实施例的相应描述相同。
在第九方面，本发明涉及一种包括指令的计算机可读(存储)介质，当该指令由计算机执行时使计算机执行根据第五或第六方面的任何实施例的方法。
在诸实施例中，第九方面的任何实施例的任何特征可以独立地与针对任何其他方面的任何实施例的相应描述相同。
现在将通过本发明的若干实施例的详细描述来描述本发明。显然，根据本领域技术人员的知识能够配置本发明的其他实施例而不背离本发明的真正技术示教，本发明仅受限于所附权利要求书的各条款。
示例1：具有支撑膜的EM网格
示例1a
现在参考图1和图2，其示出了根据本发明实施例的EM网格(100)的示意性表示。在图1中，诸表示从图1a到d逐渐放大，描绘了图1a-c中的俯视图和图1d中的侧视图。图2与图1相同，但示出了图2c的侧视图。应该清楚的是，图1b和图2b中描绘的图案反映支撑膜内孔的图案，而图1c和图2c中的图案反映各个体链接器的图案。
示例性EM网格(100)包括网状结构(210)形式的穿孔基板(200)和网状结构(210)上的穿孔箔(220)。网状结构(210)通常包括具有多个较小孔(211；例如正方形)的网(例如，框)。网可以是金属的，例如由Cu、Ni、Au、Si或其他金属或者其他材料(诸如二氧化硅)制成。穿孔箔(220)包括以规则或不规则图案布置的孔(221)，诸如在有孔箔、有花边箔或QuantifoilTM(多孔箔)中。穿孔箔(220)可由碳或金属(例如Au)材料制成。穿孔箔(220)在某些情况下可被用于引导(例如部分自动化)图像采集过程，因为孔指示图像采集应发生的区域。
支撑膜(300)进一步设置在具有以非随机图案附着的链接器(400)的穿孔基板(200上；例如在穿孔箔(220)上)。链接器(400)允许以非随机图案来固定感兴趣的分析物(500；例如蛋白质)。支撑膜(300)例如可以是用链接器(400)进行化学官能化的石墨烯层(例如单层石墨烯)。
链接器(400)通常包括用于与分析物(500)相互作用的亲和基团(410)以及亲和基团(410)和支撑膜(300)之间的间隔基(420)。亲和基团可以例如是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、糖、肽、蛋白质(例如抗体或纳米体)、脂质、镍氮三乙酸(Ni-NTA)、钴氮三乙酸(Co-NTA)、
Figure BDA0003227526940000191
Ligand(例如来自Promega)、
Figure BDA0003227526940000192
Ligand(例如来自NEB)、SpyTag或SpyCatcher或可被用于选择性结合带有或不带有特定化学或遗传标签(如HisTag、
Figure BDA0003227526940000193
SpyCatcher或SpyTag)的特定分析物的任何其他天然或合成化学探针。间隔基(420)可具有固定或可变长度和/或化学成分。在一个EM网格(100)内具有不同长度和/或化学成分的间隔基(420)可影响分析物(500)的随机角分布并促进不同分析物分子(500)的不同取向。进而，这可以便于在不同取向上采集分析物(500)的图像。
非随机图案可以是规则图案，但这不是严格要求的。然而，非随机图案是如下意义上的可预测图案：在初始对准之后，可以相对准确地(即，在实验误差范围内)预测链接器(400)(以及因此分析物分子500)的位置。相邻链接器(400)之间的所需间距通常取决于感兴趣的分析物(500；例如，取决于其大小或体积)。优选地，间距可至少是分析物半径的2.5倍。例如，对于具有5nm最大半径的分析物而言，可以使用12.5nm的间距。
示例1b
现在参考图3，其示出了如示例1a中所述的EM网格(100)，但其中单个EM网格(100)上的不同区域/区(例如，对应于网格210中的不同孔211)配备有不同亲合基团；这种不同的官能化由数字1到4表示。以此方式，EM网格(100)允许固定不同类型的分析物或筛选不同类型的亲和基团以使其与单个分析物结合。
此外，这种不同官能化的图案不需要局限于微尺度，而是可以通过在局部图案中——以受控方式——附着具有不同亲和基团的链接器来在纳米尺度上实现。
示例2：使用经官能化的石墨烯层制造EM网格
