CN113430281B - 一种鉴别凸颅鼢鼠物种的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴别凸颅鼢鼠的试剂盒，包括检测待检物种的如下14个SNP位点的试剂：12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位，SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位，SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位，SEQID NO:11所示保守motif序列的第47位，SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位、第2位，SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位；16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位，SEQ IDNO:12所示保守motif序列的第35位，SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位、第31位。本发明可以简便准确地将凸颅鼢鼠属内个体鉴定到物种，解决了通过形态进行凸颅鼢鼠物种鉴定的难题，具有优异的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别凸颅鼢鼠物种的试剂盒及方法。
背景技术
鼢鼠是鼢鼠亚科(Myospalacinae)动物的统称，是一种适应地下生活的啮齿类动物。
鼢鼠体型粗壮、圆柱形，头宽扁，头部具有触须，鼻端平钝，有裸露鼻垫，尾及四肢短，眼睛极小，视力差，几乎被毛所隐盖，耳廓退化，隐于毛下。鼢鼠终生营地下生活，夜间偶尔到地面活动。鼢鼠挖洞速度极快，用前肢挖土，用头推土，每个个体都有独立的洞穴系统，洞道长且结构复杂，洞道上方形成土丘或隆起，主洞道有许多分支，洞道在地面无明显洞口。鼢鼠食谱广，主要采食植物的地下块状根茎及果实和种子，在洞穴中储存大量食物。
我国是鼢鼠的主要分布区，几乎囊括了所有的化石种和现存种，现存鼢鼠依据颅骨枕部形态分为平颅鼢鼠属(Myospalax)和凸颅鼢鼠属(Eospalax)，其中凸颅鼢鼠属只分布在中国。平颅鼢鼠属内物种较少，目前普遍认为平颅鼢鼠属下有3个物种，即草原鼢鼠(M.aspalax)、阿尔泰鼢鼠(M.myospalax)和东北鼢鼠(M.psilurus)；凸颅鼢鼠属下有6个物种：中华鼢鼠(E.fontanieri)、甘肃鼢鼠(E.cansus)、秦岭鼢鼠(E.rufescens)、罗氏鼢鼠(E.rothschildi)、斯氏鼢鼠(E.smithi)和高原鼢鼠(E.baileyi)。
鼢鼠几乎终生都生活在密闭的地下洞道系统中，独特的地下生活方式使得其在觅食、婚配、繁殖等多方面具有特殊性，引起了科学家的广泛兴趣。识别鉴定生物种类是认识和保护生物多样性的基础，每种生物只有能够被准确识别后，才能开展更多领域的研究和资源利用。但是由于不同鼢鼠生活环境相似而形态趋同，尤其是凸颅鼢鼠属物种形态鉴定难度大，幼体和亚成体头骨鉴定特征不明显，未经专业分类训练通过形态进行物种准确鉴定非常困难。
因此，研究一种能够快速、准确进行凸颅鼢鼠物种鉴定的方法与试剂，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够简便、准确鉴定凸颅鼢鼠物种的试剂盒和方法，解决通过形态进行鼢鼠物种鉴定的难题。
本发明提供了一种鉴别凸颅鼢鼠物种的试剂盒，它包括同时检测待检物种的如下14个SNP位点的试剂：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位，SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位，SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位，SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位，SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位、第2位，SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位；
16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位，SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位，SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位、第31位。
进一步地，上述SNP位点的碱基如下：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位为A，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位为T；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位为T，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位为T，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位为T；
或16S rRNA基因中的SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位为A；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位为G，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位为C；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位为T、第2位为G；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位为C，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位为C，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位为G、第31位为C。
更进一步地，上述试剂为：测序用试剂、KASP方法用试剂或限制性片段长度多态性方法用试剂。
更进一步地，上述试剂盒还包括扩增12S rRNA基因和16S rRNA基因保守motif序列的试剂；所述保守motif序列为SEQ ID NO:5～16所示的序列。
优选地，上述试剂包括SEQ ID NO:1～2所示的引物对和SEQ ID NO:3～4所示的引物对。
本发明还提供了扩增12S rRNA基因和16S rRNA基因保守motif序列的试剂在鉴别凸颅鼢鼠物种的试剂盒中的用途，所述保守motif序列是SEQ ID NO:5～16所示的序列。
