CN110501413B

CN110501413B - 基于ft-icr ms的溶解性有机物分子式的确定方法

Info

Publication number: CN110501413B
Application number: CN201910743030.4A
Authority: CN
Inventors: 周永强; 张运林; 周蕾
Original assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Current assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Priority date: 2019-08-13
Filing date: 2019-08-13
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2039-08-13
Also published as: CN110501413A

Abstract

本发明涉及基于FT‑ICR MS的溶解性有机物分子式的确定方法。测定溶解性有机物FT‑ICR MS并经内部定标后，基于质荷比m/z值范围确定CHONS五种元素变幅范围，生成分子组合网格，得到潜在待匹配分子式。根据CHONS精确分子质量换算负离子条件下各分子式对应m/z值、理论去质子化m/z值向下取整、DBE、O/C、H/C、N/C、S/C、C+1‑H/2‑O值，并对分子式中CHONS原子数分别与相应元素标称质量乘积取模，并依此进行筛选以剔除自然环境下不存在的分子式。通过实测的校正后的m/z值与筛选后剩余潜在待匹配分子式理论m/z值逐一匹配，确定实测质谱峰的分子式。本发明方法无需添加化学试剂，也不需要繁琐的指标测定和复杂计算，即可实现溶解性有机物分子式的快速确定，可操作性强，具有重要而广泛的应用价值。

Description

基于FT-ICR MS的溶解性有机物分子式的确定方法

技术领域

本发明属于环境监测技术领域，主要用以判定溶解性有机物分子组成，具体涉及一种基于超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)的溶解性有机物分子式的确定方法。

背景技术

地表水生态系统中广泛存在的溶解性有机物(DOM)为全球范围内最大的有机碳库，其迁移转化每个环节发生的改变均在很大程度上决定碳循环和温室气体排放，从而制约全球气候变化的走向。由于这些环节均受DOM库的组成结构及生物与光降解活性所制约，因而揭示水生态系统中DOM结构对地表碳循环提供理论支撑。DOM包括一系列腐殖酸、富里酸、脂肪族及芳香烃类物质，组成结构也十分复杂，传统的化学分析手段很难有效揭示其结构与组成信息。有色可溶性有机物(CDOM)是DOM中能强烈吸收紫外辐射及蓝光的带发色团的那部分有机物，由于CDOM光谱吸收和荧光测量相对简单，其变化常被用来表征溶解性有机物库的丰度和组成变化。

CDOM由一系列分子量迥异的有机物质组成，结构相当复杂。根据CDOM能强烈吸收紫外辐射的特性，通常运用其在350nm吸收系数半定量表征其浓度。单位溶解性有机碳在紫外区吸收系数SUVA₂₅₄，光谱斜率S_275-295，吸收系数比值a(250):a(365)及光谱斜率比值S_R，亦即S_275-295/S_350-400通常用以表征腐殖化程度。其中SUVA₂₅₄越高，则表征腐殖化程度越高，而a(250):a(365)，S_275-295及S_R越高则表征腐殖化程度越低。由于CDOM中部分氨基酸、腐殖酸及芳香类物质具有荧光特性，在短波激发条件下会发出荧光。由于CDOM在相同激发波长下会发射出不同波长的荧光峰，因而荧光光谱比吸收光谱具有更高的分辨率，因而近年来大量研究结果运用荧光光谱表征CDOM组成结构的变化。传统的“寻峰法”只能获取很有限的若干个荧光峰，另外三维荧光图谱中荧光峰相互交叠，很容易造成荧光结果的误判。近年来兴起的平行因子分析法(parallel factor analysis,PARAFAC)能有效将错综交叠三维荧光图谱解析为相互独立的不同荧光组分，可有效定量或半定量表征CDOM各荧光组分的特征。然而值得指出的是，荧光手段仅能表征在短波激发条件下能发荧光的物质，这部分物质在DOM库中通常占比不超过10％。而且PARAFAC仅能揭示有限的荧光峰组分，该类组分的变化并不能完全定量揭示相应有机物质的来源、组成及迁移转化。

