CN113444166A - 卡洛芬人工抗原、抗体及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了卡洛芬人工抗原、抗体及其合成方法和应用。卡洛芬人工抗原，其结构式如式Ⅰ所示；

Description

卡洛芬人工抗原、抗体及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及了免疫化学分析技术领域，特别是涉及了卡洛芬人工抗原、抗体及其合成方法和应用。
背景技术
卡洛芬(Carprofen，简称CPF)是一种高效非甾体类抗炎药物，具有解热、镇痛和抗炎作用。因其效果显著，在畜牧养殖业中常与抗生素联合使用，用于动物疾病的治疗。兽药的过量添加、滥用等不合理使用，容易导致畜禽体内兽药残留超标，从而对人体健康造成潜在危害。随着人们对肉、蛋、奶等需求量的增加，动物源性食品中兽药残留问题受到人们的广泛关注。为加强对动物源性食品中卡洛芬的残留监管，保证动物产品质量安全，欧盟委员会规定卡洛芬在牛和马的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织中的最大残留限量分别为500、1000、1000和1000μg/kg；日本肯定列表规定卡洛芬在陆生哺乳动物肌肉组织中的最大残留限量为500μg/kg。
目前，我国行业标准中对动物源性食品中卡洛芬的残留检测主要为液相色谱-质谱/质谱法。这种方法虽然特异性强、灵敏度高，但是样品前处理复杂繁琐，检测时间长，成本也较高，推广使用受到限制。
发明内容
本发明提供卡洛芬人工抗原、抗体及其合成方法和应用。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
第一方面，卡洛芬人工抗原，其结构式如式Ⅰ所示。
Figure BDA0003132114380000021
式Ⅰ中，n为1-100的自然数，K表示载体蛋白。
作为本发明提供的所述的卡洛芬人工抗原的一种优选实施方式，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清白蛋白或血蓝蛋白。
作为本发明提供的所述的卡洛芬人工抗原的一种优选实施方式，当K为血蓝蛋白时，作为免疫原；当K为牛血清白蛋白时，作为包被原。
第二方面，上述的卡洛芬人工抗原的合成方法，其是使用卡洛芬作为半抗原与载体蛋白进行化学偶联得到。
作为本发明提供的所述的卡洛芬人工抗原的合成方法的一种优选实施方式，其包括以下步骤：
(1)将卡洛芬、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，反应4-48小时，得到A液；
(2)将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中得到B液；
(3)将A液和B液混合，室温反应6-48小时，得到式I所示的卡洛芬人工抗原。
作为本发明提供的所述的卡洛芬人工抗原的合成方法的一种优选实施方式，其包括以下步骤：
(1)将10-60mg卡洛芬、10-60mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10-40mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.2-2mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌反应4-48小时，得到A液；
(2)将10-70mg载体蛋白溶解于10mL浓度为0.01M，pH为7.4的磷酸盐缓冲液中得到B液；
(3)将A液逐滴加入到B液中，室温搅拌，过夜反应；
(4)纯化：将上述反应液在PBS中透析1-3天，即得到式I所示的卡洛芬人工抗原。
第三方面，卡洛芬抗体，其是由上述的卡洛芬免疫抗原经动物免疫得到。
作为本发明提供的所述的卡洛芬抗体的一种优选实施方式，其包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。
第四方面，上述的卡洛芬人工抗原，或上述的卡洛芬抗体的以下任一应用：
(1)在检测卡洛芬中的应用；
(2)在制备卡洛芬的检测试剂盒中的应用；
(3)在制备卡洛芬的免疫层析试纸条中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次公开了一种新的卡洛芬人工抗原及其制备方法，用所述人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体，制备过程简单、经济，抗体的检测灵敏度可达0.33ng/mL。本发明实用性强，对于卡洛芬的残留检测具有重大实用价值。
附图说明
图1为卡洛芬人工抗原的基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)谱图。
图2为卡洛芬多克隆抗体的间接竞争ELISA标准抑制曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从常规生化试剂厂商购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中所用的磷酸盐缓冲液(简称PBS)均为pH 7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液，所用碳酸盐缓冲液(简称CB)均为pH 9.6、0.05M的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA，血蓝蛋白简称KLH。
实施例1卡洛芬人工抗原的制备和表征
一、卡洛芬免疫原的制备
(1)将13mg CPF溶于0.5mL DMF中，加入15mg EDC.HCL和8mg NHS，室温条件下磁力搅拌反应10小时，得到溶液A。
(2)将10mg KLH溶于10mL PBS缓冲液中，得到溶液B。