为了在单层石墨烯(SLG)表面获得亚100nm周期性的链接器模板，可以使用电子束光刻(EBL)和共价化学官能化的组合。
示例2a：使用电子束光刻来将石墨烯图案化
首先在通过化学气相沉积(CVD)在Cu上生长的SLG上旋涂薄的正电子束光刻胶，由此2D碳晶体的优选晶粒大小大于100-200μm。
然后使用电子束SEM光刻系统辐照电子束光刻胶，来以非随机图案(例如规则图案)定义具有小于等于10nm(甚至更小)直径的辐照点。所使用的EBL系统原则上可以允许任意节距，因为辐照点原则上可以具有任意节距。然而，节距应足够大以避免相邻的经固定分析物(例如大蛋白质)之间的交叠和/或相互作用，但应足够小以允许在单个步骤中对大量分析物进行成像。例如，可以使用100nm或更低的节距。
接着，显影光刻胶以创建对应于辐照点的开口，从而以非随机图案暴露石墨烯层。
或者，代替直接在基板上写入图案，通过纳米压印可以(例如，使用电子束光刻)制造纳米戳(nanostamp)(例如，参见CHOU，Stephen Y.等人Sub-10nm imprint lithographyand applications(亚10nm压印光刻和应用)，Journal of Vacuum Science&TechnologyB:Microelectronics and Nanometer Structures Processing,Measurement,andPhenomena(真空科学与技术杂志B：微电子与纳米结构加工、测量与现象)，1997年，15.6:2897-2904)可以(例如，在聚合物掩模中)产生相应的图案。在此，可在SLG基板的Cu侧沉积抗蚀剂(例如聚合物)。然后，使用纳米戳对抗蚀剂进行图案化，并执行固化步骤。此后，穿过经图案化抗蚀剂来蚀刻Cu以创建对应于纳米戳的开口，从而以非随机图案暴露石墨烯层。
随后对具有所暴露的石墨烯点的经图案化SLG(P-SLG)进行共价官能化(参见示例2b)，以在每个点中实现0或1个链接器分子的附着。石墨烯层的其他部分仍然被光致抗蚀剂覆盖，并且因此不受官能化的影响。
然后去除光致抗蚀剂，以完全暴露在其上以非随机图案在离散位置附着有链接器的石墨烯层。
然后可将目标分析物(例如以其溶液的形式)施加到石墨烯表面以在链接器处选择性地结合分析物，例如在每个点(即每个链接器位置)实现0或1个分析物的固定化。从而获得支撑膜上分析物的非随机图案。
示例2b：用重氮化学或化学氧化对SLG进行官能化
使用重氮化学对SLG进行官能化是使用两步法来执行的。在第一步骤中，重氮化学被用于将官能团(例如链接器前体)附着到原始石墨烯。在第二步骤中，将附加部分添加到所附着的官能团(参见示例2c)，以形成实际链接器。
现在参考图4。石墨烯表面附近重氮试剂的还原产生芳基，其经由C-C键附着到表面以形成链接器前体(401)。还原可以使用电化学活化或经由化学活化来实现。该化学反应通常是稳健和可重复的，并且已经证明允许石墨烯以及石墨的受控官能化。羧苯基到SLG(300)的附着例如被探索，因为其便于附着进一步基团以用于形成具有亲和基团(410)的链接器(400)。拉曼光谱和扫描隧道显微镜(STM)可被用于评估官能化的效率。对于EM网格(100)的SLG的官能化，例如可以使用两种办法。
或者，官能化可以基于化学氧化而不是重氮化学。在此，使用化学氧化工艺对铜基板上的SLG进行官能化，例如基于Hummer方法的修改版(参见例如LIU，Nan等人，Bioactivefunctionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electronmicroscopy(用于高分辨率冷冻电子显微镜的生物活性官能化单层石墨烯)，Journal ofthe American Chemical Society(美国化学学会杂志)，2019年，141.9:4016-4025)，由此KMnO4被用于创建反应性羧基。这在图6中被示意性地例示出。
可以使用拉曼光谱比较使用不同办法获得的EM网格(100)上的SLG(300)的官能化程度。
示例2c：将生物特异性链接器附着到经官能化的石墨烯
