CN113423840A - 多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解 - Google Patents

多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于多核苷酸的无模板酶促合成的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包括或能够实现使用内切核酸酶V活性和具有3’‑倒数第二脱氧肌苷的起始子使多核苷酸产物从其起始子有效裂解的步骤。

Description

多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解
背景
由于许多领域(诸如合成生物学、CRISPR-Cas9应用、高通量测序等)对合成多核苷酸的需求增加以及由于多核苷酸合成的化学方法的局限性二者，对多核苷酸合成的酶促方法的兴趣最近有所增加，Jensen等人，Biochemistry,57:1821-1832(2018)。目前，大多数酶促方法采用无模板聚合酶将3’-O-封闭的核苷三磷酸重复添加到附接至支持物上的单链起始子或延长的链中，随后是去封闭，直到获得期望序列的多核苷酸。设计这种酶促合成的实际实现方法的挑战之一是找到从起始子序列和支持物上裂解期望多核苷酸产物的成本效益且有效的方法。
鉴于以上所述，如果有可用于多核苷酸产物从其单链起始子的高效裂解的方法，多核苷酸的酶促合成将会得到推进。
发明概述
本发明涉及用于多核苷酸的无模板酶促合成的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包括或能够实现使用内切核酸酶V活性使多核苷酸产物从其起始子上有效裂解的步骤。
在一方面，本发明的方法包括通过以下步骤合成预定序列的多核苷酸的方法：a)提供具有在3’-末端核苷酸侧的倒数第二的脱氧肌苷的起始子，所述3’-末端核苷酸具有游离3’-羟基；b)重复以下循环：(i)使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和非模板依赖性DNA聚合酶在延伸条件下接触，使得所述起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，直到形成多核苷酸；并且c)将多核苷酸用内切核酸酶V活性进行处理，以将多核苷酸从起始子上裂解。
本发明通过提供在其3’末端倒数第二位置处具有脱氧肌苷的起始子，有利地克服了酶促多核苷酸合成领域中的上述问题。这允许单链起始子在其末端核苷酸处的有效裂解，释放具有5’-单磷酸的多核苷酸产物。
附图简述
图1示出了用于显示本发明裂解效率的实验装置。
图2示出了比较USER/脱氧尿苷裂解和Endo V/肌苷裂解的效率的数据。
发明详述
本文更详细地公开了本发明的一般原理，特别地通过实例的方式，诸如在附图中示出并详细描述的那些。然而，应该理解的是，本发明并非将本发明限制于所描述的特定的实施方案。本发明适用于各种修改和替代形式，其细节在若干实施方案中示出。本发明将覆盖落入本发明的原理和范围内的所有修改、等同物和替代物。
除非另外指出，否则本发明的实践可以采用有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述，这些都在本领域的技术内。这样的常规技术可以包括，但不限于，合成肽、合成多核苷酸、单克隆抗体的制备和使用，核酸克隆、扩增、测序和分析以及相关技术。这样的常规技术的方案可以见于来自制造商的产品文献和标准实验室手册中，诸如Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)；PCRPrimer:A Laboratory Manual；和Molecular Cloning:A Laboratory Manual(全部来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Lutz和Bornscheuer，编著，ProteinEngineering Handbook(Wiley-VCH,2009)；Hermanson，Bioconjugate Techniques，第2版(Academic Press,2008)；以及类似的参考文献。
本发明部分基于对使用内切核酸酶V活性和在起始子3’末端核苷酸侧的倒数第二的脱氧肌苷将多核苷酸产物从起始子上裂解与其他可裂解核苷酸诸如脱氧尿苷相比的效率的认识和理解。在一方面，认为通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在具有倒数第二脱氧肌苷的起始子上的合成起始比在其他可裂解核苷酸构型上的起始有效得多。
图1提供了采用具有倒数第二脱氧肌苷的起始子的无模板酶促合成方法的示意图。在该描述中示出了通过其5’末端附接至固体支持物(105)上的起始子(100)。每个起始子(102)在具有游离3’羟基的3’-末端核苷酸(106)隔壁具有3’-倒数第二脱氧肌苷(104)。在酶促掺入和去封闭的预定次数的循环之后，形成通过起始子(102)附接至固体支持物(105)上的多核苷酸产物。多核苷酸产物通过用内切核酸酶V活性处理附接的产物从起始子(102)和支持物(105)上裂解，该内切核酸酶V活性识别脱氧肌苷的存在并且在起始子末端核苷酸(106)的3’侧(112)上裂解链。在一些实施方案中，内切核酸酶V活性通过使用原核内切核酸酶V来提供。在仍其他实施方案中，内切核酸酶V是大肠杆菌(E.coli)内切核酸酶V。如本文使用的，术语“内切核酸酶V活性”意指催化单链DNA中以下裂解反应的酶活性：5’…NNINNNN…-3’→5’-…NNIN+5’-PO4-NNNN…-3’，其中N是任何核苷酸，并且I是脱氧肌苷。内切核酸酶V活性对多核苷酸(116)的裂解(114)在多核苷酸上留下5’-单磷酸，所述5’-单磷酸任选地可以通过将其用5’-磷酸酶处理的步骤去除。
具有内切核酸酶V活性的酶从商业酶供应商，例如，New England Biolabs(Beverly,MA,USA)、NzyTech(Lisbon,Portugal)处可得。这样的酶可以与供应商推荐的裂解缓冲液(cleavage buffer)(例如，50mM K-Ac、20mM Tris-Ac、10mM Mg-Ac、在pH 7.9的1mM DTT)一起使用。通常的裂解条件如下：在37℃，在50μl的Nzytech缓冲液中的70U的EndoV，用于在树脂上进行500pmol合成规模。通常的裂解时间是5至60分钟，或10至30分钟。任选地，以上酶的内切核酸酶活性可以通过在65℃或更高温度孵育20分钟而被热灭活。任选地，Nzytech内切核酸酶V包含His标签，该His标签允许在制备最终产品时方便地从反应混合物中去除酶。
无模板酶促合成
多核苷酸的无模板酶促合成可以通过多种已知的方案使用无模板聚合酶来进行，无模板聚合酶诸如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，包括其被工程化为更有效地适应3’-O-封闭的脱氧核苷三磷酸(3’-O-封闭的dNTP)的变体，例如Ybert等人，国际专利公布WO/2015/159023；Ybert等人，国际专利公布WO/2017/216472；Hyman，美国专利5436143；Hiatt等人，美国专利5763594；Jensen等人，Biochemistry,57:1821-1832(2018)；Mathews等人，Organic&Biomolecular Chemistry,DOI:0.1039/c6ob01371f(2016)；Schmitz等人，Organic Lett.,1(11):1729-1731(1999)。
在一些实施方案中，在每个合成步骤中，将核苷酸的有序序列在存在3’-O-可逆地封闭的dNTP的情况下使用TdT偶联至起始子核酸上。在一些实施方案中，合成寡核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3’-羟基的起始子；(b)使起始子或具有游离3’-羟基的延伸中间体与TdT在延伸条件下在存在3’-O-封闭的核苷三磷酸的情况下反应，以产生3’-O-封闭的延伸中间体；(c)使延伸中间体去封闭以产生具有游离3’-羟基的延伸中间体；和(d)重复步骤(b)和(c)，直至多核苷酸被合成。(有时“延伸中间体”也被称为“延长片段”)。在一些实施方案中，起始子以例如通过其5’末端附接至固体支持物上的寡核苷酸的形式提供。以上方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及去封闭步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括在预定孵育时间段或反应时间之后例如通过洗涤去除未掺入的核苷三磷酸的子步骤。这样的预定孵育时间段或反应时间可以是几秒(a few seconds)，例如30秒，至数分钟(several minutes)，例如30min。
以上方法还可以包括一个或更多个加帽步骤以及在反应或延伸步骤之后以及去封闭步骤之后的洗涤步骤。如以上提及的，在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中使非延伸的游离3’-羟基与阻止加帽链的任何进一步延伸的化合物反应。在一些实施方案中，这样的化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其他实施方案中，具有游离3’-羟基的非延伸链可以通过将其用3’-核酸外切酶活性，例如Exo I处理来降解。例如，参见Hyman，美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，未能够被去封闭的链可以被处理以去除该链或使其对进一步的延伸呈惰性。
在一些包括寡核苷酸的连续合成的实施方案中，加帽步骤可能是不期望的，因为加帽可能阻止等摩尔量的多于一种寡核苷酸的产生。在不加帽的情况下，序列将具有均匀分布的缺失错误，但是多于一种寡核苷酸中的每一种将以等摩尔量存在。在非延伸的片段被加帽时，情况并非如此。
在一些实施方案中，用于延伸或延长步骤的反应条件可以包括以下：2.0μM纯化的TdT；125-600μM 3’-O-封闭的dNTP(例如3’-O-NH2-封闭的dNTP)；约10mM至约500mM的二甲胂酸钾缓冲液(6.5与7.5之间的pH)和约0.01mM至约10mM的二价阳离子(例如CoC12或MnC12)，其中延伸反应可在50μL的反应体积中，在RT至45℃范围内的温度进行3分钟。在其中3’-O-封闭的dNTP是3’-O-NH2-封闭的dNTP的实施方案中，用于去封闭步骤的反应条件可以包括以下：700mM NaNO2；1M乙酸钠(用乙酸调节至在4.8-6.5范围内的pH)，其中去封闭反应可以在50μL体积中，在RT至45℃范围内的温度进行30秒至数分钟(several minutes)。
根据特定的应用，去封闭和/或裂解的步骤可以包括多种化学或物理条件，例如光、热、pH、特定试剂诸如能够裂解特定的化学键的酶的存在。选择3’-O-封闭基团和对应的去封闭条件的指导可以见于以下参考文献中，这些参考文献通过引用并入：美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公布WO91/06678；和下文引用的参考文献。在一些实施方案中，裂解剂(有时也被称为去封闭试剂或剂)是化学裂解剂，诸如，例如二硫苏糖醇(DTT)。在替代实施方案中，裂解剂可以是酶促裂解剂，诸如，例如，可以裂解3’-磷酸封闭基团的磷酸酶。本领域技术人员将理解，去封闭剂的选择取决于所使用的3’-核苷酸封闭基团的类型、是使用一个还是多于一个封闭基团、起始子是被附接至活细胞或生物体还是固体支持物等，这些都需要温和的处理。例如，膦诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)可以用于裂解3’O-叠氮甲基基团，钯络合物可以用于裂解3’O-烯丙基基团，或亚硝酸钠可以用于裂解3’O-氨基基团。在特定实施方案中，裂解反应涉及TCEP、钯络合物或亚硝酸钠。
如以上所述，在一些实施方案中，期望采用可以使用正交去封闭条件被去除的两个或更多个封闭基团。以下示例性封闭基团对可以用于并行合成实施方案，诸如以上描述的那些中。应当理解，用于在本发明的这些实施方案中使用的其他的封闭基团对，或者包含多于两个的基团可以是可用的。
3’-O-NH2 3’-O-叠氮甲基
3’-O-NH2 3’-O-烯丙基
3’-O-NH2 3’-O-磷酸
3’-O-叠氮甲基 3’-O-烯丙基
3’-O-叠氮甲基 3’-O-磷酸
3’-O-烯丙基 3’-O-磷酸
在活细胞上合成寡核苷酸需要温和的去封闭或去保护条件，即不会破坏细胞膜、使蛋白变性、干扰关键细胞功能等的条件。在一些实施方案中，去保护条件在与细胞存活相容的生理条件范围内。在这样的实施方案中，酶促去保护是期望的，因为它可以在生理条件下进行。在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团与特定的酶相关联以将其去除。例如，基于酯的或基于酰基的封闭基团可以用酯酶诸如乙酰酯酶或类似的酶去除，并且磷酸封闭基团可以用3’磷酸酶诸如T4多核苷酸激酶去除。通过实例的方式，3’-O-磷酸可以通过用100mM Tris-HCl(pH 6.5)10mM MgC12、5mM 2-巯基乙醇和一个单位T4多核苷酸激酶的溶液处理来去除。反应在37℃的温度进行1分钟。
“3'-磷酸封闭的”或“3’-磷酸保护的”核苷酸是指其中3’-位置处的羟基基团被含磷酸部分的存在封闭的核苷酸。根据本发明的3’-磷酸封闭的核苷酸的实例是核苷酸基-3'-磷酸单酯/核苷酸基-2',3'-环磷酸、核苷酸基-2'-磷酸单酯和核苷酸基-2'或3'-烷基磷酸二酯(nucleotidyl-2'or 3'-alkylphosphate diester)，以及核苷酸基-2'或3'-焦磷酸。也可以使用这样的化合物的硫代磷酸酯或其他类似物，条件是这种取代不阻止磷酸酶去磷酸化产生游离的3’-OH。
