CN113470749B - 一种腔室亮度不均匀校正方法及装置 - Google Patents
一种腔室亮度不均匀校正方法及装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种腔室亮度不均匀校正方法，包括读入腔室原始亮度数据；原始亮度数据的坐标标准化，得到坐标标准化的原始亮度数据；原始亮度不均匀拟合，得到亮度不均匀对应的线性函数；亮度不均匀校正，而消除数字PCR阅读过程中引入的亮度不均匀现象，使阳性腔室的亮度值均匀分布在亮度值1附近，阴性腔室的亮度值均匀分布在亮度值2附近，而提高腔室阳性率计算准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，尤其是一种腔室亮度不均匀校正方法。
背景技术
数字PCR(digital PCR，dPCR)是一种定量分析技术，是将含有目标分子的PCR反应体系分配到上万个独立腔室中，实现单分子模板PCR扩增，扩增后含有核酸分子模板的腔室会发出荧光信号即为阳性反应腔室，未发出荧光信号的腔室即为阴性反应腔室，最终依据泊松分布原理和阳性腔室的比例(阳性率＝阳性反应腔室个数/(阳性反应腔室个数+阴性反应腔室个数))计算出目标分子的绝对浓度。
数字PCR的分析结果是根据泊松分布原理和阳性率计算获得，因此阳性率的准确性决定了分析结果的准确性。然，目前的阳性率计算方式存在诸多问题，以生物芯片为例，数字PCR阅读过程中使用CCD相机拍摄生物芯片图像，并通过算法分析该图像包含的信息。生物芯片内包含一定数量的阳性腔室和一定数量的阴性腔室，理论上阳性腔室的亮度值均匀分布在亮度值1附近，阴性腔室的亮度值均匀分布在亮度值2附近。由于CCD相机在拍摄图像过程中存在亮度不均匀现象，所以采用算法分析后得到的亮度值将会与真实值存在差距，分析结果中阳性腔室的亮度值不再均匀分布在亮度值1附近，而是跟随图像的亮度不均匀变化，阴性腔室的亮度值表现出与阳性腔室相似的特征，因此无法通过阈值正确区分阳性反应腔室和阴性反应腔室，而引起腔室阳性率计算准确性的降低，进而引起数字PCR准确性的降低，请参阅图1所示的采用现有技术获得的腔室原始亮度分布示意图。
因此，急需一种能够消除数字PCR阅读过程中引入的亮度不均匀现象的方法，使阳性腔室的亮度值均匀分布在亮度值1附近，阴性腔室的亮度值均匀分布在亮度值2附近，而提高腔室阳性率计算准确性。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提出一种腔室亮度不均匀校正方法，包括：S101：读入腔室原始亮度数据，原始亮度数据包括腔室亮度值和腔室在图像中的坐标值；S102：原始亮度数据的坐标标准化，得到坐标标准化后的原始亮度数据；S103：原始亮度不均匀拟合，得到亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；S104：根据亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面对亮度不均匀校正。
更进一步的，所述的原始亮度数据的坐标标准化包括腔室坐标变换。
更进一步的，腔室坐标变换为：依据原始亮度数据对应腔室在完整图像中的坐标，将原始亮度数据的坐标从完整图像的坐标转换到子图中的坐标，其中腔室坐标变换公式如下：
ui，j＝xi，j-αk，l+n
vi，j＝yi，j-βk，l+n
其中，(xi，j，yi，j)表示索引号为(i，j)的腔室在完整大图中的坐标，(ui，j，vi，j)表示索引号为(i，j)的腔室进行坐标变换后在子图中的坐标，(αk，l，βk，l)表示索引号为(k，l)的子图在完整大图中的拼接坐标，n为自然数。
更进一步的，原始亮度不均匀拟合包括：计算拟合周期；计算拟合周期内标定值；判断拟合是否异常；若是则修复异常标定值；若否则进行曲线或曲面光滑。
更进一步的，根据子图中单行或单列腔室个数确定拟合周期；
当为同类腔室时，将单个拟合周期内的亮度值升序排列，并计算该序列的梯度值，选择一梯度值将对应拟合周期内的亮度值分成两类，分别计算两类腔室的亮度均值，作为拟合周期内的标定值；
当为不同类腔室时，分别计算各类腔室的亮度均值，并选择最大和最小的亮度均值作为拟合周期内的标定值；
采用二次线性回归判断拟合是否异常；
采用邻域值对异常标定值进行校正。
更进一步的，根据拟合的亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，采用线性插值法对亮度不均匀进行校正，确定腔室所对应的新亮度值。
