CN113413459A - 沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制药和化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活性多肽及其基因和在制药和化妆品中的应用，所述沼水蛙多功能多肽Cath‑HG是由24个氨基酸组成的多肽，分子量2725.12道尔顿，等电点10.232，其氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示，上述多肽的第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸构成分子内二硫键。本发明所述沼水蛙多功能多肽Cath‑HG是根据SEQ ID NO.1所示的序列合成。本发明由沼水蛙多功能多肽Cath‑HG具有结构简单、人工合成方便、生物活性多样而强的特点，可以作为制备抗痤疮感染、抗炎、免疫调节、脓毒症、预防血栓形成的治疗药物的应用。

Description

沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制药和化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及一种沼水蛙多肽在制药和化妆品中的应用，属于生物医药领域，特别涉及沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制药和化妆品中的应用。

背景技术

炎症是身体对外部攻击和有害刺激(例如，因为伤口、微生物病原体感染或化学刺激引起的组织损伤)的生理防御反应。这是一个复杂的过程，受一系列炎症介质和细胞因子的调控。当机体对感染的反应损害其自身组织和器官，如发现、治疗不及时，就会出现脓毒症，甚至因休克、多器官衰竭最终导致死亡。免疫细胞通过模式识别受体识别致病菌并启动炎症反应。作为机体固有免疫的重要组成部分，巨噬细胞是主要促炎细胞，在非特异性和后天免疫应答中都起着至关重要的作用，受刺激的巨噬细胞释放各种细胞因子和促炎介质，包括前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、白介素6(IL-6)、趋化因子(MCP-1)、白介素-1β(IL-1β)和活性氧(ROS)，其介导炎症和与分子病理生理学密切相关。诱发刺激的因素包括促细胞分裂剂、炎性细胞因子、电离辐射和细菌脂多糖(LPS)刺激等。

脂多糖(LPS)也被称为内毒素，是脓毒症的重要致病因素之一。脓毒症是一种与宿主对感染的反应有关的临床综合征，已经成为全球性的健康危机，并持续成为发达国家重症监护病房中患者死亡的主要原因之一。脓毒症炎症反应失调和免疫稳态破坏贯穿于整个疾病发展过程，并与器官损伤及功能障碍密切相关。脓毒症感染的严重性归因于激活级联反应，在此过程中，炎症反应失调时的炎性反应亢进，病原体激活天然免疫系统，特别是巨噬细胞等固有免疫细胞，产生大量促炎因子，该激活级联反应会导致细胞因子产生自动扩增形成“细胞因子风暴”，进一步放大炎症反应，造成众多组织细胞的炎性损伤。当前脓毒症治疗方法主要是进行病源学诊断，针对病因给予积极的治疗例如抗感染和扩容升压等，一些感染性休克的患者可能会受益于诸如皮质类固醇或活化的蛋白C之类的药物，这些治疗措施对于患者预后及生存质量都是极大挑战。在脓毒症休克发生时应用得当药物对于控制、延缓疾病进展、提升生存率意义重大。因此，对于能够针对于提高脓毒症患者生存率，纠正内环境紊乱以及器官功能障碍的药物需求仍面临诸多挑战。

痤疮是一种经常发生于青少年的慢性炎性疾病，已被列为全球排名第八最常见的疾病。痤疮的发病机理是多方面的，但是革兰氏阳性的厌氧芽孢杆菌痤疮丙酸杆菌在炎性痤疮的发展中直接和间接地起重要作用。它通常在人类皮肤皮脂囊中发现并且能够诱导一些趋化因子将嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞吸引到毛囊皮脂。此外，据报道，痤疮丙酸杆菌可以通过某些途径激活核因子(NF)-κβ转录因子刺激和延长由Toll样受体2介导的促炎细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的产生，从而引起炎症。因此，抑制或杀死痤疮丙酸杆菌和抗炎对痤疮治疗至关重要。常用的痤疮药物包括过氧化苯甲酰、抗生素、异维甲酸、水杨酸、类固醇、口服抗雄激素。这些药物通常能针对一种或多种致病因素。但是使用这些合成化学药物可能会导致轻度至严重的副作用。例如，抗生素通过杀死痤疮丙酸杆菌和抗炎发挥治疗作用，然后长期应用后很容易产生耐药性。过氧化苯甲酰尽管能通过抗菌发挥作用，但它却会引起红斑、脱屑和灼烧感。因此，找到一种具有抗痤疮丙酸杆菌和抗炎作用但诱导耐药潜能很弱并且其他副作用少的新药物至关重要。