3’-O-酯保护的dNTP或3’-O-磷酸保护的dNTP的合成和酶促去保护的另外的实例描述于以下参考文献中：Canard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,92:10859-10863(1995)；Canard等人，Gene,148:1-6(1994)；Cameron等人，Biochemistry,16(23):5120-5126(1977)；Rasolonjatovo等人，Nucleosides&Nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999)；Ferrero等人，Monatshefte fur Chemie,131:585-616(2000)；Taunton-Rigby等人，J.Org.Chem.,38(5):977-985(1973)；Uemura等人，Tetrahedron Lett.,30(29):3819-3820(1989)；Becker等人，J.Biol.Chem.,242(5):936-950(1967)；Tsien，国际专利公布WO1991/006678。
如本文使用的，“起始子”(或等同术语，诸如，“起始片段(initiatingfragment)”、“起始子核酸(initiator nucleic acid)”、“起始子寡核苷酸(initiatoroligonucleotide)”等)是指可以被无模板聚合酶(诸如TdT)进一步延长的具有游离3’-末端的短寡核苷酸序列。在一种实施方案中，起始片段是DNA起始片段。在另一种实施方案中，起始片段是RNA起始片段。在一种实施方案中，起始片段具有3个与100个之间的核苷酸，特别地3个与20个之间的核苷酸。在一种实施方案中，起始片段是单链的。在替代实施方案中，起始片段是双链的。在特定实施方案中，用5’-伯胺合成的起始子寡核苷酸可以使用制造商的方案共价连接至磁珠上。同样，用3’-伯胺合成的起始子寡核苷酸可以使用制造商的方案共价连接至磁珠上。适用于与本发明实施方案一起使用的多种其他附接化学是本领域熟知的，例如Integrated DNA Technologies小册子，“Strategies for AttachingOligonucleotides to Solid Supports,”，第6卷(2014)；Hermanson,BioconjugateTechniques，第二版(Academic Press,2008)；和类似的参考文献。
本发明中采用的许多3’-O-封闭的dNTP可以从商业供应商处购买，或者使用公布的技术合成，例如美国专利7057026；国际专利公布WO2004/005667、WO91/06678；Canard等人，Gene(上文引用)；Metzker等人，Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994)；Meng等人，J.Org.Chem.,14:3248-3252(3006)；美国专利公布2005/037991。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括包含嘌呤碱基或嘧啶碱基和以下核糖或脱氧核糖糖部分的修饰的核苷酸或核苷分子，所述核糖或脱氧核糖糖部分具有与其共价附接的可去除的3’-OH封闭基团以使得3’碳原子已附接以下结构的基团
-O-Z
其中–Z是–C(R’)2-O-R”、-C(R’)2-N(R”)2、-C(R’)2-N(H)R”、-C(R’)2-S-R”和-C(R’)2-F中的任一个，其中每个R”是可去除的保护基团或可去除的保护基团的一部分；每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基团、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰氨基(amido)基团或通过连接基团附接的可检测的标记物；条件是在一些实施方案中，这样的取代基具有多达10个碳原子和/或多达5个氧或氮杂原子；或者(R’)2代表式＝C(R”’)2的基团，其中每个R”’可以是相同的或不同的并且选自包括氢原子和卤素原子以及烷基基团的组，条件是在一些实施方案中，每个R’”的烷基具有1个至3个碳原子；并且其中分子可以反应以产生中间体，在所述中间体中每个R”被交换为H，或当Z是–(R’)2-F时，F被交换为OH、SH或NH2，优选地OH，所述中间体在水性条件下解离以提供具有游离3’-OH的分子；条件是，当Z是-C(R’)2-S-R”时，两个R’基团均不是H。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的R’是烷基或取代的烷基，条件是，这样的烷基或取代的烷基具有1个至10个碳原子和0至4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的-Z是式-C(R’)2-N3。在某些实施方案中，Z是叠氮甲基基团。
在一些实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有200或更小分子量的可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有100或更小分子量的可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有50或更小分子量的可裂解有机部分。在一些实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有200或更小分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有100或更小分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有50或更小分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有200或更小分子量的酶促可裂解酯基团。在其他实施方案中，Z是可被3’-磷酸酶去除的磷酸基团。在一些实施方案中，以下3’-磷酸酶中的一种或更多种可以根据制造商推荐的方案使用：T4多核苷酸激酶、牛小肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如，从New England Biolabs,Beverly,MA可得的)。
在另外的特定实施方案中，3’-封闭的核苷酸三磷酸被3’-O-叠氮甲基、3’-O-NH2或3’-O-烯丙基基团封闭。
在仍其他实施方案中，本发明的3’-O-封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰乙基)和3’-O-炔丙基。
在一些实施方案中，3’-O-保护基团是电化学不稳定基团。即，保护基团的去保护或裂解通过改变保护基团附近的电化学条件(其导致裂解)来实现。电化学条件的这样的改变可以通过改变或施加物理量(诸如电压差或光)来激活辅助物质而引起，这继而引起保护基团位置处的电化学条件的改变，诸如pH值的增加或减少。在一些实施方案中，电化学不稳定基团包括例如每当pH改变至预定值时被裂解的对pH敏感的保护基团。在其他实施方案中，电化学不稳定基团包括每当还原或氧化条件(例如通过增加或减少保护基团位置处的电压差)改变时被直接裂解的保护基团。
在一些实施方案中，酶促合成方法采用对于3’-O-修饰的核苷三磷酸显示出增加的掺入活性的TdT变体。例如，这样的TdT变体可以使用Champion等人的美国专利10435676中描述的技术产生，该专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，采用了TdT变体，所述TdT变体具有与SEQ ID NO:2至少60％相同的氨基酸以及位置207处的第一精氨酸的取代和位置325处的第二精氨酸的取代或其功能等同残基。在一些实施方案中，采用了末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，所述末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体具有与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQID NO:15的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，具有相对于SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13在位置207处，相对于SEQ ID NO 5在位置206处，相对于SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 10在位置208处，相对于SEQ ID NO 11在位置205处，相对于SEQ ID NO 14在位置216处和相对于SEQID NO 15在位置210处的精氨酸(“第一精氨酸”)的取代；以及相对于SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 9和SEQ ID NO 13在位置325处，相对于SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4在位置324处，相对于SEQ ID NO 320在位置320处，相对于SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8在位置331处，相对于SEQ ID NO 11在位置323处，相对于SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 15在位置328处的取代和相对于SEQ ID NO 14在位置338处的精氨酸(“第二精氨酸”)的取代；或其功能等同残基；其中TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够将3’-O-修饰的核苷酸掺入到核酸片段的游离3'-羟基上。在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的SEQ ID NO的至少80％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的SEQID NO的至少90％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的SEQ IDNO的至少95％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少97％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少98％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少99％同一性。如本文使用的，用于比较参考序列与变体序列的同一性百分比值不包括包含变体序列取代明确指定的氨基酸位置；即，同一性关系百分比是在参考蛋白序列与变体中包含取代的明确指定位置之外的变体蛋白序列之间的关系。因此，例如，如果参考序列和变体序列各自包含100个氨基酸，并且变体序列在位置25和81处具有突变，那么同源性百分比将是关于序列1-24、26-80和82-100。
关于(ii)，这样的3’-O-修饰的核苷酸可以包含3’-O-NH2-核苷三磷酸、3’-O-叠氮甲基核苷三磷酸、3’-O-烯丙基核苷三磷酸、3’O-(2-硝基苄基)-核苷三磷酸或3’-O-炔丙基核苷三磷酸。
在一些实施方案中，本发明中使用的TdT变体具有表1所示的取代或其他TDT中功能等同的残基位置。
表1
Figure BDA0003206604630000101
如以上描述的本发明的TdT变体各自包含与指定SEQ ID NO具有序列同一性百分比的氨基酸序列，经历指示的取代的存在。在一些实施方案中，以这种方式描述的本发明的TdT变体与指定的SEQ ID NO之间的序列差异的数目和类型可能是由于取代、缺失和/或插入，并且被取代、缺失和/或插入的氨基酸可以包含任何氨基酸。在一些实施方案中，这样的缺失、取代和/或插入仅包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，取代仅包含保守的或同义的氨基酸改变，如Grantham,Science,185:862-864(1974)中描述的。即，氨基酸的取代仅能够发生在其同义氨基酸组的成员之间。在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸组列于表2A中。
表2A：氨基酸同义组I
Figure BDA0003206604630000111
在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸组列于表2B中。
表2B：氨基酸同义组II
Figure BDA0003206604630000121
试剂盒
本发明包括用于进行本发明方法的试剂盒。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括通过5’末端被附接至支持物上并且具有距离3’末端倒数第二的脱氧肌苷和游离3’-羟基的起始子。在一些实施方案中，本发明的试剂盒还包括能够裂解在起始子的末端核苷酸3’的起始子-多核苷酸缀合物的内切核酸酶V。在一些这样的试剂盒中，内切核酸酶V具有捕获部分，以允许从反应混合物中取出。在一些试剂盒中，这样的捕获部分是His标签。在一些实施方案中，试剂盒的起始子具有5’-dI-dT-3’的3’-末端序列。在一些实施方案中，试剂盒的起始子具有5’-dI-dG-3’的3’-末端序列。在一些实施方案中，试剂盒的起始子具有5’-dI-dA-3’的3’-末端序列。在一些实施方案中，试剂盒的起始子具有5’-dI-dT-3’、5’-dI-dG-3’或5’-dI-dA-3’的3’-末端序列。在一些实施方案中，这样的支持物是固体支持物。这样的固体支持物可以包括珠，诸如磁珠；平面固体，诸如玻璃载玻片或膜；或类似固体支持物。在一些实施方案中，本发明的试剂盒还可以包括无模板聚合酶和脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷中的一种或更多种的3’-O-封闭的核苷三磷酸。在一些试剂盒中，这样的无模板聚合酶可以是TdT。在一些实施方案中，这样的TdT可以是本文描述的TdT变体。在一些实施方案中，本发明的试剂盒还可以包括去封闭剂，该去封闭剂能够从掺入的3’-O-封闭的核苷酸中去除3’封闭基团。
