CN113444818B - 一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法，本发明根据标记物在目标和非目标宿主中源强特征的差异，并结合通用标记物的浓度分布特征，建立了一种能够有效排除假阳性信号的标记物检测方法，即在采用以宿主特异性生物标记为基础的微生物污染溯源技术进行微生物污染源解析时，以3.00Log10GC/100mL作为参比微生物的检出浓度阈值，由于本发明提出了准确获取真阳性信号时参比标记物应有的浓度范围，可以帮助研究和管理人员有效排除标记物与非目标宿主产生的交叉反应带来的干扰，从而能够精准解析水体中的各类微生物的污染来源。

Description

一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法
技术领域
本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法。
背景技术
随着我国人口的激增和畜禽养殖规模的不断扩大，粪便污染已成为水质恶化，影响人们用水健康的主要诱因。一方面，粪便中含有的氮、磷等物质进入水环境后，可导致水体的富营养化。另一方面，粪便携带的致病微生物可通过水体进行传播，引起介水性疾病的爆发。因此，如何准确识别水环境中存在的粪便污染并制定有效的污染防治措施，是改善水质质量，保护人们用水健康的关键问题。
粪大肠菌群和大肠埃希氏菌等传统指示菌作为最早开发出的水体粪便污染指示菌，已被世界各国沿用多年。我国的地表水环境质量标准(GB3838-2002)中也包含了与粪大肠菌群检出浓度相对应的水质评价标准。然而，此类传统指示菌广泛存在于各类动物粪便中，仅能用于评价水体中的粪便污染程度，无法识别污染来源，也不能对各污染源的贡献率进行量化分析，从而导致水体微生物污染防治工作停留在“见污治污”的被动治理模式中，进而极大增加了管理和治理的成本。此外，不同动物粪便中含有的致病菌种类也各不相同，对人体的致病菌机理差异显著，若无法准确识别微生物的污染来源，也难以有效评估粪便污染给人类带来的健康风险。
近年来，欧、美等发达国家已针对解析粪便污染源的问题率先开发出以宿主特异性生物标记为基础的微生物污染溯源(Microbial source tracking,MST)技术，其主要思想是针对不同物种肠道微生物中所包含的特异性序列设计出具有“指纹功能”的特异性基因。通过检测该特异性基因在水环境中的赋存特征可以直接识别出水体中的粪便污染来源。同时，对特异性基因的表达量进行定量分析还可以量化各污染源的相对贡献率，为水体粪便污染的针对性治理提供有效的信息。
然而，目前尚未开发出具有绝对特异性的标记物，导致特异性下降的主要原因是标记物与非目标物种形成了交叉反应，产生了假阳性结果。标记物的这一缺陷使得研究人员难以准确识别粪源微生物的污染来源。因此，研究一种能够有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法很有必要。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法，可以避免因监测过程中产生的假阳性信号而影响源解析结果的准确性。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法，即在采用以宿主特异性生物标记为基础的微生物污染溯源技术进行微生物污染源解析时，以3.00Log10GC/100mL作为参比微生物的检出浓度阈值。
优选地，所述参比微生物为大肠埃希氏菌和通用拟杆菌。
本发明基于标记物假阳性信号强度普遍小于其在目标样本中的源强特征这一特性，将以往对标记物进行简单扩增获得源解析结果的方法进行了改进，并以大肠埃希氏菌和通用拟杆菌标记物作为参比，提出了开展源解析工作时各标记物表达量应控制的范围，避免因监测过程中产生的假阳性信号而影响源解析结果的准确性。由于改进后的标记物监测方法可以使得研究人员简单有效的排除假阳性信号的干扰，所以为获取更加准确的污染物宿主来源信息提供了重要帮助。
优选地，上述的一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法，包括以下步骤：
S1、在水体污染区域采集不同生物的粪便样品；
S2、根据3.00Log10 GC/100mL的检出浓度阈值，对采集的粪便样品进行稀释，稀释后进行DNA提取；
S3、采用宿主特异性生物标记对DNA样品进行PCR扩增，根据扩增结果判断污染微生物的来源。