进一步地，上述试剂包括SEQ ID NO:1～2所示的引物对和SEQ ID NO:3～4所示的引物对。
本发明还提供了一种鉴别凸颅鼢鼠物种的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检鼢鼠样本的基因组总DNA；
(2)检测如下14个物种特异性SNP位点，分析即可：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位，SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位，SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位，SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位，SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位、第2位，SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位；
16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位，SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位，SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位、第31位；
优选的，步骤(1)所述的样本为组织样本或血液样本。
进一步地，上述步骤(2)所述检测的步骤如下：
1)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用扩增试剂进行PCR扩增得到扩增产物；
2)对步骤1)所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
3)对步骤2)的检测结果中在490bp有明亮条带的12S rRNA基因PCR扩增产物和1450bp的明亮条带的16S rRNA基因PCR扩增产物进行测序，得到12S rRNA和16S rRNA基因序列；
4)对步骤3)得到的12S rRNA基因序列和16S rRNA基因序列中的如下14个物种特异性SNP位点进行分析：12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位，SEQID NO:6所示保守motif序列的第18位，SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位，SEQ IDNO:8所示保守motif序列的第7位，SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位，SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位、第2位，SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位，SEQ IDNO:15所示保守motif序列的第25位；
16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位，SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位，SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位、第31位；
优选地，步骤1)所述扩增试剂包括SEQ ID NO:1～2所示的引物对和SEQ ID NO:3～4所示的引物对；所述的PCR扩增的退火温度52～56℃；步骤3)所述测序为双向Sanger测序。
更进一步地，上述物种特异性SNP位点的碱基如下，则待检鼢鼠为凸颅鼢鼠：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位为A，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位为T；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位为T，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位为T，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位为T；
或16S rRNA基因中的SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位为A；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位为G，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位为C；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位为T、第2位为G；
或12S rRNA基因中的SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位为C，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位为C，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位为G、第31位为C；
优选地，上述物种特异性SNP位点的碱基如下：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位为A，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位为T，则为中华鼢鼠；
或，上述物种特异性SNP位点的碱基如下：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位为T，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位为T，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位为T，则为斯氏鼢鼠；
或，上述物种特异性SNP位点的碱基如下：
16S rRNA基因中的SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位为A，则为罗氏鼢鼠；
或，上述物种特异性SNP位点的碱基如下：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位为G，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位为C，则为秦岭鼢鼠；
或，上述物种特异性SNP位点的碱基如下：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位为T、第2位为G，则为高原鼢鼠；
