CN113403399B - Pcdhgb1突变在预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 - Google Patents

Pcdhgb1突变在预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及PCDHGB1突变在预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性，以及预测肺腺癌患者肿瘤突变负荷、PD‑L1表达量、DNA错配修复通路基因突变和肿瘤内CD8+T细胞浸润程度中的应用。

Description

PCDHGB1突变在预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏 感性中的应用
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，具体涉及PCDHGB1突变在预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用。
背景技术
近年来，基于PD-1/PD-L1、CTLA-4等新兴的免疫检查点抑制剂(Immunecheckpoint inhibitors,ICIs)的治疗方案在多种实体瘤得到了广泛的研究，并已进入非小细胞肺癌(NSCLC)一线治疗。非小细胞肺癌中，大约55％为肺腺癌。尽管免疫检查点抑制剂效果不错，但整体客观缓解率(ORR)依然只有20％左右，因此开发合适的生物标志物，精确筛选更多免疫治疗获益人群，是未来肿瘤免疫治疗发展亟待解决的关键问题。
基于免疫组织化学染色检测肿瘤PD-L1表达是目前免疫治疗应用最为广泛的生物标志物。在某些肿瘤类型，如肺腺癌，PD-L1的表达可以作为抗PD-1/PD-L1治疗反应的预测标志物。但是，多个临床试验结果显示PD-L1表达对免疫治疗疗效的预测能力并不一致，部分PD-L1阴性患者依然能从免疫治疗获益，虽然PD-L1阴性患者整体有效率更低，但持续缓解时间不逊于PD-L1阳性的患者。并且，PD-L1的检测标准依然存在诸多争议，而且PD-L1在肿瘤的不同的解剖以及随着治疗的进展都会发生改变。
肿瘤突变负荷(TMB)已证明与多种肿瘤类型包括黑色素瘤，肺腺癌和膀胱癌的免疫检查点抑制剂的治疗疗效相关。不过TMB作为预测因子的应用仍面临一些问题，比如高TMB患者能从免疫治疗中获益，但有研究表明无论TMB的高或低，帕博利珠单抗联合化疗在鳞状和非鳞状NSCLC患者的一线治疗中均显示出生存获益；其次，国内不同检测机构因检测产品不同及算法各异，TMB的检测尚没有标准的方法。此外，TMB阈值问题仍然是区分有效或者无效患者的难点。
研究表明对肿瘤微环境中免疫细胞，特别是CD8+ T细胞的浸润程度，能够预测肿瘤对免疫治疗反应的可能性，但目前缺少简便、有效的分子标志物来反映肺腺癌的免疫特征。另外，近期研究表明，DNA错配修复(DDR)通路基因突变，导致癌细胞中DNA损伤的增加和DNA修复能力的降低，这能提高免疫治疗的有效性。然而，DDR通路涉及基因众多，目前缺少简便的检测方式。
越来越多的二代测序肿瘤精准治疗中研究发现，特定基因的体细胞突变可能影响肿瘤免疫功能或对免疫治疗的响应，即提示特定体细胞突变可能是潜在的免疫治疗预测因子。因此现有技术中仍然需要更高效、准确地鉴定适用于免疫检查点抑制剂治疗肺癌患者的方法和工具，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案。
本发明首先提供一种PCDHGB1突变检测剂在制备用于预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，所述PCDHGB1突变检测剂是作为唯一突变检测剂在制备用于预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种PCDHGB1突变在预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用。
进一步的，上述PCDHGB1突变的存在是所述肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征。
在一些优选方式中，所述PCDHGB1突变的存在是PCDHGB1突变的独立存在。
本发明还提供了一种PCDHGB1突变检测剂在制备用于预测肺腺癌患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒中的应用；
本发明还提供一种PCDHGB1在预测肺腺癌患者肿瘤突变负荷程度中的应用。
进一步的，所述PCDHGB1点突变的存在是高肿瘤突变负荷的指征。
本发明还提供了一种PCDHGB1突变检测剂在制备用于预测肺腺癌患者PD-L1基因表达量的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种PCDHGB1在预测肺腺癌患者PD-L1基因表达量中的应用。
进一步的，所述PCDHGB1点突变的存在是PD-L1基因高表达的指征。
本发明还提供了一种PCDHGB1突变检测剂在制备用于预测肺腺癌患者DDR通路基因突变频率的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种PCDHGB1在预测肺腺癌患者DDR通路基因突变频率的应用。
进一步的，所述PCDHGB1突变的存在是所述肺腺癌患者DDR通路基因突变频率高的指征。
本发明还提供了一种PCDHGB1突变检测剂在制备用于预测肺腺癌患者肿瘤内免疫细胞浸润水平的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种PCDHGB1在预测肺腺癌患者肿瘤内CD8+ T细胞浸润程度的应用。
进一步的，所述PCDHGB1突变的存在是所述肺腺癌患者肿瘤内CD8+ T细胞浸润程度高的指征。
进一步的，上述免疫检查点抑制剂为PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
进一步的，所述突变为点突变；优选的，所述点突变包括但不限于单核苷酸多态性，碱基取代/插入/缺失，或沉默突变。
