CN113425898A - 一种可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料及其制备方法。是在多聚赖氨酸软凝胶中装载纳米氟掺杂磷酸钙纳米颗粒，形成可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。多聚赖氨酸热可变软凝胶与磷酸钙类化合物结合后，形成蓬松的多孔结构，有利于细胞附着和繁殖，具有很好的生物相容性。多聚赖氨酸复合磷酸钙不仅可控降解并释放赖氨酸、氟离子、钙离子和磷酸根离子，促进骨细胞增殖，而且在实际临床使用过程中，还可以装载其它药物或生长因子。

Description

一种可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及到一种可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料及其制备方法。
背景技术：
材料的成骨性能一直以来是大部分骨科植入性医疗器械的首要临床要求，但是材料的抗感染或者抗菌性能(尤其是不依赖抗生素的抗感染或者抗菌性能)也不容忽视，抗感染性能逐渐成为骨科植入物的另一重要临床要求。开发同时具有成骨和抗感染性能的生物材料对于骨科临床具有重要意义。目前应用最广泛的抗菌剂，例如纳米银、纳米金、纳米铂、阿莫西林、万古霉素和庆大霉素都可以减少细菌感染。抗生素具有良好的抗菌活性，但抗生素的过多或不当使用易产生耐药性。其他金属抗菌剂的毒副作用也不容忽视，抗感染骨修复材料仍任重道远。
近年来，氟掺杂磷酸钙(FCaP)纳米涂层材料作为涂覆生物惰性表面的生物活性涂层表现出良好的性能，并且其致密的表面结构可以有效降低表面自由能，使细菌难以在其表面繁殖生长。FCaP在牙科领域和骨质疏松等治疗中均发挥了良好的作用。值得重视的是，骨是一种多相复合材料，由无机磷灰石相的纳米组装棒状晶体和有机I型胶原纤维组成。在磷灰石中引入可生物降解的聚合物是增强其成骨性能和拓宽其功能的一种有效方法。
发明内容：
本发明旨在提供了一种可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料及其制备方法，以克服现有磷酸钙生物降解性弱、抗生素耐药性、骨修复活性单一等缺陷，提供一种可降解、兼备抗菌和骨修复活性的复合支架材料，解决目前临床上复杂性骨缺损的抗感染问题。
本发明的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料的制备方法，其是在多聚赖氨酸软凝胶中装载纳米氟掺杂磷酸钙纳米颗粒，形成可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
优选，所述的多聚赖氨酸软凝胶是将多聚赖氨酸盐与醇铵类离子液体静电结合产生多聚赖氨酸软凝胶。
优选，具体步骤为：
在氮气气氛中，按4％-15％g/ml的比例将多聚赖氨酸加入到醇铵类离子液体中，40-50℃搅拌加热待多聚赖氨酸完全溶解后，继续搅拌直至形成多聚赖氨酸溶胶体；
在40-50℃条件下将可溶性钙离子溶液添加到多聚赖氨酸溶胶体中，搅拌均匀后，添加到磷酸盐水溶液中，同时使用氨水将pH保持在9-11之间，搅拌形成浑浊溶胶体；
向浑浊溶胶体中加入含氟离子液并转移至反应釜中，40-50℃条件下搅拌反应3-5小时，冷却至室温，用去离子水洗涤并真空抽滤纯化，再经真空冷冻干燥即得可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
优选，所述的添加到磷酸盐水溶液中是搅拌均匀后，以0.5-1.5mL/min流速通过注射管泵滴加到磷酸盐水溶液中。
优选，所述的钙离子和磷酸根离子加入物质的量比为(1～2):1。
优选，所述的磷酸根离子和氟离子的物质的量比为1：(0.003-0.03)。
优选，所述的醇胺离子液以羟基醇胺和酸进行酸碱中和反应而成。优选为：单(2-羟乙基)甲酸铵、双(2-羟乙基)甲酸铵、三(2-羟乙基)甲酸铵等一种或几种离子液或离子液混合液。
优选，所述含氟阴离子的离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸酯、1-乙基-2,3-二甲基咪唑鎓四氟硼酸酯、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
优选，所述的可溶性钙盐为氯化钙或四水硝酸钙。
优选，所述的磷酸盐水溶液为磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和/或磷酸二氢铵的水溶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)多聚赖氨酸盐是一类广谱抗菌多肽，而且能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，所以聚赖氨酸不但生物相容性好和可降解性，而且降解产物可以作为营养物质提供给缺损部位以促进骨再生。
2)多聚赖氨酸盐与醇铵类离子液体静电结合可以产生热可变软凝胶，可以形成独特的温热可逆软凝胶，在40-50℃区间可由凝胶转变成溶胶，具有良好的成膜性。聚赖氨酸在该离子液体中可长期保持化学结构和性能稳定性，并且聚赖氨酸无毒副作用，醇铵类离子液体属于低毒，其毒性远小于有机溶剂。