实施例
在本实施例中，比较了使用脱氧肌苷/endo V裂解的效率与脱氧尿苷/USER裂解的效率，并且评估对邻近dI的核苷酸裂解的影响。在常规反应中将包含dI的5’-氨基多(dT)寡核苷酸使用EDC偶联至磁珠的羧基基团上。在所有实验中，起始子包含(1)5’-10mer多T区段，随后是脱氧肌苷和3’末端dT，或(2)5’-10mer多T区段，随后是末端脱氧尿苷。在一些实验中，起始子被延伸20mer多T区段，随后是用Cy5染料标记的最终dA，所有这些都使用TdT酶和3’-O-NH2-封闭的核苷三磷酸(除了标记的末端dA)。在其他实验中，起始子被指示的二核苷酸序列延伸，随后是18mer多(dT)和用Cy5染料标记的最终dA，所有这些都使用TdT酶和3’-O-NH2-封闭的核苷三磷酸(除了标记的末端dA)。如指示的(USER或Endo V)裂解之后，裂解的标记的多核苷酸通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
图2示出了比较具有末端脱氧尿苷的起始子的合成产物和具有倒数第二脱氧肌苷的起始子的合成产物的电泳数据。凝胶左侧四个梯状物(ladder)中对应于脱氧尿苷起始子的条带显示出比最右侧10个梯状物中来自脱氧肌苷起始子的对应条带显著更强的失败序列，表明具有倒数第二脱氧肌苷的起始子比具有末端脱氧尿苷的起始子导致更有效的合成。
定义
除非本文另外明确定义，否则本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书中的那些，例如，Kornberg和Baker,DNAReplication，第2版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry，第2版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics，第2版(Wiley-Liss,New York,1999)。
提及两种或更多种不同TdT中的氨基酸位置时，“功能等同”意指(i)在相应位置处的氨基酸在TdT的活性中发挥相同的功能作用，和(ii)氨基酸出现在相应TdT的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。基于序列比对和/或分子建模鉴定两种或更多种不同TdT的氨基酸序列中的在位置上等同或同源的氨基酸残基是可能的。在一些实施方案中，功能等同的氨基酸位置属于在进化相关物种(例如属、科等)的TdT的氨基酸序列中是保守的序列基序。这样的保守序列基序的实例描述于以下中：Motea等人，Biochim.Biophys.Acta.1804(5):1151-1166(2010)；Delarue等人，EMBO J.,21:427-439(2002)；以及类似的文献。
“试剂盒”是指用于递送用于进行本发明方法的材料或试剂的任何递送系统。在反应测定的情况下，这样的递送系统包括允许反应试剂(例如，适当容器中的荧光标记物，诸如相互猝灭的荧光标记物、荧光标记物连接剂、酶、猝灭剂等)和/或支持材料(例如，缓冲液，用于进行测定的书面说明等)从一个位置到另一个位置的储存、运输或递送的系统和/或化合物(诸如稀释剂、表面活性剂、运载体等)。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一种或更多种外罩(例如盒子)。这些内含物可以一起或单独地被递送到预期的接收者。例如，第一个容器可以包含用于测定的酶，而第二个或更多个容器包含相互猝灭的荧光标记物和/或猝灭剂。
可互换使用的“突变体”或“变体”是指来源于本文描述的天然或参考TdT多肽并且在一个或更多个位置处包含修饰或改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。变体可以通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，用于改变编码野生型蛋白的DNA序列的技术的实例包括，但不限于，定点诱变、随机诱变、序列改组和合成寡核苷酸构建。诱变活性包括在蛋白序列中或者在本发明的情况下聚合酶的序列中缺失、插入或取代一个或数个氨基酸。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换使用并且均意指核苷酸单体或其类似物的线性聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的常规模式特异性结合至天然多核苷酸，例如沃森-克里克型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen类型的碱基配对等。此类单体及其核苷间键可以是天然存在的，或者可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包含PNA、硫代磷酸核苷间连键、含有允许标记物(例如荧光团或半抗原)附接的连接基团的碱基等。每当使用寡核苷酸或多核苷酸要求酶促加工，例如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等时，普通技术人员将理解，在那些情况下，寡核苷酸或多核苷酸在任何或一些位置处将不含有核苷间键、糖部分或碱基的某些类似物。多核苷酸的尺寸通常范围为几个单体单元(a few monomericunits)例如5-40(此时多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”)至数千个单体单元。除非另外指定或从上下文明显的，否则每当多核苷酸或寡核苷酸以字母(大写或小写)序列诸如“ATGCCTG”表示时，应该理解的是该核苷酸从左至右是5’→3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另外说明，否则术语和原子编号惯例将遵循在Strachan和Read，Human MolecularGenetics2(Wiley-Liss,New York,1999)中公开的那些。通常多核苷酸包含由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷(对于DNA)或它们的核糖对应物(对于RNA))；然而，它们还可包含非天然的核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷间连键。本领域技术人员清楚，在酶的活性具有对特定的寡核苷酸或多核苷酸底物的要求的情况下，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则选择用于寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成完全是在普通技术人员的知识范围内，特别是在来自论文例如Sambrook等人，Molecular Cloning，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)以及类似的参考文献的指导下。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其相应互补物的双链体)。哪种形式是意图的或是否两种形式都是意图的将是普通技术人员从术语使用的上下文清楚的。
“引物”意指能够在与多核苷酸模板形成双链体后充当核酸合成的起始点并且从其3'末端沿模板延伸，从而形成延伸的双链体的天然或合成的寡核苷酸。引物的延伸通常用核酸聚合酶例如DNA或RNA聚合酶来进行。在延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。通常通过DNA聚合酶延伸引物。引物通常具有从14个核苷酸至40个核苷酸范围内或从18个核苷酸至36个核苷酸范围内的长度。引物用于各种核酸扩增反应，例如使用单一引物的线性扩增反应，或采用两种或更多种引物的聚合酶链式反应中。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导是本领域普通技术人员熟知的，如通过引用并入的以下参考文献所证明的：Dieffenbach，编著，PCR Primer:A Laboratory Manual，第2版(ColdSpring Harbor Press,New York,2003)。
“序列同一性”是指两个序列(诸如两个多肽序列或两个多核苷酸序列)之间匹配(例如相同的氨基酸残基)的数目(或分数，通常以百分比表示)。序列同一性可以通过将序列对齐使得重叠和同一性最大化同时使序列空位最小化时对序列进行比较来确定。特别地，序列同一性可以使用许多数学全局或局部比对算法中的任何一种来确定，这取决于两个序列的长度。相似长度的序列优选地使用全局比对算法(例如，Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970)进行比对，其将序列在整个长度上最优地对齐，而明显不同长度的序列优选地使用局部比对算法(例如，Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等人，1997；Altschul等人，2005)进行比对。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式，例如，使用可在互联网网站诸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或ttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上可得的公开可得的计算机软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序VERSION Needle生成的值，该程序VERSION Needle使用Needman-Wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对，其中所有检索参数被设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10并且末端空位延伸＝0.5。
“取代”意指一种氨基酸残基被另一种氨基酸残基替代。优选地，术语“取代”是指一种氨基酸残基被选自以下的另一种氨基酸残基替代：天然存在的标准20种氨基酸残基、罕见的天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和通常合成获得的非天然存在的氨基酸残基(例如环己基-丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指一种氨基酸残基被选自天然存在的标准20种氨基酸残基的另一种氨基酸残基替代。符号“+”指示取代的组合。氨基酸在本文中由它们的单字母或三字母代码根据以下命名法表示：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。在本文件中，使用以下术语指定取代：L238A表示亲本序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)被改变为丙氨酸(A)。A132V/I/M表示亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守的或非保守的取代。保守取代的实例在以下组内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
本公开内容不旨在限于所阐述的特定形式的范围，而是旨在覆盖在此描述的变型的替代、修改和等同物。此外，本公开内容的范围完全包含鉴于本公开内容对于本领域技术人员而言可能变得明显的其他变型。本发明的范围仅由所附权利要求来限定。
序列表
<110> DNA斯克瑞普特公司
<120> 多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解
<130> B2960PC00
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> TdT
<400> 1
Met Asp Pro Leu Gln Ala Val His Leu Gly Pro Arg Lys Lys Arg Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Gly Thr Pro Val Ala Ser Thr Pro Tyr Asp Ile Arg Phe
20 25 30
Arg Asp Leu Val Leu Phe Ile Leu Glu Lys Lys Met Gly Thr Thr Arg
35 40 45
Arg Ala Phe Leu Met Glu Leu Ala Arg Arg Lys Gly Phe Arg Val Glu
50 55 60
Asn Glu Leu Ser Asp Ser Val Thr His Ile Val Ala Glu Asn Asn Ser
65 70 75 80
Gly Ser Asp Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Gln Asn Ile Lys Ala Ser
85 90 95
Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Ile Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met Gly
