CN113416767A

CN113416767A - 一种检测生物分子数量的方法

Info

Publication number: CN113416767A
Application number: CN202110678583.3A
Authority: CN
Inventors: 高鹏程; 林美华; 王昕萌; 夏帆
Original assignee: China University of Geosciences
Current assignee: Shandong Leize Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2041-06-18
Also published as: CN113416767B

Abstract

本发明的一种检测生物分子数量的方法。该方法通过RCA扩增样品中的生物分子得到DNA纳米球，利用电化学方法对通过具有单一孔道的基层的DNA纳米球产生的电流进行检测，计算得到样品中扩增后的DNA纳米球的数量。本发明采用RCA扩增得到一定尺寸的DNA纳米球，建立一个尺寸与DNA纳米球相匹配的孔道，能够最终能利用库尔特技术读取DNA纳米球在过孔瞬间的电压脉冲信号，将实现待测生物分子的特异性识别，并实现对其数量的精确统计。

Description

一种检测生物分子数量的方法

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种检测生物分子数量的方法。

背景技术

在人工配制溶液或细胞裂解液、组织液、血液等环境下，特异性识别特定的、痕量的核酸、蛋白质等生命物质并准确统计其数量，对重大疾病筛查，特别是疾病的早期筛查具有重大的意义。库尔特技术是一种成熟的颗粒计数技术。其原理是利用电压驱动待测颗粒穿越人工构建的孔道，监测穿越过程电压脉冲信号，并最终实现颗粒的数量统计。仅通过颗粒与孔道的尺寸匹配进行识别，采用百纳米甚至更大孔的库尔特技术对多数纳米尺寸的生物分子，特别是核酸、蛋白质等缺乏特异性识别能力。近年来，随着纳米加工技术的发展，提取或人工合成具有数纳米或亚纳米尺寸开口的纳米孔道被应用在库尔特技术中。当生物分子与孔道尺寸的高度匹配，通过捕获生物分子穿越孔道时的电压变化，能够特异性识别并实现生物分子的计数。目前，基于库尔特原理，纳米孔已经实现了核酸测序、单分子检测等。然而，在实际应用中，真实样品中的待测物处于复杂环境中。而纳米孔对干扰物极为敏感，干扰物堵塞孔道会产生假信号，并很高几率造成不可逆堵塞，使纳米孔无法继续工作。虽然已公开技术通过纳米孔道修饰探针分子实现特异性识别，但这些技术仍无法实现痕量分子的数量统计。利用百纳米或微米尺度的孔道，基于库尔特技术，建立对待测物质特异性识别的方法，是实现真实样品中生物分子特异性识别和准确数量统计的可行途径之一。目前已公开的技术，可以通过对人工合成微米或百纳米颗粒修饰探针分子，特定捕获待测物，实现特异性检测。然而，微米或百纳米颗粒与捕获待测物，尤其是纳米尺度的蛋白和核酸等，受到修饰条件、识别环境的限制，很难建立颗粒与捕获定量关系，因而无法实现待测物的数量统计。

目前，亟需构建一个基于微米或百纳米孔的检测体系，实现对核酸、蛋白质等待测物的特异性识别，同时建立准确的定量关系，从而实现待测物数量统计。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种准确检测生物分子数量的方法。

本发明的一种检测生物分子数量的方法，通过RCA扩增样品中的生物分子得到DNA纳米球，利用电化学方法对通过具有单一孔道的基层的DNA纳米球产生的电流进行检测，计算得到样品中扩增后的DNA纳米球的数量。

进一步的，所述DNA纳米球的直径大于100nm，所述DNA纳米球的直径不小于所述孔道的直径的1/5。

进一步的，所述孔道的深度小于孔道的直径的40倍。

进一步的，所述基层包括硅的二维膜、氮化硅的二维膜、石墨烯的二维膜或二硫化钼的二维膜，所述孔道为通过聚焦电子、离子束或化学法刻蚀的孔道；

或所述基层包括石英管，所述孔道为石英管拉制的孔道；

或所述基层包括PET薄膜、PC薄膜或PI薄膜，所述孔道为化学刻蚀的核径迹聚合物单孔阵列；

或所述基层为磷脂薄膜，所述孔道为生物体提取或蛋白重结晶的生物蛋白孔道。

进一步的，所述基层和孔道疏水化处理或\和修饰负电荷。基层和孔道修饰排斥待测物吸附不限于疏水化处理，可采用与RCA产物相同电性即负电的聚电解质在孔道表面修饰，通过静电排斥作用，减小滞留和信号丢失的几率。也可以使用Plasma对孔道表面改性，富含带负电羟基实现。也可以将疏水和静电排斥作用相结合，及孔道表面同时疏水化和引入负电荷。