近年来，消费者对于“天然”药品、保健品、美容品的需求日渐增加。因此，厂商在其配方中加入了更多的基于天然产物的材料。随着最近科学的发展，研究人员已经能够更好的评估天然产物的效力和/或可能的新用途。由于该科学的崭新性，以及由于可被用于药品、保健品、美容品生物活性剂的动物天然产物是如此的广泛，大多数仍然没有被充分研究。

此外，由于天然产品需求增加，保护地球的天然资源也引起关注。消费者需要的许多“天然”成分来源于当被收获用于消费品时往往被耗尽和/或破坏的生物资源。因此，消费者对于天然的、更环境友好的产品的需求相反地导致了其所意图保护的生物资源的破坏。因此，需要这样的天然生物活性产物，其能维持它们的被期望的生物活性谱，适于局部或全身给药。此外，需要此类生物活性材料，其能够以生态健康的、可持续的方式进行获得和处理。

两栖动物皮肤裸露，生活在有利于微生物生存的阴暗潮湿的自然环境中。为了保护机体免受各种侵害，两栖动物的皮肤上散布着腺体，分泌产生不同的化合物，包括生物活性成分生物碱、蛋白质、多肽、蟾蜍二烯内酯等。目前已经从两栖动物皮肤中鉴定出超过1900种活性多肽。这些活性多肽分别有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节、抗氧化等等功能。由于生存环境的不同和遗传背景的差异，不同两栖动物的皮肤药理活性分子具有高度生化多样性，两栖动物皮肤含有许多结构新颖、功能复杂多样且具有临床应用价值的生物分子，因此两栖动物是有待开发利用的资源宝库。其中，沼水蛙(Hylarana guentherip)主要分布于我国中南部各省、台湾、海南岛和香港，是我国特色资源动物之一。

多肽药物是近年来世界新药研究开发的热点、新药发现与创新的源泉，也是我国生物医药研究的重点方向之一。与传统药物相比，多肽药物具有以下明显的优势：(1)较高的活性，在极低的剂量或浓度下即可表现出显著活性；(2)较小的分子量，合成简单，结构易于改造，易于控制；(3)副作用小，多肽类药物分子量小，抗原性较低，不易引起免疫反应。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供沼水蛙多功能多肽Cath-HG及其在制药和化妆品中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明涉及沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备治疗痤疮、抗炎、调节免疫、改善脓毒症预后、预防和治疗血栓性疾病药物中的应用。

本发明所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG采用本领域已知的方法(固相合成方法)制备得到，以及采用本领域已知的分离纯化方法(例如高效液相色谱法)分离纯化。所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG由24个氨基酸组成的多肽，分子量2725.12道尔顿，等电点10.232。所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG的编码基因由438个核苷酸组成，自5’端至3’端序列如SEQ IDNO.2所示，序列中第364-435位核苷酸编码具有功能的成熟沼水蛙多功能多肽Cath-HG。氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，多肽中第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

本发明提供如上所述的沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备抗痤疮丙酸杆菌药物、或制备治疗痤疮药物中的应用。

本发明提供如上所述的沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备祛痘美容用品中的应用。

通过肉汤稀释法检测沼水蛙多功能多肽对痤疮丙酸杆菌ATCC 6919的杀菌效果，结果显示多肽对细菌的最低抑菌浓度(MIC)为1.5625μM；构建小鼠体内痤疮模型，结果显示沼水蛙多功能多肽Cath-HG局部施用于皮肤表面，能够减轻痤疮丙酸杆菌诱导的皮肤病理变化。

本发明提供如上所述的沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备抗炎及免疫调节治疗药物中的应用。

进一步地，所述制备抗炎及免疫调节治疗药物中的应用具体为沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备调节RAW 264.7细胞分泌一氧化氮和/或促炎细胞因子药物中的应用，包括降低一氧化氮水平、和/或降低细胞因子IL-1β水平、和/或降低细胞因子IL-6水平、和/或细胞因子TNF-α水平药物中的应用；在制备抑制角叉菜胶药物中的应用；在制备促进中心粒细胞迁移药物中的应用。

通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测沼水蛙多功能多肽Cath-HG在调节脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞分泌一氧化氮或者促炎细胞因子、包括降低细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α水平的作用，结果显示沼水蛙多功能多肽Cath-HG抑制了脂多糖(LPS)一氧化氮和细胞因子水平。构建小鼠体内急性炎症模型发现沼水蛙多功能多肽Cath-HG能够抑制角叉菜胶诱导的小鼠急性炎症。迁移实验显示沼水蛙多功能多肽Cath-HG浓度依赖性地促进中性粒细胞迁移。