更进一步的，亮度不均匀校正过程包括：计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值；采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；检测扩展是否异常；如是则将拟合直线斜率赋值为0，截距赋值为亮度均值；若否则采用线性插值对亮度进行校正。
更进一步的，计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值的公式为：
其中，ci表示为系数，Vi为拟合曲线或曲面上的值；
采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面为：截取拟合曲线或曲面一截面的首部或尾部数据，采用最小二乘法对截取数据进行直线拟合得到拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的覆盖范围；
检测扩展是否异常为：通过拟合直线的斜率，判断扩展是否异常；
计算校正后的亮度值的公式为：
其中，Li，j，li，j分别为索引号(i，j)的腔室校正后的亮度值和原始亮度值，Vb1，Vb2为亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值，U1，U2为索引号(i，j)的腔室亮度在拟合曲线或曲面上对应的拟合值。
本申请还提供一种亮度不均匀校正装置，包括：标准化单元，接收腔室原始亮度数据，用于对原始亮度数据的坐标标准化，得到坐标标准化的原始亮度数据；拟合单元，接收坐标标准化的原始亮度数据，用于根据坐标标准化的原始亮度数据，拟合出亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；校正单元，接收亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，用于根据所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，确定所述腔室对应的新亮度值。
本申请还提供一种计算机可读存储介质，其上储存有计算机指令，所述计算机指令运行时执行上述的腔室亮度不均匀校正方法。
本申请还提供一种亮度不均匀校正装置，包括：存储器和处理器，所述存储器上存储有计算机指令，所述计算机指令运行时执行上述的腔室亮度不均匀校正方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过根据腔室亮度数据所对应的位置坐标进行坐标变换，得到标准化的亮度数据，然后拟合出所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，进而计算得到校正后的亮度值。根据校正后的腔室亮度值，可以清晰的区分阳性腔室和阴性腔室，提高阳性率的准确性，进而提升数字PCR检测结果的准确性，消除亮度不均匀带来的问题，并可提高数字PCR检测结果的准确性，使阳性腔室的亮度值均匀分布在亮度值1附近，阴性腔室的亮度值均匀分布在亮度值2附近，并可提高数字PCR的可靠性和稳定性，采用本发明的亮度不均匀校正方法，可以降低对高性能CCD相机和复杂光学系统的要求，从而降低硬件的复杂度，提高数字PCR整体的可靠性和稳定性。
附图说明
图1为采用现有技术获得的腔室原始亮度分布示意图。
图2为本发明一实施例的腔室亮度不均匀校正方法流程图。
图3为生物芯片图像子图分布示意图。
图4为本发明一实施例的原始亮度数据坐标标准化流程图。
图5为本发明一实施例的亮度不均匀拟合流程图。
图6为本发明一实施例的亮度不均匀校正流程图。
图7为采用本发明一实施例的亮度不均匀校正方法获得的腔室亮度分布示意图。
图8为本发明一实施例的亮度不均匀校正装置结构示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在不做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
经发明人研究发现：由实际物理规律可知，CCD相机在拍摄图像过程中存在的腔室亮度不均匀的程度与腔室本身的亮度之间有强相关关系，若能表征出腔室亮度不均匀以及所述强相关关系，则能根据腔室亮度计算得到腔室的真实亮度，即校正亮度。
基于此，本发明一实施例中，在于提供一种腔室亮度不均匀校正方法，具体的，请参阅图2所示的本发明一实施例的腔室亮度不均匀校正方法流程图，本申请的腔室亮度不均匀校正方法，包括：
S101：读入腔室原始亮度数据，原始亮度数据包括腔室亮度值和腔室在图像中的坐标值；
在数字PCR阅读过程中通过CCD相机拍摄生物芯片图像，并通过算法分析出图像中所有腔室的亮度，该亮度为图像中腔室区域对应所有像素亮度的平均值，腔室亮度值和腔室在图像中的坐标值即为本发明方法需要读入的原始亮度数据。腔室原始亮度数据作为腔室亮度不均匀校正方法的处理对象。
