CN113456676A - 纳米银仿生递送体系及其制备方法与应用 - Google Patents

纳米银仿生递送体系及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，尤其涉及一种纳米银仿生递送体系及其制备方法与应用，所述递送体系的组分包括：纳米银颗粒、外泌体、穿膜肽和靶向分子，所述外泌体能中和细菌α‑毒素，所述纳米银颗粒具有过氧化物酶活性。外泌体的表面蛋白能中和细菌α‑毒素，穿膜肽可以穿透鼓膜递送；进入鼓膜后，表面修饰的靶向分子通过点击化学反应主动识别被标记的细菌，达到细菌靶向的目的，可以有效突破细菌生物膜，靶向、灵敏的清除细菌。

Description

纳米银仿生递送体系及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，尤其涉及一种纳米银仿生递送体系及其制备方法与应用。
背景技术
外泌体是一种优良的生物载体，并且具有较强的中和细菌毒素的能力，但单独依靠细菌毒素的中和作用难以实现有效的抑菌效果，需要协同其它杀菌制剂联合治疗。
近年来，随着纳米技术的高速发展及向医学领域的不断渗透，纳米技术与传统有机、无机和生物材料结合为杀菌治疗开辟了一条新的途径，纳米材料杀菌的优势有：（1）纳米材料组装条件灵活，可与大量分子组装以与宿主和病原体进行动态连接，同时某些纳米材料自身具有杀菌功能，因此可以有效减少抗生素导致的细菌耐药性产生；（2）表面粗糙的纳米材料，可有效防止细菌附着或通过与细菌的物理机械作用杀死细菌。已有许多科学家利用纳米材料作为新的抗菌材料或者药物输送载体来抵抗或清除生物膜，比如金属纳米颗粒（银、铜等），氧化物纳米颗粒（氧化锌、二氧化钛等），石墨烯等。以上纳米制剂均具有一定的抗菌性能，抗菌机制各不相同。此外，通过对中耳炎发病机制的研究发现，细菌主要以生物膜的形式粘附于中耳粘膜表面，膜内细菌持续分泌内毒素，刺激粘膜，产生炎性介质，导致局部炎症反应。其中，生物膜是指病原微生物通过分泌脂多糖，纤维蛋白，脂蛋白等物质，将自身克隆积聚包裹于其中而形成的膜样复合物。研究表明，中耳粘膜上形成的细菌生物膜是慢性中耳炎反复发作迁延不愈的重要原因之一，且细菌形成生物膜及躲进宿主细胞内逃避抗生素的杀伤等导致了细菌耐药。临床上生物膜一旦形成，彻底清除和杀灭由胞外基质包裹在生物膜内的细菌变得极其困难，因此具有生物膜形态的细菌耐药性更强。一般情况下，抗生素难以穿透生物膜，无法杀死生物膜内细菌或胞内菌，致使其在宿主体内长期存在，导致治疗效果不佳。
发明内容
本申请提供了一种纳米银仿生递送体系及其制备方法与应用，以解决慢性中耳炎反复发作迁延不愈的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种纳米银仿生递送体系，所述递送体系的组分包括：纳米银颗粒、外泌体、穿膜肽和靶向分子，所述外泌体能中和细菌α-毒素，所述纳米银颗粒具有过氧化物酶活性。
可选的，所述外泌体为巨噬细胞与血管内皮细胞构建的杂化细胞分泌的外泌体。
可选的，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
将巨噬细胞与血管内皮细胞的细胞核混合，构建杂化细胞；
将所述杂化细胞与溶酶体抑制剂接触并培养，得到高表达杂化细胞体系，
将所述杂化细胞体系继续培养并纯化，得到所述外泌体。
可选的，所述溶酶体抑制剂包括BAFA1。
第二方面，本申请提供了一种纳米银仿生递送体系的制备方法，所述方法包括以下步骤：
获得所述外泌体；
将所述外泌体和银离子溶液混合孵育，纯化，得到离心后混合溶液；
将所述离心后混合溶液与还原剂接触并反应，得到纳米银颗粒修饰的外泌体；
将所述纳米银颗粒修饰的外泌体与穿膜肽、靶向分子接触，得到外泌体复合物，即纳米银仿生递送体系。