3)本发明以高亲水性含氟阴离子离子液用作前体，湿法原位合成含氟掺杂磷酸钙纳米颗粒。离子液体具有高热氧化稳定性、超分子网络和低毒性，与其他氟化氢、氟化钠、氟化铵或六氟磷酸相比，用含氟离子液体作为氟化物前体，更安全、高效且环境友好。氟掺杂磷灰石在人体体液中有更好的热稳定性、更高的结晶度，但是其更低的溶解度也限制了其应用范围。虽然氟离子具有一定的抗菌性，但是由于氟掺杂磷酸钙的溶解性差，氟离子降解速率慢，无法短期发挥抗菌性。为了避免氟掺杂磷酸钙类生物材料的长期植入后的细菌感染问题，本发明提供的抗菌多聚赖氨酸(PL)软凝胶装载纳米氟掺杂磷酸钙纳米颗粒，可加快氟掺杂磷酸钙的降解速率，提高体系抗菌活性。在多聚赖氨酸溶胶体系中，氟离子液体不但可以充当氟离子源和模板剂，还可以稳定多聚赖氨酸溶胶体系。
4)多聚赖氨酸热可变软凝胶与磷酸钙类化合物结合后，形成蓬松的多孔结构，有利于细胞附着和繁殖，具有很好的生物相容性。多聚赖氨酸复合磷酸钙不仅可控降解并释放赖氨酸、氟离子、钙离子和磷酸根离子，促进骨细胞增殖，而且在实际临床使用过程中，还可以装载其它药物或生长因子。
5)体外抗菌实验证实了本发明的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料具有很好的抑制金黄葡萄糖球菌和大肠杆菌的功能。
附图说明：
图1为实施例1中制备可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料的SEM图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
(1)在氮气气氛中，按15％(w/v g/ml)的比例将多聚赖氨酸粉末加入到单(2-羟乙基)甲酸铵离子液体中，40℃搅拌加热待多聚赖氨酸完全溶解后，恒温磁力搅拌30min以上，至形成多聚赖氨酸溶胶体；该溶胶体在冷却至40℃以下即变成凝胶状。
(2)在40℃条件下将0.003mol 20ml氯化钙溶液逐滴添加到1.4g多聚赖氨酸溶胶体中，搅拌均匀后，以0.5mL/min流速通过注射管泵添加到与0.002mol 20ml磷酸氢二钾水溶液中，同时使用氨水将pH保持在9-11之间，搅拌3h以上，至形成浑浊溶胶体。
(3)向浑浊溶胶中加入0.0015mmol 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸酯并转移至密封反应釜中，40℃条件下磁力搅拌保持3小时。冷却至室温，用去离子水多次洗涤真空抽滤纯化；最后将复合材料真空冷冻干燥即得可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料，其SEM图如图1所示，从图中可以看出，多聚赖氨酸热可变软凝胶与磷酸钙类化合物结合后，形成蓬松的多孔结构，有利于细胞附着和繁殖，具有很好的生物相容性。
运用Co-60辐照进行灭菌将本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料进行灭菌处理，称取1.0g浸泡于50mL模拟体液SBF缓冲液中进行为期21天的降解实验。在预设时间点取出25mL释放液，补充等量新鲜介质后继续振荡。取出液采用高效液相色谱法检测ε-聚赖氨酸释放量，采用离子色谱分析检测氟离子含量。
多聚赖氨酸的释放过程接近零级释放，21天释放量达33.7％。氟离子在降解初期的2天释放缓慢，释放率仅为0.72％；但是2天后开始释放加快，氟离子释放速率跟时间的平方根呈线性关系，12天释放率为14.5％；随后缓慢匀速降解，21天后氟离子释放率分别为18.85％。可见本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料先释放多聚赖氨酸，然后再缓慢降解有规律释放氟离子。
通过抑菌实验测试本实施例的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料的抗菌效果，具体方法如下：用接种环挑取已培养24h的供试细菌菌株一环于5mL的无菌生理盐水中，并进行梯度稀释，取浓度在103cfu/mL菌液100μL，加入100μL 20mg/L浓度的含可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料水悬液，涡旋振荡均匀后，进行涂布实验，每个梯度平行三组，以只有供试细菌没有材料处理的平板为对照，通过抑菌率＝(对照菌落数-处理菌落数)/对照菌落×100％计算抑菌率。实验证明在添加浓度为20mg/L时，本实施例的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料对金黄色葡萄球菌抑菌率达到95.2％，对大肠杆菌抑菌率达到97.4％，显示出良好的抗菌活性。