更进一步的，所述读入腔室原始亮度数据为：将数字PCR分析得到的阳性腔室和阴性腔室亮度数据读入。在具体实施中，所校正的腔室亮度可以为FAM通道、CY5通道、ROX通道、HEX通道、AF700通道中的任意一个通道的亮度。可以理解的是，所校正的腔室亮度还可以为其他通道腔室的亮度，并不仅限于上述所列举的五种通道，此处不做赘述。
在具体实施中，可以采用多种算法分析获得腔室的原始亮度数据。在实际应用中，对图像进行霍夫变换计算出圆形腔室所在区域，然后统计腔室所在区域中所有像素的亮度均值和坐标均值即为腔室的原始亮度数据。也可以对图像进行二值化处理，标记出圆形腔室所在的区域，然后统计腔室所在区域中所有像素的亮度均值和坐标均值即为腔室的原始亮度数据。还可以采用神经网络对图像进行目标识别，识别出图像中腔室所在的区域，然后统计腔室所在区域中所有像素的亮度均值和坐标均值即为腔室的原始亮度数据。可以理解的是，还可以存在其他的算法分析得到腔室的原始亮度数据，此处不在赘述。
在具体实施中，可以采用多种不同的方法读入前期算法分析得到的原始亮度数据。在实际应用中，可以将原始亮度数据生成二维矩阵结构写入存储介质，然后读入该二维矩阵结构的数据，也可以由前期算法模块提供接口直接将腔室原始亮度数据读入。可以理解的是，还可以存在其他的读入原始亮度数据的方法，此处不在赘述。在实际应用中，可以采用上述具体实施例中任意一种方法读入原始亮度数据。
S102：原始亮度数据的坐标标准化，得到坐标标准化后的原始亮度数据；
数字PCR阅读过程中拍摄的被测物如生物芯片图像，需要拍摄n×m张子图，然后拼接成完整的生物芯片图像，称为完整图像，请参阅图3所示的生物芯片图像子图分布示意图，n×m张子图拼接成被测物的完整图像。因为亮度不均匀是由数字PCR阅读过程中CCD相机拍摄引入，所以亮度不均匀分布在各个子图中。
所述的原始亮度数据的坐标标准化包括腔室坐标变换。在一实施例中，腔室坐标变换为：依据原始亮度数据对应腔室在完整图像中的坐标，将原始亮度数据的坐标从完整图像的坐标转换到子图中的坐标。更具体的为：通过坐标变换将腔室亮度与坐标的关系由完整被测物大图转换到由CCD相机拍摄形成的子图区域内。其中腔室坐标变换公式如下：
ui，j＝xi，j-αk，l+n
vi，j＝yi，j-βk，l+n
其中，(xi，j，yi，j)表示索引号为(i，j)的腔室在完整大图中的坐标，(ui，j，vi，j)表示索引号为(i，j)的腔室进行坐标变换后在子图中的坐标，(αk，l，βk，l)表示索引号为(k，l)的子图在完整大图中的拼接坐标，n为自然数。
如上，根据腔室在完整大图中的位置坐标和腔室所在子图的拼接坐标进行坐标变换，将腔室亮度与腔室位置坐标之间的关系由完整大图转换到子图区域，得到标准化的腔室亮度数据。
也可以根据腔室在完整大图中的位置坐标和腔室所在子图中预设的一个腔室位置坐标进行坐标变换，将腔室亮度与腔室位置坐标之间的关系由完整大图转换到子图区域，得到标准化的腔室亮度数据。还可以根据腔室在完整大图中的位置坐标和腔室所在子图中特定腔室坐标的数学运算值进行坐标变换，将腔室亮度与腔室位置坐标之间的关系由完整大图转换到子图区域，得到标准化的腔室亮度数据。
请参阅图4所示的原始亮度数据坐标标准化流程图，所述的原始亮度数据的坐标标准化还包括剔除异常亮度。更具体的，剔除异常亮度为：腔室亮度值在腔室亮度均值±系数*亮度标准差的范围内的认为是正常的，不剔除；超出腔室亮度均值±系数*亮度标准差的范围是异常的，将其剔除。
经步骤S102后原始亮度数据的坐标由在大图中的坐标转化为在子图中的坐标，即将原始亮度数据的坐标标准化。
S103：原始亮度不均匀拟合，得到亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；
请参阅图5所示的亮度不均匀拟合流程图，其包括：计算拟合周期；计算拟合周期内标定值；判断拟合是否异常；若是则修复异常标定值；若否则进行曲线或曲面光滑。
在具体实施中，可以对所述腔室为同类腔室的标准化亮度数据，拟合出所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，也可以对所述腔室为不同类腔室的标准化亮度数据，拟合出所述不同类腔室亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面。
下面根据同类腔室的标准化亮度数据，进行拟合亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面进行说明。具体的：