100 105 110
Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Met Gly Arg His Gln Leu Val Val Asn
115 120 125
Arg Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
145 150 155 160
Leu Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala
165 170 175
Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met
180 185 190
Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met
195 200 205
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile
210 215 220
Ile Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val
225 230 235 240
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
245 250 255
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg
260 265 270
Thr Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met
275 280 285
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val
305 310 315 320
Thr Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg
325 330 335
Gly Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
340 345 350
Ala Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe
355 360 365
Trp Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr
370 375 380
Phe Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His
385 390 395 400
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His
405 410 415
Ser Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg
420 425 430
Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu
435 440 445
Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
450 455 460
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg
465 470 475 480
Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala
485 490 495
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
500 505 510
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)
<220>
<223> 截短的小鼠TdT
<400> 2
Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp
225 230 235 240
Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His Ser
275 280 285
Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 3
<211> 380
<212> PRT
<213> 牛科动物(BOVINE)
<400> 3
Asp Tyr Ser Ala Thr Pro Asn Pro Gly Phe Gln Lys Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Ser Glu Phe Lys Glu Asn Glu Val Ser Tyr Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Ala Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser
275 280 285
Lys Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 4
<211> 380
<212> PRT
<213> 人类(HUMAN)
<400> 4
Asp Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Pro Gly Pro Pro Lys Thr Pro Pro Ile
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Cys Val Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Gly Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Gln Lys Val Met Asn Leu Trp Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu
245 250 255
Lys Leu Arg Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln
260 265 270
Lys Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Pro Arg Gln Arg Val Asp Ser Asp
275 280 285
Gln Ser Ser Trp Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp
290 295 300
Leu Val Leu Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp
305 310 315 320
Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His
325 330 335
Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys
340 345 350
Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu
355 360 365
Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 5
<211> 376
<212> PRT
<213> 鸡(CHICKEN)
<400> 5
Gln Tyr Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Glu Val Ser Ser Phe Thr
1 5 10 15
Ala Ser Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn
20 25 30
Asn Cys Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Met Ala Glu Asn
35 40 45
Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala
50 55 60
Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Val Thr Arg Met Lys Asp
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Arg Val Arg Asp Val Ile Glu
85 90 95
Glu Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Ala Lys Asp Val Leu Asn
100 105 110
Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val
115 120 125
Gly Val Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Leu Arg Thr Val
130 135 140
Glu Glu Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Arg
145 150 155 160
Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala
165 170 175
Glu Ala Asp Ala Val Ser Ser Ile Val Lys Asn Thr Val Cys Thr Phe
180 185 190
Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys
195 200 205
Lys Ile Gly His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Gln Arg
210 215 220
Glu Asp Asp Glu Leu Leu His Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile
225 230 235 240
Ile Glu Ser Thr Phe Val Lys Glu Gln Ile Pro Ser Arg His Val Asp
245 250 255
Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Leu Tyr Gln
260 265 270
Pro Arg Val Asp Asn Ser Ser Tyr Asn Met Ser Lys Lys Cys Asp Met
275 280 285
Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Ile Thr
290 295 300
Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg
305 310 315 320
Gln Phe Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met
325 330 335
Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Arg Lys Arg Val Phe Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr
355 360 365
Val Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 6
<211> 387
<212> PRT
<213> 负鼠(POSSUM)
<400> 6
Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Ala Gly Thr Leu Asn Ile Leu Pro Pro
1 5 10 15
Thr Thr Lys Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Ile
20 25 30
Asn Asn His Asn Gln Arg Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Asp Asp Thr Cys Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Trp Ile Gly Asp Glu Val Lys Gly Ile Met
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Gln Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Leu Cys Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Asp Cys Val Ser Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Leu Leu Val Gln Asp Ala Val Trp Thr
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Glu Phe Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Glu Lys Glu Gln Glu Asp Gln Leu Leu Gln Lys Val Thr Asn Leu Trp
225 230 235 240
