CN113466459A - 靶向治疗后b细胞肿瘤的检测试剂及治疗靶标与相关应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向治疗后B细胞肿瘤的检测试剂及治疗靶标与相关应用。所述试剂组合物包括3组抗体，第一组抗体包括抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体；第二组抗体包括CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体；第三组抗体包括抗胞浆CD79a抗体。本发明的试剂组合物可应用于流式细胞术检测靶向治疗后B淋巴细胞肿瘤。本发明找到一个B靶向治疗后高效的B细胞设门标志抗体CD72，并有望作为继CD19之后另一个B细胞肿瘤的治疗新靶点。

Description

靶向治疗后B细胞肿瘤的检测试剂及治疗靶标与相关应用
技术领域
本发明涉及一种靶向治疗后B细胞肿瘤的检测试剂及治疗靶标与相关应用，具体而言，涉及一种用于靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测的试剂组合物、试剂盒、检测装置、治疗靶标及相关应用，属于血液病检测与治疗技术领域。
背景技术
急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukaemia，ALL）/淋巴母细胞淋巴瘤(lymphoblastic lymphoma，LBL)是一种常见急性白血病，其中80%-85%是B-ALL/LBL。尤其在儿童白血病中，急性淋巴细胞白血病是发病率最高的一种，占据几乎80%的儿童急性白血病，在成人中也占据急性白血病的30%以上。在没有靶向治疗的年代，微小残留病变（minimal residual disease，MRD）持续阳性和/或不良预后遗传学等这些预后不佳B-ALL/LBL，即便是异基因造血干细胞移植，依旧长期存活率只有20%-30%。近年来靶向治疗取得了进展，尤其是CD19-嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptors T cell，CAR-T）治疗B-ALL，以及CD3/CD19双靶点抗体药物治疗B-ALL，都在治疗难治/复发B-ALL中取得了90%以上的完全缓解率。虽然目前CAR-T和双靶点药物治疗方法以及其他相关靶向治疗B-ALL的方法单独使用时复发率高，很多医院采用的是2个月内桥接造血干细胞移植，但是众多研究表明，不论何种方法获得完全缓解，都可以取得与常规化疗获得完全缓解后桥接异基因移植一样的成功率和存活率，这就意味着，在靶向治疗之前，这些常规治疗不能取得完全缓解的B-ALL/LBL患者，异基因造血干细胞移植后五年存活率只有20%-30%，而采用靶向治疗后90%以上的患者可以获得缓解，桥接移植，五年存活率就提高到70%-80%，这将挽救众多B-ALL/LBL患者生命。另一个成功的CAR-T治疗病种是B细胞淋巴瘤，也就是成熟B细胞肿瘤，绝大多数表达CD19，因此CD19-CAR-T治疗也是B细胞淋巴瘤的重大突破性进展。
靶向治疗由于可以重复使用，或者CD19-CAR-T失败之后采用CD22-CAR-T或者两者联合CAR-T等，因此MRD检测至关重要。研究表明，靶向治疗后、桥接移植前、以及桥接移植后，每一个时间点的MRD以及MRD检测中CD19的评价，或者其他靶点的检测都非常重要。流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测MRD是目前临床最常用、最普及、性价比最高的检测方法。尤其是CAR-T和靶向药物治疗前的靶点选择以及治疗后疗效评估和下一步方案的确定，对于采用合适的靶向治疗方法，都有重要的临床意义。
但是CD19-CAR-T之后有三个重要的问题：①13%-68%的病例复发时为CD19减弱或者阴性复发，此时FCM检测MRD的难度增加，因为100%的临床FCM实验室都是使用CD19/SSC设置B细胞门，进行MRD检测，这就意味着13%-68%的病例有漏诊的风险。②常规MRD检测方案只采用CD19一个B系标志设门，并不涉及CD19阴性复发后其他靶点筛查，这对于CD19-复发的病例缺乏指导意义。③此外，当前MRD检测技术难度大，人工参与度高，不利于流式细胞术的发展，人工智能是MRD检测技术下一步发展的方向。
现有技术中，有学者进行过研究性的探索，包括华盛顿大学的研究使用CD22联合CD24+/CD66c-设门B细胞在CAR-T细胞输注治疗后检测MRD，但是意义有限。CN112552407A公开了一种采用CD19和胞浆（cytoplasmatic，c）CD79a双B系标志检测MRD、多标志组合设门的方法，该方法一定程度上可以有效设门选出CD19-的B细胞和CD19+的B细胞，使其覆盖最完整的不成熟B细胞群乃至B细胞群，降低漏诊概率。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测用试剂组合物，以更高效地进行靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测。
本发明的另一目的在于提供一种所述靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测用试剂组合物的相关应用。
本发明的另一目的在于提供用于流式检测靶向治疗后B细胞肿瘤的装置。
本发明的另一目的在于提供一种新的治疗B细胞肿瘤的靶标及其相关应用。
本发明的一个方面提供了一种试剂组合物，该试剂组合物包括第一组抗体、第二组抗体、第三组抗体，其中：
第一组抗体包括：抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体；
第二组抗体包括：CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体；
第三组抗体包括：抗胞浆CD79a抗体；
所述试剂组合物为能用于流式细胞术检测靶向治疗后B细胞肿瘤的组合物，应用时使用2管并行的方案，其中第二组抗体、第三组抗体用于同一管样本。