本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料用Co60进行灭菌处理，然后浸泡于无菌PBS缓冲液中，添加量为1.0mg/mL，缓慢振荡降解2天，离心取上清液即为材料浸提液。在细胞培养基中添加体积比10％的浸提液进行细胞培养，细胞浓度为1 × 104cells/well，在37℃,5％CO2细胞培养箱中培养24小时，运用CCK-8试剂盒测试细胞增殖性，以不添加浸提液，仅添加等量无菌PBS的作为对照，每个处理3个重复，增殖效果的计算公式是实验组/对照组*100％。实验证明：本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料在添加浓度为1.0mg/mL对纤维母细胞和成骨细胞的增殖效果可达126％和104％，具有良好的生物相容性。
实施例2
(1)在氮气气氛中，按10％(w/v g/ml)的量将多聚赖氨酸粉末加入到三(2-羟乙基)甲酸铵离子液体中，45℃搅拌加热待多聚赖氨酸完全溶解后，恒温磁力搅拌30min以上，至形成多聚赖氨酸溶胶体；该溶胶体在冷却至40℃以下即变成凝胶状。
(2)在45℃条件下将0.0025mol 20ml四水硝酸钙水溶液逐滴添加到1.8g多聚赖氨酸溶胶体中，搅拌均匀后，以1.0mL/min流速通过注射管泵添加到与0.0015mol 20ml的磷酸氢二铵水溶液中，同时使用氨水将pH保持在9-11之间，搅拌3h以上，至形成浑浊溶胶体。
(3)将浑浊溶胶体pH值调节为6.5，加入0.0075mmol 1-乙基-2,3-二甲基咪唑鎓四氟硼酸酯并转移至密封反应釜中，45℃条件下磁力搅拌保持4.5小时。冷却至室温，用去离子水多次洗涤真空抽滤纯化；最后将复合材料真空冷冻干燥即得可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
参考实施例1进行可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料的降解实验和抑菌实验。
多聚赖氨酸的释放过程接近零级释放，21天释放量达21.08％。氟离子在降解初期的2天释放缓慢，释放率仅为0.65％；但是2天后开始释放加快，氟离子释放速率跟时间的平方根呈线性关系，13天释放率为14.78％；随后缓慢匀速降解，21天后氟离子释放率分别为19.04％。可见本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料先释放多聚赖氨酸，然后再缓慢降解有规律释放氟离子。
抑菌实验表明，在添加浓度为20mg/L时，本实施例的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料对金黄色葡萄球菌抑菌率达到99.12％，对大肠杆菌抑菌率达到93.41％，显示出良好的抗菌活性。
本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料在添加浓度为1.0mg/mL对纤维母细胞和成骨细胞的增殖效果可达131％和107％，具有良好的生物相容性(参照实施例1中的实验方法)。
实施例3
(1)在氮气气氛中，按8％(w/v g/ml)的量将多聚赖氨酸粉末加入到单(2-羟乙基)甲酸铵+三(2-羟乙基)甲酸铵离子液体(体积比为：2:1)，40℃搅拌加热待多聚赖氨酸完全溶解后，恒温磁力搅拌30min以上，形成多聚赖氨酸溶胶体；该溶胶体在冷却至40℃以下即变成凝胶状。
(2)在40℃条件下将0.003mol 20ml四水硝酸钙溶液逐滴添加到1.8g多聚赖氨酸溶胶体中，搅拌均匀后，以0.5mL/min流速通过注射管泵添加到与0.003mol 20ml磷酸二氢钾溶液中，同时使用氨水将pH保持在9-11之间，搅拌3h以上，形成浑浊溶胶体。
(3)将浑浊溶胶体pH值调节为7，加入0.005mmol 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐并转移至密封反应釜中，40℃条件下磁力搅拌保持3小时。冷却至室温，用去离子水多次洗涤真空抽滤纯化；最后将复合材料真空冷冻干燥即得可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
参考实施例1进行磷酸钙复合材料的降解实验和抗菌实验。
多聚赖氨酸的释放过程接近零级释放，21天释放量达25.43％。氟离子在降解初期的2天释放缓慢，释放率仅为1.07％；但是36小时后开始释放加快，氟离子释放速率跟时间的平方根呈线性关系，11天释放率为15.37％；随后缓慢匀速降解，21天后氟离子释放率分别为20.16％。可见本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料先释放多聚赖氨酸，然后再缓慢降解有规律释放氟离子。
抑菌实验表明，在添加浓度为20mg/L时，本实施例中可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料对金黄色葡萄球菌抑菌率达到96.53％，对大肠杆菌抑菌率达到92.93％，显示出良好的抗菌活性。
本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料在添加浓度为1.0mg/mL对纤维母细胞和成骨细胞的增殖效果可达115％和117％，具有良好的生物相容性(参照实施例1的实验方法)。
实施例4