现在参考图5和图6。在初始羧苯基或羧基官能化(参见示例2b)之后，下一步是延伸链接器前体(401)以从中形成具有更具特异性的亲和基团(410)的链接器(400)。因此，许多不同的亲合基团(410)(诸如Ni/Co-NTA或HaloLigand(卤代配体))被附着到已经接枝到SLG(300)的羧苯基(401)或羧基。在羧苯基官能化的情况下，可使用N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)实现偶联，这允许在相对温和的条件下形成酰胺。在羧基官能化的情况下，可使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)作为中间步骤来实现与反应性胺基的反应。因此可以构建具有以非随机图案官能化(Ni/Co-NTA、HaloLigand等；或其组合)的支撑膜(300)的EM网格的库。这些具有包括间隔基(420)和亲和基团(410)的经图案化链接器(400)的EM网格(100)随后可用于不同分析物的基于亲和力的结合和固定化。
示例2d：通过荧光和电子显微镜验证石墨烯亲和网格
所制造的EM网格可以使用荧光和电子显微镜来被验证。因此，建立了等离子体清洗和辉光放电实验方案，重点尤其是防止污染物与支撑膜上亲和基团的A-特异性结合。EM网格上链接器的存在和扩散可通过荧光显微镜使用作为分析物的His标签荧光蛋白(例如增强型绿色荧光蛋白eGFP或红色荧光蛋白mCherry)和/或内部开发的针对HaloTag的荧光标签单域抗体来进行验证。阳性结果被进一步验证，以验证蛋白质颗粒的角度分布，这是使用冷冻电子显微镜和个体颗粒投影的2D分类来完成的。代替将蛋白质固定(弱相对象)，经官能化的金颗粒可另选地被固定并被用作验证工具。
示例2e：EM网格制造的解说
图7和图8分别描绘了EM网格制造的两种说明性办法。在这两者中，在实心基板(600)上执行SLG(300)的官能化，随后将SLG(300)转移到EM网格(100)，诸如Quantifoil Au300 1.2/1.3非铜网格。
为此，如示例2a中所述，在Cu(600)上CVD生长的SLG(300)经受直接EBL(参见图7)或纳米戳(800)(参见图8)图案化。
然后，在将光致抗蚀剂(710)(例如PMMA)和石墨烯P-SLG(300)转移到EM网格(100)之前，对其进行共价官能化。官能化包括两个步骤，其中第一步骤涉及重氮盐的电化学还原或化学氧化，以将羧苯基或羧基单元作为链接器前体(401)共价附着到SLG(300)(参见示例2c)。该步骤也可在沉积光致抗蚀剂(710)之前完成。该初始步骤之后是随后的化学反应，该化学反应将带有官能团的实际链接器共价附着到这些前体(参见示例2d)。
在官能化之后，将经官能化的石墨烯(300)转移到EM网格(100)。这可以使用基于聚合物的转移或基于夹心的转移来实现。对于后者，将个体盘从Cu(600)上的具有与EM网格(100)相似的直径的SLG(300)中冲出，然后去除PMMA层。可使用与Passmore和Russo(PASSMORE，Lori A.；RUSSO，Christopher J.Specimen preparation for high-resolution cryo-EM(用于高分辨率cryo-EM的样品制备)，Methods in enzymology(酶学方法)，Academic Press(学术出版社)，2016年，第51-86页)所描述的规程相似的基于夹心的规程来完成经图案化的经官能化SLG(300)盘转移到EM网格(100)，由此SLG(300)盘和EM网格两者都被放置在两个载玻片之间。使用蚀刻剂溶液——在转移之前或之后——移除铜基板(600)，从而不影响金网格(例如Quantifoil Au300 1.2/1.3)。
或者，转移可以使用基于聚合物的湿法转移或干法转移来完成，例如如Suk等人所描述的(Suk，Ji-Won等人，Transfer of CVD-grown monolayer graphene onto arbitrarysubstrates(将CVD生长的单层石墨烯转移到任意基板上)，ACS nano，2011年，5.9:6916-6924)。根据我们的经验，基于聚合物的石墨烯转移方法可以实现更高吞吐量转移规程——具有高质量石墨烯，但通常受益于聚合物溶解的优化实验方案(例如基于有机溶剂，诸如热丙酮)。