进一步地，所述稀释方法为往1g粪便样品中加入1L去离子水制成粪便废水原液，原液充分混匀后再根据3.00Log10 GC/100mL的检出浓度阈值进行稀释。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明根据标记物在目标和非目标宿主中源强特征的差异，并结合通用标记物的浓度分布特征，建立了一种能够有效排除假阳性信号的标记物检测方法，即在采用以宿主特异性生物标记为基础的微生物污染溯源技术进行微生物污染源解析时，以3.00Log10 GC/100mL作为参比微生物的检出浓度阈值，由于本发明提出了准确获取真阳性信号时参比标记物应有的浓度范围，可以帮助研究和管理人员有效排除标记物与非目标宿主产生的交叉反应带来的干扰，从而能够精准解析水体中的各类微生物的污染来源。
附图说明
图1为不同标记物对人粪实验体系样本的扩增结果(纵坐标为浓度)；
图2为不同标记物对猪粪实验体系样本的扩增结果(纵坐标为浓度)；
图3为不同标记物对反刍动物实验体系样本的扩增结果(纵坐标为浓度)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
技术术语：
qPCR：实时荧光定量核酸扩增检测系统；是一种在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR的进程，最后通过相应的标准曲线对DNA模板进行定量分析的方法。
DNA：脱氧核糖核酸；是一种生物大分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作，具有信息储存的功能。
宿主特异性标记物：针对目标宿主中特定肠道微生物16S rRNA的特异性基因片段进行开发的，能对较短的、具有特异性的核苷酸序列片段扩增的引物。
灵敏度：指衡量标记物测出特定基因片段的能力，灵敏度是能够与特定基因片段进行配对的标记物正确地判定为真阳性的比例。
特异性：指衡量引物不能与非目的基因片段匹配的能力，特异性是将不能够与目的基因片段进行匹配的标记物正确地判定为真阴性的比例。
目标源强特征：特异性标记物在目标宿主样本库中的平均检出浓度。
非目标源强特征：特异性标记引物在非目标宿主样本库中的平均检出浓度。
实施例1采用qPCR技术分析基于宿主特异性生物标记引物的定量源解析方法的源强特征
具体步骤如下：
(1)样品采集与DNA提取
采集人、猪、牛、羊粪便样本各5份，共20份样本。牛和羊的粪便样本统一归类于反刍动物样本。样品采集后保存于密闭的冰盒中，48h内送回实验室。
(2)特异性引物的选取
选用具有广泛地区适用性的人源、猪源和反刍动物标记物进行方法的建立和验证工作。此外，选取大肠埃希氏菌和通用拟杆菌标记物作为参比，探究排除假阳性反应时参比标记物应有的浓度范围。具体的标记物信息如表1所示。
表1特征生物标记引物
Figure BDA0003100689710000041
/>
Figure BDA0003100689710000051
(3)假阳性信号排除实验的建立
将5份人粪样本混合后，称取1g样本，加入至1L去离子水中制备粪便废水原液。待原液充分混匀后进行梯度稀释，稀释为10-0,10-1，10-2，10-3，10-4，10-5六个梯度。每个梯度采集水样100mL，通过0.22μm水系滤膜在真空过滤装置中进行过滤，使得微生物截留在滤膜上。过滤后的滤膜放入-20℃冰箱短暂冷冻，剪碎放入2mL灭菌离心管中，采用Magen(美基生物)公司水体DNA提取试剂盒(D3145-02)提取滤膜中的DNA，具体的提取步骤参照试剂盒说明书进行。每张滤膜可获取40μL DNA样本。提取的DNA通过超微量分光光度计测定其品质和浓度(DNA的OD260/280在1.6-1.8之间)。
猪粪和反刍动物粪便实验体系的搭建和DNA提取步骤均与人粪实验体系一致。
(4)qPCR反应和标准曲线制作
以不同的人和动物粪便样本DNA为模板，对选取的各类宿主特异性引物进行扩增，引物信息如表1所示。qPCR扩增包括荧光染料和荧光探针两种方法。荧光染料法扩增体系为20uL:
Figure BDA0003100689710000052
Premix Ex TaqTM II(2×)(购自TaKaRa公司)10uL；ddH2O，6.4uL；上下游引物各0.8uL；DNA模板2uL。反应程序：①预变性，95℃，30s；②变性，95℃，5s；③退火延伸，60℃，1min，40个循环。荧光探针法扩增体系为20uL:SuperReal probe PreMix(2×)(购自TaKaRa公司)10uL；DNA模板2uL；上下游引物各0.25uL；探针1uL(10nM)；ddH2O，6.4uL。反应程序：①预变性，95℃，15min；②变性，95℃，3s；③退火延伸，60℃，30s，40个循环。
为构建标准品，对各特异性引物采用对应的样本DNA进行PCR扩增，扩增后的目标产物通过DNA纯化试剂盒进行纯化回收。回收后的噬菌体引物扩增产物(CPQ_056,CPQ_064)连接到
Figure BDA0003100689710000062