或，上述物种特异性SNP位点的碱基如下：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位为C，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位为C，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位为G、第31位为C，则为甘肃鼢鼠。
本发明的有益效果：本发明引物对特异性良好，利用其进行PCR，不与目标以外的DNA片段产生非特异扩增；扩增目的基因为线粒体单拷贝基因，不需要克隆，可以直接用于测序，方法简单。本发明提供的凸颅鼢鼠物种保守motif序列，可辅助确定凸颅鼢鼠物种特异性SNP位点在12S rRNA和/或16S rRNA基因片段(DNA条形码)中的位置，便于所述SNP位点基因型的确定。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1、12S rRNA基因用于凸颅鼢鼠物种鉴别的SNP位点。
图2、16S rRNA基因用于凸颅鼢鼠物种鉴别的SNP位点。
图3、实施例3中编号ZYX-4的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(中华鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:5)。
图4、实施例3中编号ZYX-4的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(中华鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:6的反向互补序列)。
图5、实施例3中编号MX-16的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(斯氏鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:7)。
图6、实施例3中编号MX-16的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(斯氏鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:8)。
图7、实施例3中编号MX-16的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(斯氏鼢鼠保守motif 3，序列SEQ ID NO:9的反向互补序列)。
图8、实施例3中编号ZBX-4的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(罗氏鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:10)。
图9、实施例3中编号TCX-7的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(秦岭鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:11)。
图10、实施例3中编号TCX-7的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(秦岭鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:12)。
图11、实施例3中编号CD-8的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(高原鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:13)。
图12、实施例3中编号FFX-5的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(甘肃鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:14)。
图13、实施例3中编号FFX-5的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(甘肃鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:15)。
图14、实施例3中编号FFX-5的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(甘肃鼢鼠保守motif 3，序列SEQ ID NO:16的反向互补序列)。
图15、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(中华鼢鼠保守motif1，序列SEQ ID NO:5所在位置)。
图16、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(中华鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:6的反向互补序列所在位置)。
图17、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(斯氏鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:7所在位置)。
图18、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(斯氏鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:8所在位置)。
图19、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(斯氏鼢鼠保守motif 3，序列SEQ ID NO:9的反向互补序列所在位置)。
图20、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(罗氏鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:10所在位置)。
图21、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(秦岭鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:11所在位置)。
图22、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(秦岭鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:12所在位置)。
图23、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(高原鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:13所在位置)。