Lys Lys Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Asp Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Ile Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr His His Lys Glu Asp Lys
275 280 285
Arg Lys Trp Glu Met Pro Thr Gly Ser Asn Glu Ser Glu Ala Lys Ser
290 295 300
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Asp Arg Tyr
305 310 315 320
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp
325 330 335
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His
340 345 350
Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Lys Ser Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Gln Pro Ser Glu
370 375 380
Arg Asn Ala
385
<210> 7
<211> 381
<212> PRT
<213> 鼩鼱(SHREW)
<400> 7
Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser Ala
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe Trp
225 230 235 240
Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp Asp
275 280 285
Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 8
<211> 387
<212> PRT
<213> 蟒(PYTHON)
<400> 8
Glu Lys Tyr Gln Leu Pro Glu Asp Glu Asp Arg Ser Val Thr Ser Asp
1 5 10 15
Leu Asp Arg Asp Ser Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Lys Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Glu Asn Tyr Glu Phe Asn Glu Asn Lys Gly Phe Cys Thr Ala Phe Arg
50 55 60
Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Gln Val
65 70 75 80
His Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Met Gly Lys Gln Val Lys Gly Ile
85 90 95
Ile Glu Asp Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asp Asn Glu Asn Tyr Arg Ser Val Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
115 120 125
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ser Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg
130 135 140
Thr Leu Glu Glu Val Lys Arg Asp Lys Asn Leu Lys Leu Thr Arg Met
145 150 155 160
Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Asp Asp Leu Thr Ser Cys Val Ser
165 170 175
Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ala Ser Leu Ile Val Gln Asp Val Val Trp
180 185 190
Lys Ile Val Pro Asn Ala Ile Val Thr Ile Ala Gly Gly Phe Arg Arg
195 200 205
Gly Lys Gln Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Val Pro Gly
210 215 220
Ser Lys Gln Glu Glu Glu Glu Leu Leu His Thr Val Ile Asp Ile Trp
225 230 235 240
Lys Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Asp Thr Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Val His Lys Glu Arg Glu Asp Lys
275 280 285
Gly Asn Ser Ile Arg Ser Lys Ala Phe Ser Glu Glu Glu Ile Lys Asp
290 295 300
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Val Pro Phe Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Thr Gln Phe Glu Arg Asp
325 330 335
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His
340 345 350
Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Asn Ala Ala Ser Glu
355 360 365
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu
370 375 380
Arg Asn Ala
385
<210> 9
<211> 381
<212> PRT
<213> 犬(DOG)
<400> 9
Asp Tyr Thr Ala Ser Pro Asn Pro Glu Leu Gln Lys Thr Leu Pro Val
1 5 10 15
Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Tyr Asn Asn Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Phe Ser Leu Thr Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Gln Val Lys Cys Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Lys Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Pro Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Asp Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Gly Lys Cys Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 10
<211> 382
<212> PRT
<213> 截短的鼹鼠(TRUNC MOLE)
<400> 10
Gly Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met
50 55 60
Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met
65 70 75 80
Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val
85 90 95
Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val
100 105 110
Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe
115 120 125
Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg
130 135 140
Thr Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met
145 150 155 160
Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr
165 170 175
Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp
180 185 190
Ala Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg
195 200 205
Gly Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu
210 215 220
Ala Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe
225 230 235 240
Trp Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr
245 250 255
Phe Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His
260 265 270
Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp
275 280 285
Asp Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg
290 295 300
Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu
305 310 315 320
Gly Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala
325 330 335
Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys
340 345 350
Thr Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala
355 360 365
His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 11
<211> 379
<212> PRT
<213> 鼠兔截短物(PIKA TRUNK)
<400> 11
Glu Tyr Ser Ala Asn Pro Ser Pro Gly Pro Gln Ala Thr Pro Ala Val
1 5 10 15
Tyr Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn
20 25 30
His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr
35 40 45
Glu Phe Lys Glu Asn Glu Gly Cys Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala
50 55 60
Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Val Ser Met Lys Asp Thr
65 70 75 80
Glu Gly Ile Pro Cys Leu Glu Asp Lys Val Lys Ser Ile Met Glu Glu
85 90 95
Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Ser Asp
100 105 110
Glu Arg Tyr Gln Cys Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly
115 120 125
Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser
130 135 140
Asn Ile Arg Leu Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala
145 150 155 160
Gly Phe Arg Tyr Tyr Glu Asp Ile Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu
165 170 175
Ala Glu Ala Val Asp Val Leu Val Asn Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu
180 185 190
Pro Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys
195 200 205
Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Leu Thr Glu
210 215 220
Glu Asp Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys
225 230 235 240
Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys
245 250 255
Leu Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys
260 265 270
Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Tyr His Glu Arg Val Gly Gly Asp Arg
275 280 285
Cys Arg Gln Pro Glu Gly Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu
290 295 300
Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys His Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr
305 310 315 320
Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser His Glu
325 330 335
Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg
340 345 350
Val Phe Leu Gln Ala Glu Asn Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly
355 360 365
Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375
<210> 12
<211> 384
<212> PRT
<213> 截短的刺猬(TRUNC HEDGEHOG)
<400> 12
Asp Ala Ser Phe Gly Ser Asn Pro Gly Ser Gln Asn Thr Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ala Ile Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Ser Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
35 40 45
Asn His Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Ser Cys Val Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys
65 70 75 80
Asp Thr Lys Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Ala Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Ile Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Asn Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys
165 170 175
Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Val Leu Val Gln Glu Ala Val Trp Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Met Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Leu Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala
210 215 220
Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Phe Trp
225 230 235 240
Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Leu Gln His Val Asn Gly
275 280 285
Val Gly Asn Ser Lys Thr Gly Gln Gln Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Phe Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 13
<211> 381
<212> PRT
<213> 树鼩(TREE SHREW)
<400> 13
Asp His Ser Thr Ser Pro Ser Pro Gly Pro Gln Lys Thr Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Arg Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Thr Leu Ala Glu
35 40 45
Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val Ile Phe Leu Arg
50 55 60
Ala Ala Ser Val Leu Arg Ser Leu Pro Phe Thr Ile Thr Ser Met Arg
65 70 75 80
Asp Thr Glu Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Asn Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
115 120 125
Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr
130 135 140
Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu His Leu Thr Arg Met Gln
145 150 155 160
Gln Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Ser Cys Val Thr Arg
165 170 175
Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala
180 185 190
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
195 200 205
Lys Lys Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser
210 215 220
Thr Glu Glu Lys Glu Glu Glu Leu Leu Gln Lys Val Leu Asn Leu Trp
225 230 235 240
Glu Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe
245 250 255
Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe
260 265 270
Pro Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly
275 280 285
Asp Lys Pro Ser Gln Gln Glu Gly Lys Ser Trp Lys Ala Ile Arg Val
290 295 300
Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg His Ala Phe Ala Leu Leu Gly
305 310 315 320
Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr
325 330 335
His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr
340 345 350
Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His
355 360 365
Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
370 375 380
<210> 14
<211> 394
<212> PRT
<213> 鸭嘴兽(PLATYPUS)
<400> 14
Leu Thr Asn Ser Ala Pro Ile Asn Cys Met Thr Glu Thr Pro Ser Leu
1 5 10 15
Ala Thr Lys Gln Val Ser Gln Tyr Ala Cys Glu Arg Arg Thr Thr Leu
20 25 30
Asn Asn Cys Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys
35 40 45
Asp Phe Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ile Cys Leu Ala Phe Met Arg
50 55 60
Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Lys
65 70 75 80
Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Leu Gly Asp Gln Val Lys Ser Ile Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Ser Val Lys Ala Val Leu
100 105 110
Asn Asp Glu Arg Tyr Arg Ser Phe Gln Leu Phe Asn Ser Val Phe Glu
115 120 125
Val Gly Leu Thr Asp Asn Gly Glu Asn Gly Ile Ala Arg Gly Phe Gln
130 135 140
Thr Leu Asn Glu Val Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ser Leu Thr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Leu Ser Thr Ser Leu Trp Asn Tyr Leu Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr
165 170 175
Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys Glu Glu Ala Asp Ala Val Tyr
180 185 190
Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu Pro Glu Ala Leu Val
195 200 205
Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val
210 215 220
Asp Phe Leu Ile Ser Asp Pro Glu Ser Gly Gln Asp Glu Gln Leu Leu
225 230 235 240
Pro Asn Ile Ile Lys Leu Trp Glu Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr
245 250 255
Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Ile Pro Ser Arg Lys
260 265 270
Val Asp Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu
275 280 285
His His Gln Lys Val Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Pro Pro Pro Glu Ser
290 295 300
Lys Asn His Glu Ala Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val
305 310 315 320
Met Cys Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly
325 330 335
Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys
340 345 350
Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile
355 360 365
Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr His Leu Gly Leu
370 375 380
Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala
385 390
<210> 15
<211> 384