本发明还提供一种PCDHGB1在预测肺腺癌患者肿瘤突变负荷程度中的应用。
进一步的，所述检测剂于核酸水平进行检测。
优选的，所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
进一步的，所述检测剂于蛋白水平进行检测。
优先的，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
进一步的，所述试剂盒中还包括检测其他基因突变的试剂。
优选的，所述其他基因包括但不限于POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
进一步的，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
进一步的，所述样品选自所述肺腺癌患者的血液、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。
本发明还提供一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性试剂盒，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1基因突变检测的试剂。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括其他肺腺癌免疫治疗敏感性基因的突变检测试剂，所述其他基因包括但不限于：POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
在一些实施方式中，所述试剂盒中不包含其它肺腺癌免疫治疗敏感性基因的突变检测试剂，PCDHGB1基因可作为唯一独立的敏感性标记。
本发明还提供一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1其他基因突变检测的试剂。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括其它肺腺癌免疫治疗敏感性基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
本发明还提供一种预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法，所述方法包括检测患者PCDHGB1基因突变情况进行预测，或利用上述试剂盒进行预测。
本发明还提供一种预测、评估或筛查肺腺癌患者肿瘤突变负荷程度的方法，所述方法包括检测患者PCDHGB1基因突变情况进行预测，或利用上述试剂盒进行预测。
本发明还提供一种预测、评估或筛查肺腺癌患者DDR通路基因突变频率的方法，所述方法包括检测患者PCDHGB1基因突变情况进行预测，或利用上述试剂盒进行预测。
本发明还提供一种预测、评估或筛查肺腺癌患者肿瘤内免疫细胞浸润程度的方法，所述方法包括检测患者PCDHGB1基因突变情况进行预测，或利用上述试剂盒进行预测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 Hellmann&Miao队列中PCDHGB1突变与野生型患者PFS具有显著差异。
图2 Hellmann&Miao队列中PCDHGB1突变组ORR显著高于野生型。
图3 Hellmann&Miao队列中PCDHGB1突变组DCB比例显著高于野生型组。
图4 Hellmann&Miao队列中PCDHGB1是免疫治疗PFS的独立预测因素。
图5 TCGA-LUAD队列中PCDHGB1突变组PD-L1基因表达水平显著高于野生型组。
图6 Hellmann&Miao队列中PCDHGB1突变组(MUT)患者TMB显著高于野生型(WT)组。
图7 TCGA-LUAD队列中PCDHGB1突变组(MUT)TMB显著高于野生型组(WT)。
图8 Hellmann&Miao队列中PCDHGB1基因突变与DDR通路基因的高突变频率有关。
图9 TCGA-LUAD队列中PCDHGB1基因突变与DDR通路基因的高突变频率有关。
图10 TCGA-LUAD队列中PCDHGB1突变组(MUT)CD8+ T细胞浸润程度显著高于野生型组(WT)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
以下基本术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。
本文所使用的术语“互补”涉及核苷酸碱基G、A、T、C和U之间的氢键碱基配对，以使得当两种给定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火时，在DNA中A与T配对、G与C配对，在RNA中G与C配对、A与U配对。
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及PCDHGB1基因突变的检测剂在制备用于预测或筛查肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用，优选的，PCDHGB1基因突变的存在是所述肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征。
本发明还涉及PCDHGB1基因突变的检测剂在制备用于预测或筛查肺腺癌患者肿瘤突变负荷程度、PD-L1基因表达量、DDR通路基因突变频率、肿瘤内CD8+ T细胞浸润程度的试剂盒中的应用，其中PCDHGB1基因突变的存在是高肿瘤突变负荷的指征，或PD-L1基因高表达的指征，或DDR通路基因突变频率高的指征，或肿瘤内免疫细胞浸润程度高的指征。
本发明的PCDHGB1为原钙黏蛋白家族B1，PCDHGB1基因种属可以为哺乳动物；优选的，为灵长类动物。
可以理解的是，本发明提供一种预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的新标记物：PCDHGB1基因突变。通过公共数据挖掘，PCDHGB1突变的患者接受免疫治疗后预后明显好于PCDHGB1野生型患者，对目前已报道的免疫治疗预测分子标记物进行分析，发现在肺腺癌患者PCDHGB1发生突变与未发生突变患者TMB的程度、PD-L1基因表达量、DDR基因突变频率、CD8+ T细胞浸润程度具有统计学差异。