图24、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(甘肃鼢鼠保守motif 1，序列SEQ ID NO:14所在位置)。
图25、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠12S rRNA基因PCR产物测序峰图(甘肃鼢鼠保守motif 2，序列SEQ ID NO:15所在位置)。
图26、实施例3中编号WCX-3的鼢鼠16S rRNA基因PCR产物测序峰图(甘肃鼢鼠保守motif 3，序列SEQ ID NO:16的反向互补序列所在位置)。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照以下实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商建议的条件；实施例中所用到的各种化学试剂均可以商购获得，所用引物委托合成。
实施例1、本发明鉴别凸颅鼢鼠的试剂盒
本发明试剂盒的组分包括：
(1)PCR扩增试剂：包含SEQ NO:1～2和SEQ NO:3～4的引物对；(2)测序用试剂。
实施例2、PCR引物设计与SNP位点的验证
发明人对8个鼢鼠物种121个鼢鼠个体的线粒体基因组序列进行比对，发现12SrRNA基因存在8个凸颅鼢鼠物种特异性SNP，16S rRNA基因存在6个凸颅鼢鼠物种特异性SNP。
8个鼢鼠物种121个鼢鼠个体，其中草原鼢鼠12个、东北鼢鼠10个、中华鼢鼠15个、斯氏鼢鼠18个、罗氏鼢鼠16个、高原鼢鼠14个、甘肃鼢鼠24个、秦岭鼢鼠12个。
将12S rRNA和16S rRNA及附近基因序列，在保守区设计引物如下：
ME12S-1L：AGCACTGAAAATGCTTAGATGG(SEQ ID NO:1)；
ME12S-1R：CGGCTAAGCATAGTGGGGTA(SEQ ID NO:2)。
ME16S-1L：AGAGGAGATAAGTCGTAACAAGGT(SEQ ID NO:3)
ME16S-1R：TCCTGATCCAACATCGAGGT(SEQ ID NO:4)
使用上述引物对不同鼢鼠物种的DNA样本进行扩增，确认用于凸颅鼢鼠物种鉴定的12S rRNA基因和的16S rRNA基因的14个SNP位点，位点名称中12S表示该位点位于12SrRNA基因上，16S表示该位点位于16S rRNA基因上，其后的数字表示序列比对后，该位点在序列中的位置，中间用“-”连接。具体如下：
1)中华鼢鼠物种特异性SNP位点：12S-310，基因型为A；16S-1313，基因型为T；
2)斯氏鼢鼠物种特异性SNP位点：12S-133，基因型为T；12S-455，基因型为T；16S-1328，基因型为T；
3)罗氏鼢鼠物种特异性SNP位点：16S-392，基因型为A；
4)秦岭鼢鼠物种特异性SNP位点：12S-323，基因型为G；16S-393，基因型为C；
5)高原鼢鼠物种特异性SNP位点：12S-141，基因型为T；12S-142，基因型为G；
6)甘肃鼢鼠物种特异性SNP位点：12S-330，基因型为C；12S-433，基因型为C；16S-1317，基因型为G；16S-1326，基因型为C。
每个物种特异性SNP位点附近存在物种保守motif序列，具体如下：
1)中华鼢鼠保守motif 1如序列表中SEQ ID NO:5所示，序列第37位为SNP位点12S-310；
2)中华鼢鼠保守motif 2如序列表中SEQ ID NO:6所示，序列第18位为SNP位点16S-1313；
3)斯氏鼢鼠保守motif 1如序列表中SEQ ID NO:7所示，序列第33位为SNP位点12S-133；
4)斯氏鼢鼠保守motif 2如序列表中SEQ ID NO:8所示，序列第7位为SNP位点12S-455；
5)斯氏鼢鼠保守motif 3如序列表中SEQ ID NO:9所示，序列第33位为SNP位点16S-1328；
6)罗氏鼢鼠保守motif 1如序列表中SEQ ID NO:10所示，序列第34位为SNP位点16S-392；
7)秦岭鼢鼠保守motif 1如序列表中SEQ ID NO:11所示，序列第47位为SNP位点12S-323；
8)秦岭鼢鼠保守motif 2如序列表中SEQ ID NO:12所示，序列第35位为SNP位点16S-393；
9)高原鼢鼠保守motif 1如序列表中SEQ ID NO:13所示，序列第1位为SNP位点12S-141，第2位为SNP位点12S-142；
10)甘肃鼢鼠保守motif 1如序列表中SEQ ID NO:14所示，序列第4位为SNP位点12S-330；
11)甘肃鼢鼠保守motif 2如序列表中SEQ ID NO:15所示，序列第25位为SNP位点12S-433；
12)甘肃鼢鼠保守motif 3如序列表中SEQ ID NO:16所示，序列第22位为SNP位点16S-1317，第31位为SNP位点16S-1326。
实施例3、凸颅鼢鼠物种鉴别
首先合成12S rRNA基因片段引物对(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和16S rRNA基因片段引物对(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)。
采用如下方法进行鉴别：
a)利用凯杰DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒，分别提取编号为ZYX-4、MX-16、ZBX-4、TCX-7、CD-8、FFX-5、WCX-3的鼢鼠的组织样本的基因组总DNA；
b)以步骤a)所述的基因组总DNA为模板，利用所述12S rRNA引物对和16S rRNA引物对分别进行PCR反应，ZYX-4退火温度52℃，MX-16退火温度56℃，ZBX-4退火温度52℃，TCX-7退火温度56℃，CD-8退火温度56℃，FFX-5退火温度56℃，WCX-3退火温度55℃。
c)对步骤b)所得PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察到490bp左右和1450bp左右的明亮条带；
d)对步骤c)的PCR产物分别进行双向Sanger测序，获得12S rRNA基因和16S rRNA基因测序峰图；
e)在所得测序峰图中找到SEQ ID NO:5～16的保守motif序列，分析SNP位点碱基。
结果如下：
(1)ZYX-4鼢鼠：SEQ ID NO:5的序列中第37位碱基为A(图3)；SEQ ID NO:6所示的序列中第18位碱基为T(图4)。
即判断编号ZYX-4的样本为凸颅鼢鼠属的中华鼢鼠。
(2)MX-16鼢鼠：SEQ ID NO:7的序列中第33位碱基为T(图5)；SEQ ID NO:8所示的序列中第7位碱基为T(图6)；SEQ ID NO:9所示的序列中第33位碱基为T(图7)。
即判断编号MX-16的样本是凸颅鼢鼠属的斯氏鼢鼠。
(3)ZBX-4鼢鼠：SEQ ID NO:10的序列中第34位碱基为A(图8)。
即判断编号ZBX-4的样本是凸颅鼢鼠属的罗氏鼢鼠。
