CN113419005B - 一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法及应用，属于污水处理领域，所述方法包括以下步骤：(1)提取污水中的溶解性有机氮；(2)检测溶解性有机氮提取液中的质谱峰；(3)预处理污水样品的谱图数据；(4)构建污水中物质反应的网络关系；(5)筛查溶解性有机氮的物质反应关系；(6)确定不同源溶解性有机氮。本发明提供的方法具有检测通量高、普适性强、操作简便快速的优点，应用该方法可实现污水中外源性与内源性溶解性有机氮的定性及定量，对指导污水处理厂溶解性有机氮的减量化控制具有现实意义。
Description
技术领域
本发明属于污水处理领域，更具体地说，涉及一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法及应用。
背景技术
溶解性有机氮(dissolved organic nitrogen,DON)是城市污水处理厂中溶解性总氮的重要组成部分，其出水浓度约为0.50mg/L–6.46mg/L，占出水溶解性总氮比值约为25％–80％。污水中DON可作为消毒副产物前体物，在消毒阶段产生致癌性消毒副产物，同时，污水厂出水DON可刺激藻类生长，引发受纳水体富营养化现象。因此，污水中DON是污水处理过程中不可忽视的问题。在城市污水处理厂中，污水中DON可依据其来源分为外源性DON与内源性DON。外源性DON是源于污水处理厂进水的DON，包括在污水处理过程中尚未完全降解DON、进水中不可降解或难生物降解DON；内源性DON是源于污水处理过程的DON，包括微生物类DON、外源性DON的微生物转化产物、污水处理过程的DON副产物。现有研究表明，外源性DON与内源性DON在主要分子组成、转化行为、环境影响、调控因素等方面都有显著的差异。基于此，在评价污水厂运行效果与制定污水厂运行控制策略时，有必要区分外源性DON与内源性DON。
近年以来，尽管研究人员已逐渐意识到不同源DON的差异性及辨析污水中不同源DON的必要性，但是目前污水中不同源DON的区分及其相关的定性定量研究仍存在许多阻碍。在城市污水处理过程中，外源性DON与内源性DON可同时存在于污水中，导致大多数的分析技术手段难以实现外源性DON与内源性DON的分离。不同源DON的辨析主要涉及宏观浓度以及分子组成两个层面。在宏观浓度层面，现有方法是依靠数学模型预测或采用模拟废水实验测定污水中内源性DON的浓度来解决混合体系中内源性DON的定量问题，并进一步通过差减法实现外源性DON的定量。在分子组成层面，现有方法是通过解析不同源DON的典型特征组分来解决外源性DON与内源性DON的定性问题。尽管不同源DON的辨析已获得突破，但是同时在宏观浓度与分子组成层面上进行不同源DON的区分仍是一个巨大的挑战。中国专利申请号CN 201910861998.7，公开了一种污水中微生物类溶解性有机氮的预测模型及其应用，基于活性污泥系统中微生物类DON产生及消耗的动力学原理组建以微生物类DON为对象的预测模型，结合模型灵敏度分析和参数估计结果进行预测模型的准确度校正，并将校正后的预测模型应用于实际污水厂出水中微生物类DON的预测。该方法虽然可以实现混合体系中微生物类DON的定量，但是，该方法仅仅定量内源性DON的一部分(微生物类DON)，在不同源DON的辨析方法中仍有很大改善空间。污水中DON的组成复杂、分子组成多样，对于污水中不同源DON的辨析更加需要从分子组成层面开展，并结合宏观浓度变化进行分析。
发明内容
本发明的目的是要解决在现有污水中不同源DON辨析方法存在的无法同时在宏观浓度层面与分子组成层面区分外源性DON与内源性DON的问题，并改善现有方法对仪器与参数条件的依赖性，进而提供一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法及应用。
本发明所采用的技术方案如下：一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，是利用液相色谱-高分辨率质谱联用技术、反应组学分析技术建立的污水样品中外源性DON与内源性DON同步定性定量方法，具体建立步骤为：
(a)提取污水中的DON：采用固相萃取小柱，通过污水样品预处理、柱活化、上样、淋洗、洗脱，将污水中DON与其他干扰物进行分离，并浓缩富集污水中DON，得到待检测的DON提取液；
(b)检测DON提取液中的质谱峰：采用液相色谱-高分辨率质谱联用仪进行DON提取液的全扫描分析检测，得到污水中DON的检测谱图；