可选的，所述还原剂包括硼氢化钠或氨水；所述穿膜肽包括CPP或iRGD；所述靶向分子包括含DBCO或叠氮胆碱的氨基酸。
一种DCHA水凝胶制剂，所述水凝胶制剂包括所述递送体系
一种DCHA水凝胶制剂的制备方法，所述方法包括：将所述外泌体复合物冻干后，与表面活性剂接触混匀，得到DCHA水凝胶制剂。
可选的，所述表面活性剂包括：泊洛沙姆188、泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127中至少一种。
一种纳米银仿生递送体系的应用，或水凝胶制剂的应用，所述应用包括在中耳炎或细菌性生物膜或或抑菌或减小细菌耐药性中的应用。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的纳米银仿生递送体系的组分包括：纳米银颗粒、外泌体、穿膜肽和靶向分子，对具有过氧化物酶活性的纳米银颗粒进行仿生及靶向修饰，其中外泌体的表面蛋白能中和细菌α-毒素，所述纳米银颗粒具有过氧化物酶活性，穿膜肽可以穿透鼓膜递送；进入鼓膜后，表面修饰的靶向分子通过点击化学反应主动识别被标记的细菌（例如：局部给药前，预先在外耳道局部滴注N3标记的D-氨基酸，可以配合靶向性的识别），达到细菌靶向的目的，可以有效突破细菌生物膜，靶向、灵敏的清除细菌，解决了目前抗菌物质无法彻底清除和杀灭由胞外基质包裹在生物膜内的细菌，导致细菌耐药性增强以及机体感染的技术难题。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DCHA的构建及表征；
图2为DCHA在金黄色葡萄球菌生物膜上结合与分布；
图3为DCHA体外杀菌效果及与细菌毒素结合能力；
图4为DCHA体内安全性分析及杀菌效果。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例中提供了一种纳米银仿生递送体系，所述递送体系的组分包括：纳米银颗粒、外泌体、穿膜肽和靶向分子，所述外泌体能中和细菌α-毒素，所述纳米银颗粒具有过氧化物酶活性。
本申请实施例中，研究表明过氧化物纳米材料具有突破生物膜基质屏障和杀灭内部细菌并促进清除生物膜的潜力。纳米银作为一种过氧化物纳米材料具有多种杀菌机制：（1）银离子与含硫的蛋白相互作用，使蛋白质变性；（2）正电银离子与负电的膜结合后打开孔洞，使胞浆从胞内流出；（3）进入细菌内后，结合损伤DNA及RNA；（4）抑制革兰氏阳性菌细胞壁合成；（5）可降解细胞膜基质；（6）产生活性氧，可攻击核酸、蛋白质、多糖、脂类等生物分子使其失去功能，最终杀死和分解细菌。
本申请实施例中，利用具有过氧化物酶活性的纳米银颗粒实现突破生物膜基质屏障高效杀死细菌，深入阐明纳米银在细菌生物膜清除及杀菌中的作用机理，研发特异性靶向结合到细菌生物膜的纳米银颗粒，以中耳炎为疾病模型，构建了一种基于杂化外泌体“诱捕”细菌毒素协同纳米材料杀菌的仿生载药系统。
作为一种可选的实施方式，所述外泌体为巨噬细胞与血管内皮细胞构建的杂化细胞分泌的外泌体。
本申请实施例中，分离提取尺寸均一、高表达细菌毒素结合受体的功能化外泌体包括：分离原代腹腔巨噬，利用IL-4刺激成M2型巨噬细胞，随后利用细胞核提取试剂盒抽提血管内皮细胞的细胞核，最后按照1:1的比例将巨噬细胞与细胞核混合，构建杂化细胞。
本申请实施例中，外泌体为M2型巨噬细胞与血管内皮细胞的杂合细胞分泌的外泌体。所述外泌体具有明显的杯托状结构，大小为100 nm。所述的杂合外泌体具有中和细菌α-毒素能力的外泌体。
第二方面，本申请实施例提供了一种纳米银仿生递送体系的制备方法，所述方法包括以下步骤：
获得所述外泌体；
将所述外泌体和银离子溶液混合孵育，纯化，得到离心后混合溶液；
将所述离心后混合溶液与还原剂接触并反应，得到纳米银颗粒修饰的外泌体；
将所述纳米银颗粒修饰的外泌体与穿膜肽、靶向分子接触，得到外泌体复合物，即纳米银仿生递送体系。