如本文所用，术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。
本发明所述“免疫检查点”包括但不限于程序性死亡受体1(PD-1)、PD-L1、细胞毒性T免疫细胞相关抗原4(CTLA-4)；也包括一些新发现的免疫检查点例如免疫细胞活化基因3(LAG3)、T-细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(TIM-3)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素7/9等。在一些实施方式中，本发明的免疫检查点抑制剂优选为PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。所述PD-1抑制剂进一步可以选择为Nivolumab(Opdivo；BMS-936558)、Pembrolizumab(Keytruda；MK-3475)、lambrolizumab(MK-3475)、Pidilizumab(CT-011)、特瑞普利单抗(JS001)、信迪利单抗(IBI308)、卡瑞利珠单抗(艾瑞卡)以及替雷利珠单抗(百泽安)中的一种或多种。所述PD-L1抑制剂进一步可以选择为Atezolizumab(Tecentriq；MPDL3280A)、JS003、Durvalumab(Imfinzi)、Avelumab(Bavencio)、BMS-936559、MEDI4736以及MSB0010718C中的一种或多种。
本发明术语“突变负荷”、“突变负荷(Mutation burden)”和“突变负荷(Mutational burden)”在本文中可互换使用。在肿瘤的背景下，突变负荷在本文中又称为“肿瘤突变负荷”、“肿瘤突变负荷”或“TMB”。
在本发明中，“DDR通路基因突变频率”是指DNA错配修复(DNA damage response)通路中基因突变频率。DDR通路包括碱基切除修复(BER)，同源重组(HR)、错配修复(MMR)、范科尼贫血(FA)、非同源端连接(NHEJ)、DNA损伤修复(DDR)、核酸切除修复(NER)、DNA双链断裂(DSB)和单链断裂(SSBs)9个通路，各通路包含的基因列表来自Broad Institute MSigDB数据库(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)。基因突变频率指这9个通路中任一基因发生突变的样本数占总样本数的比例。
在本发明中，“CD8+ T细胞浸润程度”是指离开血流并迁移到肿瘤中的CD8+ T细胞的相对含量的多少。CD8+ T细胞表达CD8分子的T细胞，它在抗毒感染、急性同种异型移植物排斥和对肿瘤细胞的杀伤作用是重要的效应细胞。它在肿瘤免疫治疗过程中扮演重要作用，并且多项研究报道，CD8+ T细胞浸润程度高的患者免疫治疗预后较好。
在本发明中，点突变可以是单核苷酸多态性(SNP)、碱基取代，碱基插入或碱基缺失，或沉默突变(例如，同义突变)。
评估PCDHGB1基因突变包括确定其编码区是否存在突变，例如移码突变。
在一些实施方案中，所述突变位于PCDHGB1基因的869-4528位核苷酸。在一些优选实施方式中，评估PCDHGB1基因突变包括确定其编码区是否存在使PCDHGB1蛋白截短的突变。
在一些实施方式中，在确定PCDHGB1基因编码区存在使PCDHGB1蛋白截短的突变后，评估PCDHGB1基因表达，例如PCDHGB1基因的蛋白表达水平。
在一些实施方式中，所述肺腺癌患者的病理类型包括肺腺癌及肺鳞癌。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括其它基因突变的检测剂；优选的，所述基因包括但不限于：POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
鉴于PCDHGB1基因为一种能够编码蛋白质的基因，因而其基因的突变通常也会表现在转录水平和反应水平上，本领域技术人员可以从RNA和蛋白水平对其突变进行检测以间接反映其是否发生基因突变，这些都可以应用于本发明。
在一些实施方式中，所述检测剂于核酸水平进行检测。
核酸水平(DNA或RNA水平)的检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该DNA或RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等。并且本领域技术人员也容易想到将mRNA反转录成cDNA后对cDNA进行检测，这些技术手段的常规置换不超出本发明的保护范围。
在一些实施方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：
聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。在一些实施方式中，所述聚合酶链反应选自限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、Taqman探针法、竞争性等位基因特异性PCR和等位基因特异性PCR。
在一些实施方式中，所述生物质谱法选自飞行质谱仪检测，例如Massarray检测。
在一些实施方式中，所述核酸测序法选自Snapshot法。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。在本发明另外一些实施方案中，所述核酸测序法是高通量测序，也称作二代测序(“NGS”)。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。NGS是对传统Sanger测序技术革命性的变革，可以一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定。可用本发明的NGS的测序平台是商用可得的，包括但不限于Roche/454FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer和Applied Biosystems SOLID system等。转录组测序也可以通过二代测序平台快速、全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。在本发明另外一些实施方案中，所述核酸测序法可以为单分子实时测序，单分子DNA测序技术是近10年发展起来的新一代测序技术,也称为第三代测序技术,包括单分子实时测序、真正单分子测序、单分子纳米孔测序等技术。