超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)是截至目前最先进的高分辨率质谱，质荷比分辨率高达10^-6量级，能在分子层面上有效应用于DOM组成结构的定量识别。在结合分子数据库的前提下能够检索到符合样品测定质荷比的海量分子信息。FT-ICRMS测定的质谱数据经由van Krevelen图谱的H/C及O/C分子量比值可表征DOM的来源与组成信息。简而言之，生物分子的化学结构可由van Krevelen分子量比值进一步细分为脂肪族、蛋白质与氨基酸、木质素、碳水化合物、不饱和烃、稠环芳烃类物质及单宁酸等几个亚类。由于木质素为陆地维管束植物降解的特有信号，因而其比重越高，陆源腐殖酸输入信号越强，而脂肪族及蛋白质为藻源性DOM信号，其比重大小与内源氨基酸新生信号息息相关。

由于超高分辨率质谱FT-ICR MS检测信号灵敏、包含海量分子结构信息且测定较为简便，在揭示DOM来源、组成及迁移转化过程方面远优于上述吸收与荧光光谱测量方法，因而越来越受到相关领域国内外学者的青睐。然而值得指出的是，目前国内外关于超高分辨率质谱FT-ICR MS分子式的确定方法一直是国内外学者开展工作的拦门虎。国内外学者目前较为广泛运用的是findformula-master及Formularity软件解译结果，然而两种方法均难以低匹配解译分子量DOM，再者分子结构van-Krevelen图谱中共轭结构不明显，相对强度的分布凌乱，存在较为广泛的误译，严重干扰研究者对溶解性有机物分子结构的判读。

发明内容

本发明目的在于提供一种新型的基于超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)的溶解性有机物分子式的确定方法。该方法适用于各类自然生态系统中溶解性有机物分子式的判读，以及来源与组成的解译，并且无需添加化学试剂，操作简单易行，所需成本很低且数据处理速度快，能很容易开发为界面软件；本发明基于超高分辨率质谱FT-ICR MS校正后图谱，能有效确定其分子组成并能用以快速确定溶解性有机物来源组成特征。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于FT-ICR MS的溶解性有机物分子式的确定方法，包括以下步骤：

(1)测定溶解性有机物FT-ICR MS并经内部定标；

(2)基于FT-ICR MS的质荷比m/z范围确定C、H、O、N、S五种元素的变幅范围，生成排列组合网格，获取潜在待匹配分子式；

(3)根据五种元素精确分子质量换算负离子条件下各潜在待匹配分子式对应m/z值、理论去质子化m/z值向下取整、双键等价物(DBE)、氧碳比O/C值、氢碳比H/C值、氮碳比N/C值、硫碳比S/C值、C+1-H/2-O值，并对潜在待匹配分子式中五种元素原子数分别与相应元素标称质量乘积取模；

(4)基于下述条件对潜在待匹配分子式进行筛选：

①溶解性有机物实测m/z值155-1200；

②双键等价物(DBE)≥0且为整数；

③理论去质子化m/z值与向下取整值之差0.3-0.9；

④O/C≤1；

⑤0.3≤H/C≤2；

⑥-10≤C+1-H/2-O≤10；

⑦2≤H≤(2C+2)；

⑧N/C<0.5；

⑨S/C<0.2；

⑩分子式中五种元素原子数与相应元素标称质量乘积取模值≠1；

剔除不符合上述①～⑩定义范围的潜在待匹配分子式，亦即剔除天然水体中不存在的分子式，获取剩余潜在待匹配分子式；

(5)通过校正后的实测m/z值与剩余潜在待匹配分子式的理论m/z值逐一匹配，并依此确定实测质谱峰的分子式。

所述步骤(1)中，测定溶解性有机物和超纯水Milli-Q空白的FT-ICR MS原始图谱，并经Data Analysis软件，依据Suwannee River Fulvic Acid(SRFA)标准品进行内部定标；FT-ICR MS的测定方法为：利用固相萃取后获得溶解性有机物样品，运用甲醇与纯水配比1:1比例稀释，之后采用15T超高分辨率质谱FT-ICR MS在负离子模式下测定溶解性有机物质谱，扣除超纯水Milli-Q空白制备的固相萃取FT-ICR MS峰，并通过Data Analysis(version4.2)软件依据Suwannee River Fulvic Acid(SRFA)标准品完成内部定标。FT-ICR MS图谱经Data Analysis进一步完成内部校正后质荷比m/z值相对误差控制在<1ppm；进一步的，FT-ICR MS质谱的测定并定标后，将精确分子质量设置为小数点后6位；在与理论值匹配过程中通过加氢并减电子质量的方式进行去离子化。