(1)在氮气气氛中，按4％(w/v g/ml)的比例将多聚赖氨酸粉末加入到单(2-羟乙基)甲酸铵+双(2-羟乙基)甲酸铵(体积比为3:1)，50℃搅拌加热待多聚赖氨酸完全溶解后，恒温磁力搅拌30min以上，形成多聚赖氨酸溶胶体；该溶胶体在冷却至40℃以下即变成凝胶状。
(2)在50℃条件下将0.004mol 20ml氯化钙水溶液逐滴添加到2.25g多聚赖氨酸溶胶体中，搅拌均匀后，以1.5mL/min流速通过注射管泵添加到与0.002mol 20ml磷酸二氢铵水溶液中，同时使用氨水将pH保持在9-11之间，搅拌3h以上，形成浑浊溶胶体。
(3)将浑浊溶胶体pH值调节为8，加入0.015mmol 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐并转移至密封反应釜中，50℃条件下磁力搅拌保持5小时。冷却至室温，形成凝胶体，去除上清液。添加适量去离子水并加热至50℃，待成溶胶后，搅拌30min，室温冷却，去除上清液，如此重复3-4次，纯化凝胶体；最后将凝胶体冷冻干燥即得可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
参考实施例1进行降解实验和抗菌实验。
多聚赖氨酸的释放过程接近零级释放，21天释放量达31.17％。氟离子在降解初期的2天释放缓慢，释放率仅为0.85％；但是2天后开始释放加快，氟离子释放速率跟时间的平方根呈线性关系，12天释放率为14.6％；随后缓慢匀速降解，21天后氟离子释放率分别为19.29％。可见本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料先释放多聚赖氨酸，然后再缓慢降解有规律释放氟离子。
抑菌实验表明，在添加浓度为20mg/L时，本实施例中可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料对金黄色葡萄球菌抑菌率达到99.18％，对大肠杆菌抑菌率达到97.66％，显示出良好的抗菌活性。
本实施例中的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料在添加浓度为1.0mg/mL对纤维母细胞和成骨细胞的增殖效果可达145％和127％，具有良好的生物相容性(参照实施例1的方法)。

Claims (10)

1.一种可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料的制备方法，其特征在于，是在多聚赖氨酸软凝胶中装载纳米氟掺杂磷酸钙纳米颗粒，形成可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的多聚赖氨酸软凝胶是将多聚赖氨酸盐与醇铵类离子液体静电结合产生多聚赖氨酸软凝胶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
在氮气气氛中，按4％-15％g/ml的比例将多聚赖氨酸加入到醇铵类离子液体中，40-50℃搅拌加热待多聚赖氨酸完全溶解后，继续搅拌直至形成多聚赖氨酸溶胶体；
在40-50℃条件下将可溶性钙离子溶液添加到多聚赖氨酸溶胶体中，搅拌均匀后，添加到磷酸盐水溶液中，同时使用氨水将pH保持在9-11之间，搅拌形成浑浊溶胶体；
向浑浊溶胶体中加入含氟离子液并转移至反应釜中，40-50℃条件下搅拌反应3-5小时，冷却至室温，用去离子水洗涤并真空抽滤纯化，再经真空冷冻干燥即得可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的添加到磷酸盐水溶液中是搅拌均匀后，以0.5-1.5mL/min流速通过注射管泵滴加到磷酸盐水溶液中。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的钙离子和磷酸根离子加入物质的量比为(1～2):1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸根离子和氟离子的物质的量比为1：(0.003-0.03)。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的醇胺离子液为：单(2-羟乙基)甲酸铵、双(2-羟乙基)甲酸铵、三(2-羟乙基)甲酸铵等一种或几种离子液或离子液混合液。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含氟阴离子的离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸酯、1-乙基-2,3-二甲基咪唑鎓四氟硼酸酯、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的可溶性钙盐为氯化钙或四水硝酸钙；所述的磷酸盐水溶液为磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和/或磷酸二氢铵的水溶液。
10.一种按照权利要求1-9任一项权利要求的制备方法制备得到的可降解抗感染磷酸钙骨修复复合材料。
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