本申请实施例中，外泌体表面通过原位还原法温和在外泌体表面合成具有过氧化物催化杀菌能力的纳米银颗粒，并修饰穿膜肽、靶向分子，提高其对鼓膜的穿透和靶向细菌的能力。
本申请实施例中，杀菌能力的物质是具有过氧化物酶活性的纳米银杀菌颗粒。所述的纳米银颗粒是通过原位合成的技术在外泌体表面合成，粒径为5 nm。
本申请实施例中，纯化的方式为离心后重悬，可以进行一次或多次。
本申请实施例中，具体的操作方式为：1）在PBS中，外泌体与硝酸银置于37℃下孵育16 h，使其充分吸附在外泌体表面，混合液离心，除去游离的银离子，用PBS重悬，加NaBH4于37℃反应5 h；
2）在4℃、120, 000 rpm离心2 h，通过调控制备条件获得纳米银颗粒，同时，在反应体系中按1:1比例加入DSPE-PEG-CPP和DSPE-PEG-DBCO，使其修饰到外泌体表面，制备得到外泌体复合体。
作为一种可选的实施方式，所述还原剂包括硼氢化钠或氨水；所述穿膜肽包括CPP或iRGD；所述靶向分子包括含DBCO或叠氮胆碱的氨基酸。
作为一种可选的实施方式，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
将巨噬细胞与血管内皮细胞的细胞核混合，构建杂化细胞；
将所述杂化细胞与溶酶体抑制剂接触并培养，得到高表达杂化细胞体系，
将所述杂化细胞体系继续培养并纯化，得到所述外泌体。
本申请实施例中，在杂化细胞培养过程中，加入一定量的溶酶体抑制剂BAFA1，得到高表达金属蛋白酶（ADAM10）、CCR5的杂化细胞体系，随后利用无外泌体的血清培养48 h后，通过超速离心法制备得到尺寸约为100 nm的较纯的外泌体。所述纯化的方式为通过超速离心法（差速离心）。
本申请实施例中，需要制得高表达ADAM10（巨噬细胞外泌体高表达金属蛋白酶ADAM10，可有效结合金黄色葡萄球菌α-toxin毒素）、CCR5（巨噬细胞外泌体高表达CCR5蛋白，其可有效结合金黄色葡萄球菌LukED毒素）。
作为一种可选的实施方式，所述溶酶体抑制剂包括BAFA1。本申请实施例中，BAFA1为巴弗洛霉素A1。
一种DCHA水凝胶制剂，所述水凝胶制剂包括所述递送体系。
一种DCHA水凝胶制剂的制备方法，所述方法包括：将所述外泌体复合物冻干后，与表面活性剂接触混匀，得到DCHA水凝胶制剂。
本申请实施例中，具体的操作方式为：将100 mg外泌体冻干粉加入到1%、10mL的泊洛沙姆407溶液中涡旋混匀，制备出DCHA水凝胶制剂，利于局部经皮缓释给药。
作为一种可选的实施方式，所述表面活性剂包括：泊洛沙姆188、泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127至少一种。
本申请实施例中，所述的DCHA水凝胶制剂，利于局部经皮缓释给药。当该DCHA水凝胶制剂经外耳道局部滴注给药。
本申请实施例中，所述的DCHA在穿膜肽的作用下，穿透鼓膜递送；进入鼓膜后，DCHA表面修饰的DBCO通过点击化学反应主动识别N3标记的细菌（局部给药前，预先在外耳道局部滴注N3标记的D-氨基酸），达到细菌靶向的目的。
一种纳米银仿生递送体系的应用，或水凝胶制剂的应用，所述应用包括在中耳炎或细菌性生物膜或或抑菌或减小细菌耐药性中的应用。
本申请中，所涉及的生物膜，主要是细菌性生物膜。PEG为聚乙二醇，DSPE为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺，酪蛋白磷酸肽(CPP)是一种生物活性肽，是可以穿过生物膜。DBCO为马来酰亚胺。
实施例1、DCHA的构建及表征