(3)将A液逐滴加到B液中，室温搅拌，过夜反应，得到反应产物即卡洛芬免疫原。将反应产物在PBS中透析72小时，中间换6次水。透析后将反应产物分装于2mL离心管中，-20℃保存备用。
二、卡洛芬包被原的制备和表征
1.卡洛芬包被原的制备
(1)将13mg CPF溶于0.5mL DMF中，加入15mg EDC.HCL和8mg NHS，室温条件下磁力搅拌反应10小时，得到溶液A。
(2)将20mg BSA溶于10mL PBS缓冲液中，得到溶液B。
(3)将A液逐滴加入到B液中，室温搅拌，过夜反应，得到反应产物即卡洛芬包被原(CPF-BSA)。将反应产物在PBS中透析72小时，中间换6次水。透析后将反应产物分装于2mL离心管中，-20℃保存备用。
2.卡洛芬包被原偶联比的确定
将上述合成的产物用MALDI-TOF-MS鉴定，并计算偶联比。结果如图1所示，BSA的分子量为65156.959，合成产物的分子量为67080.199，表明包被原合成成功，偶联比为(67080.199-65156.959)/273＝7，即平均每个BSA分子与7个卡洛芬半抗原偶联。
实施例2卡洛芬抗血清的制备
将实施例1得到的卡洛芬免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后免疫Balb/c小鼠，初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂。免疫方式为颈背部皮下多点注射，免疫剂量100μg/只，免疫间隔为4周，共免疫三次。每次免疫后第7天，尾静脉采血，4000rpm离心10min，收集上清液，即为抗血清，-20℃保存。
实施例3卡洛芬抗血清的鉴定
采用间接竞争ELISA方法，对实施例2得到的抗血清进行鉴定。具体操作步骤如下：
(1)包被：用CB液将卡洛芬包被原稀释到1μg/mL，每孔100μL加至酶标板，37℃孵育2小时；
(2)洗涤：倾去孔内液体，用洗涤液洗3遍，每次1min，在吸水纸上拍干；
(3)封闭：每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1小时，洗涤；
(4)加样：每孔加入50μL PBS稀释的系列浓度的卡洛芬标准品和50μL工作浓度的抗血清，37℃孵育30min，洗涤；
(5)加二抗：每孔加入100μL HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育30min，洗涤；
(6)显色：每孔加入100μL新鲜配制的TMB溶液，37℃避光显色15min；
(7)终止：每孔加入50μL浓度为2mol/L的H2SO4溶液终止反应；
(8)读数：用酶标仪读取各孔的OD450nm值；
(9)建立标准曲线：以CPF标准品浓度的对数值为横坐标，以各浓度标准品对应的OD值为纵坐标，绘制标准抑制曲线，并计算IC50值。
三免后的抗血清鉴定结果如图2所示，由标准曲线计算得到该卡洛芬抗血清的IC50为0.33ng/mL。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.卡洛芬人工抗原，其特征在于，其结构式如式Ⅰ所示。
Figure FDA0003132114370000011
式Ⅰ中，n为1-100的自然数，K表示载体蛋白。
2.如权利要求1所述的卡洛芬人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清白蛋白或血蓝蛋白。
3.根据权利要求2所述的卡洛芬人工抗原，其特征在于，当K为血蓝蛋白时，作为免疫原；当K为牛血清白蛋白时，作为包被原。
4.如权利要求1所述的卡洛芬人工抗原的合成方法，其特征在于，其是使用卡洛芬作为半抗原与载体蛋白进行化学偶联得到。
5.根据权利要求4所述的卡洛芬人工抗原的合成方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将卡洛芬、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，反应4-48小时，得到A液；
(2)将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中得到B液；
(3)将A液和B液混合，室温反应6-48小时，得到式I所示的卡洛芬人工抗原。
6.根据权利要求4所述的卡洛芬人工抗原的合成方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将10-60mg卡洛芬、10-60mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10-40mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于0.2-2mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌反应4-48小时，得到A液；
(2)将10-70mg载体蛋白溶解于10mL浓度为0.01M，pH为7.4的磷酸盐缓冲液中得到B液；
(3)将A液逐滴加入到B液中，室温搅拌，过夜反应；
(4)纯化：将上述反应液在PBS中透析1-3天，即得到式I所示的卡洛芬人工抗原。
7.卡洛芬抗体，其特征在于，其是由权利要求3所述的卡洛芬免疫抗原经动物免疫得到。
8.根据权利要求7所述的卡洛芬抗体，其特征在于，其包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。
9.如权利要求1所述的卡洛芬人工抗原的以下任一应用：
(1)在检测卡洛芬中的应用；
(2)在制备卡洛芬的检测试剂盒中的应用；
(3)在制备卡洛芬的免疫层析试纸条中的应用。
10.如权利要求7所述的卡洛芬抗体的以下任一应用：
(1)在检测卡洛芬中的应用；
(2)在制备卡洛芬的检测试剂盒中的应用；
(3)在制备卡洛芬的免疫层析试纸条中的应用。
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