<212> PRT
<213> 跳鼠科(JERBOA)
<400> 15
Ser Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Val Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met
1 5 10 15
Gly Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Thr Gly Arg His Gln Leu Val Lys
20 25 30
Gln Thr Phe Cys Leu Pro Gly Phe Ile Leu Gln Asp Ala Phe Asp Ile
35 40 45
Leu Ala Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Ala Ser Cys Val Glu
50 55 60
Phe Met Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ile
65 70 75 80
Ser Val Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Trp Leu Gly Gly Lys Val Lys
85 90 95
Cys Val Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys
100 105 110
Ala Leu Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser
115 120 125
Val Phe Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Arg Trp Phe Arg Met Gly
130 135 140
Phe Arg Thr Leu Ser Thr Val Lys Leu Asp Lys Ser Leu Thr Phe Thr
145 150 155 160
Arg Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys
165 170 175
Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Gln Gln Ala
180 185 190
Val Val Ala Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Ser Met Thr Gly Gly Phe
195 200 205
Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser
210 215 220
Pro Glu Ala Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr
225 230 235 240
Asn Phe Trp Glu Gln Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp His Val Glu
245 250 255
Ser Thr Phe Glu Lys Cys Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu
260 265 270
Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Arg
275 280 285
Val Asp Ser Val Lys Ser Ser Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala
290 295 300
Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala
305 310 315 320
Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg
325 330 335
Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Arg Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr
340 345 350
Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile
355 360 365
Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Pro Leu Glu Arg Asn Ala
370 375 380

Claims (16)

1.一种合成具有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供具有3’-倒数第二脱氧肌苷和具有游离3’-羟基的3’-末端核苷酸的起始子；
b)重复以下循环：(i)使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长的片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和非模板依赖性DNA聚合酶在延伸条件下接触，使得所述起始子或延长的片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸延长以形成3’-O-封闭的延长的片段，和(ii)使所述延长的片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延长的片段，直到形成多核苷酸；
c)将所述多核苷酸用内切核酸酶V活性进行处理，以将所述多核苷酸从所述起始子上裂解。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述内切核酸酶V活性由原核内切核酸酶V提供。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述原核内切核酸酶V是大肠杆菌(E.coli)内切核酸酶V。
4.根据权利要求2或3所述的方法，所述方法还包括将所述原核内切核酸酶V从所述裂解的多核苷酸中去除的步骤。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述非模板依赖性DNA聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述起始子通过5’末端被附接至支持物上。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述支持物是固体支持物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述起始子具有5’-dI-dT-3’的3’-末端序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中从所述起始子上裂解的所述多核苷酸具有5’-单磷酸。
10.一种用于酶促合成多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括通过5’末端被附接至支持物上并且具有3’-倒数第二脱氧肌苷和具有游离3’-羟基的3’-末端核苷酸的起始子。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，所述试剂盒还包括能够裂解在所述起始子的末端核苷酸3’侧的起始子-多核苷酸缀合物的内切核酸酶V。
12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，所述试剂盒还包括具有5’-dI-dT-3’的3’-末端序列的所述起始子。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的试剂盒，其中所述支持物是固体支持物。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括无模板聚合酶和针对脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷和脱氧胞苷中的一种或更多种的3’-O-封闭的核苷三磷酸。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括去封闭剂。
16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述3’-O-封闭的核苷三磷酸是3’-O-NH2-核苷三磷酸。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113423840B (zh) 2019-02-12 2024-03-08 Dna斯克瑞普特公司 多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解
GB202013102D0 (en) 2020-08-21 2020-10-07 Nuclera Nucleics Ltd Methods of nucleic acid synthesis
EP4232571A1 (en) 2020-10-26 2023-08-30 DNA Script Novel variants of endonuclease v and uses thereof
US20240052391A1 (en) * 2020-10-29 2024-02-15 Dna Script Enzymatic Synthesis of Polynucleotide Probes
JP2024511874A (ja) 2021-04-02 2024-03-15 ディーエヌエー スクリプト Ｇ４を形成しやすいポリヌクレオチドの酵素合成のための方法及びキット
US20220389500A1 (en) * 2021-05-26 2022-12-08 Illumina, Inc. Purifying and polymerizing 3'-blocked nucleotides
NL2032097B1 (en) 2021-06-10 2024-03-29 Dna Script Enzymatic synthesis of polynucleotides using 3'-o-amino-2'-deoxyribonucleoside triphosphate monomers
WO2024083883A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Dna Script Methods and products for removal of uracil containing polynucleotides

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471588A (zh) * 2000-08-23 2004-01-28 宝生物工程株式会社 核酸扩增方法
CN1681923A (zh) * 2002-07-18 2005-10-12 孟山都技术有限公司 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法
CN1860227A (zh) * 2003-10-02 2006-11-08 巴斯福股份公司 用于序列饱和诱变(SeSaM)的方法
CN1955283A (zh) * 2005-10-24 2007-05-02 西川橡胶工业株式会社 突变的核酸内切酶
US20100055742A1 (en) * 2006-07-26 2010-03-04 Nishikawa Rubber Co., Ltd. Method for amplification of nucleotide sequence
WO2017216472A2 (fr) * 2016-06-14 2017-12-21 Dna Script Variants d'une adn polymérase de la famille polx
CN107567501A (zh) * 2015-02-10 2018-01-09 核酸有限公司 新用途
WO2018134616A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-26 Oxford Nanopore Technologies Limited Methods and reagents for synthesising polynucleotide molecules

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4772691A (en) 1985-06-05 1988-09-20 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Chemically cleavable nucleotides
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5516664A (en) 1992-12-23 1996-05-14 Hyman; Edward D. Enzymatic synthesis of repeat regions of oligonucleotides
US5436143A (en) 1992-12-23 1995-07-25 Hyman; Edward D. Method for enzymatic synthesis of oligonucleotides
FR2703052B1 (fr) 1993-03-26 1995-06-02 Pasteur Institut Nouvelle méthode de séquençage d'acides nucléiques.