所述步骤(2)中，质荷比m/z范围为155-2000；五种元素的变幅范围分别为C：4～60、H：4～80，O：1～27，N：0～2；S：0～1。

所述步骤(5)中，保留与实测m/z值相比误差≤2ppm的理论潜在待匹配分子式，实测值与理论值之差最接近者确定为对应实测质谱峰的分子式。进一步的，所述方法还包括将环境变量与FT-ICR MS分子式相对丰度进行关联，确定各类水体分子组成的潜在环境驱动机制，步骤如下：

(1)以各个样点对应的环境指标作为自变量；

(2)将同一背景下所采集并完成测定的各个样点对应的FT-ICR MS分子式依据筛选出的剩余潜在待匹配分子式理论m/z值排列，将出现频率<20％且频次n<4的分子式剔除，并将对应质谱峰相对丰度作为因变量；

(3)计算样点采集所在地对应的各个环境指标自变量与FT-ICR MS质谱峰对应的相对丰度因变量进行Spearman秩相关分析，保留显著性水平p<0.05及|r|≥0.4所对应的质谱峰结果。

进一步的，FT-ICR MS质谱峰分子类型判别依据如下：

(1)计算质谱峰芳香性指数AI_mod＝(1+C-0.5O-S-0.5H)/(C-0.5O-S-N)；

(2)木质素Lignin判别依据为0.1≤O/C≤0.67；0.7≤H/C≤1.5；AI<0.67；

(3)稠环芳烃Condensed aromatics判别依据为0≤O/C≤0.67；0.2≤H/C≤0.67；AI≥0.67；

(4)单宁Tannin判别依据为0.67≤O/C≤2.0；0.5≤H/C≤1.5；AI<0.67；

(5)碳水化合物Carbohydrate判别依据为0.67≤O/C≤2.0；1.5≤H/C≤2.0；

(6)不饱和烃Unsaturated hydrocarbon判别依据为0≤O/C≤0.1；0.7≤H/C≤1.5；

(7)脂肪族Lipids判别依据为0≤O/C≤0.3；1.5≤H/C≤2.0；

(8)蛋白质Protein判别依据为0.3≤O/C≤0.67；1.5≤H/C≤2.0；0.05≤N/C；

本发明的优点：

(1)与以往利用有色可溶性有机物光谱吸收特征指数仅能测定部分能吸收紫外辐射的DOM、三维荧光指数及平行因子法PARAFAC解析得到的荧光组分仅能测定能发荧光的DOM、稳定性同位素δ¹³C-DOC及δ¹⁵N-TDN、傅里叶变换红外光谱用以判别溶解性有机物来源的方法不同，本发明方法能完成纷繁复杂的物质化学结构的测定，质荷比分辨率高达10^-6量级，能在分子层面上揭示DOM组成结构。根据分子数据库能够检索到符合样品测定质谱峰的海量分子信息。

(2)本发明不需要进行繁琐的传统化学液相色谱质谱指标的测定和单个分子量有机物分子式逐一分析等复杂计算，只需将定标后的溶解性有机物FT-ICR MS的m/z值与筛选的剩余潜在待匹配分子式对应去质子化后的m/z值匹配，将质子化后的m/z值与剩余潜在待匹配分子式差值控制在2ppm以内，相差值最小者即为最终确定分子式，据此即可实现内陆水体溶解性有机物超高分辨率质谱分子式的快速确定，物理意义清晰且可操作性强，易于推广并与国内外同行研究结果作对比。