首先摸索血管内皮细胞核与M2巨噬细胞的混合比例，得到杂化细胞，结果表明，当细胞核：细胞为2:1时，得到最优的细胞核摄取量和细胞活力（图1a）。细胞活力范围为100-80的曲线代表在不同细胞核与巨噬细胞的比例条件下，杂化细胞的活力情况；细胞活力范围为0-100的曲线表示在不同细胞核与巨噬细胞的比例条件下，杂化细胞中细胞核的内化效率。随后，培养杂化细胞分离其外泌体，通过超速离心初步得到粒径约100 nm的外泌体，TEM结果表明，提取的外泌体具有明显的杯托状结构，NTA检测其粒径约100 nm，结合蛋白质免疫印迹（WB）的结果表明成功提取外泌体（图1b-d），随后成功在其表面修饰CPP、DBCO及原位还原合成5 nm左右的纳米银颗粒（图1e），通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）发现修饰后不影响颗粒的大小，稳定性良好（图1f）。随后考察DCHA凝胶制剂体外释放情况，结果表明凝胶组有明显的缓释效果（图1g），同时利用酶标仪检测DCHA中纳米银类过氧化物酶的催化活性（图1h），结果表明，纳米银颗粒与H2O2的反应动力学曲线符合米氏方程，并随着H2O2浓度的升高，酶促反应速率逐渐增大，最后趋于平衡。电子自旋共振波谱法电子自旋共振法（ESR）检测证明，纳米银具备催化H2O2，产生高毒性的•OH的能力（图1i）。以上实验，初步验证了构建的DCHA无损外泌体的结构及功能，并且能够产生•OH，可结合银离子共同杀伤细菌。图1a不同细胞核与细胞比例下细胞的活性及细胞核摄取量；图1b H-Exo的TEM；图1c 杂化细胞及其外泌体的WB分析，其中CD9/TSG101为外泌体膜表面标志蛋白，GADPH为内参；图1d H-Exo的粒径电势分析；图1e DCHA表面纳米银颗粒的TEM表征；图1f DCHA的粒径电势分析；图1g DCHA凝胶制剂体外释放情况；图1h纳米银颗粒与H2O2的反应动力学曲线符合米氏方程，随着H2O2浓度的升高，酶促反应速率逐渐增大，最后趋于平衡；图1i ESR技术检测•OH的生成情况。
实施例2、DCHA在金黄色葡萄球菌生物膜上结合与分布
将环炔基修饰的DCHA通过点击化学与叠氮修饰的生物膜结合，建立了以环境扫描电镜技术直接观察DCHA在生物膜表面结合与分布的方法（图2a-b），该方法可直接观察生物膜样本，尽可能保持样本的完整性，还可以借助元素分析法鉴定纳米银的分布（图2c）。图2、DCHA在金黄色葡萄球菌生物膜上结合与分布：图2a 环境扫描电镜观察完整生物膜;图2b局部放大显示生物膜表面的DCHA纳米颗粒;图2c 元素分析表明生物膜表面的颗粒为纳米银颗粒。
实施例3、DCHA体外杀菌效果及与细菌毒素结合能力
以金黄色葡萄球菌为研究对象，考察DCHA的杀菌效果。结果表明DCHA可以有效的杀灭此细菌，并能显著降解细菌基因组DNA。随后分析外泌体和细菌毒素的亲和力情况，表明杂化细胞的外泌体能够与细菌毒素结合，并显著降低细胞的死亡，实现保护细胞的目的。图3a DCHA杀菌效果分析；图3b 细菌基因组DNA的降解情况；图3c 外泌体与细菌毒素亲和力测定（Kon: 结合速率常数；Ligate：结合）；图3d 外泌体与细菌毒素结合测定。LDH为乳酸脱氢酶。
实施例4、DCHA体内安全性分析及杀菌效果
通过注射金黄色葡萄球菌和混合菌构建相应中耳炎模型，造模两天后积脓明显，有大量分泌物，中耳分泌物细菌培养结果为阳性，菌落密集，鼓膜周围充血明显，炎性症状明显，表明造模成功。通过中耳灌洗，观察细菌生长情况（图4a），图4a中每组时间中，从左到右分别为：生理盐水组（N.S）、氧氟沙星滴耳液对照组（Ofloxacine）、DCHA溶液组和DCHA(Gel )凝胶组。结果发现各治疗组和生理盐水组（N.S）相比，细菌培养菌落计数皆有下降，表明各组药物具有一定的药效。给药6 h后，各药物组与模型组比较细菌数降低，且DCHA溶剂组与氧氟沙星滴耳液对照组（Ofloxacine）相比，抑菌效率相当。DCHA凝胶剂组治疗效果明显优于DCHA溶液剂组，进一步证实凝胶的缓释作用。