(c)预处理污水样品的谱图数据：对上述污水中DON的检测谱图进行背景信号值的扣除、干扰峰的排除、噪声信号的消除，得到经预处理后的污水样品谱图数据；
(d)构建污水中物质反应的网络关系：利用反应组学分析技术进行污水样品谱图数据的峰提取、保留时间的层次聚类、峰去冗余，简化污水样品谱图数据；建立污水样品的全局反应质量差关系、筛选其中独立的质谱峰，构建污水样品中物质反应的高频质量差矩阵；结合高频质量差矩阵以及物质反应数据库，生成污水中物质反应的网络关系图；
(e)筛查DON的物质反应关系：将网络关系图中的质谱峰与质谱数据库进行匹配，获取质谱峰对应的物质分子式，筛选网络关系图中与DON相关联的高频质量差关系，得到DON的物质反应关系；
(f)确定不同源DON：计算DON的物质反应关系中每个DON分子的反应关系连接度、反应距离，依据反应关系连接度与反应距离划分外源性DON与内源性DON。
进一步地，污水样品包括城市污水处理厂中单一处理单元的污水样品、城市污水处理厂中多个处理单元的污水样品合集、城市污水处理厂全流程污水样品合集、城市污水处理厂的出水样品；外源性DON为在污水处理过程中尚未完全降解DON、进水中不可降解或难生物降解DON；内源性DON为微生物类DON、外源性DON的微生物转化产物、污水处理过程的DON副产物。
进一步地，步骤(a)中，固相萃取小柱为使用苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填料的商业化固相萃取小柱；污水样品预处理为采用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤，再使用ACS级高纯盐酸酸化至pH为2；柱活化为依次使用10-15mL的LC-MS级甲醇、20-25mL的pH为2的超纯水滤过固相萃取小柱；淋洗为使用20-25mL的pH为2超纯水滤过固相萃取小柱；洗脱为先利用氮气吹干去除固相萃取小柱中液体，再使用5-15mL的LC-MS级甲醇滤过固相萃取小柱；固相萃取小柱的滤过流速控制为0.5-2.0mL/min；上机检测前，DON提取液经0.22μm有机系滤膜过滤，且其中溶解性有机碳浓度为50-100mg/L。
进一步地，步骤(b)中，液相色谱-高分辨率质谱联用仪的仪器条件即：扫描模式为正离子与负离子离子化模式，电离源为电喷雾电离源，流速为0.2-0.5mL/min，采集谱图范围为50-1200Da。
进一步地，步骤(c)中，背景信号值的获取方式为：以超纯水为待处理样品，通过步骤(a)与步骤(b)相同的操作获取背景信号；采用峰强度差减法扣除背景信号，保留差减后峰强度≥1000的质谱峰；污水样品谱图数据为经R语言中“XCMS”程序包转换的“.mzrt”数据。
进一步地，步骤(d)中，反应组学分析技术为在生物化学反应过程中，DON参与的物质反应过程都具有其对应的反应物DON与反应产物DON，以及反应物DON与反应产物DON间特定的质量差关系；在物质反应过程未知的条件下，依据质量差关系可获得样品中反应物DON、反应产物DON、DON参与的物质反应过程；
峰去冗余为扣除污水样品谱图数据中多余质谱峰；
保留时间的层次聚类为利用R语言中“getpaired”函数计算污水样品中质量差关系，并依据递推公式(1)进行保留时间分簇，D值大于10作为截断分组阈值：
式中，RTm与RTn为保留时间数据的组合簇，RT1为待计算的单一保留时间数据，D值为RT1与保留时间数据的组合簇(RTm，RTn)距离；高频质量差关系为利用R语言中“getstd”函数扣除质量差关系中的加合物、中性丢失、同位素、共同碎片后的质量差关系；高频质量差矩阵为依据式(2)以质谱峰作为矩阵元的物质反应矩阵：
式中，{P1，P2，…，Pm}为质谱峰，{B1，B2，…，Bn}为质谱峰潜在的母体反应物；
物质反应数据库为KEGG数据库与HMDB数据库；
物质反应的网络关系图为以物质反应的最小质量差作为连接、质谱峰作为节点、相关值≥0.6的拓扑关系。
更进一步地，最小质量差计算公式为：
PMDBk＝{min(|Bk-P1|，|Bk-P2|，...，|Bk-Pm|)|k＝1，2，...，n} (3)
式中，PMDBK为物质反应的最小质量差，{P1，P2，…，Pm}为质谱峰，{B1，B2，…，Bn}为质谱峰潜在的母体反应物。
进一步地，步骤(e)中，质谱峰对应的物质分子式匹配规则为质谱峰误差＜5ppm、保留时间误差＜2min、含偶数个氮原子的DON分子的相对分子质量为偶数、含奇数个氮原子的DON分子的相对分子质量为奇数、分子式匹配得分＞90。