统计所有子图中单行腔室个数的列表Ax或单列腔室个数的列表Ay，计算单行腔室个数列表或单列腔室个数列表的均值μx或μy，然后将所述均值乘以系数coef，得到行向或列向的拟合周期Tx或Ty，其中系数coef∈[3，8]。也即计算拟合周期为：根据子图中单行或单列腔室个数确定拟合周期。
当为同类腔室时，将单个拟合周期内的亮度值升序排列，并计算该序列的梯度值，选择一梯度值将对应拟合周期内的亮度值分成两类，分别计算两类腔室的亮度均值，作为拟合周期内的标定值。具体的，根据拟合周期Tx将坐标标准化后的亮度数据按照腔室的行向坐标的有序数列分成Nx个周期，根据拟合周期Ty将坐标标准化后的亮度数据按照腔室的列向坐标的有序数列分成Ny个周期。将每个周期内的亮度值进行有序排列(如亮度值升序排列)得到亮度有序数列，然后，采用如下公式剔除每个周期内的异常值，
Lb＝ω+asc*σ，
Ls＝ω-asc*σ，
其中，Lb为亮度上限值，Ls为亮度下限值，asc∈[2，6]，ω为单个周期内亮度均值，σ为单个周期内亮度均值的标准差。根据所述亮度有序数列计算亮度梯度数列，并在梯度最大值处将亮度数列分成第一部分和第二部分两部分，分别计算两个部分的亮度均值作为单个周期内的标定值。可以理解的是，还可以计算单个周期内亮度数列两部分的最大值或最小值等作为一个周期内的标定值，此处就不在赘述。当为不同类腔室时，分别计算各类腔室的亮度均值，并选择最大和最小的亮度均值作为拟合周期内的标定值，即为计算拟合周期内标定值。
采用二次线性回归检测标定值是否异常，即判断拟合是否异常，若出现异常，采用邻域值对异常标定值进行校正，即修复标定异常值。具体的，将标准化的亮度数据作为变量，对其进行线性回归分析运算，得到对应的标定值异常检测拟合曲线或曲面。根据所述拟合曲线或曲面计算值与所述对应周期内的标定值相减，得到差值数列，计算τi＝(δi-ε1)/σ1，其中δi为差值，ε1为差值数列均值，σ1为标准差，当τi＞3时，标定值异常，采用vi＝(vi-1+vi+1)/2重新计算，其中vi为当前标定值，vi-1，vi+1为当前标定值的邻域值。本发明实施例中采用的是线性回归运算，可以理解的是，还可以采用其他类型的线性回归运算，此处不在赘述，判断拟合是否异常。
对所述拟合周期内标定值进行光滑，得到亮度不均匀的拟合曲线或曲面。在一实施例中，采用如下高斯核函数对所述拟合周期内标定值进行光滑，得到拟合亮度不均匀的拟合曲线或曲面。
其中，x，y分别为横坐标和纵坐标；μ1，μ2分别为高斯模板的中心坐标。
本发明实施例中采用的是高斯光滑，可以理解的是，还可以采用其他类型的曲线光滑方法，此处不在赘述。
下面根据不同类腔室的标准化亮度数据，进行拟合所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面进行说明。
统计所有子图中单行腔室个数的列表Ax或单列腔室个数的列表Ay，计算单行腔室个数列表或单列腔室个数列表的均值μx或μy，然后将所述均值乘以系数coef，得到行向或列向的拟合周期Tx或Ty，其中系数coef∈[3，8]。根据拟合周期Tx将标准化的亮度数据按照腔室的行向坐标的有序数列分成Nx个周期。根据拟合周期Ty将标准化的亮度数据按照腔室的列向坐标的有序数列分成Ny个周期。
将所述单个周期内同类型腔室的亮度值进行有序排列，采用如下公式剔除单个周期内的异常值，
Lb＝ω+asc*σ，
Ls＝ω-asc*σ，
其中，Lb为亮度上限值，Ls为亮度下限值，asc∈[2，6]，ω为单个周期内亮度均值，σ为单个周期内亮度均值的标准差。计算同类型腔室的亮度均值作为单个周期内的标定值。可以理解的是，还可以计算同类型腔室的最大值或最小值等作为单个周期内的标定值，此处就不在赘述。
将同类型腔室的标准化亮度数据作为变量，对其进行线性回归分析运算，得到对应的标定值异常检测拟合曲线或曲面。根据所述拟合曲线或曲面计算值与所述对应周期内的标定值相减，得到差值数列，计算τi＝(δi-ε1)/σ1，其中δi为差值，ε1为差值数列均值，σ1为标准差，当τi＞3时，标定值异常，采用vi＝(vi-1+vi+1)/2重新计算，其中vi为当前标定值，vi-1，vi+1为当前标定值的邻域值。本发明实施例中采用的是线性回归运算，可以理解的是，还可以采用其他类型的线性回归运算，此处不在赘述。
如采用如下高斯核函数对所述标定值进行光滑，得到拟合亮度不均匀的拟合曲线或曲面。
其中，x，y分别为横坐标和纵坐标；μ1，μ2分别为高斯模板的中心坐标。
即为曲线光滑或曲面光滑。
如上所述，采用曲线或曲面拟合技术对亮度数据进行拟合，拟合出腔室亮度不均匀与腔室位置坐标之间的关系，而得到第一拟合曲线或曲面和第二拟合曲线或曲面。