(4)TCX-7鼢鼠：SEQ ID NO:11的序列中第47位碱基为G(图9)；SEQ ID NO:12所示的序列中第35位碱基为C(图10)。
即判断编号TCX-7的样本是凸颅鼢鼠属的秦岭鼢鼠。
(5)CD-8鼢鼠：SEQ ID NO:13的序列中第1位碱基为T，第2位碱基为G(图11)。
即判断编号CD-8的样本是凸颅鼢鼠属的高原鼢鼠。
(6)FFX-5鼢鼠：SEQ ID NO:14的序列中第4位碱基为C(图12)；SEQ ID NO:15所示的序列中第25位碱基为C(图13)；SEQ ID NO:16所示的序列中第22位碱基为G，第31位碱基为C(图14)。
即判断编号FFX-5的样本为凸颅鼢鼠属的甘肃鼢鼠。
(7)WCX-3鼢鼠：SEQ ID NO:5的序列中第37位碱基不为A(图15)；SEQ ID NO:6所示的序列中第18位碱基不为T(图16)；SEQ ID NO:7的序列中第33位碱基不为T(图17)；SEQ IDNO:8所示的序列中第7位碱基不为T(图18)；SEQ ID NO:9所示的序列中第33位碱基不为T(图19)；SEQ ID NO:10的序列中第34位碱基不为A(图20)；SEQ ID NO:11的序列中第47位碱基不为G(图21)；SEQ ID NO:12所示的序列中第35位碱基不为C(图22)；SEQ ID NO:13的序列中第1位碱基不为T，第2位碱基不为G(图23)；SEQ ID NO:14的序列中第4位碱基不为C(图24)；SEQ ID NO:15所示的序列中第25位碱基不为C(图25)；SEQ ID NO:16所示的序列中第22位碱基不为G，第31位碱基不为C(图26)。
即判断编号WCX-3的样本不属于凸颅鼢鼠属物种。
另外，通过传统形态鉴定方式，对编号为ZYX-4、MX-16、ZBX-4、TCX-7、CD-8、FFX-5、WCX-3的鼢鼠进行鉴别。
ZYX-4个体体型大，额部具白斑，鼻垫椭圆，尾较长，裸露；头骨脑颅枕部隆起，鼻垫椭圆形，颧弓扩展程度低，颧弓最宽处位于偏后部，顶嵴平行，眶上嵴、枕中嵴不发达，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，第三上臼齿(M3)具后伸叶，这些特征中华鼢鼠相符，表明是中华鼢鼠。
MX-16个体鼻垫僧帽状，尾被密毛，头骨脑颅枕部隆起，颧弓非常扩展，其前部明显宽于后部，额顶嵴在中缝处相当靠近；门齿孔被前颌骨包围，这些特征与斯氏鼢鼠相符，表明是斯氏鼢鼠。
ZBX-4个体体型小，前爪明显纤弱，鼻垫僧帽状，尾被密毛；头骨脑颅枕部隆起，颧弓扩展，顶嵴平行，不在中缝处靠近，在额部内折靠近，向前与发达的眶上嵴联合，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，证实了ZBX-4为罗氏鼢鼠。
TCX-7个体鼻垫僧帽状，尾被密毛；头骨脑颅枕部隆起，颧弓扩展，额、顶嵴明显靠近，顶嵴间距大于额嵴，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，这些特征与秦岭鼢鼠相符，表明是秦岭鼢鼠。
CD-8鼢鼠鼻垫僧帽状，尾被密毛；头骨脑颅枕部隆起，颧弓较扩展，顶嵴不在中缝处会和，门齿孔被前颌骨包围，这些特征与高原鼢鼠相符，确定是高原鼢鼠。
FFX-5个体鼻垫椭圆形，尾长裸露或被稀白毛；头骨脑颅枕部隆起，颧弓扩展，顶嵴平行，在额部内折靠近，与发达的眶上嵴联合，枕中嵴发达，门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，第三上臼齿(M3)不具后伸叶，这些特征都符合甘肃鼢鼠的形态鉴定特征，表明是甘肃鼢鼠。
WCX-3头骨脑颅枕部不隆起，顶-枕嵴水平成截切状，证实了WCX-3不是凸颅鼢鼠属物种，而是平颅鼢鼠属物种；它的门齿孔被前颌骨和上颌骨包围，M1内侧有一个内凹角，M3短小，鼻骨后缘无缺刻，这些特征都符合草原鼢鼠的形态鉴定特征，表明WCX-3是平颅鼢鼠属的草原鼢鼠。
实验结果说明，本发明鉴别凸颅鼢鼠物种的方法准确，可以实际用于进行凸颅鼢鼠物种的鉴别检测。
综上，本发明提供了一种简便、准确鉴定凸颅鼢鼠物种的试剂盒以及鉴定凸颅鼢鼠的方法，解决了通过形态进行鼢鼠物种鉴定的难题，在鼢鼠的物种鉴别中具有优异的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院西北高原生物研究所
<120> 一种鉴别凸颅鼢鼠的试剂盒及方法
<130> GY417-2021P0113700CC
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> ME12S-1L
<400> 1
agcactgaaa atgcttagat gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> ME12S-1R
<400> 2
cggctaagca tagtggggta 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> ME16S-1L
<400> 3
agaggagata agtcgtaaca aggt 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> ME16S-1R
<400> 4
tcctgatcca acatcgaggt 20
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 中华鼢鼠motif1
<400> 5
ggtaaatttc gtgccagcca ccgcggtcat acgattaacc caaa 44
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 中华鼢鼠motif2
<400> 6
cctccgaata acaaaactaa gacctacaag tcaaagt 37
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 斯氏鼢鼠motif1
<400> 7
cccgcaccag tgaaaaaatc cctaaaaatc ttt 33
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 斯氏鼢鼠motif2
<400> 8
gtacgatagc taagatccaa actgggatta gatacc 36
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 斯氏鼢鼠motif3
<400> 9
cctccgaata acaaaaccaa gacttacaag tctaagt 37
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 罗氏鼢鼠motif1
<400> 10
cccgaaacca aacgagctac ctaagaacaa tttat 35
<210> 11
<211> 49
<212> DNA
<213> 秦岭鼢鼠motif1
<400> 11
aaatttcgtg ccagccaccg cggtcatacg attgacccaa actaatgat 49