进一步地，步骤(f)中，连接度为在物质反应关系的邻接矩阵中每个DON分子参与的物质反应个数；
反应距离为在物质反应关系的邻接矩阵中DON分子之间连接距离，即在邻接矩阵A＝(aij)N×N中，DON分子连接度为
DON分子的反应距离为
其中A为邻接矩阵，aij为DON分子i与DON分子j的关系描述符，N为DON分子个数，ki为DON分子i的连接度，lij为DON分子i与DON分子j之间最短连接关系的个数，L为DON的物质反应关系网络的平均连接长度；
反应关系连接度与反应距离划分为以污水样品中连接度中位数为主要截断值、反应距离中位数为次要截断值，划分{ki≤median(ki)}∩{lij≥median(lij)}的DON分子为外源性DON分子、{ki＞median(ki)}∪{lij＜median(lij)}的DON分子为内源性DON分子，其中median(ki)为连接度中位数，median(lij)为反应距离中位数。
本发明还提供了一种上述方法的应用，将该方法应用于污水中外源性与内源性溶解性有机氮的定性及定量中，可以定量外源性DON与内源性DON的比例。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种操作简便、同步定性定量、可从宏观浓度层面与分子组成层面辨析不同源DON的方法，解决了现有分析方法中难以区分实际污水中外源性DON与内源性DON的问题；
(2)本发明基于污水体系中DON的反应原理与规律，结合液相色谱-高分辨率质谱的快速检测、高效率分离的特性，预先筛选有效的高频率发生的物质反应关系，大大简化了计算步骤，降低假阳性检出率，能够同时保证检测的高通量与准确度；
(3)本发明采用反应组学分析技术探究污水中DON分子的固有反应关系，利用DON的物质反应关系中拓扑结构的差异进行不同源DON的分类，降低了现有方法对于仪器条件的依赖性，增强不同源DON辨析方法的方法普适性，可提高方法的应用性。
附图说明
图1为本发明中污水中不同源DON辨析的流程框图；
图2为本发明实施例1中不同源DON的物质反应拓扑结构图。
图3为本发明实施例2中不同源DON的物质反应拓扑结构图。
图4为本发明实施例3中不同源DON的物质反应拓扑结构图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
本实施例的应用对象是某污水处理厂A的生物段出水，A厂日处理量为4.5万立方米/日，主体工艺为氧化沟工艺。其生物段出水含COD 25.59mg/L，总氮7.31mg/L，总磷0.40mg/L，氨氮0.06mg/L，硝态氮2.31mg/L，亚硝态氮0.09mg/L，DON 4.85mg/L。A厂生物段出水DON中外源性DON与内源性DON的辨析步骤如图1所示，一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，是利用液相色谱-高分辨率质谱联用技术、反应组学分析技术建立的污水样品中外源性DON与内源性DON同步定性定量方法，具体建立步骤为：
步骤一：提取污水中的DON。采用苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填料的商业化固相萃取小柱进行污水中DON的浓缩富集。先采用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤、ACS级高纯盐酸将过滤后的污水样品酸化至pH为2，再依次使用10mL LC-MS级甲醇、20mL pH为2的超纯水活化固相萃取小柱，以0.5mL/min流速上样，使用20mL pH为2超纯水淋洗固相萃取小柱，最后利用氮气吹干固相萃取小柱，使用10mL的LC-MS级甲醇洗脱，得到待检测的DON提取液上机检测前，DON提取液经0.22μm有机系滤膜过滤，且其中溶解性有机碳浓度为100mg/L；
步骤二：检测DON提取液的质谱峰：采用液相色谱-高分辨率质谱联用仪进行DON提取液的全扫描分析检测，设置液相色谱-高分辨率质谱联用仪的扫描模式为正离子与负离子离子化模式，电离源为电喷雾电离源，流速为0.2mL/min，采集谱图范围为50-1200Da，上机检测得到污水中DON的检测谱图；
步骤三：预处理污水样品的谱图数据。以超纯水为待处理样品，通过与污水样品相同的操作获取背景信号；采用峰强度差减法扣除背景信号，保留差减后峰强度≥1000的质谱峰，对污水样品的检测谱图进行背景信号值的扣除、干扰峰的排除、噪声信号的消除，再使用R语言中“XCMS”程序包将污水样品谱图数据转换为“.mzrt”格式数据；