本发明提供如上所述的沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备中和脂多糖药物中的应用。

等热滴定实验结果显示沼水蛙多功能多肽Cath-HG能够有效地中和脂多糖(LPS)，结合常数KD为1.25e-6±283e-9M。

本发明提供如上所述的沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备治疗脓毒症的药物中的应用。

构建两种小鼠体内脓毒症模型，结果显示沼水蛙多功能多肽Cath-HG用于早期脓毒症治疗，提高和改善了脓毒症患鼠生存率和预后。

本发明提供如上所述的沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

构建小鼠断尾模型，结果显示沼水蛙多功能多肽Cath-HG处理后显著延长了小鼠流血时间。

如上所述的应用，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG多肽还包括其截断物、类似物、组合物、药学和化妆品上可接受的载体和辅料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

由沼水蛙多功能多肽氨基酸结构通过化学法合成，合成的沼水蛙多功能多肽Cath-HG具有抗痤疮丙酸杆菌生长、抗炎、内毒素中和、免疫调节、抗血凝和提高脓毒症小鼠生存率的功能，该沼水蛙多功能多肽Cath-HG具有结构简单、人工合成方便、活性强且多样的有益特点。

本发明的所提供的沼水蛙皮肤分泌肽Cath-HG可以：经注射给药，包括静脉注射、皮下注射、腔内注射等；粘膜给药，如鼻腔给药；腔道给药，如经直肠给药，局部起效或经吸收全身发挥作用。上述给药途径优选的是经静脉给药。

附图说明

图1为本发明实施例1沼水蛙多功能多肽Cath-HG质谱鉴定结果；

图2为本发明实施例1沼水蛙多功能多肽Cath-HG HPLC纯化鉴定结果；

图3为本发明实施例2沼水蛙多功能多肽Cath-HG对痤疮丙酸杆菌的抑制作用；

图4为本发明实施例2沼水蛙多功能多肽Cath-HG对痤疮丙酸杆菌导致的鼠耳肿胀的抑制作用；

图5为本发明实施例3沼水蛙多功能多肽Cath-HG对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7细胞一氧化氮(NO)、细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α的表达水平的抑制作用；

图6为本发明实施例4沼水蛙多功能多肽Cath-HG与脂多糖(LPS)的结合作用；

图7为本发明实施例5沼水蛙多功能多肽Cath-HG对急性炎症模型小鼠的治疗作用；

图8为本发明实施例6沼水蛙多功能多肽Cath-HG对盲肠结扎穿刺(CLP)手术造模的脓毒症小鼠的生存曲线；

图9为本发明实施例6沼水蛙多功能多肽Cath-HG对脂多糖造模的脓毒症小鼠的生存曲线；

图10为本发明实施例7沼水蛙多功能多肽Cath-HG抑制凝血的作用；

图11为本发明实施例8沼水蛙多功能多肽Cath-HG促进中性粒细胞迁移的作用。

具体实施方式

沼水蛙皮肤分泌肽Cath-HG为具有24个氨基酸的肽，具体从动物组织得到，该多肽具有内毒素中和、免疫调节、抗痤疮和抗炎作用。本发明公开了的沼水蛙多功能多肽Cath-HG为一种新的具有抗炎和脂多糖中和活性的沼水蛙多功能多肽Cath-HG和它作为制备抗寻常痤疮感染、抗炎、免疫调节、治疗脓毒症、血栓性疾病的治疗药物的影响。所提供的沼水蛙多功能多肽Cath-HG可以：经注射给药，包括静脉注射、皮下注射、腔内注射等；粘膜给药，如鼻腔给药；腔道给药，如经直肠给药，局部起效或经吸收全身发挥作用。上述给药途径优选的是经静脉给药。

现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1沼水蛙多功能多肽Cath-HG的制备：

沼水蛙皮肤分泌肽Cath-HG是中国两栖类动物沼水蛙皮肤分泌肽Cath-HG基因编码的一种环状多肽，分子量2725.12道尔顿，等电点10.232。沼水蛙皮肤分泌肽Cath-HG的编码基因由438个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为其序列为如SEQ ID NO.2所示，序列中第364-435位核苷酸编码具有功能的成熟沼水蛙皮肤分泌肽Cath-HG。其氨基酸序列为：GlyLys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys Val Lys Ala IleLeu Gln Lys Leu(GKCNLLCKVKNKIKNKVKAILQKL)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸形成分子内二硫键使分子成环。