本发明的试剂组合物可应用于靶向治疗后B细胞肿瘤MRD的流式检测，主要为B系急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤，尤其是CD19和/或CD22甚至BAFFR等更多B细胞标志物靶向治疗后、这些B细胞标志可能减弱或者丢失的病例，可以有效设门选出B细胞，其中包括CD19-的B细胞和CD19+的B细胞。具体应用时，使用2管并行的方案，每管都使用CD19和CD24双标志或者CD19、cCD79a和CD72三标志叠加进行B细胞门检测，同时检测某一泛B标志的丢失情况与表达情况，CD10、CD34、CD20、CD38、CD45五参数或者联合CD81六参数进行B细胞表型分析。使用本发明的试剂组合为进行流式检测，可以实现：尽最大可能覆盖最完整的不成熟B细胞群乃至B细胞群，降低漏诊概率，尤其是针对CD19、CD22、BAFFR等B细胞标志靶向治疗后随访病例或者这些标志阴性或者弱表达的原发病例。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂组合物中，各抗体均为单克隆抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂组合物中，各抗体均为荧光素标记的抗体。优选地，第一组抗体中，抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421、V500。第二组抗体中，抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy7、BV421、V500。第三组抗体中，抗cCD79a抗体的荧光素标记为APC。本发明中通过对不同抗体搭配特定的荧光素，可以使得本发明的试剂组合物应用于靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测时，各通道的所有荧光素都能达到优异的染色效果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂组合物中，各抗体组分均可商购获得。各抗体应符合相关行业标准要求。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂组合物中，第一组抗体为抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体按照5：5：5：3：2：3：3：3的体积比混合（在效价基本相当的情况下）的混合物；
第二组抗体为抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体按照5：5：5：3：3：3：3的体积比混合（在效价基本相当的情况下）的混合物。
本发明的另一方面提供了一种试剂盒，其包括第一容器、第二容器和第三容器，各容器分别容置本发明的试剂组合物中的第一组抗体、第二组抗体或第三组抗体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒还可包括：溶血素、破膜剂、缓冲液、与流式细胞仪配套使用的流式管中的一种或多种。这些试剂和耗材均可商购获得。其中所述破膜剂优选为包括A液、B液的破膜剂。各试剂材料可分别容置于不同的容器中。
本发明的试剂盒可用于靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测。
本发明的另一方面还提供了所述的试剂组合物在制备用于检测靶向治疗后B细胞肿瘤的流式细胞上机样品中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述制备用于检测靶向治疗后B细胞肿瘤的流式细胞上机样品的过程包括步骤：
（1）将待测样本分别加入到甲管、乙管二个流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×106/管-1×107/管；所述待测样本为骨髓或外周血；
（2）向步骤（1）处理得到的甲管中加入本发明所述的试剂组合物中的第一组抗体，向步骤（1）处理得到的乙管中加入本发明所述的试剂组合物中的第二组抗体，各流式管室温避光孵育；
（3）向步骤（2）孵育后的乙管流式管中加入破膜剂A液，继续室温避光孵育；
（4）向步骤（2）孵育后的甲管流式管中加入1×溶血素，向步骤（3）孵育后的乙管流式管中加入1×溶血素，继续室温避光孵育；
（5）将步骤（4）孵育后的各流式管离心后去上清；
（6）向步骤（5）去上清后的乙管中加入破膜剂B液和本发明所述的试剂组合物中的第三组抗体，室温避光孵育；
（7）向步骤（5）去上清后的甲管以及步骤（6）孵育后的乙管流式管中，分别加入PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用PBS缓冲液重悬细胞，即得到流式细胞上机样品。
本发明中，对操作步骤的描述，除非特别注明或是从上下文的表述能明显确定存在先后关系的之外，描述的先后顺序并不用于限定这些步骤实际操作的先后顺序。
根据本发明的具体实施方案，除本发明的试剂组合物外，其余各试剂的用量可参照本领域现有技术的常规用量或是按照商家的推荐剂量。
根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂组合物，第一组抗体的加入量为15-58μl/管，第二组抗体的加入量为14-54μl/管，第三组抗体的加入量为2-5μl/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（1）中，每管样本加入量体积不超过160μl（如果患者外周血细胞量少，根据需要可先加入体积超过160μl，离心去上清浓缩）。
根据本发明的具体实施方案，步骤（2）中，孵育时间可为10-30分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（3）中，孵育时间可为5-20分钟。破膜剂A液的加入量按照商家的推荐剂量即可，通常为100μl/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（4）中，孵育时间可为5-30分钟。1×溶血素的加入量为2-3ml/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（5）中，通常离心条件可为1000-2000rpm（或300-450g）离心5分钟。
根据本发明的具体实施方案，步骤（6）中，需孵育10-30分钟左右。破膜剂B液的加入量按照商家的推荐剂量即可，通常为50μl/管。
根据本发明的具体实施方案，步骤（7）中，洗涤用PBS缓冲液的加入量为2-3ml/管。所述离心条件可为1000-2000rpm（或300-450g）离心5分钟。重悬用PBS缓冲液的加入量为0.5-1ml/管。
本发明的另一方面提供了一种用于流式检测靶向治疗后B细胞肿瘤的装置，该装置包括检测单元和分析单元，其中：
所述检测单元包括用于通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的试剂材料，用于获得样本的检测结果；所述试剂材料包括本发明所述的试剂组合物；