(3)本发明所解译的分子数显著高于目前常用的findformula-master及Formularity软件解译结果，耗时显著缩短，且所得分子van-Krevelen图谱共轭结构更显著，相对强度更集中。另外由于本发明直接基于筛选剩余的潜在待匹配分子式进行匹配，这就意味着最终匹配所得到的数据矩阵的行数确定为剩余潜在待匹配分子式数目，能轻易实现样品间比较，尤其是生物降解及光降解等原位及室内培养实验前后样品间的差异，包括哪些分子在实验过程中矿化，哪部分分子在实验过程中新生。该发明还能使FT-ICR MS分子相对质谱丰度与环境驱动因子关联。传统的findformula-master及Formularity仅能每次分析一个样品质谱结果，且每个样品分子数不尽相同，无法做到样品之间作比较，也无法与环境因子关联，因而本发明在探讨DOM的超高分辨率质谱FT-ICR MS的分子组成及潜在环境驱动机制方面具有更为显著的优势。

(4)本发明提出了一种新型傅里叶变换离子回旋超高分辨率质谱的溶解性有机物分子式确定的新途径。由于该发明容易加工为线上或脱机超高分辨率质谱分子式的快速确定exe可执行软件，因而具有重要而广泛的应用价值。因而可以广泛应用于不同类型水体溶解性有机物DOM来源与分子组成的研究，也非常方便国内外同行研究成果进行比较，必将深化内陆水体碳循环的理论与实际应用研究，也将有利于溶解性有机物来源与分子结构的监测。

附图说明

图1是本发明简单模式图，亦即首先剔除天然水体中不存在的分子式后，获取的62462个剩余理论潜在待匹配分子式；通过校正后的实测m/z值与上述剩余潜在待匹配分子式的理论m/z值逐一匹配确定的实测质谱峰的分子式，并据此绘制的van-Krevelen分子组成图谱。

图2是长江干流三个河水样品运用目前国内外质谱分子确定软件findformula-master、Formularity及本发明的分析结果，其中点的颜色与大小均表征超高分辨率质谱FT-ICR MS峰的相对丰度。

图3是太湖西北入湖河口及湖心区(每个样点一个样品)经28天生物培养前后的DOM样品测定结果，根据Data Analysis(version 4.2)软件，经Suwannee River FulvicAcid(SRFA)标准品进行内部定标超高分辨率质谱在质核比m/z为150-800区间范围内的谱图(a-b)；太湖西北入湖河口及湖心区(每个样点一个样品)经28天生物培养前后的DOM样品van-Krevelen图谱(c-f)，图谱中点大小分别对应为超高分辨率质谱相对丰度的变幅大小；太湖不同湖区DOM超高分辨率质谱相对丰度与相应湖区温室气体N₂O释放通量的Spearman相关系数，仅显示相关系数绝对值|r|>0.4的结果(g)。

图4是我国青藏高原东北缘老虎沟冰川水系及东南缘雅鲁藏布江林芝-波密段冰川融水DOM样品超高分辨率质谱FT-ICR MS峰的相对丰度与冰川覆盖度(Glacialcoverage)、距离冰川尾碛(Distance to glacial terminus)及两者比值之间的Spearman相关系数。

具体实施方式

以下通过对我国不同大小、深度、海拔、水力滞留时间及营养水平的湖库及支流及冰川冻土与相应补给水体等不同DOM来源水体(其中冰川融水DOM主要以微生物作用来源的类色氨酸荧光峰为主)研究结果对本方法做进一步阐述，并对本发明作为一种有效的傅里叶变换离子回旋超高分辨率质谱的溶解性有机物分子式的确定方法做进一步说明。

通过2016-2018年间对长江干流(3个)、鄱阳湖(2个)、洞庭湖(2个)、东平湖(2个)、洪泽湖(1个)、骆马湖(1个)、阳澄湖(1个)、太湖(4个)、巢湖(2个)、千岛湖(4个)、洱海(2个)、滇池(1个)、抚仙湖(3个)、纳木错(1个)、冻土补给溪流(2个)、冰川样品(8个)及青藏高原东北缘老虎沟流域及东南林芝地区冰川补给溪流(29个)共计68个样点(表1)开展数十次野外样品采集，构建溶解性有机物超高分辨率质谱，并与目前国内外质谱分子确定软件findformula-master及Formularity分析结果加以验证本发明用以判定溶解性有机物超高分辨率质谱FT-ICR MS分子式的有效性。