Ⅰ、沼水蛙多功能多肽Cath-HG的制备方法：根据沼水蛙皮肤分泌肽Cath-HG的氨基酸序列用自动多肽合成仪合成多肽。二硫键的形成采用空气氧化法，具体为在烧瓶中将多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氢氧化铵滴定成pH 7.8，然后室温搅拌过夜。

Ⅱ、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry,FAB-MS)，以甘油：间硝基苄醇：二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。质谱鉴定结果如图1所示，测得沼水蛙多功能多肽Cath-HG的分子量为2725.12道尔顿。

Ⅲ、纯化的沼水蛙多功能多肽Cath-HG用高效液相色谱(HPLC)方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。纯化时A液体为0.05％TFA+2％CH3CN，B液为0.05％TFA+90％CH3CN，B液浓度梯度为25min 15-40％，检测波长为220nm，多肽出现在第20分钟，等电点为10.232。HPLC纯化鉴定结果如图2所示，主要色谱峰集中在第20分钟。

实施例2抗痤疮能力测定：

1)体外抑制细菌生长能力

通过肉汤稀释法确定沼水蛙多功能多肽对痤疮丙酸杆菌ATCC6919的最低抑菌浓度(MIC)。痤疮丙酸杆菌ATCC6919购自广东省微生物研究所，并在脑心浸出液肉汤培养基中用MGC Anaeropack系统(日本三菱瓦斯化学有限公司)进行厌氧培养。在96孔微量滴定板(Costar，Corning，Inc.，美国)中，用稀释的不同浓度的沼水蛙多功能多肽与等体积的稀释在新鲜BHI肉汤中的细菌孵育，将板在37℃，缺氧条件下温育24小时。用酶标仪(InfiniteM1000Pro，Tecan Company，瑞士)测量600nm处的吸光度以测定细菌的生长。MIC被确定为防止可见浊度的最低肽浓度。所有实验均重复五次。结果如图3所示，沼水蛙多功能多肽对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度为1.5625μM。

2)体内抗痤疮能力

体重20-22g，6-8周龄昆明小鼠，雌雄各半随机分为3组，每组5只。对照组仅注射生理盐水。其余小鼠左耳皮内注射25μL痤疮丙酸杆菌(5×10⁷CFU/ml)。然后分别用克林霉素(10μg)和沼水蛙多功能多肽(100μg)与无菌凡士林(50mg)混合涂抹于左耳皮肤表面。用游标卡尺检测注射细菌24小时后耳厚的增加情况并拍摄照片。为了解痤疮丙酸杆菌在耳内的数量和炎症症状，测量耳厚后切下左耳进行之后的生化检测。结果如图4A和B所示，注射沼水蛙多功能多肽24小时后，痤疮丙酸杆菌可引起小鼠耳组织明显红肿。而克林霉素组和沼水蛙多功能多肽组小鼠耳增厚分别减少约50.0％和26.0％。

实施例3抗炎作用测定：

小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7细胞培养于含100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司产品)，置于37℃，5％CO₂环境中培养。当RAW264.7细胞培养至汇合度80-90％，用胰酶消化，细胞密度调整至5×10⁵个/孔铺于6孔板中，37℃过夜培养。每孔细胞分别加入1、2、4和8μM的沼水蛙多功能多肽共孵育30min后，再用100ng/mL的脂多糖(来源于E.coli 055:B5，Sigma公司)处理细胞。共培养24h后收集细胞上清液，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法来检测细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平，使用一氧化氮释放检测试剂盒(碧云天公司)检测一氧化氮水平。

结果如图5所示，沼水蛙多功能多肽能显著调节RAW 264.7细胞分泌细胞因子，其中图5A为多肽对一氧化氮(NO)水平的影响；图5B为多肽对细胞因子IL-1β水平的影响；图5C为多肽对细胞因子IL-6水平的影响；图5D为多肽对细胞因子TNF-α水平的影响。