所述分析单元用于分析检测单元的检测结果。
根据本发明的具体实施方案，本发明的用于流式检测靶向治疗后B细胞肿瘤的装置，用于流式检测靶向治疗后B细胞肿瘤时，其中：
通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：
利用本发明所述的试剂组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品（具体处理过程可参照前述记载）；
进行流式细胞上机检测。其中，建议获取至少30万、优选100万细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明在进行靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测分析时，甲管使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81两两组合分析B细胞门内正常各阶段B细胞表达；乙管使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34两两组合分析B细胞门内正常各阶段B细胞表达；并且，采用多维度B细胞分析法，使用任一B细胞标志阳性的多参数多维度设门方法设置B细胞门，并分别使用六参数六维雷达图和五参数五维雷达图分别分析B细胞的发育模式表达情况，调整各参数的角度让不同阶段发育B细胞清楚分布在不同区域，分析正常对照管时，将微小残留病变出现概率最高的区域空出。同法分析患者标本，找出与正常不同的细胞。根据本发明的具体实施方案，本发明用于靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测时，其中通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：
其中流式细胞上机检测时甲管按照以下方式设门：设置去黏连细胞门P1，P1门内设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；使用B细胞标志CD19和CD24分别组合SSC设门检测CD19+B和CD24+B细胞；P2门内使用CD19、CD24以及SSC进行三参数三维设门，圈出CD19+和/或CD24+B细胞门B1；B1门内使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81六维设门，使B细胞按照分化阶段分布在不同区域；
其中流式细胞上机检测时乙管按照以下方式设门：依次设置去黏连细胞门P1、活细胞门P2；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；使用B细胞标志CD19、CD72和胞浆CD79a分别组合SSC设置CD19+B、CD72+B和cCD79a+B细胞门；P2门内，使用CD19、cCD79a、CD72、SSC进行四参数四维设门，圈出任一标志阳性的细胞门B2，并且使用cCD79a、CD19、CD72进行三参数三维设门，分别圈出CD19-细胞门、CD72-细胞门；B2门内使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34五维设门，使B细胞按照分化阶段分布在不同区域。
更具体而言，使用多参数多维度分析时，可以0点方向为0度，顺时针一周360度顺序分别定义各个坐标轴的角度时，需要注意两点：①在设置B细胞门时，注意设置的角度：因为正常B细胞同时表达甲管的CD24和CD19，乙管的CD19、CD72、cCD79a，所以如果是甲管两个标志180度角或者乙管三个标志分散在间隔120度角的位置，这样会由于均表达而彼此抵消，导致位于中心附近；最多因为不同荧光素标记的标志强度不同，而观察到表达减弱或者丢失造成与正常的位移。本发明涉及的4个B细胞标志表达的差异，正常情况下，CD19和cCD79a表达范围基本一致，除了见于B细胞，还见于正常浆细胞，CD24、CD72基本一致，只限于B细胞，不表达于浆细胞，因此本发明中，甲管为CD19、CD24、SSC三参数成合适的角度显示，既能够排除浆细胞干扰，又能够做到通过两个标志表达的并集（任一个标志表达）选中B细胞门，同时还能观察到靶向治疗前或者治疗后某标志是否因为减弱或者丢失而应该选择合适的靶向治疗方法；同样在乙管检测时，CD19、CD72、cCD79a、SSC四参数成合适的角度显示，既能够排除浆细胞干扰，又能够做到通过三个标志表达的并集（任一个标志表达）选中B细胞门，同时还能观察到靶向治疗前或者治疗后CD19、CD72标志是否因为减弱或者丢失而应该选择合适的靶向治疗方法。②在B细胞门内，观察B细胞免疫表型时，设置多维图，需要根据正常B细胞发育过程中，每个标志的表达特点，选择顺序与角度，防止阴性阳性互相抵消降低多维软件的效果，尽量将正常细胞按照第一阶段（T1：CD34+/CD10++/CD38+/CD81++/CD20-/CD45+）、第二阶段（T2：CD34-/CD10+/CD38+/CD81+++/CD20异质性/CD45++）、第三阶段（T3：CD34-/CD10-/CD38-/CD81+/CD20++/CD45+++）顺序排列，并且从统计学上，B-ALL的特点是CD34+/CD38dim/CD10bri/CD81dim/CD20-/CD45dim，所以尽量将MRD容易出现的区域空出来，这样出现任何一种异常，甚至常规二维点图两个参数组合时不易发现的异常，都可以通过叠加效果予以放大，显示出多维的叠加效果。在多标志多维合适角度的组合设门内，将所显示的B细胞发育模式与正常细胞进行比较，高灵敏度高效地找出肿瘤细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，按照以下方式设门：