本发明确定傅里叶变换离子回旋超高分辨率质谱FT-ICR MS的溶解性有机物分子式具体操作如下：

(1)样本采集：

野外布置样点并采集样本，运用Millipore(孔径为0.22μm)滤膜过滤后，通过PPL柱经固相萃取后于15T超高分辨率质谱仪FT-ICR MS在负离子雾化电喷扫模式下完成超高分辨率质谱原始谱测定，同时完成超纯水Milli-Q的萃取及测定并扣除超纯水Milli-Q空白。

表1采样水体表面面积、海拔、营养水平及每个采样区域采集的样品数量；NA为无数据

采集的样本分布如表1所示。表1为不同水体面积、海拔及营养水平及每个水体采集的样品数量。由该表可知，野外采集的样品覆盖不同大小、深度、海拔、水力滞留时间及营养水平。由此表明，本发明作为一种新型傅里叶变换离子回旋超高分辨率质谱的溶解性有机物分子式的确定方法具有良好的普适性及重要的推广潜力。

其中固相萃取具体步骤为选用安捷伦Agilent6mL PPL柱，运用质谱纯度的12mL甲醇冲洗PPL柱，留3mL甲醇浸泡PPL柱子至少四小时；随后放掉甲醇后用12mL超纯水Milli-Q冲洗PPL柱，继而用6mL甲醇冲洗PPL柱；运用试剂纯级盐酸(10M，即32％HCl)与Milli-Q超纯水配置0.01M稀盐酸，约为每1mL超纯水加1μL盐酸，采用12mL的0.01M稀盐酸冲洗PPL柱；将野外采集的水样滤经Millipore(孔径为0.22μm)滤膜，滤后液每1mL超纯水加1μL盐酸，将水样酸化至pH＝2。假定样品固相萃取效率为60％，最终保证每个样品萃取60μgC，即假设样品DOC为1mg/L，则需水样100mL。将水样缓慢经过PPL柱富集有机物，流速约5mL/min以保障萃取效率。每个PPL柱添加12mL的0.01M稀盐酸清洗PPL柱，最后用高纯氮气将PPL柱填充物完全吹干，取下柱后以1mL甲醇将PPL柱中富集的有机物洗脱出来再以超纯水Milli-Q以1:1配比稀释为上机前样品。

(2)测定溶解性有机物FT-ICR MS原始图谱后经Data Analysis(version 4.2)软件，依据Suwannee River Fulvic Acid(SRFA)标准品进行内部定标；校正后质荷比m/z值相对误差控制在<1ppm；FT-ICR MS质谱的测定并定标后，将精确分子质量设置为小数点后6位；在与理论值匹配过程中通过加氢并减电子质量的方式进行去离子化，即加1.0072765，以消除负离子模式的影响；

(3)基于FT-ICR MS的质荷比m/z范围确定C、H、O、N、S五种元素的变幅范围(C4-60/H4-80/O1-27/N0-2/S0-1)，生成排列组合网格，共得到711018个潜在待匹配分子式；

(4)采用上述m/z值根据实测FT-ICR MS图谱确定为155-1200之间，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；理论去质子化m/z值与向下取整值之差设定为0.3-0.9之间，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据双键等价物(DBE)≥0且为整数，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据溶解性有机物通常氧碳比O/C≤1，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据溶解性有机物通常氢碳比0.3≤H/C≤2，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据2≤H≤(2C+2)，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据N/C<0.5，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据S/C<0.2，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据溶解性有机物-10≤C+1-H/2-O≤10，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；依据分子式中CHONS原子数与相应元素标称质量乘积取模值≠1，剔除该范围以外的潜在待匹配分子式；最终确定62462个潜在待匹配分子式(图1)。

(5)通过校正后实测m/z值与62462个潜在待匹配分子式理论m/z值逐一匹配，保留与实测m/z值相比误差≤2ppm的理论潜在待匹配分子式，实测值与理论值之差最小者确定为对应实测质谱峰的分子式(图1)。

将去离子化后的m/z及每个质谱峰对应相对强度分别导入findformula-master及Formularity软件进行分析。与本发明结果进行对比，以证明本发明用以判定溶解性有机物超高分辨率质谱FT-ICR MS分子式的可行性和有效性(图2)。