具体的，上述的拟合曲线或曲面为线性函数。
S104：根据亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面对亮度不均匀校正。
根据拟合的亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，采用线性插值法对亮度不均匀进行校正，确定腔室所对应的新亮度值。
请参阅图6所示的亮度不均匀校正流程图，亮度不均匀校正过程包括：计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值；采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；检测扩展是否异常；如是则将拟合直线的斜率赋值为0，截距赋值为亮度均值；若否则采用线性插值对亮度进行校正。
具体的，计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值为：采用如下公式计算亮度不均匀基准值
其中，ci为系数，Vi为拟合曲线或曲面上的值。在一实施例中，较优的，用如下公式计算亮度不均匀基准值
Vb＝c1*Vmax+c2*Vmin
其中，c1，c2表示为系数，Vmax为拟合曲线或曲面的最大值，Vmin为拟合曲线或曲面的最小值。
具体的，采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面为：截取拟合曲线或曲面一截面的首部或尾部数据，采用最小二乘法对截取数据进行直线拟合得到拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的覆盖范围，达到对所有腔室的亮度校正。
具体的，检测扩展是否异常为：通过拟合直线的斜率，判断扩展是否异常。计算b＝s1*s2，其中s1，s2为直线的斜率。若b＜0，表示扩展异常，需要将拟合直线的斜率赋值为0，截距赋值为亮度均值。
具体的，采用线性插值对亮度进行校正为：采用如下公式计算校正后的亮度值
其中，Li，j，li，j分别为索引号(i，j)的腔室校正后的亮度值和原始亮度值，Vb1，Vb2为亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值，U1，U2为索引号(i，j)的腔室亮度在拟合曲线或曲面上对应的拟合值。
需要说明的是本发明还可以采用其它高阶插值方法，但是本发明的发明人发现采用其它高阶插值方法后亮度不均匀的校正效果提升有限，而计算开销却大幅增加，综合考虑本发明采用线性插值对亮度进行校正。
在具体实施中，可以对所述腔室为同类腔室的拟合曲线或曲面，确定腔室所对应的新亮度值，也可以对所述腔室为不同类腔室的拟合曲线或曲面，确定腔室所对应的新亮度值。
下面根据同类腔室的拟合曲线或曲面，确定腔室所对应的新亮度值进行说明。
在具体实施中，可以根据得到的拟合曲线或曲面，计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值。采用如下公式计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值Vb
其中，ci为系数，Vi为拟合曲线或曲面上的值。
在一实施例中，较优的，用如下公式计算亮度不均匀基准值Vb＝c1*Vmax+c2*Vmin
式中，c1+c2＝1，c1∈[0.6，0.8]，Vmax为拟合曲线或曲面的最大值，即将腔室坐标代入拟合曲线或曲面对应的函数后得到的最大值，Vmin为拟合曲线或曲面的最小值，即将腔室坐标代入拟合曲线或曲面对应的函数后得到的最小值。
在具体实施中，可以根据得到的拟合曲线或曲面，扩展该拟合曲线或曲面的适用范围即扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面。截取所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面一截面首段30％～50％片段的数据，采用最小二乘法对所述片段进行直线拟合，得到表示所述直线的参数(s1，i1)，(s2，i2)，其中(s1，i1)为第一拟合曲线或曲面扩展的直线斜率和截距，(s2，i2)为第二拟合曲线或曲面扩展的直线斜率和截距。可以理解的是，还可以采用其他类型的方法进行直线拟合，此处不在赘述。
将所述直线斜率s1和s2相乘，当乘积小于0时，表示拟合曲线或曲面扩展异常，需要根据截取片段内的数据量将s1或s2至0，对应的截距i1或i2赋值为第一部分亮度均值或第二部分亮度均值。
将腔室的位置坐标代入第一拟合曲线或曲面和第二拟合曲线或曲面，得到对应的拟合值U1，U2。采用如下公式进行线性插值计算，得到校正后的亮度值Li，j。