其中流式细胞上机检测时甲管按照以下方式设门：使用FSC-A/FSC-H设置去黏连细胞门P1，FSC/SSC设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内，分别使用CD19和CD24组合SSC设置CD19+或者CD24+B细胞门；多维度方法使用CD19、CD24、SSC三参数三维度组合设置B1细胞门观察B细胞：鉴于CD24在粒细胞表达，因此不适合作为CAR-T或者其他靶向治疗靶点，所以甲管的B细胞门设置相对简单。只需要利用两个参数叠加的优势，圈出任一标志阳性的B细胞即可。做多维图片分析时，为了提高检测灵敏度，防止弱荧光素或者肿瘤细胞表达过弱以及仪器条件设置过低造成的设门不清楚的影响，可将坐标轴的中心位于左下位置，SSC为纵轴，CD19和CD24成小角度横轴，清楚显示任一标志阳性细胞群，圈出设置为B细胞门，同时又可以清楚显示是否存在CD19阴性细胞；B细胞门内使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81六维雷达图显示各阶段B细胞，调整角度，让B细胞按照分化阶段分布在不同区域。如：CD45位于正上位置（大约345-15度左右），CD20位于右上位置（大约15-45度左右），CD81位于左上位置（大约300-330度左右），CD38位于左下（210-240度左右），CD34位于右下位置（大约120-150度），CD10位于正下方（165-195度左右），因此可以使第三阶段成熟B细胞（T3）在上方，第一阶段最早期的原始细胞（T1）在正下方，中部偏左为从弱到强的中间阶段细胞（T2），并且因为多维的关系，将平时融合在一起的细胞分散开，增加检测灵敏度。浆细胞位于左下，右下为空档区域。
其中流式细胞上机检测时乙管按照以下方式设门：依次设置去黏连细胞门P1、活细胞门P2；然后P2门内，使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；P2门内，常规方法使用使用CD19、CD72和胞浆CD79a分别组合SSC设置B细胞门，多维度分析法使用SSC与胞浆CD79a、CD19、CD72四参数四维雷达图设置B2细胞门，为了尽可能灵敏地检测B细胞，将坐标轴的中心位于左下位置，SSC为纵轴，CD19、CD72和cCD79a成小角度横轴，清楚显示任一标志阳性细胞群，圈出设置为B细胞门，同时又可以清楚显示是否存在CD19或者CD72阴性细胞群。此时注意，因为CD19、CD72、cCD79a本身在细胞表面的表达强度不同，加上使用的荧光素不同，而且三标志叠加会让表达增强，所以为了提高灵敏度，根据表达强度的差异，让三个标志的扩大倍数（每个标志的坐标轴终点距离原点的距离）与表达强度呈反比，即表达强度最大的CD72终点最接近原点。B细胞门内，使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34五维雷达图显示各阶段B细胞，调整角度，让B细胞按照分化阶段分布在不同区域。如CD45位于左上位置（大约315-345度左右），CD20位于右上位置（大约30-60度左右），CD38位于左下（210-240度左右），CD34位于右下位置（大约120-150度），CD10位于正下方（165-195度左右），因此可以使第三阶段成熟B细胞在上方，第一阶段最早期的原始细胞在正下方，中部偏左为从弱到强的中间阶段细胞，并且因为多维的关系，将平时融合在一起的细胞分散开，增加检测灵敏度。浆细胞位于左下，右下为空档区域；P2门内，使用cCD79a、CD19、CD72三个抗体三维雷达图设门，可评价CD19和CD72在肿瘤细胞上的表达情况以及选择合适的靶向治疗方案。调整角度，使cCD79a这个标志居中0度位置，CD72和CD19分别小角度位于两边（如CD19在315-345度，CD72在15-45度，左右可以互换），并且为了提高检测灵敏度，防止弱荧光素或者肿瘤细胞表达过弱以及仪器条件设置过低造成的设门不清楚的影响，可将坐标轴横轴放在最下方，分别圈出cCD79a+/CD72+/CD19-细胞、cCD79a+/CD72-/CD19+细胞。正常情况下cCD79a+/CD72+/CD19-细胞比例极低，cCD79a+/CD72-/CD19+细胞为浆细胞，肿瘤时候进行B细胞发育表达模式分析予以确定，从而得出肿瘤细胞是否表达CD19和/或CD72，从而为进一步靶向治疗选择合适的方案。
如果出现与正常发育模式不同，可疑为恶性，排除其他因素影响后诊断MRD阳性。
根据本发明的另一方面，本发明在研究中还发现了CD72不仅可以作为本发明的靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检的高效的B细胞设门标志，还有望作为恶性肿瘤特别是B细胞肿瘤的治疗新靶点。在本案发明人从2020年10月到2021年8月检测的多例样本中，经过大量研究和反复检测分析，发现CD72这个灵敏度、特异性、表达强度都不亚于CD19的标志，既可以作为靶向治疗后设门标志，还有希望成为CD19之后恶性肿瘤特别是B细胞肿瘤的突破性靶点。本发明的研究发现，CD72在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中的阳性率97.73%，并且CD72特异性比CD19好，在正常和恶性浆细胞均不表达。CD72在其他疾病表达率，B系成熟淋巴细胞肿瘤100%（包括伯基特淋巴瘤(burkitt)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘带淋巴瘤(MZL)、小细胞淋巴瘤(SLL)），T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)为14.29%，混合表型急性白血病(MPAL)为40%，急性髓系白血病(AML)为10.85%。因此，CD72可以作为B细胞急性淋巴细胞白血病、B系成熟淋巴细胞肿瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病、混合表型急性白血病、急性髓系白血病等恶性肿瘤的治疗靶点，用于筛选或制备治疗这些恶性肿瘤的药物。CD72可以单独作为靶标，也可以联合CD19和/或CD22、BAFFR等其他标志作为靶标。所述的恶性肿瘤可以是未经靶向治疗的肿瘤，也可以是靶向治疗后（例如，CD19、CD22、BAFFR和/或本发明的CD72等靶向治疗后）复发肿瘤。本发明以CD72为靶标治疗（包括辅助治疗）所述恶性肿瘤，可作为CD19-CAR-T或者靶向治疗后CD19弱表达或者丢失的B-ALL和B细胞淋巴瘤的替代方法，特别是对于CD19和/或CD22甚至BAFFR等更多B细胞标志物靶向治疗后、这些B细胞标志可能减弱或者丢失的病例具有重要意义。
从而，本发明还提供了CD72作为靶标在筛选和/或制备用于治疗恶性肿瘤的药物中的应用，其中，所述恶性肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病、B系成熟淋巴细胞肿瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病、混合表型急性白血病或急性髓系白血病。具体地，所述CD72为胞膜蛋白CD72，优选为个体的骨髓或外周血的胞膜蛋白CD72。