(6)通过培养前与培养后的差值方法得出培养前后DOM分子组成的差异，包括哪些分子在培养过程中矿化降解，哪些分子在培养过程中新生(图3)。

FT-ICR MS质谱峰分子类型判别依据如下：

a.计算质谱峰芳香性指数AI_mod＝(1+C-0.5O-S-0.5H)/(C-0.5O-S-N)；

b.木质素Lignin判别依据为0.1≤O/C≤0.67；0.7≤H/C≤1.5；AI<0.67；稠环芳烃Condensed aromatics判别依据为0≤O/C≤0.67；0.2≤H/C≤0.67；AI≥0.67；单宁Tannin判别依据为0.67≤O/C≤2.0；0.5≤H/C≤1.5；AI<0.67；碳水化合物Carbohydrate判别依据为0.67≤O/C≤2.0；1.5≤H/C≤2.0；不饱和烃Unsaturated hydrocarbon判别依据为0≤O/C≤0.1；0.7≤H/C≤1.5；脂肪族Lipids判别依据为0≤O/C≤0.3；1.5≤H/C≤2.0；蛋白质Protein判别依据为0.3≤O/C≤0.67；1.5≤H/C≤2.0；0.05≤N/C。

(7)将环境变量与FT-ICR MS分子式相对丰度进行关联，确定各类水体分子组成的潜在环境驱动机制。

以各个样点对应的海拔、纬度、综合富营养指数、水力滞留时间、土地覆被比重等参数环境指标作为自变量；将同一背景下所采集并完成测定的各个样点对应的FT-ICR MS分子式依据筛选出的62462个剩余潜在待匹配分子式理论m/z值排列，将出现频率<20％且频次n<4的分子式剔除，并将对应质谱峰相对丰度作为因变量；计算样点采集所在地对应的各个环境指标自变量与FT-ICR MS质谱峰对应的相对丰度因变量进行Spearman秩相关分析，保留显著性水平p<0.05及|r|≥0.4所对应的质谱峰结果。据此即可看出特定水生态环境系统中DOM分子组成的潜在环境驱动机制(图3；图4)。

长江干流三个河水样品运用目前国内外质谱分子确定软件findformula-master、Formularity及本发明的分析结果如图2所示，其中点的颜色与大小均表征超高分辨率质谱FT-ICR MS峰的相对丰度。其中findformula-master结果共轭结果及质谱峰的相对丰度的分布相当混乱，而Formularity结果相对而言虽更为合理，主要体现在共轭结果及质谱峰的相对丰度的分布相对规律，然而值得指出的是O/C<0.3范围内分子式的峰值相对丰度分布依旧较为混乱。反观本发明所得结果相当规律，共轭结果显著，长江干流陆源土壤淋溶所得类腐殖酸信号通常比较强，相对丰度分布集中在木质素区域，与预期结果一致。

通过网格删选后的矩阵将输出数据规律排列，实现了多个样品间比较分析，尤其是光降解或生物培养降解前后溶解性有机物DOM分子组成的差异，包括哪些分子在培养过程中矿化降解，哪些分子在培养过程中新生。图3显示了经28天生物培养前后的DOM样品测定结果以及太湖不同湖区DOM超高分辨率质谱相对丰度与相应湖区温室气体N₂O释放通量的Spearman相关系数，陆源木质素等物质质谱峰相对丰度与N₂O释放通量显著正相关。这表明本发明结果能行之有效地表征不同样品之间的分子组成的定量差异，尤其是能表征经光化学降解或生物降解等外部扰动前后DOM分子组成的定量差异，也能反映哪些分子在外部扰动过程中降解矿化、哪些分子在外部扰动过程中新生。与以往findformula-master、Formularity等软件仅能分析单个样品相比，本发明具有更为重要的潜在推广与应用价值。另外也能定量反映分子组成与环境因子之间的关联程度，分析水体DOM分子组成的潜在环境驱动因子。

不同水域溶解性有机物DOM在28天生物培养实验前后超高分辨率质谱所揭示的分子数量及各类有机物类别分子数与相对贡献率得以准确确定(表2)，进一步证实了本发明在表征不同样品之间的分子组成的定量差异，尤其是表征经光化学降解或生物降解等外部扰动前后DOM分子组成的定量差异方面所表现出重要的推广潜力与应用价值。