步骤四：构建污水中物质反应的网络关系：利用反应组学分析技术进行污水样品谱图数据的峰提取、保留时间的层次聚类、峰去冗余，简化污水样品谱图数据；建立污水样品的全局反应质量差关系、筛选其中独立的质谱峰，构建污水样品中物质反应的高频质量差矩阵；结合高频质量差矩阵以及物质反应数据库，生成污水中物质反应的网络关系图。其中，反应组学分析技术为在生物化学反应过程中，DON参与的物质反应过程都具有其对应的反应物DON与反应产物DON，以及反应物DON与反应产物DON间特定的质量差关系；在物质反应过程未知的条件下，依据质量差关系可获得样品中反应物DON、反应产物DON、DON参与的物质反应过程；峰去冗余为扣除污水样品谱图数据中多余质谱峰；保留时间的层次聚类为利用R语言中“getpaired”函数计算污水样品中质量差关系，并依据递推公式
中D值大于10作为截断分组阈值，进行保留时间分簇，其中RTm与RTn为保留时间数据的组合簇，RT1为待计算的单一保留时间数据，D值为RT1与保留时间数据的组合簇(RTm，RTn)距离；高频质量差关系为利用R语言中“getstd”函数扣除质量差关系中的加合物、中性丢失、同位素、共同碎片后的质量差关系；高频质量差矩阵为以质谱峰作为矩阵元的物质反应矩阵，即：
其中{P1，P2，…，Pm}为质谱峰，{B1，B2，…，Bn}为质谱峰潜在的母体反应物；物质反应数据库为KEGG数据库与HMDB数据库；物质反应的网络关系图为以物质反应的最小质量差作为连接、质谱峰作为节点、相关值≥0.6的拓扑关系；其中，最小质量差计算公式为：
PMDBk＝{min(|Bk-P1|，|Bk-P2|，...，|Bk-Pm|)|k＝1，2，...，n}；
步骤五：筛查DON的物质反应关系。依据匹配规则质谱峰误差＜5ppm、保留时间误差＜2min、含偶数个氮原子的DON分子的相对分子质量为偶数、含奇数个氮原子的DON分子的相对分子质量为奇数、分子式匹配得分＞90，将网络关系图中的质谱峰与质谱数据库进行匹配，获取质谱峰对应的物质分子式，筛选网络关系图中与DON相关联的高频质量差关系，得到DON的物质反应关系；
步骤六：确定不同源DON。计算DON的物质反应关系中每个DON分子的反应关系连接度、反应距离，依据反应关系连接度与反应距离划分外源性DON与内源性DON。连接度为在物质反应关系的邻接矩阵中每个DON分子参与的物质反应个数，反应距离为在物质反应关系的邻接矩阵中DON分子之间连接距离，即在邻接矩阵A＝(aij)N×N中，DON分子连接度为
DON分子的反应距离为
其中A为邻接矩阵，aij为DON分子i与DON分子j的关系描述符，N为DON分子个数，ki为DON分子i的连接度，lij为DON分子i与DON分子i之间最短连接关系的个数，L为DON的物质反应关系网络的平均连接长度；反应关系连接度与反应距离划分为以污水样品中连接度中位数为主要截断值、反应距离中位数为次要截断值，划分{ki≤median(ki)}∩{lij≥median(lij)}的DON分子为外源性DON分子、{ki＞median(ki)}∪{lij＜median(lij)}的DON分子为内源性DON分子，其中median(ki)为连接度中位数，median(lij)为反应距离中位数。
如图2所示，通过本方法将A厂生物段出水DON分子划分为外源性DON分子与内源性DON分子，分别计算外源性DON分子与内源性DON分子的质谱峰强度值，可确认在DON浓度为4.85mg/L的A厂生物段出水中，外源性DON占比58.3％，内源性DON占比41.7％。
实施例2
同实施例1不同的是本实施例的应用对象是某污水处理厂B的总出水，B厂日处理量为15万立方米/日，主要水处理工艺为A2/O工艺+二沉池+高效沉淀池+石英砂滤池。其总出水含COD 17.32mg/L，总氮10.95mg/L，总磷0.10mg/L，氨氮0.33mg/L，硝态氮7.47mg/L，亚硝态氮0.04mg/L，DON 3.11mg/L。B厂总的出水DON中外源性DON与内源性DON的辨析步骤如图1所示，一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，是利用液相色谱-高分辨率质谱联用技术、反应组学分析技术建立的污水样品中外源性DON与内源性DON同步定性定量方法，具体建立步骤为：