式中，Li，j，li，j分别为索引号为(i，j)的腔室校正后的亮度值和原始亮度值，Vb1，Vb2为所述亮度不均匀基准值。
下面根据不同类腔室的拟合曲线或曲面，确定腔室所对应的新亮度值进行说明。
在具体实施中，可以根据得到的拟合曲线或曲面，计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值。采用如下公式计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值Vb
其中，ci为系数，Vi为拟合曲线或曲面上的值。在一实施例中，较优的，用如下公式计算亮度不均匀基准值
Vb＝c1*Vmax+c2*Vmin式中，c1+c2＝1，c1∈[0.6，0.8]，Vmax为拟合曲线或曲面的最大值，即将腔室坐标代入拟合曲线或曲面对应函数后得到的最大值，Vmin为拟合曲线或曲面的最小值，即将腔室坐标代入拟合曲线或曲面对应函数后得到的最小值。
在具体实施中，可以根据得到的拟合曲线或曲面，扩展该拟合曲线或曲面的适用范围即扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面。截取所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面一截面的首段30％～50％片段的数据，采用最小二乘法对所述片段进行直线拟合，得到表示所述直线的参数(s1，i1)，(s2，i2)，其中(s1，i1)为第一类腔室拟合曲线或曲面扩展的直线斜率和截距，(s2，i2)为第二类腔室拟合曲线或曲面扩展的直线斜率和截距。第一类腔室为不同类腔室中亮度均值最大的类，第二类腔室为不同类腔室中亮度均值最小的类，第一类和第二类只是标签不代表腔室的类型特征。可以理解的是，还可以采用其他类型的方法进行直线拟合，此处不在赘述。
将所述直线斜率s1和s2相乘，当乘积小于0时，表示拟合曲线或曲面扩展异常，需要根据截取片段内的数据量将s1或s2至0，对应的截距i1或i2赋值为第一类腔室的亮度均值或第二类腔室的亮度均值。
将腔室的位置坐标代入第一类腔室的拟合曲线或曲面和第二类腔室的拟合曲线或曲面，得到对应的拟合值U1，U2。采用如下公式进行线性插值计算，得到校正后的亮度值Li，j。
本发明的腔室亮度不均匀校正方法还可包括S105：更新亮度数据。
更具体的为：采用计算得到的校正后的腔室亮度数据更新原始亮度数据。
在具体实施中，可以采用本发明方法对x方向或y方向以及先x方向后y方向或先y方向后x方向进行腔室亮度不均匀拟合，得到表征x方向或y方向腔室亮度不均匀的拟合曲线，然后根据所述拟合曲线进行腔室亮度不均匀校正得到腔室对应的新亮度值，也可以采用本发明方法对x方向和y方向同时进行腔室亮度不均匀拟合，得到表征x方向和y方向耦合的腔室亮度不均匀的拟合曲面，然后根据所述拟合曲面进行腔室亮度不均匀校正得到腔室对应的新亮度值。
在本发明实施例中，根据腔室亮度数据所对应的位置坐标进行坐标变换，得到标准化的亮度数据，然后拟合出所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，进而计算得到校正后的亮度值。根据校正后的腔室亮度值，可以清晰的区分阳性腔室和阴性腔室，提高阳性率的准确性，进而提升数字PCR检测结果的准确性，消除亮度不均匀带来的问题。并可提高数字PCR检测结果的准确性，如图7所示，其中的横坐标为点数，纵坐标为腔室的亮度值，通过对生物芯片中腔室的亮度不均匀进行校正，可使阳性腔室的亮度值在600至700之间，阴性腔室的亮度值在300至400之间，因此可以减弱数字PCR阅读过程中CCD相机拍摄图像引入的亮度不均匀对生物芯片信息读取的影响，使阳性腔室的亮度值均匀分布在亮度值1附近，阴性腔室的亮度值均匀分布在亮度值2附近。这样可以清晰的区分腔室的阴阳属性，准确的计算检测结果。可参阅表1给出的10组样本真实阳性率、未进行亮度不均匀校正的计算阳性率以及采用本发明的方法进行亮度不均匀校正后的计算阳性率的统计结果对比，由下表中数据可知进行亮度不均匀校正后的计算阳性率与未进行亮度不均匀校正时的计算阳性率相比更接近真实阳性率即进行亮度不均匀校正后计算阳性率的准确性得到提高。
注：表中r为样本真实阳性率，ro为未进行亮度不均匀校正时的阳性率，rp为进行亮度不均匀校正时的阳性率，
表示亮度不均匀校正后计算阳性率准确性提高的百分比。
本发明的腔室亮度不均匀校正方法还可提高数字PCR的可靠性和稳定性，采用本发明的亮度不均匀校正方法，可以降低对高性能CCD相机和复杂光学系统的要求，从而降低硬件的复杂度，提高数字PCR整体的可靠性和稳定性。