实施例4脂多糖(LPS)中和作用测定：

沼水蛙多功能多肽对脂多糖的中和作用通过等热滴定仪进行测定。实验前备已超声脱气的PBS缓冲液(pH 6.0)，LPS(50μM)和沼水蛙多功能多肽溶液(1mM)。根据仪器说明在样品池和注射器中分别装载LPS(50μM)和沼水蛙多功能多肽(1mM)。滴定条件如下：滴定时间间隔为120s，温度25℃，上样针的转速为1000rpm/min，参考功率5μCal/s。上样针内每次滴定1.0μL至反应池中。ITC配套仪器将检测整个滴定过程中热量变化，高反馈模式分析数据。结果如图6所示，沼水蛙多功能多肽与LPS的结合导致焓降低以及ITC曲线的降低趋势，结合饱和发生在约9min，结合常数KD为1.25e-6±283e-9M。

实施例5体内抗急性炎症作用测定：

体重20-25g的昆明小鼠24只，雌雄不限，随机分为4组，将它们保持在温度(22±1℃)和湿度(55±10％)的房间内，进行12h的明/暗循环。通过在小鼠右后爪单次注射50μl角叉菜胶(1％，w/v，溶于生理盐水)以诱导急性炎症发生。注射角叉菜胶1h前，腹腔注射5mg/kg的沼水蛙多功能多肽和阳性对照吲哚美辛(Indo)溶液。角叉菜胶注射后在设定时间点(1、2、4、12、24和48小时)用足趾容积测量仪测定每只小鼠的右后爪的体积，每只小鼠应测三次并取平均值。另外地，注射步骤同上操作，但是在角叉菜胶注射后四小时对动物实施安乐死。结果如图7所示，沼水蛙多功能多肽抑制角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀，控制了急性炎症的进展。

实施例6体内小鼠脓毒症治疗作用测定：

1)对盲肠结扎穿孔模型(CLP)模型小鼠的治疗作用

体重20-25g的昆明小鼠24只，雌雄不限，随机分为3组，将它们保持在温度(22±1℃)和湿度(55±10％)的房间内，进行12小时的明/暗循环。小鼠麻醉后仰卧于手术台上固定，剃去腹部多余毛发，使用碘伏消毒腹部并用75％酒精棉球清理，于剑突下约一指处沿腹中线位置用手术刀打开约1cm左右切口。使用镊子小心分离盲肠，在盲肠长度1/2的位置用4号线结扎，结扎后使用21G针头在盲肠盲端以上约0.5cm处穿刺肠壁2次，挤出适量肠内容物，将肠内容物及盲肠按原位放回腹腔，逐层缝合。假手术组不进行肠结扎及穿孔，其余操作同手术组。术后皮下注射1ml 37℃预热的生理盐水以补充体液帮助复苏。药物处理组于造模一小时后腹腔注射沼水蛙多功能多肽，然后密切观察72小时内小鼠的存活情况以及包括体温、呼吸等生命体征还有一般状态等并绘制生存曲线。结果如图8所示，假手术组小鼠无死亡，模型组脓毒症小鼠具有很高的死亡率(达到100％)；使用沼水蛙多功能多肽干预后脓毒症小鼠的死亡率得到明显的控制，脓毒症小鼠的死亡率都有明显下降(75％)。

2)对脂多糖诱导模型小鼠的治疗作用

内毒素(又称脂多糖，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成份，也是目前研究脓毒症发病机制广泛采用的脓毒症动物模型诱导剂之一。本研究采用亚致死剂量LPS刺激进行脓毒症小鼠造模。用碘伏消毒小鼠腹部皮肤，模型组按体重腹腔注射LPS(剂量10mg/kg，生理盐水溶解)；药物处理组于造模一小时后腹腔注射沼水蛙多功能多肽；阳性药物组腹腔注射等体积地塞米松注射液；对照组无需LPS刺激，但是和模型组同样的给予腹腔注射等体积的生理盐水。然后密切观察72小时内小鼠的存活情况以及包括体温、呼吸等生命体征还有一般状态等并绘制生存曲线。结果如图9所示，模型组脓毒症小鼠具有很高的死亡率(达到90％)，地塞米松组和沼水蛙多功能多肽组小鼠死亡率均显著低于模型组(P＜0.05)，且分泌肽组疗效和阳性药组药效差距较小。

实施例7体内对正常小鼠断尾出血的作用：

体重20-25g的昆明小鼠24只，雌雄不限，随机分为4组，将它们保持在温度(22±1℃)和湿度(55±10％)的房间内，进行12h的明/暗循环。实验前1小时经尾静脉注射不同浓度的沼水蛙多功能多肽，到时间后将小鼠固定在自制的固定瓶中，将尾部探出瓶口，在37℃的水浴中完全浸泡5min舒张血管，接着使用锐利的刀片从距离鼠尾5mm处切断，立即放入提前37℃预热的生理盐水中，观察并计录鼠尾流血时间。结果如图10所示，沼水蛙多功能多肽预处理后延长了小鼠断尾的流血时间并呈现浓度依赖性。