同时考察中耳灌洗液中细胞因子表达情况（图4b-c），结果表明与N.S模型组相比，各治疗组TNF-α（肿瘤坏死因子-α）和IL-8（白细胞介素-8）水平均有降低；DCHA溶液组的TNF-α和IL-8水平显著低于氧氟沙星滴耳液组；并且DCHA凝胶组显示出更明显的下降趋势，由此表明DCHA可显著降低TNF-α和IL-8水平，改善炎症情况。造模2天后，中耳黏膜上皮细胞坏死，炎症细胞浸润严重，出现间质纤维化，间质血管增生，黏膜增厚明显。生理盐水模型组炎性细胞浸润严重，主要为中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞；氧氟沙星滴耳液组在黏膜浅层有少许炎性细胞浸润；DCHA组炎症细胞浸润情况较轻，炎症细胞散在分布，表明经DCHA治疗后，降低对中耳黏膜的损伤（图4d）。图4a中耳灌洗液细菌计数；图4b 各组中耳腔灌洗液中TNF-α含量；图4c 各组中耳腔灌洗液中IL-8含量；图4d 大鼠中耳炎模型各治疗组中耳黏膜HE染色切片。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种纳米银仿生递送体系，其特征在于，所述递送体系的组分包括：纳米银颗粒、外泌体、穿膜肽和靶向分子，所述外泌体能中和细菌α-毒素，所述纳米银颗粒具有过氧化物酶活性。
2.根据权利要求1所述的递送体系，其特征在于，所述外泌体为巨噬细胞与血管内皮细胞构建的杂化细胞分泌的外泌体。
3.根据权利要求1所述的递送体系，其特征在于，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
将巨噬细胞与血管内皮细胞的细胞核混合，构建杂化细胞；
将所述杂化细胞与溶酶体抑制剂接触并培养，得到高表达杂化细胞体系，
将所述杂化细胞体系继续培养并纯化，得到所述外泌体。
4.根据权利要求3所述的递送体系，其特征在于，所述溶酶体抑制剂包括BAFA1。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述的纳米银仿生递送体系的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
获得所述外泌体；
将所述外泌体和银离子溶液混合孵育，纯化，得到离心后混合溶液；
将所述离心后混合溶液与还原剂接触并反应，得到纳米银颗粒修饰的外泌体；
将所述纳米银颗粒修饰的外泌体与穿膜肽、靶向分子接触，得到外泌体复合物，即纳米银仿生递送体系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述还原剂包括硼氢化钠或氨水；所述穿膜肽包括CPP或iRGD；所述靶向分子包括含DBCO或叠氮胆碱的氨基酸。
7.一种DCHA水凝胶制剂，其特征在于，所述水凝胶制剂包括权利要求1-4任意一项所述的递送体系，或权利要求5或6所述方法制得的所述递送体系。
8.一种如权利要求7所述的DCHA水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将所述外泌体复合物冻干后，与表面活性剂接触混匀，得到DCHA水凝胶制剂。
9.根据权利要求8所述的DCHA水凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂包括：泊洛沙姆188、泊洛沙姆F68、泊洛沙姆F127中至少一种。
10.一种如权利要求1-4任意一项所述的纳米银仿生递送体系，或如权利要求5或6所述的方法制得的递送体系，或如权利要求7的所述水凝胶制剂，或如权利要求8或9所述的方法制得的水凝胶制剂的应用，其特征在于，所述应用包括在中耳炎或细菌性生物膜或或抑菌或减小细菌耐药性中的应用。
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