根据本发明的具体实施方案，CD72作为靶标用于筛选和/或制备用于治疗B细胞肿瘤的药物的应用中，所述B系成熟淋巴细胞肿瘤包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤或小细胞淋巴瘤。
根据本发明的具体实施方案，CD72作为靶标用于筛选和/或制备用于治疗恶性肿瘤的药物的应用中，CD72是单独作为靶标，或是联合CD19、CD22和/或BAFFR等其他标志作为靶标。
根据本发明的具体实施方案，CD72作为靶标用于筛选和/或制备用于治疗恶性肿瘤的药物的应用中，所述的恶性肿瘤是未经靶向治疗的肿瘤，或是靶向治疗后（例如，CD19、CD22、BAFFR和/或本发明的CD72等靶向治疗后）复发肿瘤。
在一些更具体实施方案中，所述恶性肿瘤为未经靶向治疗的B系成熟淋巴细胞肿瘤。在另一些更具体实施方案中，所述恶性肿瘤为靶向治疗后复发的B系成熟淋巴细胞肿瘤。在另一些更具体实施方案中，所述恶性肿瘤为未经靶向治疗的CD72阳性的B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、混合表型急性白血病或急性髓系白血病。在另一些更具体实施方案中，所述恶性肿瘤为靶向治疗后复发的CD72阳性的B细胞急性淋巴细胞白血病、T细胞急性淋巴细胞白血病、混合表型急性白血病或急性髓系白血病。
在一些更具体实施方案中，所述恶性肿瘤为靶向治疗后CD19、CD22和/或BAFFR标志减弱或者丢失的肿瘤。对于这类肿瘤患者，本发提供了CD72作为有效靶点。
综上所述，本发明提供了一种靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测试剂组合物及应用。本发明优势在于：①最大限度地防止了因为原发或者靶向治疗后B细胞标志丢失或者表达减弱而造成漏诊；②同时进行CD19、cCD79a、CD72的三参数三维度B细胞标志分析，在检测MRD的同时，还能准确评估有希望作为B系肿瘤靶向治疗靶点的B系表达标志，为患者选择合适的靶向治疗提供实验依据；③多参数多维度设B细胞门和分析各阶段B细胞表达，化繁为简，将几十个繁琐的图片集中到几张图片上，提高效率，降低漏诊率，既适用于目前人工分析，也为FCM软件人工智能的发展提供雏形；④可最大限度地保证该发明的临床实用性，目前临床覆盖率最高的机型是8色流式细胞仪，而检测B-ALL MRD的组合方案中，CD45/CD10/CD38/CD20/CD34观察MRD可以覆盖80-95%病例，CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81可以覆盖90-97%病例，本发明的方法可以将灵敏度和特异性提高到接近100%。⑤提供了一个B靶向治疗后高效的B细胞设门标志抗体CD72，并有望作为继CD19之后另一个B细胞肿瘤的治疗新靶点。
附图说明
图1A至图1D、图2显示本发明一具体实施方案中同一个正常骨髓标本流式细胞术设门分析结果。其中：
图1A-图1D均为正常骨髓标本，分别为CD19/SSC设门甲乙管共同分析、CD24/SSC设门甲管分析、CD72/SSC设门乙管分析、cCD79a/SSC设门乙管分析，然后观察各B细胞标志设置的B细胞门内，CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81或者CD45/CD10/CD38/CD20/CD34两两组合形成的二维点图。
图2：与图1A至图1D所示同一正常骨髓标本，甲乙管共同进行多参数多维度分析。
图3A至图3D、图4显示本发明一具体实施方案中同一个CD19 CAR-T治疗后MRD+的B-ALL患者骨髓标本流式细胞术设门分析结果。其中：
图3A-图3D：一例CD19 CAR-T治疗后MRD+的B-ALL患者骨髓标本，分别为CD19/SSC设门甲乙管共同分析、CD24/SSC设门甲管分析、CD72/SSC设门乙管分析、cCD79a/SSC设门乙管分析，然后观察各B细胞标志设置的B细胞门内，CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81或者CD45/CD10/CD38/CD20/CD34两两组合形成的二维点图。
图4：与图3A至图3D所示同一例CD19 CAR-T治疗后MRD+的B-ALL患者骨髓标本，多参数多维度设门甲乙管共同分析。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1 试剂的配制
本实施例使用的抗体组合为，
第一组抗体为：抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体，各抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421、V500；取以上八种单克隆抗体试剂按体积比5：5：5：3：2：3：3：3混合装于第一容器中。
第二组抗体为，抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体，各抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy7、BV421、V500；取以上七种单克隆抗体试剂按体积比5：5：5：3：3：3：3混合装于第二容器中。
第三组抗体中，胞浆CD79a-APC，装于第三容器中；
本实施例中的抗体为可商购获得，其中，cCD79a-APC为四正柏公司产品，其余荧光素直接标记抗体均为美国Becton Dickinson公司产品。
任选再配溶血素装于第四容器中，破膜剂A液装于第五容器中，破膜剂B液装于第六容器中，PBS缓冲液装于第七容器中，溶血素、破膜剂、PBS缓冲液为可商购获得，其中，溶血素、破膜剂均为美国Becton Dickinson公司产品，PBS缓冲液为Beckman Coulter公司产品。
实施例2 标本的处理
按照细胞计数结果，将肝素或EDTA抗凝的骨髓或外周血样本，加入到流式管甲管中，保证加入的细胞量约为2×106个，再按表1向流式管中加入29μl不同荧光素标记的八种胞膜单克隆抗体试剂，与细胞悬液充分混匀后常温避光孵育15分钟，加入3ml 1×溶血素，避光孵育10分钟裂解红细胞，1500rpm离心5分钟去上清后加入3ml PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用0.5ml PBS缓冲液重悬细胞，即为处理好的标本，可供上机检测。