步骤一：提取污水中的DON。采用苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填料的商业化固相萃取小柱进行污水中DON的浓缩富集。先采用0.45pm醋酸纤维滤膜过滤、ACS级高纯盐酸将过滤后的污水样品酸化至pH为2，再依次使用15mL LC-MS级甲醇、25mL pH为2的超纯水活化固相萃取小柱，以2.0mL/min流速上样，使用25mL pH为2超纯水淋洗固相萃取小柱，最后利用氮气吹干固相萃取小柱，使用15mL的LC-MS级甲醇洗脱，得到待检测的DON提取液上机检测前，DON提取液经0.22μm有机系滤膜过滤，且其中溶解性有机碳浓度为70mg/L；
步骤二：检测DON提取液中的质谱峰：采用液相色谱-高分辨率质谱联用仪进行DON提取液的全扫描分析检测，设置液相色谱-高分辨率质谱联用仪的扫描模式为正离子与负离子离子化模式，电离源为电喷雾电离源，流速为0.5mL/min，采集谱图范围为100-1000Da，上机检测得到污水中DON的检测谱图；
步骤三：预处理污水样品的谱图数据。以超纯水为待处理样品，通过与污水样品相同的操作获取背景信号；采用峰强度差减法扣除背景信号，保留差减后峰强度≥3000的质谱峰，对污水样品的检测谱图进行背景信号值的扣除、干扰峰的排除、噪声信号的消除，再使用R语言中“XCMS”程序包将污水样品谱图数据转换为“.mzrt”格式数据；
步骤四：构建污水中物质反应的网络关系：利用反应组学分析技术进行污水样品谱图数据的峰提取、保留时间的层次聚类、峰去冗余，简化污水样品谱图数据；建立污水样品的全局反应质量差关系、筛选其中独立的质谱峰，构建污水样品中物质反应的高频质量差矩阵；结合高频质量差矩阵以及物质反应数据库，生成污水中物质反应的网络关系图。其中，反应组学分析技术为在生物化学反应过程中，DON参与的物质反应过程都具有其对应的反应物DON与反应产物DON，以及反应物DON与反应产物DON间特定的质量差关系；在物质反应过程未知的条件下，依据质量差关系可获得样品中反应物DON、反应产物DON、DON参与的物质反应过程；峰去冗余为扣除污水样品谱图数据中多余质谱峰；保留时间的层次聚类为利用R语言中“getpaired”函数计算污水样品中质量差关系，并依据递推公式
中D值大于20作为截断分组阈值，进行保留时间分簇，其中RTm与RTn为保留时间数据的组合簇，RT1为待计算的单一保留时间数据，D值为RT1与保留时间数据的组合簇(RTm，RTn)距离；高频质量差关系为利用R语言中“getstd”函数扣除质量差关系中的加合物、中性丢失、同位素、共同碎片后的质量差关系；高频质量差矩阵为以质谱峰作为矩阵元的物质反应矩阵，即：
其中{P1，P2，…，Pm}为质谱峰，{B1，B2，…，Bn}为质谱峰潜在的母体反应物；物质反应数据库为KEGG数据库与HMDB数据库；物质反应的网络关系图为以物质反应的最小质量差作为连接、质谱峰作为节点、相关值≥0.8的拓扑关系；其中，最小质量差计算公式为：
PMDBk＝{min(|Bk-P1|，|Bk-P2|，...，|Bk-Pm|)|k＝1，2，...，n}；
步骤五：筛查DON的物质反应关系。依据匹配规则质谱峰误差＜3ppm、保留时间误差＜1min、含偶数个氮原子的DON分子的相对分子质量为偶数、含奇数个氮原子的DON分子的相对分子质量为奇数、分子式匹配得分＞90，将网络关系图中的质谱峰与质谱数据库进行匹配，获取质谱峰对应的物质分子式，筛选网络关系图中与DON相关联的高频质量差关系，得到DON的物质反应关系；
步骤六：确定不同源DON。计算DON的物质反应关系中每个DON分子的反应关系连接度、反应距离，依据反应关系连接度与反应距离划分外源性DON与内源性DON。连接度为在物质反应关系的邻接矩阵中每个DON分子参与的物质反应个数，反应距离为在物质反应关系的邻接矩阵中DON分子之间连接距离，即在邻接矩阵A＝(aij)N×N中，DON分子连接度为
DON分子的反应距离为
其中A为邻接矩阵，aij为DON分子i与DON分子j的关系描述符，N为DON分子个数，ki为DON分子i的连接度，lij为DON分子i与DON分子j之间最短连接关系的个数，L为DON的物质反应关系网络的平均连接长度；反应关系连接度与反应距离划分为以污水样品中连接度中位数为主要截断值、反应距离中位数为次要截断值，划分{ki≤median(ki)}∩{lij≥median(lij)}的DON分子为外源性DON分子、{ki＞median(ki)}∪{lij＜median(lij)}的DON分子为内源性DON分子，其中median(ki)为连接度中位数，median(lij)为反应距离中位数。