本发明的腔室亮度不均匀校正方法还可提高数字PCR检测结果的应用性，采用本发明的亮度不均匀校正方法后，数字PCR检测的不同通道的结果可以进行比较，分析不同通道中腔室亮度的分布特征，提高仪器检测结果的应用性。
本发明一实施例中，还提供了一种亮度不均匀校正装置，请参阅图8所述的亮度不均匀校正装置结构示意图，其包括：标准化单元，接收腔室原始亮度数据，用于对原始亮度数据的坐标标准化，得到坐标标准化的原始亮度数据；拟合单元，接收坐标标准化的原始亮度数据，用于根据坐标标准化的原始亮度数据，拟合出亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；校正单元，接收亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，用于根据所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，确定所述腔室对应的新亮度值。
其原理与技术效果与上述的腔室亮度不均匀校正方法相同，在此不再赘述。
更具体的，标准化单元将腔室原始亮度数据由在大图中的坐标转化为在子图中的坐标，得到标准化的亮度数据。
更具体的，亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面包括第一拟合曲线或曲面和第二拟合曲线或曲面。
本发明一实施例中，还提供了一种计算机可读存储介质，其上储存有计算机指令，所述计算机指令运行时执行本发明上述任一实施例中提供的腔室亮度不均匀校正方法的步骤，此处不在赘述。
本发明一实施例中，还提供了一种亮度不均匀校正装置，包括：存储器和处理器，所述存储器上存储有计算机指令，所述计算机指令运行时执行本发明上述任一实施例中提供的腔室亮度不均匀校正方法的步骤，此处不在赘述。
如上的描述以CCD相机拍摄为例，但也可通过其它方式获得图像。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1.一种腔室亮度不均匀校正方法，其特征在于，包括：
S101：读入腔室原始亮度数据，原始亮度数据包括腔室亮度值和腔室在图像中的坐标值；
S102：原始亮度数据的坐标标准化，得到坐标标准化后的原始亮度数据，其中所述的原始亮度数据的坐标标准化包括腔室坐标变换，腔室坐标变换为：依据原始亮度数据对应腔室在完整图像中的坐标，将原始亮度数据的坐标从完整图像的坐标转换到子图中的坐标，其中腔室坐标变换公式如下：
ui,j＝xi,j-αk,l+n
vi,j＝yi,j-βk,l+n
其中，(xi,j,yi,j)表示索引号为(i,j)的腔室在完整大图中的坐标，(ui,j,vi,j)表示索引号为(i,j)的腔室进行坐标变换后在子图中的坐标，(αk,l,βk,l)表示索引号为(k,l)的子图在完整大图中的拼接坐标，n为自然数；
S103：原始亮度不均匀拟合，得到亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，其中原始亮度不均匀拟合包括：计算拟合周期；计算拟合周期内标定值；判断拟合是否异常；若是则修复异常标定值；若否则进行曲线或曲面光滑，其中根据子图中单行或单列腔室个数确定拟合周期；
当为同类腔室时，将单个拟合周期内的亮度值升序排列，并计算单个拟合周期内的亮度值升序排列后形成的序列的梯度值，选择一梯度值将对应拟合周期内的亮度值分成两类，分别计算两类腔室的亮度均值，作为拟合周期内的标定值；
当为不同类腔室时，分别计算各类腔室的亮度均值，并选择最大和最小的亮度均值作为拟合周期内的标定值；
采用二次线性回归判断拟合是否异常；
采用邻域值对异常标定值进行校正；
S104：根据亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面对亮度不均匀校正，其中亮度不均匀校正过程包括：计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值；采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；检测扩展是否异常；如是则将拟合直线的斜率赋值为0，截距赋值为亮度均值；若否则采用线性插值对亮度进行校正，其中，
计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值的公式为：
其中，ci为系数，Vi为拟合曲线或曲面上的值；