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按照细胞计数结果，将肝素或EDTA抗凝的骨髓或外周血样本，加入到流式管乙管中，保证加入的细胞量约为2×106个，再按表1向流式管中加入27μl不同荧光素标记的七种胞膜单克隆抗体试剂，与细胞悬液充分混匀后常温避光孵育15分钟，加入100μl A液，室温避光孵育5分钟，加入3ml 1×溶血素，避光孵育10分钟裂解红细胞，1500rpm离心5分钟去上清后加入50μl B液和2μl胞浆单克隆抗体试剂cCD79a-APC，室温避光孵育15分钟，最后加入3ml PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用0.5ml PBS缓冲液重悬细胞，即为处理好的标本，可供上机检测。
实施例3 标本的检测
将按照实施例2的方法处理好的标本，在美国Becton Dickinson公司3激光8色FACS Canto II或者类似机型流式细胞仪上机检测，优选获取每管100万细胞（建议至少30万）后，使用diva 2.8软件以及kaluza等其他软件分析数据。
其中，流式细胞上机检测时按照以下方式设门：
①固定设门：依次使用FSC-A/H设置去除黏连细胞门P1、FSC/SSC设置活细胞门P2。P2门内，CD45/SSC设置主要血细胞门；②甲管使用CD19和CD24分别组合SSC设置B细胞门，乙管使用CD19、CD72、cCD79a分别组合SSC设置B细胞门；③多维参数设置B细胞门：甲管使用CD19和CD24组合SSC设置三参数三维B细胞门B1，乙管使用CD19、CD72、cCD79a组合SSC设置四参数四维B细胞门B2，以及CD19、CD72、cCD79a设置三参数三维B细胞门设置CD19-B细胞门和CD72阴性B细胞门；④甲管使用CD38/CD34/CD10/CD20/CD81/CD45、乙管使用CD38/CD34/CD10/CD20/CD45分别两两组合，显示各个B细胞门内细胞的表达情况；⑤多维度分析法：B1细胞门内，甲管使用CD38/CD34/CD10/CD20/CD81/CD45设置六参数六维图观察B细胞发育；B2细胞门内，乙管使用CD38/CD34/CD10/CD20/CD45设置五参数五维图观察B细胞发育；如果CD72-或者CD19-B细胞，同时分析这些细胞群的五参数五维图。
由于正常骨髓中有比例不定的正常增生的B祖细胞，这些增生的早期细胞在化疗后或者受到其他因素刺激会比例明显升高，干扰MRD的判断（图1A至图1D、图2）。
本发明的标志组合，可以精确锁定目的细胞。
正常CD19阴性B细胞的表达也与常见的CD19阳性B细胞不同，这群细胞多为最早期阶段的B祖细胞，表现为CD10表达减弱，SSC偏大，极易误诊为ALL-B MRD（图1B-图1D）。这群细胞正常情况下也存在，但是因为大多数病例比例极低，加上现有技术仅使用CD19设门，所以被忽视。本发明的多标志组合设置B细胞门方法，以及多参数多维度图片分析法可使得这群细胞变得明显。
本实施例中，首先选择20例正常骨髓标本进行测试，所有的正常骨髓B细胞虽然比例不同，各分化阶段B细胞占比有差别，但是抗原出现时间、表达强度及两两组合都成规律性的分化模式（图1A至图1D、图2），分为3个阶段，有的会出现CD19阴性B细胞。同时进行五维、六维软件分析，可以起到叠加效果从而增强灵敏度，一张图显示正常B细胞五参数或者六参数的图片。以此为依据，肿瘤细胞在各种抗原及抗原组合表达模式上，都会与正常细胞出现或多或少差异，据此差异判断为MRD阳性，恶性细胞比例超过有核细胞5%认为复发。
本实施例提供正常和B-ALL CD19-CAR-T后复发各一例作为示例。图1A至图1D、图2为正常标本，①常规设置去粘连细胞门P1、活细胞门P2、CD45/SSC设血细胞门；②P2门内，甲管使用CD19、CD24分别组合SSC设置B细胞门，乙管使用CD19、CD72、cCD79a分别组合SSC设置各自的B细胞门，分别分析B细胞门内，甲管CD38/CD34/CD10/CD20/CD81/CD45两两组合、乙管CD38/CD34/CD10/CD20/CD45两两组合的二维点图，显示正常B细胞从早期到成熟阶段的发育表达模式；③使用多维参数设置B细胞门：甲管使用CD19和CD24组合SSC设置三参数三维B细胞门B1，乙管使用CD19、CD72、cCD79a组合SSC设置四参数四维B细胞门B2，以及CD19、CD72、cCD79a设置三参数三维B细胞门设置CD19-B细胞门和CD72阴性B细胞门；④多维度分析：B1细胞门内，甲管使用CD38/CD34/CD10/CD20/CD81/CD45设置六参数六维图观察B细胞发育；B2细胞门内，乙管使用CD38/CD34/CD10/CD20/CD45设置五参数五维图观察B细胞发育；为了清楚显示B细胞参数的关系，乙管B2门内，使用乙管使用CD19、CD72、cCD79a设置三参数三维B细胞门，观察CD72-或者CD19-B细胞，同时分析这些细胞群的五参数五维图。
具体而言，图1A-图1D均为正常骨髓标本，分别为CD19/SSC设门甲乙管共同分析、CD24/SSC设门甲管分析、CD72/SSC设门乙管分析、cCD79a/SSC设门乙管分析，然后观察各B细胞标志设置的B细胞门内，CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81或者CD45/CD10/CD38/CD20/CD34两两组合形成的二维点图，观察各个阶段B细胞（从最早期的CD34+CD10++的T1阶段，CD34-CD10+的T2阶段，到CD34-CD10-的T3阶段）正常发育表达模式。CD72和CD24只见于B细胞，浆细胞不表达，CD19和cCD79a正常B细胞和浆细胞都表达。CD19设门和cCD79a设门看到正常标本中存在少量CD72阴性细胞，但是都是浆细胞或者CD20++的成熟B细胞，所以不影响B-ALL MRD检测和作为CAR-T治疗B-ALL的靶点。
具体而言，图2：与图1A至图1D同一正常骨髓标本，甲乙管共同进行多参数多维度分析。甲管分析：常规设置去黏连门P1、活细胞门P2门以后，甲管P2门内CD19、CD24组合SSC设置三参数三维雷达图设置B1细胞门。B1细胞门内，使用CD34/CD10二维点图将正常B细胞分成T1（CD34+CD10++）、T2（CD34-CD10+）、T3（CD34-CD10-）三个不同成熟阶段细胞，CD38/CD10/CD34/CD20/CD45/CD81六参数六维雷达图观察正常B细胞发育过程，调整角度，让正常B细胞在左边从下到上依次为T1、T2、T3阶段，右边空出来为MRD高频出现的区域。乙管分析：常规设置去黏连门P1、活细胞门P2门：P2门内CD19、CD72、cCD79a组合SSC设置四参数四维雷达图设置B2细胞门。B2细胞门内，CD38/CD10/CD34/CD20/CD45五参数五维雷达图观察正常B细胞发育过程。与甲管一样，调整角度，让正常B细胞在左边从下到上依次为T1、T2、T3阶段，右边空出来为MRD高频出现的区域。B2门内，使用CD19、CD72、cCD79a设置三参数三维雷达图，检测CD19-或者CD72-细胞群。少量CD72-细胞群为浆细胞或者CD20++成熟B细胞。少量CD19-细胞群为早期阶段细胞。图1A-图1D几十个复杂的二维点图片，图2仅仅9-12张图片就清楚显示出来各自关系。