实施例8中性粒细胞迁移调节活性测定：

4mL外周静脉血和2mL的Dextran(用6％，终浓度2％，生理盐水配制)混合，颠倒混匀，置于37℃恒温箱中，沉降30min。将上层黄色液体(富含白细胞)按2：1缓慢加入到密度为1.077g/L的人外周血淋巴细胞分离液上(不要扰乱分离液层)。4℃、1500rpm离心30min。小心弃去上三层，收集中性粒细胞层，加入等量的预冷的灭菌dd水，低渗裂解残存的红细胞，裂解时间不超过28s，迅速加入过滤灭菌后的等体积1.8％NaCl溶液，并加入0.9％NaCl补足8mL，4℃、250g离心5min。细胞用PBS洗一次后，重悬与于HBSS(D-Hanks)中，计数，分别用吉姆萨染色和台盼兰染色鉴定细胞纯度和活力，细胞纯度和活力分别在95％和98％以上。

中性粒细胞迁移活性采用国际上普遍认可的Zigmond Chamber来进行。实验开始前，先清洗并风干Zigmond chamber和盖玻片，打开倒置显微镜和图片采集软件。吸取20uL(10uL)细胞悬液在洁净的盖玻片(22*44mm)上画一悬液均匀的直线，室温静置5min让细胞有足够的时间沉降并黏附在盖玻片上。吸去多余液体，将盖玻片倒扣在Zigmond chamber上，立即置于倒置显微镜上，在20×的物镜下观察，并计数自发极化的细胞。100uL 100nMfMLP(中性粒细胞趋化剂)的Hanks溶液作为阳性对照，随机选取一个视野，每隔30s拍摄一张照片，记录15min。将长宽比大于等于2的细胞视为发生极化性的细胞。将细胞的长轴与浓度梯度方向在±45°是为固定方向的极化，计数总细胞，所有极化细胞，固有方向的极化细胞数目，每组细胞不得少于150个，每个条件的实验次数不少于3次。结果如图11所示，沼水蛙多功能多肽浓度依赖性地促进中性粒细胞迁移。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制药和化妆品中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> hylarana guentherip

<400> 1

Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Lys Val Lys Asn Lys Ile Lys Asn Lys

1 5 10 15

Val Lys Ala Ile Leu Gln Lys Leu

20

<210> 2

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagacct ggcagtgtgt gctatggctc tgcgccgtca cattggaggt cgctcactct 60

cagtctctgg atcaggaaga attgatcaaa gaagctctgg atctctacaa ccagagggaa 120

gatggagagt tcctctttaa gttcctgtct gagctcccca accccctccc aaagggggag 180

ggagactctc cagcaatcac ttttttgatc aaggagacgg actgtcccaa atctgaagac 240

aatgacttgg agccatgtga ctacaaggag gacggggagg tgaaggtctg cgctctggag 300

gacgaggatg tgaaatgcgc cagtctgtcc gagaattacc gaaccaagag atccaatgga 360

aacggaaagt gcaacttact ctgcaaagtg aaaaataaga taaaaaataa ggtcaaggct 420

atcctgcaaa aattataa 438

Claims (8)

1.沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备抗痤疮丙酸杆菌药物、或制备治疗痤疮药物中的应用，其特征在于，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，多肽中第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

2.沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备祛痘美容用品中的应用，其特征在于，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，多肽中第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

3.沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备抗炎及免疫调节治疗药物中的应用，其特征在于，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，多肽中第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备调节RAW264.7细胞分泌一氧化氮和/或促炎细胞因子药物中的应用，包括降低一氧化氮水平、和/或降低细胞因子IL-1β水平、和/或降低细胞因子IL-6水平、和/或细胞因子TNF-α水平药物中的应用；在制备抑制角叉菜胶药物中的应用；在制备促进中心粒细胞迁移药物中的应用。

5.沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备脂多糖LPS中和的药物中的应用，其特征在于，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，多肽中第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

6.沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备治疗脓毒症的药物中的应用，其特征在于，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，多肽中第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫键。

7.沼水蛙多功能多肽Cath-HG在制备预防和治疗血栓性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，多肽中第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子内二硫。

8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，所述沼水蛙多功能多肽Cath-HG还包括其截断物、类似物、组合物、药学和化妆品上可接受的载体和辅料。

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