注意，尽管图7和图8两者都示出了面向下的链接器(400)，但是链接器(400)相对于EM网格(100)的这一取向可以通过图案化规程和/或转移规程中的变化来控制。在这样做时，链接器可以例如朝向EM网格(100)(如图7和图8所示)或向上，远离EM网格(100)(如图9所示)。例如，通过将抗蚀剂层(710)直接施加在图8中的支撑膜(300)的顶部——而不是施加在Cu层(600)上，可以将链接器(400)施加在支撑膜(300)的相对面上，并且化学基团可以在转移(例如，基于聚合物的转移)之后向上定向。链接器的取向以及因此样品的位置通常会对网格的后续玻璃化规程产生影响。
在优选实施例中，图案化可使用纳米戳来完成，链接器前体可通过化学氧化来形成，并且转移可通过基于聚合物的方法来执行。
示例3：使用EM网格来改进分析物图像采集和/或图像处理
由于链接器是以可预测图案来附着的，因此该非随机图案可被输入到颗粒拾取算法中，例如在图像采集和/或图像处理期间。在将所输入的非随机图案与支撑膜上的对应图案叠加并对齐后，颗粒拾取算法随后可以使用所述图案作为定位分析物分子的指导。可在EM网格上找到分析物的可能性由此被降低，从连续分布在成像区域中的基本无限数目的随机位置减少到离散数量的可预测位置(对应于非随机图案)。因此，可以使颗粒拾取算法更快且更准确地发挥作用。另外，由于污染物通常没有显示出对链接器的特别亲和力，因此它们在EM网格上保持随机分布并且因此可以更容易地与分析物区分开(并滤除)。
示例4：链接器在支撑膜上的非随机图案的示例
图10示出了正六边形非随机图案。在这一图案中，每行内的链接器的附着点相对于相邻行内的附着点偏移开，从而形成附着点的对角线。这一偏移在此等于两个附着点之间距离的一半。如图11所示，一行内的节距等于附着点对角线内的节距，从而生成六边形图案。
可以理解，尽管本文针对根据本发明的设备讨论了优选实施例、具体结构和配置以及材料，但是可做出形式和细节上的各种改变或修改而不背离本发明的范围和技术教导。例如，上面给出的任何分子式仅代表可被使用的步骤。可从框图中增删功能，且可在功能框之间互换操作。在本发明范围内可对所述方法增删步骤。

Claims (15)

1.一种电子显微镜网格(100)，包括：
i.穿孔基板(200)，
ii.所述穿孔基板(200)上的支撑膜(300)，所述支撑膜(300)具有
Figure FDA0003227526930000011
或更小、优选地
Figure FDA0003227526930000012
或更小、更优选地
Figure FDA0003227526930000013
或更小、最优选地
Figure FDA0003227526930000014
或更小的厚度，以及
iii.附着到在支撑膜(300)顶部的链接器(400)，所述链接器(400)包括用于固定分析物(500)的至少一个亲和基团(410)；
其中所述链接器(400)在所述支撑膜(300)上形成非随机图案。
2.根据权利要求1所述的电子显微镜网格(100)，其特征在于，是低温电子显微镜网格。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的电子显微镜网格(100)，其特征在于，所述支撑膜(300)是原子单层或分子单层。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的电子显微镜网格(100)，其特征在于，所述链接器(400)包含不同长度和/或不同化学成分的链接器。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的电子显微镜网格(100)，其特征在于，所述链接器(400)包括包含第一亲合基团的至少一个第一链接器和包含第二亲合基团的至少一个第二链接器，所述第二亲合基团不同于所述第一亲合基团。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的电子显微镜网格(100)，其特征在于，所述链接器(400)中的每一者具有到所述支撑膜(300)的附着点，并且其中所述附着点形成具有10到300nm、优选地15到100nm、更优选地20到50nm的间距的规则图案。