如图3所示，通过本方法将B厂总出水DON分子划分为外源性DON分子与内源性DON分子，分别计算外源性DON分子与内源性DON分子的质谱峰强度值，可确认在DON浓度为3.11mg/L的B厂总出水中，外源性DON占比62.5％，内源性DON占比37.5％。
实施例3
同实施例1不同的是本实施例的应用对象是某污水处理厂C的提标改造段出水，C厂日处理量为6万立方米/日，主要水处理工艺为为氧化沟工艺，提标改造后增加混凝池+反硝化滤池。其提标改造段出水COD 13.13mg/L，总氮7.34mg/L，总磷0.03mg/L，氨氮0.16mg/L，硝态氮2.94mg/L，亚硝态氮0.06mg/L，DON 4.18mg/L。C厂的提标改造段出水中外源性DON与内源性DON的辨析步骤如图1所示，一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法及应用，是利用液相色谱-高分辨率质谱联用技术、反应组学分析技术建立的污水样品中外源性DON与内源性DON同步定性定量方法，具体建立步骤为：
步骤一：提取污水中的DON。采用苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填料的商业化固相萃取小柱进行污水中DON的浓缩富集。先采用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤、ACS级高纯盐酸将过滤后的污水样品酸化至pH为2，再依次使用12mL LC-MS级甲醇、20mL pH为2的超纯水活化固相萃取小柱，以1.0mL/min流速上样，使用25mL pH为2超纯水淋洗固相萃取小柱，最后利用氮气吹干固相萃取小柱，使用5mL的LC-MS级甲醇洗脱，得到待检测的DON提取液上机检测前，DON提取液经0.22μm有机系滤膜过滤，且其中溶解性有机碳浓度为50mg/L；
步骤二：检测DON提取液中的质谱峰：采用液相色谱-高分辨率质谱联用仪进行DON提取液的全扫描分析检测，设置液相色谱-高分辨率质谱联用仪的扫描模式为正离子与负离子离子化模式，电离源为电喷雾电离源，流速为0.4mL/min，采集谱图范围为150-1200Da，上机检测得到污水中DON的检测谱图；
步骤三：预处理污水样品的谱图数据。以超纯水为待处理样品，通过与污水样品相同的操作获取背景信号；采用峰强度差减法扣除背景信号，保留差减后峰强度≥2000的质谱峰，对污水样品的检测谱图进行背景信号值的扣除、干扰峰的排除、噪声信号的消除，再使用R语言中“XCMS”程序包将污水样品谱图数据转换为“.mzrt”格式数据；
步骤四：构建污水中物质反应的网络关系：利用反应组学分析技术进行污水样品谱图数据的峰提取、保留时间的层次聚类、峰去冗余，简化污水样品谱图数据；建立污水样品的全局反应质量差关系、筛选其中独立的质谱峰，构建污水样品中物质反应的高频质量差矩阵；结合高频质量差矩阵以及物质反应数据库，生成污水中物质反应的网络关系图。其中，反应组学分析技术为在生物化学反应过程中，DON参与的物质反应过程都具有其对应的反应物DON与反应产物DON，以及反应物DON与反应产物DON间特定的质量差关系；在物质反应过程未知的条件下，依据质量差关系可获得样品中反应物DON、反应产物DON、DON参与的物质反应过程；峰去冗余为扣除污水样品谱图数据中多余质谱峰；保留时间的层次聚类为利用R语言中“getpaired”函数计算污水样品中质量差关系，并依据递推公式
中D值大于15作为截断分组阈值，进行保留时间分簇，其中RTm与RTn为保留时间数据的组合簇，RT1为待计算的单一保留时间数据，D值为RT1与保留时间数据的组合簇(RTm，RTn)距离；高频质量差关系为利用R语言中“getstd”函数扣除质量差关系中的加合物、中性丢失、同位素、共同碎片后的质量差关系；高频质量差矩阵为以质谱峰作为矩阵元的物质反应矩阵，即：
其中{P1，P2，…，Pm}为质谱峰，{B1，B2，…，Bn}为质谱峰潜在的母体反应物；物质反应数据库为KEGG数据库与HMDB数据库；物质反应的网络关系图为以物质反应的最小质量差作为连接、质谱峰作为节点、相关值≥0.7的拓扑关系；其中，最小质量差计算公式为：
PMDBk＝{min(|Bk-P1|，|Bk-P2|，...，|Bk-Pm|)|k＝1，2，...，n}；