载体上，其它回收产物连接到pMD 19-T Vector载体上。连接完成后，均转化至DH5α感受态细胞，采用氨苄抗生素含量为1:1000的平板培养基筛取阳性克隆，并提取质粒DNA，同时测定相应的DNA浓度，计算目的片段拷贝数。制备的质粒均进行10倍梯度稀释，稀释为10-0,10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-67个梯度。以各梯度质粒为模板，每个梯度设置3个重复，进行qPCR扩增，通过反应获得的Cq值构建相应的标准曲线(表2)，各标准曲线的相关系数(R2)均大于0.97，且扩增效率在90-110％之间，表明各标准曲线合格。
表2不同粪便样本的标准曲线
Figure BDA0003100689710000061
(4)不同稀释梯度下标记物的检出浓度分析
在各类宿主实验体系中，针对每个梯度的样本均采用标记物进行qPCR扩增【具体方法同步骤(3)】，根据标准曲线计算标记物的浓度，结果如图1、图2、图3所示。
由图1-3可以看出，特异性标记物在其目标宿主内的前5个梯度内(10-0-10-5)均获得了阳性结果，且浓度呈现出显著的梯度下降趋势，仅人源标记物CPQ_064在人粪实验体系中获得的阳性结果较少(仅在10-0、10-12个梯度显示出阳性反应)。标记物在非目标宿主的各稀释样本中的假阳性信号则没有表现出梯度下降，而是呈现出无规则变化。一般情况下，在梯度稀释样本中标记物呈无规则变化的原因主要有两方面，一方面可能是由于样本中含有影响标记物扩增效率的酚类或有机质，另一方面可能是标记物出现了非特异性扩增(即假阳性反应)所致。鉴于真阳性信号(标记物在目标宿主内获得的结果)和参比标记物在梯度稀释的样本中浓度变化呈梯度下降趋势，且线性拟合结果较好，因此可排除各样本中酚类或有机质的等抑制物的干扰，假阳性信号的产生原因主要是标记物在非目标宿主中出现了非特异性扩增。因此，可以通过对样本的稀释监测，并结合线性拟合的方法判断获取的标记物监测结果中是否为假阳性信号。
(5)参比微生物的浓度范围
尽管可通过对水样的稀释判断标记物监测结果是否为假阳性结果，但该方法操作较为繁杂，耗时耗力，且增加了监测的成本。而参比标记物的引入可以帮助研究人员通过控制真阳性信号的范围从而降低获取假阳性信号的几率。各实验体系中，假阳性信号除浓度变化不规则外，在10-3-10-5稀释梯度之间，大多数假阳性信号表现出突然消失的现象，特别是当参比标记物的浓度小于3.00Log10 GC/100mL(10-4-10-5稀释梯度之间)时，绝大部分假阳性信号均未能检出，仅反刍动物标记物Rum-2-Bac因特异性较差，在人粪实验体系的10-4梯度和猪粪实验体系的10-4、10-5梯度中有检出。由于开发参比标记物的源指示微生物(大肠埃希氏菌和拟杆菌)广泛存在于动物肠道中，且该类微生物在各宿主肠道中均具有较高丰度，因此参比标记物的检出浓度普遍较高。鉴于参比标记物的这一特性，在开展源解析工作时，可以将参比标记物检出浓度3.00Log10 GC/100mL设定为阈值，当参比标记物浓度小于该阈值时，绝大多数特异性标记物在目标宿主中的真阳性信号仍有检出，而假阳性信号则消失。
图1中，人粪实验体系内样本稀释至10-4梯度时，参比标记物的检出浓度小于3.00Log10GC/100mL(GC为Gene Copy的缩写)。当参比标记物的浓度小于设定的阈值时，各类非目标引物产生的假阳性信号均已消失，特别是在10-0-10-3梯度与人粪废水产生较强假阳性信号的猪源标记物P.ND5，其假阳性信号在10-4梯度也难以检出。图2中，猪粪实验体系的样本稀释至10-4时，参比标记物的检出浓度小于3.00Log10 GC/100mL。当参比标记物浓度控制在阈值以下时，绝大多数与猪粪废水有假阳性反应的非目标引物均未检出假阳性信号，仅反刍动物标记Rum-2-Bac存在假阳性反应。图3中，反刍动物实验体系样本稀释至10-5梯度时，参比标记物的检出浓度小于3.00Log10 GC/100mL。当参比标记物浓度控制在阈值以下时，绝大多数与反刍动物粪便废水有假阳性反应的非目标引物均未检出假阳性信号，仅猪源标记物Pig-2-Bac在10-5梯度样本下表现出假阳性结果。
综上所述，尽管在不同实验体系中，可使假阳性信号消失的稀释倍数有所不同，但均在参比微生物浓度控制在阈值(3.00Log10 GC/100mL)以下时，非目标引物产生的假阳性结果可有效排除。因此，在开展源解析工作时，以3.00Log10 GC/100mL作为参比微生物的检出浓度阈值，对于控制假阳性反应的产生是一种切实可行的监测方法。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 生态环境部华南环境科学研究所
<120> 一种有效排除假阳性反应的微生物污染源解析方法