采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面为：截取拟合曲线或曲面一方向的截面的首部或尾部数据，采用最小二乘法对截取数据进行直线拟合得到拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的覆盖范围；
检测扩展是否异常为：通过拟合直线的斜率，判断扩展是否异常；
计算校正后的亮度值的公式为：
其中，Li,j,li,j分别为索引号(i,j)的腔室校正后的亮度值和原始亮度值，Vb1,Vb2为亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值，U1,U2为索引号(i,j)的腔室亮度在拟合曲线或曲面上对应的拟合值。
2.根据权利要求1所述的腔室亮度不均匀校正方法，其特征在于，根据拟合的亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，采用线性插值法对亮度不均匀进行校正，确定腔室所对应的新亮度值。
3.一种亮度不均匀校正装置，其特征在于，包括：
标准化单元，接收腔室原始亮度数据，用于对原始亮度数据的坐标标准化，得到坐标标准化的原始亮度数据，其中所述的原始亮度数据的坐标标准化包括腔室坐标变换，腔室坐标变换为：依据原始亮度数据对应腔室在完整图像中的坐标，将原始亮度数据的坐标从完整图像的坐标转换到子图中的坐标，其中腔室坐标变换公式如下：
ui,j＝xi,j-αk,l+n
vi,j＝yi,j-βk,l+n
其中，(xi,j,yi,j)表示索引号为(i,j)的腔室在完整大图中的坐标，(ui,j,vi,j)表示索引号为(i,j)的腔室进行坐标变换后在子图中的坐标，(αk,l,βk,l)表示索引号为(k,l)的子图在完整大图中的拼接坐标，n为自然数；
拟合单元，接收坐标标准化的原始亮度数据，用于根据坐标标准化的原始亮度数据，拟合出亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，其中所述拟合单元被配置为执行原始亮度不均匀拟合，原始亮度不均匀拟合包括：计算拟合周期；计算拟合周期内标定值；判断拟合是否异常；若是则修复异常标定值；若否则进行曲线或曲面光滑，其中根据子图中单行或单列腔室个数确定拟合周期；
当为同类腔室时，将单个拟合周期内的亮度值升序排列，并计算单个拟合周期内的亮度值升序排列后形成的序列的梯度值，选择一梯度值将对应拟合周期内的亮度值分成两类，分别计算两类腔室的亮度均值，作为拟合周期内的标定值；
当为不同类腔室时，分别计算各类腔室的亮度均值，并选择最大和最小的亮度均值作为拟合周期内的标定值；
采用二次线性回归判断拟合是否异常；
采用邻域值对异常标定值进行校正；
校正单元，接收亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，用于根据所述亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面，确定所述腔室对应的新亮度值，其中所述校正单元被配置为执行亮度不均匀校正过程，亮度不均匀校正过程包括：计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值；采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面；检测扩展是否异常；如是则将拟合直线的斜率赋值为0，截距赋值为亮度均值；若否则采用线性插值对亮度进行校正，其中，
计算亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值的公式为：
其中，ci为系数，Vi为拟合曲线或曲面上的值；
采用最小二乘法拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面为：截取拟合曲线或曲面一方向的截面的首部或尾部数据，采用最小二乘法对截取数据进行直线拟合得到拟合直线，扩展亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的覆盖范围；
检测扩展是否异常为：通过拟合直线的斜率，判断扩展是否异常；
计算校正后的亮度值的公式为：
其中，Li,j,li,j分别为索引号(i,j)的腔室校正后的亮度值和原始亮度值，Vb1,Vb2为亮度不均匀对应的拟合曲线或曲面的基准值，U1,U2为索引号(i,j)的腔室亮度在拟合曲线或曲面上对应的拟合值。
4.一种亮度不均匀校正装置，其特征在于，包括：存储器和处理器，所述存储器上存储有计算机指令，所述计算机指令运行时执行权利要求1所述的腔室亮度不均匀校正方法。
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