进一步的，所述基层为PET薄膜，采用具有单一重离子轰击核径迹的PET薄膜，利用碱液刻蚀，控制刻蚀时间，获得孔道，采用氟硅烷作为前驱物，利用气相沉积技术使基层和孔道疏水化。

进一步的，激光刻蚀法在硅片上刻蚀孔道，后使用等离子体技术对硅片和孔道表面改性，使其表面富含带负电羟基。

进一步的，核酸中的靶标DNA分子的扩增采用如下步骤：当靶标DNA分子自身可以作为引物时，将靶标DNA分子与设计好的线型模板DNA的两端杂交，在DNA连接酶作用下，模板DNA变成环形结构，靶标DNA分子作为引物在聚合酶和dNTP作用下沿模板扩增，得到DNA纳米球；当靶标DNA分子自身不可以作为引物时，将靶标DNA分子与设计好的线型模板DNA的两端杂交，在DNA连接酶作用下，模板DNA变成环形结构，加入一段设计好的引物连接在模板DNA中段作为靶标DNA分子扩增的起始点，在DNA聚合酶作用下，靶标DNA分子从环形模板侧边引物DNA分子开始扩增，然后环形DNA在连接酶作用下继续沿环形模板扩增，得到DNA纳米球；

所述核酸中的靶标RNA分子的扩增采用如下步骤：靶标RNA分子的检测，靶分子RNA通过toehold作用与预先形成的双链DNA中的一条链发生链取代反应，释放出另一条DNA，释放出的这条DNA与上述靶标DNA分子的扩增原理一样，引发聚合反应，形成DNA纳米球；

对于除核酸外其他的生物分子的扩增采用如下步骤：通过寻找其他生物分子对应的核酸适配体，并设计核酸适配体的部分杂交序列使适配体形成双链，生物分子与核酸适配体的结合作用释放出与核酸适配体杂交的互补序列，该互补序列与上述靶标DNA分子的扩增原理一样，引发聚合反应，形成DNA纳米球。

进一步的，所述DNA聚合酶的粒径要小于孔道的直径的1/10。

本发明的方法中的RCA扩增是基于核酸分子之间高度匹配下实现的，对待测物识别具有特异性，基于核酸适配体和链取代反应，设计出对于生物分子(核酸、小分子、蛋白、外泌体、病毒、细胞或细菌等)的特异性识别，RCA扩增技术能够使一条DNA链扩增成具有一定体积的DNA纳米球，实现了核酸尺寸的扩增，并建立待测生物分子与DNA纳米球一一对应的定量关系，建立一个尺寸与DNA纳米球相匹配的孔道，能够最终能利用库尔特技术读取DNA纳米球在过孔瞬间的电压脉冲信号，将实现待测生物分子的特异性识别，并实现对其数量的精确统计。

附图说明

图1为靶标DNA分子自身可以作为引物时的RCA扩增过程和电化学检测过程的示意图；

图2为靶标DNA分子自身不可以作为引物时的RCA扩增过程和电化学检测过程的示意图；

图3a为实施例1中的生物样品RCA扩增10min后的FESEM图；

图3b为实施例1中的生物样品RCA扩增30min后的FESEM图；

图4为实施例1的RCA扩增后的DNA纳米球的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为实施例1中的DNA纳米球过孔时瞬间产生电脉冲图；

图6为实施例1中的DNA纳米球过孔时的zeta电位图；

图7为实施例2的DNA纳米球的粒径与数量关系图；

图8为实施例2的DNA纳米球的数量与时间关系图；

图9为对比例1中的孔道的FESEM图；

图10为对比例2的反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

使用碱液刻蚀方法在PET膜基底上刻蚀获得单个孔道，使用甲酸中和来终止反应，反应后通过皮安表测量电流计算获得孔径，可通过控制反应时间调整孔径。设计与产物尺寸接近孔径，产物中尺寸最大约为300nm，因此制备孔径为500nm的孔道，得到具有单一孔道的PET薄膜。