图3A至图3D、图4显示本发明一具体实施方案中同一个CD19 CAR-T治疗后MRD+的B-ALL患者骨髓标本流式细胞术设门分析结果。
具体而言，图3A-图3D：一例CD19 CAR-T治疗后MRD+的B-ALL患者骨髓标本，分别为CD19/SSC设门甲乙管共同分析、CD24/SSC设门甲管分析、CD72/SSC设门乙管分析、cCD79a/SSC设门乙管分析，然后观察各B细胞标志设置的B细胞门内，CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81或者CD45/CD10/CD38/CD20/CD34两两组合形成的二维点图，以图1A-图1D为对照，观察是否存在与正常发育模式和表达方式不同的细胞。可见CD38-CD10+CD81dimCD34+CD20-CD45dim的MRD细胞，cCD79a、CD24、CD72均阳性，CD19多数阳性少量阴性。
具体而言，图4为图3A至图3D同一例CD19 CAR-T治疗后MRD+的B-ALL患者骨髓标本，多参数多维度设门甲乙管共同分析。常规设置去黏连门P1、活细胞门P2门以后，P2门内CD19、CD24组合SSC设置三参数三维雷达图设置B1细胞门。B1细胞门内，CD38/CD10/CD34/CD20/CD45/CD81六参数六维雷达图观察，与正常B细胞发育过程不同的是，在右下区域出现恶性肿瘤细胞群。乙管常规设置去黏连门P1、活细胞门P2门以后，P2门内CD19、CD72、cCD79a组合SSC设置四参数四维雷达图设置B2细胞门。B2细胞门内，CD38/CD10/CD34/CD20/CD45五参数五维雷达图观察，与正常B细胞发育过程不同的是，在右下区域出现恶性肿瘤细胞群。B2门内CD19、CD72、cCD79a设置三参数三维雷达图，检测是否存在CD19-或者CD72-细胞群。可见CD72-是正常浆细胞，CD19-有少量恶性原始细胞。
利用本实施例的方法进行临床验证：河北燕达陆道培医院从2015年开始做CAR-T临床试验，迄今为止完成近1300例CD19-CAR-T治疗难治/复发B-ALL病例，临床缓解率91.3%。但是目前CAR-T治疗，尤其是CD19-CAR-T后CD19-复发率较高，文献报道13%-68%（河北燕达陆道培医院的整体统计为60%），虽然部分病例采取CD19组合CD22-CAR-T治疗，但是临床和合作CAR-T公司都在努力寻找更多的靶点。此外，MRD检测角度，虽然使用cCD79a设门的方案取得了很好的效果，但是在向外推广以及自身发展的过程中，都发现长期以来的人工分析，任务量大，迫切希望有一种人工智能、至少具有一定雏形的高效分析方法，需要多参数组合高灵敏度的分析方案。使用本发明的方法进行MRD检测，迄今为止检测了200例患者，350多人次骨髓MRD检测，使用同时进行形态学、遗传学、临床表现等方法同步验证，表明本发明的方法检测MRD的灵敏度为10-4，覆盖率和特异性接近100%。假阳性率0.6%，假阴性率0.3%。此外，本发明的多维度分析方法简便易行，可以将分析效率提高30%-40%。尤为重要的是，本发明提供了一个从流式细胞术MRD设门到CAR-T靶标的可以媲美CD19的标志物：CD72，其灵敏度（97.73%）、特异性（89.73%，即CD72在T-ALL和AML、MM这些正常系别不表达CD72的肿瘤上表达率）、表达强度都不亚于CD19的标志，既可以作为靶向治疗后设门标志，还有望作为CD19阴性复发病例进一步靶向治疗的高效靶标。而且CD72标志物在正常标本中只表达于B细胞，不表达于浆细胞，特异性好于CD19，残留的浆细胞可以保证机体的体液免疫系统，从这一点预测副作用小于CD19。
表2显示了本案发明人在从2020年10月到2021年8月收集检测的河北燕达陆道培医院193例患者靶向治疗后样本中CD72的表达率情况，在通过对多例样本经过大量研究和反复检测分析后，发现了CD72这个灵敏度、特异性、表达强度都不亚于CD19的标志，既可以作为靶向治疗后设门标志，还有希望成为CD19之后恶性肿瘤特别是B细胞肿瘤的突破性靶点。
Figure 174262DEST_PATH_IMAGE002
备注：B-ALL：B细胞急性淋巴细胞白血病；B-NHL：B细胞非霍奇金淋巴瘤（B系成熟淋巴细胞肿瘤）；burkitt：伯基特淋巴瘤；CLL：慢性淋巴细胞白血病；DLBCL：弥漫大B细胞淋巴瘤；FL：滤泡淋巴瘤；HCL：毛细胞白血病；LPL：淋巴浆细胞淋巴瘤；MCL：套细胞淋巴瘤；MZL：边缘带淋巴瘤；SLL：小细胞淋巴瘤。T-ALL：T细胞急性淋巴细胞白血病；MPAL：混合表型急性白血病；AML：急性髓系白血病；MM：多发性骨髓瘤。
可以看出，CD72在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中的阳性率97.73%，并且CD72特异性比CD19好，在正常和恶性浆细胞均不表达。CD72在其他疾病表达率，B系成熟淋巴细胞肿瘤100%（包括伯基特淋巴瘤(burkitt)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病(HCL)、淋巴浆细胞淋巴瘤(LPL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘带淋巴瘤(MZL)、小细胞淋巴瘤(SLL)），T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)为14.29%，混合表型急性白血病(MPAL)为40%，急性髓系白血病(AML)为10.85%。因此，CD72可以单独作为治疗靶点，也可以联合CD19和/或CD22、BAFFR等其他标志作为靶点，用于CD72阳性的B细胞急性淋巴细胞白血病、B系成熟淋巴细胞肿瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病、混合表型急性白血病、急性髓系白血病等恶性肿瘤的治疗。具体应用时，CD72可作为CD19-CAR-T或者靶向治疗后CD19弱表达或者丢失的B-ALL和B细胞淋巴瘤的替代方法，也可以联合CD19-CAR-T和/或其他疗法。