7.一种用于形成电子显微镜网格(100)的方法，所述电子显微镜网格(100)包括其上具有支撑膜(300)的穿孔基板(200)，所述方法包括：
a.以非随机图案将链接器(400)附着在支撑膜(300)顶部，所述链接器(400)包括用于固定分析物(500)的至少一个亲和基团(410)，所述支撑膜(300)具有
Figure FDA0003227526930000015
或更小、优选地
Figure FDA0003227526930000016
或更小、更优选地
Figure FDA0003227526930000018
或更小、最优选地
Figure FDA0003227526930000017
或更小的厚度；
其中
所述支撑膜(300)位于所述穿孔基板(200)上，或
所述方法还包括在步骤a之后执行的步骤b：
b.在所述穿孔基板(200)上提供所述支撑膜(300)。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将链接器(400)附着在所述支撑膜(300)顶部的步骤a包括：
a1.在所述支撑膜(300)顶部提供图案化掩模，所述图案化掩模中具有形成非随机图案的开口，所述开口暴露所述支撑膜(300)并且具有20nm或更小、优选地10nm或更小的宽度；
a2.在所述开口中将所述链接器(400)或其前体附着到所暴露的支撑膜(300)上；
a3.移除所述图案化掩模；以及
a4.如果在步骤a2中附着前体，则将所述前体转化成所述链接器(400)，其中步骤a4在步骤a2之后以及在步骤a3之前或之后执行。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，步骤a中的支撑膜在辅助基板上，并且其中在所述穿孔基板(200)上提供所述支撑膜(300)的步骤b包括将所述支撑膜(300)从所述辅助基板转移到所述穿孔基板(200)。
10.一种用于形成电子显微镜网格(100)的零件套件，包括：
i.穿孔基板(200)，
ii.支撑膜(300)，所述支撑膜(300)具有
Figure FDA0003227526930000021
或更小、优选地
Figure FDA0003227526930000022
或更小、更优选地
Figure FDA0003227526930000023
或更小、最优选地
Figure FDA0003227526930000024
或更小的厚度，并且其上以非随机图案附着有链接器(400)，所述链接器(400)包括用于固定分析物(500)的至少一个亲和基团(410)。
11.一种用于处理根据权利要求1至6中的任一项所述的电子显微镜网格的电子显微镜图像的方法，所述电子显微镜网格包括根据所述非随机图案固定在其预定位置的分析物，所述方法包括以下步骤：
a1.将存储在存储器中且与所述图像中存在的所述非随机图案相对应的位置的模板非随机图案叠加在所述图像中存在的所述非随机图案上并与其对齐，
a2.从所述电子显微镜图像中选择图像区域，每一所选图像区域包括所述模板非随机图案的单个位置，以及
b.处理所选图像区域以提取所述分析物的结构信息。
12.一种用于采集和处理根据权利要求1至6中的任一项所述的电子显微镜网格的电子显微镜图像的方法，所述电子显微镜网格包括根据所述非随机图案固定在其预定位置的分析物，所述方法包括以下步骤：
a1.将存储在存储器中且与所述网格中存在的所述非随机图案相对应的位置的模板非随机图案叠加在所述电子显微镜网格中存在的所述非随机图案上并与其对齐，
a2.从所述电子显微镜网格中选择网格区域，每一所选网格区域包括所述模板非随机图案的单个位置，
b.采集每一所选网格区域的图像，
c.处理所采集的图像以提取所述分析物的结构信息。
13.一种适配成执行根据权利要求11或12所述的方法的系统。
14.一种包含指令的计算机程序，当所述程序由计算机执行时，所述指令使所述计算机执行根据权利要求11或12所述的方法。
15.一种包含指令的计算机可读介质，当所述指令由计算机执行时使得所述计算机执行根据权利要求11或12所述的方法。
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