表2太湖典型西北入湖河口及湖心区溶解性有机物在28天生物培养实验前后超高分辨率质谱校正结果经本发明获取的分子数量及各类有机物类别分子数与相对贡献率；前与后分别指代28天生物培养前后质谱结果

冰川补给溪流DOM样品超高分辨率质谱的相对丰度与冰川覆盖度、与冰川尾碛距离、两者比值等环境因子的定量关系鲜明，脂肪族及蛋白质对应质谱峰相对丰度与冰川覆盖度呈显著正相关，与冰川尾碛距离呈显著负相关；与之相反，木质素对应质谱峰相对丰度与冰川覆盖度呈显著负相关，与冰川尾碛距离呈显著正相关(图4)。这意味着与以往findformula-master、Formularity等软件仅能分析单个DOM样品质谱结果相比，本发明能定量反映不同水生态系统中DOM分子组成与环境驱动机制的关联性。由此表明，本发明具有反映DOM分子组成潜在环境驱动因子的潜在巨大推广与实际应用价值。

Claims

1.一种基于FT-ICR MS的溶解性有机物分子式的确定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)测定溶解性有机物FT-ICR MS并经内部定标；

(3)根据五种元素精确分子质量换算负离子条件下各潜在待匹配分子式对应m/z值、理论去质子化m/z值向下取整、双键等价物DBE、氧碳比O/C值、氢碳比H/C值、氮碳比N/C值、硫碳比S/C值、C+1-H/2-O值，并对潜在待匹配分子式中五种元素原子数分别与相应元素标称质量乘积取模；

(4)基于下述条件对潜在待匹配分子式进行筛选：

①溶解性有机物实测m/z值155-1200；

②双键等价物DBE≥0且为整数；

③理论去质子化m/z值与向下取整值之差0.3-0.9；

④O/C≤1；

⑤0.3≤H/C≤2；

⑥-10≤C+1-H/2-O≤10；

⑦2≤H≤(2C+2)；

⑧N/C<0.5；

⑨S/C<0.2；

剔除不符合上述①～⑩定义范围的潜在待匹配分子式，亦即剔除天然水体中不存在的分子式，获取剩余理论潜在待匹配分子式；

(5)通过校正后的实测m/z值与上述剩余潜在待匹配分子式的理论m/z值逐一匹配，并依此确定实测质谱峰的分子式。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，测定溶解性有机物和超纯水Milli-Q空白样固相萃取结果的FT-ICR MS原始图谱，并经Data Analysis软件，依据Suwannee River Fulvic Acid(SRFA)标准品进行内部定标。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，FT-ICR MS的测定方法为：固相萃取后获得溶解性有机物样品，运用甲醇与纯水配比1:1比例稀释，之后采用15 T傅里叶变换超高分辨率质谱仪测定FT-ICR MS，并扣除超纯水Milli-Q空白质谱峰。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用负离子电喷雾化模式测定溶解性有机物质谱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将环境变量与FT-ICR MS分子式相对丰度进行关联，确定各类水体分子组成的潜在环境驱动机制，步骤如下：

(1)以各个样点对应的环境指标作为自变量；

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括判别FT-ICR MS质谱峰的分子类型，依据如下：

(1)计算质谱峰芳香性指数AI_mod＝(1+C-0.5O-S-0.5H)/(C-0.5O-S-N)；

(4)单宁Tannin判别依据为0.67≤O/C≤2.0；0.5≤H/C≤1.5；AI<0.67；

(7)脂肪族Lipids判别依据为0≤O/C≤0.3；1.5≤H/C≤2.0；

(8)蛋白质Protein判别依据为0.3≤O/C≤0.67；1.5≤H/C≤2.0；0.05≤N/C。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，FT-ICR MS图谱经DataAnalysis内部校正后质荷比m/z值相对误差控制在<1ppm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，质荷比m/z范围为155-2000；五种元素的变幅范围分别为C：4～60、H：4～80，O：1～27，N：0～2；S：0～1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，保留与实测m/z值相比误差≤2ppm的理论潜在待匹配分子式，实测值与理论值之差最接近者确定为对应实测质谱峰的分子式。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，FT-ICR MS质谱的测定并定标后，将精确分子质量设置为小数点后6位；在与理论值匹配过程中通过加氢并减电子质量的方式进行去离子化。