本发明的研究发现，10.85%的AML和40%的MPAL表达CD72，在目前AML尤其是恶性度很高的MPAL没有找到有效靶标的时候，这部分患者有可能会使用CD72-CAR-T得到缓解。尤其重要的是，目前B-ALL的CAR-T治疗和靶向药物治疗取得90%以上的缓解率，但是B细胞淋巴瘤的效果远不如B-ALL。本发明的研究中发现CD72在各种常见B细胞淋巴瘤(B-NHL)的覆盖率达到100%，比CD19的98%还要高，而且表达强度比CD19高，尤其是滤泡淋巴瘤这种典型CD19减弱的淋巴瘤。此外，CD72只表达于B细胞，浆细胞和少量正常成熟B细胞不表达，因此从特异性角度可以合理预期，CD72-CAR-T治疗后副作用小。在CD19-CAR-T复发率比较高的时代，CD72-CAR-T单独或者联合其他疗法使用，将很可能是B细胞淋巴瘤的一个有效治疗方法。

Claims (8)

1.一种试剂组合物，其特征在于，该试剂组合物包括第一组抗体、第二组抗体、第三组抗体，其中：
第一组抗体包括：抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体；
第二组抗体包括：CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体；
第三组抗体包括：抗胞浆CD79a抗体；
所述试剂组合物为能用于流式细胞术检测靶向治疗后B细胞肿瘤的组合物，应用时使用2管并行的方案，其中第二组抗体、第三组抗体用于同一管样本。
2.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于，各抗体均为荧光素标记的单克隆抗体；
第一组抗体中，抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7、BV421、V500；
第二组抗体中，CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体的荧光素标记按顺序分别为：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC-Cy7、BV421、V500；
第三组抗体中，抗胞浆CD79a抗体的荧光素标记为APC。
3.根据权利要求1所述的试剂组合物，其特征在于：
第一组抗体为抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD20抗体、抗CD81抗体、抗CD45抗体按照5：5：5：3：2：3：3：3的体积比混合的混合物；
第二组抗体为抗CD38抗体、抗CD10抗体、抗CD34抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD72抗体、抗CD45抗体按照5：5：5：3：3：3：3的体积比混合的混合物。
4.一种用于靶向治疗后B细胞肿瘤的流式检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括第一容器、第二容器、第三容器，各容器分别容置权利要求1-3任一项所述的试剂组合物的第一组抗体、第二组抗体、第三组抗体。
5.权利要求1-3任一项所述的试剂组合物在制备用于检测靶向治疗后B细胞肿瘤的流式细胞上机样品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制备用于检测靶向治疗后B细胞肿瘤的流式细胞上机样品的过程包括步骤：
（1）将待测样本分别加入到甲管、乙管二个流式管中，使呈单个细胞悬液状态，并保证细胞量1×106/管-1×107/管；所述待测样本为骨髓或外周血；
（2）向步骤（1）处理得到的甲管中加入权利要求1-3任一项所述的试剂组合物中的第一组抗体，向步骤（1）处理得到的乙管中加入权利要求1-3任一项所述的试剂组合物中的第二组抗体，各流式管室温避光孵育；
（3）向步骤（2）孵育后的乙管流式管中加入破膜剂A液，继续室温避光孵育；
（4）向步骤（2）孵育后的甲管流式管中加入1×溶血素，向步骤（3）孵育后的乙管流式管中加入1×溶血素，继续室温避光孵育；
（5）将步骤（4）孵育后的各流式管离心后去上清；
（6）向步骤（5）去上清后的乙管中加入破膜剂B液和权利要求1-3任一项所述的试剂组合物中的第三组抗体，室温避光孵育；
（7）向步骤（5）去上清后的甲管以及步骤（6）孵育后的乙管流式管中，分别加入PBS缓冲液洗涤，离心后去上清，用PBS缓冲液重悬细胞，即得到流式细胞上机样品。
7.一种用于流式检测靶向治疗后B细胞肿瘤的装置，其特征在于，该装置包括检测单元和分析单元，其中：
所述检测单元包括用于通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的试剂材料，用于获得样本的检测结果；所述试剂材料包括权利要求1-3任一项所述的试剂组合物；
所述分析单元用于分析检测单元的检测结果。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，该装置用于流式检测靶向治疗后B细胞肿瘤时，其中：
通过流式细胞术检测来自待测个体的样本的过程包括：
利用权利要求1-3任一项所述的试剂组合物对待测样本进行处理后制备流式细胞上机样品；
进行流式细胞上机检测；
其中流式细胞上机检测时甲管按照以下方式设门：设置去黏连细胞门P1，P1门内设置活细胞门P2，得到单个活细胞；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；使用B细胞标志CD19和CD24分别组合SSC设门检测CD19+B和CD24+B细胞；P2门内使用CD19、CD24以及SSC进行三参数三维设门，圈出CD19+和/或CD24+B细胞门B1；B1门内使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34/CD81六维设门，使B细胞按照分化阶段分布在不同区域；
其中流式细胞上机检测时乙管按照以下方式设门：依次设置去黏连细胞门P1、活细胞门P2；P2门内使用CD45/SSC抗体设置各血细胞门；使用B细胞标志CD19、CD72和胞浆CD79a分别组合SSC设置CD19+B、CD72+B和cCD79a+B细胞门；P2门内，使用CD19、cCD79a、CD72、SSC进行四参数四维设门，圈出任一标志阳性的细胞门B2，并且使用cCD79a、CD19、CD72进行三参数三维设门，分别圈出CD19-细胞门、CD72-细胞门；B2门内使用CD45/CD10/CD38/CD20/CD34五维设门，使B细胞按照分化阶段分布在不同区域。
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