US5656745A (en) 1993-09-17 1997-08-12 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide analogs
WO1995018139A1 (en) 1993-12-30 1995-07-06 Chemgenes Corporation Synthesis of propargyl modified nucleosides and phosphoramidites and their incorporation into defined sequence oligonucleotides
US5808045A (en) 1994-09-02 1998-09-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US6214987B1 (en) 1994-09-02 2001-04-10 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent formation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5990300A (en) 1994-09-02 1999-11-23 Andrew C. Hiatt Enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5872244A (en) 1994-09-02 1999-02-16 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US5763594A (en) 1994-09-02 1998-06-09 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US6232465B1 (en) 1994-09-02 2001-05-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5917031A (en) 1996-04-19 1999-06-29 Taiko Pharmaceutical Co., Ltd. Method of synthesizing polydeoxyribonucleotides
EP1961826A3 (en) 1999-03-10 2008-09-17 ASM Scientific, Inc. A method for direct nucleic acid sequencing
GB9907813D0 (en) 1999-04-06 1999-06-02 Medical Biosystems Ltd Synthesis
GB0013276D0 (en) 2000-06-01 2000-07-26 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Nucleotide analogues
AU2001296645A1 (en) 2000-10-06 2002-04-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
US6777189B2 (en) 2001-03-30 2004-08-17 Applera Corporation Nucleic acid analysis using non-templated nucleotide addition
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
DE10215035A1 (de) 2002-04-05 2003-10-23 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante terminale Deoxynukleotidyltransferase mit verbesserter Funktionalität
US20060086538A1 (en) 2002-07-08 2006-04-27 Shell Oil Company Choke for controlling the flow of drilling mud
EP3363809B1 (en) 2002-08-23 2020-04-08 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US7932025B2 (en) 2002-12-10 2011-04-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods for high fidelity production of long nucleic acid molecules with error control
DE60335144D1 (de) 2003-02-05 2011-01-05 Ge Healthcare Bio Sciences Nukleinsäureamplifikation
US7572581B2 (en) 2003-06-30 2009-08-11 Roche Molecular Systems, Inc. 2′-terminator nucleotide-related methods and systems
US7947817B2 (en) 2003-06-30 2011-05-24 Roche Molecular Systems, Inc. Synthesis and compositions of 2'-terminator nucleotides
US7407757B2 (en) 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7544794B1 (en) 2005-03-11 2009-06-09 Steven Albert Benner Method for sequencing DNA and RNA by synthesis
US8212020B2 (en) 2005-03-11 2012-07-03 Steven Albert Benner Reagents for reversibly terminating primer extension
US8399188B2 (en) 2006-09-28 2013-03-19 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
CN102083998B (zh) 2007-06-19 2016-08-03 斯特拉托斯基因公司 通过展开进行高通量核酸测序
WO2010030716A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Igor Kutyavin Detection of nucleic acids by oligonucleotide probes cleaved in presence of endonuclease v
US8034923B1 (en) 2009-03-27 2011-10-11 Steven Albert Benner Reagents for reversibly terminating primer extension
US8674086B2 (en) 2010-06-25 2014-03-18 Intel Corporation Nucleotides and oligonucleotides for nucleic acid sequencing
EP2825672B1 (en) 2012-03-13 2019-02-13 Swift Biosciences, Inc. Methods and compositions for size-controlled homopolymer tailing of substrate polynucleotides by a nucleic acid polymerase
EP2861787B1 (en) 2012-06-18 2017-09-20 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
US8808989B1 (en) 2013-04-02 2014-08-19 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids
US9279149B2 (en) 2013-04-02 2016-03-08 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids
EP2876166B1 (en) 2013-11-20 2016-12-14 Roche Diagnostics GmbH New compound for sequencing by synthesis
FR3020071B1 (fr) 2014-04-17 2017-12-22 Dna Script Procede de synthese d'acides nucleiques, notamment d'acides nucleiques de grande longueur, utilisation du procede et kit pour la mise en œuvre du procede
FR3025201B1 (fr) 2014-09-02 2018-10-12 Dna Script Nucleotides modifies pour la synthese d'acides nucleiques, un kit renfermant de tels nucleotides et leur utilisation pour la production de genes ou sequences d'acides nucleiques synthetiques
GB201503534D0 (en) 2015-03-03 2015-04-15 Nuclera Nucleics Ltd Novel method
GB201512372D0 (en) 2015-07-15 2015-08-19 Nuclera Nucleics Ltd Novel method
GB201701396D0 (en) 2017-01-27 2017-03-15 Nuclera Nucleics Ltd Novel alternating-phase synthesis method
GB201718804D0 (en) 2017-11-14 2017-12-27 Nuclera Nucleics Ltd Novel use
US10435676B2 (en) 2018-01-08 2019-10-08 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
US10752887B2 (en) 2018-01-08 2020-08-25 Dna Script Variants of terminal deoxynucleotidyl transferase and uses thereof
AU2019311199A1 (en) 2018-07-23 2021-01-28 Dna Script Massively parallel enzymatic synthesis of nucleic acid strands
US20210214382A1 (en) 2018-08-31 2021-07-15 Dna Script Method for Preparing 3'-O-Amino-2'-Deoxyribonucleoside-5'-Triphosphate
WO2020077227A2 (en) * 2018-10-12 2020-04-16 President And Fellows Of Harvard College Enzymatic rna synthesis
AU2019379287A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Dna Script Terminal deoxynucleotidyl transferase variants and uses thereof
EP3894593A2 (en) * 2018-12-13 2021-10-20 DNA Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
CN113423840B (zh) 2019-02-12 2024-03-08 Dna斯克瑞普特公司 多核苷酸无模板酶促合成中有效的产物裂解
WO2020165334A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Dna Script Process for preparing 3'-o-amino-ribonucleotide

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1471588A (zh) * 2000-08-23 2004-01-28 宝生物工程株式会社 核酸扩增方法
CN1681923A (zh) * 2002-07-18 2005-10-12 孟山都技术有限公司 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法
CN1860227A (zh) * 2003-10-02 2006-11-08 巴斯福股份公司 用于序列饱和诱变(SeSaM)的方法
CN1955283A (zh) * 2005-10-24 2007-05-02 西川橡胶工业株式会社 突变的核酸内切酶
US20100055742A1 (en) * 2006-07-26 2010-03-04 Nishikawa Rubber Co., Ltd. Method for amplification of nucleotide sequence
CN107567501A (zh) * 2015-02-10 2018-01-09 核酸有限公司 新用途
WO2017216472A2 (fr) * 2016-06-14 2017-12-21 Dna Script Variants d'une adn polymérase de la famille polx
AU2017286477A1 (en) * 2016-06-14 2018-12-06 Centre National De La Recherche Scientifique Variants of a DNA polymerase of the polX family
WO2018134616A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-26 Oxford Nanopore Technologies Limited Methods and reagents for synthesising polynucleotide molecules

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERIK SEBASTIAN VIK ET AL: "Endonuclease V cleaves at inosines in RNA", 《NATURE COMMUNICATIONS》, vol. 4, no. 1, pages 1 - 7, XP055697096, DOI: 10.1038/ncomms3271 *
YI-CHEN DU ET AL: "Terminal Deoxynucleotidyl Transferase and T7 Exonuclease-Aided Amplification Strategy for Ultrasensitive Detection of Uracil-DNA Glycosylase", 《AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》, vol. 90, pages 8629 - 8634 *
田畅等: "芹菜核酸内切酶CEU基因的克隆及其表达分析", 《南京农业大学学报》, vol. 37, no. 4, pages 39 - 45 *
秦林燕: "《一通检索记录表》" *

Also Published As

Publication number Publication date
US11905541B2 (en) 2024-02-20
CN113423840B (zh) 2024-03-08
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WO2020165137A1 (en) 2020-08-20
CA3129393A1 (en) 2020-08-20
US11359221B2 (en) 2022-06-14
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KR20210125496A (ko) 2021-10-18
JP2022520574A (ja) 2022-03-31
SG11202107921SA (en) 2021-08-30
US20210254114A1 (en) 2021-08-19
AU2020223456A1 (en) 2021-08-12

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