步骤五：筛查DON的物质反应关系。依据匹配规则质谱峰误差＜4ppm、保留时间误差＜1.5min、含偶数个氮原子的DON分子的相对分子质量为偶数、含奇数个氮原子的DON分子的相对分子质量为奇数、分子式匹配得分＞90，将网络关系图中的质谱峰与质谱数据库进行匹配，获取质谱峰对应的物质分子式，筛选网络关系图中与DON相关联的高频质量差关系，得到DON的物质反应关系；
步骤六：确定不同源DON。计算DON的物质反应关系中每个DON分子的反应关系连接度、反应距离，依据反应关系连接度与反应距离划分外源性DON与内源性DON。连接度为在物质反应关系的邻接矩阵中每个DON分子参与的物质反应个数，反应距离为在物质反应关系的邻接矩阵中DON分子之间连接距离，即在邻接矩阵A＝(aij)N×N中，DON分子连接度为
DON分子的反应距离为
其中A为邻接矩阵，aij为DON分子i与DON分子j的关系描述符，N为DON分子个数，ki为DON分子i的连接度，lij为DON分子i与DON分子i之间最短连接关系的个数，L为DON的物质反应关系网络的平均连接长度；反应关系连接度与反应距离划分为以污水样品中连接度中位数为主要截断值、反应距离中位数为次要截断值，划分{ki≤median(ki)}∩{lij≥median(lij)}的DON分子为外源性DON分子、{ki＞median(ki)}∪{lij＜median(lij)}的DON分子为内源性DON分子，其中median(ki)为连接度中位数，median(lij)为反应距离中位数。
如图3所示，通过本方法将C厂提标改造段出水DON分子划分为外源性DON分子与内源性DON分子，分别计算外源性DON分子与内源性DON分子的质谱峰强度值，可确认在DON浓度为4.18mg/L的C厂提标改造段出水中，外源性DON占比28.6％，内源性DON占比71.4％。
Claims (8)
1.一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，是利用液相色谱-高分辨率质谱联用技术和反应组学分析技术建立的污水样品中外源性DON与内源性DON定性定量方法，具体建立步骤为：
(a)提取污水中的DON：采用固相萃取小柱，通过污水样品预处理、柱活化、上样、淋洗、洗脱，将污水中DON与其他干扰物进行分离，并浓缩富集污水中DON，得到DON提取液；
(b)检测DON提取液中的质谱峰：采用液相色谱-高分辨率质谱联用仪进行DON提取液的全扫描分析检测，得到污水中DON的检测谱图；
(c)预处理污水样品的谱图数据：对上述污水中DON的检测谱图进行背景信号值的扣除、干扰峰的排除、噪声信号的消除，得到经预处理后的污水样品谱图数据；
(d)构建污水中物质反应的网络关系：利用反应组学分析技术进行污水样品谱图数据的峰提取、保留时间的层次聚类、峰去冗余，简化污水样品谱图数据；建立污水样品的全局反应质量差关系、筛选其中独立的质谱峰，构建污水样品中物质反应的高频质量差矩阵；结合高频质量差矩阵以及物质反应数据库，生成污水中物质反应的网络关系图；
(e)筛查DON的物质反应关系：将网络关系图中的质谱峰与DON数据库进行匹配，获取质谱峰对应的物质分子式，筛选网络关系图中与DON相关联的高频质量差关系，得到DON的物质反应关系；
(f)确定不同源DON：计算DON的物质反应关系中每个DON分子的反应关系连接度、反应距离，依据反应关系连接度与反应距离划分外源性DON与内源性DON；
液相色谱-高分辨率质谱联用仪的仪器条件即：扫描模式为正离子与负离子离子化模式，电离源为电喷雾电离源，流速为0.2-0.5mL/min，采集谱图范围为50-1200Da。
2.根据权利要求1所述的一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，所述的污水样品包括城市污水处理厂中单一处理单元的污水样品、城市污水处理厂中多个处理单元的污水样品合集、城市污水处理厂全流程污水样品合集、城市污水处理厂的出水样品；所述外源性DON为在污水处理过程中尚未完全降解DON、进水中不可降解或难生物降解DON；所述内源性DON为微生物类DON、外源性DON的微生物转化产物、污水处理过程的DON副产物。