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 秦岭鼢鼠motif2
<400> 12
cccgaaacca aacgagctac ctaagaacaa ttttctgaat 40
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 高原鼢鼠motif1
<400> 13
tgaaggagag ggtatcaagc acactta 27
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 甘肃鼢鼠motif1
<400> 14
acaccggcgt aaagcgtaca a 21
<210> 15
<211> 28
<212> DNA
<213> 甘肃鼢鼠motif2
<400> 15
actaaaatca ataacgaaag taatccta 28
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 甘肃鼢鼠motif3
<400> 16
cctccgaata acaaaaccaa ggcttacaag ccaaagt 37
Claims (4)
1.一种鉴别凸颅鼢鼠物种的方法，其特征在于，所述方法用于鉴别以下凸颅鼢鼠：中华鼢鼠、斯氏鼢鼠、罗氏鼢鼠、高原鼢鼠、甘肃鼢鼠、秦岭鼢鼠，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待检鼢鼠样本的基因组总DNA；
(2)检测如下14个物种特异性SNP位点，分析即可：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位，SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位，SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位，SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位，SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位、第2位，SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位；
16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位，SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位，SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位、第31位；
所述物种特异性SNP位点的碱基如下：
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位为A，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:6所示保守motif序列的第18位为T，则为中华鼢鼠；
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位为T，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位为T，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位为T，则为斯氏鼢鼠；
16S rRNA基因中的SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位为A，则为罗氏鼢鼠；
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位为G，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位为C，则为秦岭鼢鼠；
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位为T、第2位为G，则为高原鼢鼠；
12S rRNA基因中的SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位为C，SEQ ID NO:15所示保守motif序列的第25位为C，16S rRNA基因中的SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位为G、第31位为C，则为甘肃鼢鼠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本为组织样本或血液样本。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述检测的步骤如下：
1)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用扩增试剂进行PCR扩增得到扩增产物；
2)对步骤1)所得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
3)对步骤2)的检测结果中在490bp有明亮条带的12S rRNA基因PCR扩增产物和1450bp的明亮条带的16S rRNA基因PCR扩增产物进行测序，得到12S rRNA和16S rRNA基因序列；
4)对步骤3)得到的12S rRNA基因序列和16S rRNA基因序列中的如下14个物种特异性SNP位点进行分析：12S rRNA基因中的SEQ ID NO:5所示保守motif序列的第37位，SEQ IDNO:6所示保守motif序列的第18位，SEQ ID NO:7所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:8所示保守motif序列的第7位，SEQ ID NO:11所示保守motif序列的第47位，SEQ ID NO:13所示保守motif序列的第1位、第2位，SEQ ID NO:14所示保守motif序列的第4位，SEQ IDNO:15所示保守motif序列的第25位；
16S rRNA基因中的SEQ ID NO:9所示保守motif序列的第33位，SEQ ID NO:10所示保守motif序列的第34位，SEQ ID NO:12所示保守motif序列的第35位，SEQ ID NO:16所示保守motif序列的第22位、第31位。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述扩增试剂包括SEQ ID NO:1～2所示的引物对和SEQ ID NO:3～4所示的引物对；所述的PCR扩增的退火温度52～56℃；步骤3)所述测序为双向Sanger测序。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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