采用氟硅烷作为前驱物，利用气相沉积技术使基层和孔道疏水化。

提取生物样品中的靶标RNA，设计好与该靶标RNA匹配的线型模板DNA，将线型模板DNA与该靶标RNA通过T4连接酶95℃退火10min连接获得环形结构，以环形结构作为模板，加入phi29DNA连接酶在37℃进行RCA反应获得DNA纳米球，最后65℃加热5min使酶灭活结束反应。

采取上述方法将一定量的生物样品中的DNA均进行RCA扩增。

使用电化学工作站构建过孔装置，将具有修饰后具有单一孔道的PET薄膜置于两个充满电解液的电解槽之间。利用外力将薄膜夹紧，避免电解液泄露，将扩增后的生物样品放置其中一个电解槽中，采用一对Ag/AgCl电极放置在膜两侧的电解槽中，利用电压驱动力，将带负电的RCA驱动通过孔道。记录RCA颗粒通过孔道的脉冲电流判断是否有RCA产物产生，证明是否有待测物存在。当有RCA产物颗粒通过孔道，通过产生脉冲的数量，可以获得颗粒的数量。

其中：

靶标RNA序列

5’-TCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’

线性模板核酸序列

5’-TTCCCGGCGGCGCAGCAGTTAGATGCTGCTGCAGCGATACGCGTATCGCTATGGCATATCGTACGATATGCCGCAGCAGCATCTAACCGTACAGTATT-3’

图3a和图3b为扩增后的DNA纳米球的FESEM图。

图4为扩增后的DNA纳米球的琼脂糖凝胶电泳图。

从图3a、图3b和图4可以看出，DNA纳米球普遍尺寸较大，说明扩增效果优异。

图5为DNA纳米球过孔时瞬间产生电脉冲图。

图6为DNA纳米球过孔时的zeta电位图。

从图5和图6可以看出，DNA纳米球过孔时产生了明显的电脉冲信号。

实施例2

提取生物样品中的蛋白质，将其与设计好的该蛋白质的核酸适配体进行适配后，将该蛋白质核酸适配体的互补序列作为引物，与设计好的互补线性模板通过T4连接酶95℃退火10min连接获得环形结构，以环形结构作为模板，加入phi29DNA连接酶在37℃进行RCA反应获得DNA纳米球，最后65℃加热5min使酶灭活结束反应。

采取上述方法将一定量的生物样品中的蛋白质均进行RCA扩增。

采用激光刻蚀法在硅片上刻蚀孔径为500nm的孔道，后使用Plasma对孔道表面改性，使其表面富含带负电羟基，由于RCA产物带负电，改性后产物不会堵塞孔道。

将具有修饰后具有单一孔道硅片置于两个充满电解液的电解槽之间，将扩增后的生物样品放置其中一个电解槽中，电解槽两边分别含有一个Ag/AgCl电极，利用电压驱动力，将带负电的RCA产物驱动通过孔道。

使用nanocoulterⅠ纳米库尔特粒度仪(瑞芯制造(深圳)科技有限公司)对稀释后产物进行数量及粒径分析。

图7为DNA纳米球的粒径与数量关系图。

图8为DNA纳米球数量与时间关系图。

从图7和图8可以看出实施例2扩增效果优异并且能够测量扩增后DNA纳米球数量与粒径。

实例中使用的蛋白质为Her 2蛋白质，Her 2蛋白质核酸适配体序列

5'-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCTGCACTTGTCATTTTGTATATGTATTTGGTTTTTGGCTCTCACAGACACACTACACACGCACA-3'。

线性模板序列

5'-ATATGTTTTACTGTTCACGTCTGAGAATCCCTAAACCCGCCAATGCTGCTGCAGCGATACGCGTATCGCTATGGCATATCGTACGATATGCCGCAGCAGCAACACGCACACATCACACAGACACTCTCGGTTTTTGGTTTATGT-3'。

对比例1改变孔径

改变实施例1中的PET膜基底上刻蚀获得单个孔道的孔经为2μm，刻蚀孔径约为2μm的孔道如图9所示。其他步骤均与实施例相同。但由于孔道孔径过大，DNA纳米球过孔时没有产生电脉冲信号。

对比例2不扩增

不扩增实施例2中的蛋白质，在生物样品中加入与核酸适配体不匹配的线性模板，使用其他线性模板与Her2蛋白质核酸适配体RCA反应，直接将生物样品放置其中一个电解槽中，其他步骤与实施例2相同。图10为使用其他靶标与Her2蛋白质核酸适配体RCA反应后琼脂糖凝胶电泳图，由图可见，扩增后无产物，根据图片判断，样品中只有加入的线性模板，因此在蛋白质与核酸适配体不匹配时，RCA反应不能进行。