3.根据权利要求1所述的一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，步骤(a)中，所述固相萃取小柱为使用苯乙烯-二乙烯苯共聚物为填料的商业化固相萃取小柱；所述污水样品预处理为采用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤，再使用ACS级高纯盐酸酸化至pH为2；所述柱活化为依次使用10-15mL的LC-MS级甲醇、20-25mL的pH为2的超纯水滤过固相萃取小柱；所述淋洗为使用20-25mL的pH为2超纯水滤过固相萃取小柱；所述洗脱为先利用氮气吹干去除固相萃取小柱中液体，再使用5-15mL的LC-MS级甲醇滤过固相萃取小柱；固相萃取小柱的滤过流速控制为0.5-2.0mL/min；上机检测前，DON提取液经0.22μm有机系滤膜过滤，且其中溶解性有机碳浓度为50-100mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，所述步骤(c)中，背景信号值的获取方式为：以超纯水为待处理样品，通过步骤(a)与步骤(b)相同的操作获取背景信号；采用峰强度差减法扣除背景信号，保留差减后峰强度≥1000的质谱峰；所述污水样品谱图数据为经R语言中“XCMS”程序包转换的“.mzrt”数据。
5.根据权利要求1所述的一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，所述步骤(d)中，反应组学分析技术为在生物化学反应过程中，DON参与的物质反应过程都具有其对应的反应物DON与反应产物DON，以及反应物DON与反应产物DON间特定的质量差关系；在物质反应过程未知的条件下，依据质量差关系可获得样品中反应物DON、反应产物DON、DON参与的物质反应过程；
所述峰去冗余为扣除污水样品谱图数据中多余质谱峰；
所述保留时间的层次聚类为利用R语言中“getpaired”函数计算污水样品中质量差关系，并依据递推公式(1)进行保留时间分簇，D值大于10作为截断分组阈值：
式中，RTm与RTn为保留时间数据的组合簇，RT1为待计算的单一保留时间数据，D值为RT1与保留时间数据的组合簇(RTm，RTn)距离；
所述高频质量差关系为利用R语言中“getstd”函数扣除质量差关系中的加合物、中性丢失、同位素、共同碎片后的质量差关系；所述高频质量差矩阵为依据式(2)以质谱峰作为矩阵元的物质反应矩阵：
式中，{P1，P2，…，Pm}为质谱峰，{B1，B2，…，Bn}为质谱峰潜在的母体反应物；
所述物质反应数据库为KEGG数据库与HMDB数据库；
所述物质反应的网络关系图为以物质反应的最小质量差作为连接、质谱峰作为节点、相关值≥0.6的拓扑关系。
6.根据权利要求5所述的一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，所述最小质量差计算公式为：
PMDBk＝{min(|Bk-P1|，|Bk-P2|，...，|Bk-Pm|)|k＝1，2，...，n} (3)
式中，PMDBK为物质反应的最小质量差，{P1，P2，…，Pm}为质谱峰，{B1，B2，…，Bn}为质谱峰潜在的母体反应物。
7.根据权利要求1所述的一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，步骤(e)中，所述质谱峰对应的物质分子式匹配规则为质谱峰误差＜5ppm、保留时间误差＜2min、含偶数个氮原子的DON分子的相对分子质量为偶数、含奇数个氮原子的DON分子的相对分子质量为奇数、分子式匹配得分＞90。
8.根据权利要求1所述的一种污水中不同源溶解性有机氮的辨析方法，其特征在于，步骤(f)中，所述连接度为在物质反应关系的邻接矩阵中每个DON分子参与的物质反应个数；
所述反应距离为在物质反应关系的邻接矩阵中DON分子之间连接距离，即在邻接矩阵A＝(aij)N×N中，DON分子连接度为
DON分子的反应距离为
其中A为邻接矩阵，aij为DON分子i与DON分子j的关系描述符，N为DON分子个数，ki为DON分子i的连接度，lij为DON分子i与DON分子j之间最短连接关系的个数，L为DON的物质反应关系网络的平均连接长度；
反应关系连接度与反应距离划分为以污水样品中连接度中位数为主要截断值、反应距离中位数为次要截断值，划分{ki≤median(ki)}∩{lij≥median(lij)}的DON分子为外源性DON分子、{ki＞median(ki)}∪{lij＜median(lij)}的DON分子为内源性DON分子，其中median(ki)为连接度中位数，median(lij)为反应距离中位数。
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