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
acagcccgcg attgatactg gtaa 24
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
caatcggagt tcttcgtgat 20
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5’FAM;3’BHQ-1
<400> 29
atgaggtgga tggaattcgt ggtgt 25
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
ccaacyttcc cgwtactc 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
caatcggagt tcttcgtg 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ccaacyttcc cgwtactc 18
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
ggaccgtgtc tcagttccag tg 22
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
gagaggaagg tcccccac 18
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
cgctacttgg ctggttcag 19
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5’FAM;3’NFQ
<400> 36
ccattgacca atattcctca ctgctgcct 29
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
ggtagagcac tgttttggca 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
tgtctcccgt gataactttc tc 22

Claims (1)

1.一种有效排除荧光定量PCR假阳性反应的微生物污染源解析方法，其特征在于，在采用以宿主特异性生物标记为基础的微生物污染溯源技术进行微生物污染源解析时，以3.00Log10 GC/100mL作为参比微生物的检出浓度阈值，对待测水体粪便样品进行稀释，所述参比微生物为大肠埃希氏菌和通用拟杆菌，所述稀释方法为往1g粪便样品中加入1L去离子水制成粪便废水原液，原液充分混匀后再根据3.00Log10 GC/100mL的检出浓度阈值进行稀释；所述宿主特异性生物标记包括人源、猪源和反刍动物源标记物，所述人源标记物选自如下的组：引物如SEQ ID NO:1-2所示和探针如SEQ ID NO:3所示的BacH，引物如SEQ ID NO:4-5所示和探针如SEQ ID NO:6所示的BacHum，引物如SEQ ID NO:7-8所示的HF183，引物如SEQ ID NO:9-10所示和探针如SEQ ID NO:11所示的Hum2，引物如SEQ ID NO:12-13所示的Hum163，引物如SEQ ID NO:14-15所示和探针如SEQ ID NO:16所示的CPQ_056；所述猪源标记物选自如下的组：引物如SEQ ID NO:20-21所示和探针如SEQ ID NO:22所示的Pig-1-Bac，引物如SEQ ID NO:25-26所示的P.ND5；所述反刍动物源标记物选自如下的组：引物如SEQ ID NO:30-31所示的Bac708，引物如SEQ ID NO:32-33所示的BacCow；所述通用拟杆菌的标记物为引物如SEQ ID NO:34-35和探针如SEQ ID NO:36所示的AllBac；所述大肠埃希氏菌的标记物为引物如SEQ ID NO:37-38所示的EC23S857；
所述有效排除荧光定量PCR假阳性反应的微生物污染源解析方法，包括以下步骤：
S1、在水体污染区域采集不同生物的粪便样品；
S2、根据参比微生物检出浓度阈值3.00Log10 GC/100mL，对采集的粪便样品进行稀释到参比微生物的检出浓度阈值3.00Log10 GC/100mL以下，再进行DNA提取；
S3、采用所述宿主特异性生物标记对DNA样品进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果判断污染微生物的来源。
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