由于蛋白质未扩增，导致孔道孔径相对蛋白质来说过大，蛋白质过孔时没有产生电脉冲信号。

其中，调节RCA扩增时间，控制RCA产物DNA纳米球的直径，使粒径大于100nm，避免线性模板链产生干扰，同时，其直径应大于所使用孔道孔径的1/5，以实现电脉冲信号识别。

上述样品可以是血液或体液等生物样品或是人工配置溶液及复杂溶液等，来源包括但不仅限于人类、鼠类、禽类等。

本文所用的术语“DNA聚合酶”通常是指能够催化聚合反应的任何酶。DNA聚合酶的示例包括但不限于核酸聚合酶、转录酶或连接酶。DNA聚合酶可以是聚合反应酶。其中，酶的粒径要小于孔道孔径的1/10，避免假信号产生。结果表明DNA聚合酶的浓度对RCA产物颗粒大小不产生明显影响。当DNA聚合酶不产生假信号时，可以适量提高DNA聚合酶的浓度(<50U)，提高RCA反应效率。

以上未涉及之处，适用于现有技术。

虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国地质大学（武汉）

<120> 一种准确检测生物分子数量的方法

<141> 2021-07-22

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial）

<400> 1

tctaactgct gcgccgccgg gaaaatactg tacggttaga 40

<210> 2

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial）

<400> 2

ttcccggcgg cgcagcagtt agatgctgct gcagcgatac gcgtatcgct atggcatatc 60

gtacgatatg ccgcagcagc atctaaccgt acagtatt 98

<210> 3

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial）

<400> 3

aaccgcccaa atccctaaga gtctgcactt gtcattttgt atatgtattt ggtttttggc 60

tctcacagac acactacaca cgcaca 86

<210> 4

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工合成（Artificial）

<400> 4

atatgtttta ctgttcacgt ctgagaatcc ctaaacccgc caatgctgct gcagcgatac 60

gcgtatcgct atggcatatc gtacgatatg ccgcagcagc aacacgcaca catcacacag 120

acactctcgg tttttggttt atgt 144

Claims

1.一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：通过RCA扩增样品中的生物分子得到DNA纳米球，利用电化学方法对通过具有单一孔道的基层的DNA纳米球产生的电流进行检测，计算得到样品中扩增后的DNA纳米球的数量。

2.如权利要求1所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：所述DNA纳米球的直径大于100nm，所述DNA纳米球的直径不小于所述孔道的直径的1/5。

3.如权利要求2所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：所述孔道的深度小于孔道的直径的40倍。

4.如权利要求3所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：所述基层包括硅的二维膜、氮化硅的二维膜、石墨烯的二维膜或二硫化钼的二维膜，所述孔道为通过聚焦电子、离子束或化学法刻蚀的孔道；

或所述基层包括石英管，所述孔道为石英管拉制的孔道；

5.如权利要求4所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：所述基层和孔道疏水化处理或\和修饰负电荷。

6.如权利要求5所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：所述基层为PET薄膜，采用具有单一重离子轰击核径迹的PET薄膜，利用碱液刻蚀，控制刻蚀时间，获得孔道，采用氟硅烷作为前驱物，利用气相沉积技术使基层和孔道疏水化。

7.如权利要求5所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：激光刻蚀法在硅片上刻蚀孔道，后使用等离子体技术对硅片和孔道表面改性，使其表面富含带负电羟基。

8.如权利要求2所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：核酸中的靶标DNA分子的扩增采用如下步骤：

当靶标DNA分子自身可以作为引物时，将靶标DNA分子与设计好的线型模板DNA的两端杂交，在DNA连接酶作用下，模板DNA变成环形结构，靶标DNA分子作为引物在聚合酶和dNTP作用下沿模板扩增，得到DNA纳米球；

当靶标DNA分子自身不可以作为引物时，将靶标DNA分子与设计好的线型模板DNA的两端杂交，在DNA连接酶作用下，模板DNA变成环形结构，加入一段设计好的引物连接在模板DNA中段作为靶标DNA分子扩增的起始点，在DNA聚合酶作用下，靶标DNA分子从环形模板侧边引物DNA分子开始扩增，然后环形DNA在连接酶作用下继续沿环形模板扩增，得到DNA纳米球；

9.如权利要求8所述的一种检测生物分子数量的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶的粒径要小于孔道的直径的1/10。