在一些实施方式中，所述检测剂于蛋白水平进行检测。
在一些实施方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测的方法进一步可以为免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫组化、ELISA以及Western Blot等。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂；进一步地，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述样品选自所述肺腺癌患者的血液、血清、血浆、胸水、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。
在一些实施方式中，所述组织为肺腺癌癌组织或癌旁组织。其中，优选的检测样品为血液、血清、血浆；更优选的，来自外周血。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测或筛查肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法，所述方法包括：使用如上所述的检测剂检测PCDHGB1基因突变的存在与否。在一些实施方式中，所述方法用于肺腺癌患者在进行免疫检查点抑制剂疗法后的预后评估。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性试剂盒，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1基因突变检测的试剂；在一些优选的实施方式中，还包括其他基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1基因突变检测的试剂；在一些优选的实施方式中，还包括其它基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者PD-L1基因表达量的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1基因突变检测的试剂；在一些优选的实施方式中，还包括其它基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者DDR基因突变频率的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1基因突变检测的试剂；在一些优选的实施方式中，还包括其它基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者肿瘤内CD8+ T细胞浸润程度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1基因突变检测的试剂；在一些优选的实施方式中，还包括其它基因突变检测的试剂，所述基因包括但不限于：FGFR4、POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、FGFR4、MUC16或NOTCH1-4之一或多个。
下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
1.数据集
本发明共使用4个独立队列的数据集进行分析(表1)。(1)Hellmann&Miao队列，该队列由Hellmann和Miao分别于2018年发表的数据集合并组成，Hellman数据集包含75例接受ICI治疗的肺腺癌患者，Miao数据集包含56例接受ICI治疗的非细胞细胞肺癌患者，其中49例为肺腺癌患者，两数据集均通过对癌旁对照组织和癌组织进行全外显子组测序来检测患者体细胞突变，因此我们将两数据集合并，命名为Hellmann&Miao队列进行分析；(2)TCGA-LUAD队列，患者未接受免疫治疗，包含567例肺腺癌患者的全外显子组测序数据和509例患者的RNA-seq数据。数据集在肿瘤基因组学数据库cBioPortal网站(http://www.cbioportal.org/)进行下载，包括患者临床基线资料、免疫检查点抑制剂治疗疗效评估数据以及患者体细胞突变和基因表达数据。
表1本发明所使用的数据集
数据集名称 Hellmann&Miao TCGA-LUAD
治疗方式 ICI 非免疫治疗
癌症类型 肺腺癌 肺腺癌
样本数 124
临床指标 ORR，PFS PFS，OS
DNA测序 全外显子组测序，124样本 全外显子组测序，567样本
RNA测序 - RNA-seq，509样本
2.临床指标
本发明涉及的临床指标包括客观缓解率(ORR),持续获益(DCB),无进展生存率(PFS)和总生存率(OS)。ORR依据RECISTV.1.1定义为确认有完全反应(CR)或部分反应(PR)的患者的百分比。依据RECISTV.1.1定义获益(完全缓解(CR)、部分缓解(PR)或病情稳定(SD))超过6个月为持续获益(DCB)，否则为非持续获益(NDB)。PFS被定义为从免疫治疗开始到疾病进展或死亡日期的时间。对于ICI治疗的队列，即Hellmann&Miao队列，从治疗开始日期开始计算PFS。对非免疫治疗队列，即TCGA-LUAD和TCGA-LUSC，从第一次诊断之日起计算PFS与OS。
3.PCDHGB1突变型患者与野生型患者的预后比较
本发明根据PCDHGB1是否突变将患者分成两组，即PCDHGB1突变组(PCDHGB1-MUT)和PCDHGB1野生型组(PCDHGB1-WT)，通过Kaplan-Meier(KM)分析PCDHGB1-MUT和PCDHGB1-WT两组患者ICI治疗的PFS，采用对数秩检验(log-rank test)对两组患者的PFS进行比较。采用分别统计PCDHGB1-MUT和PCDHGB1-WT两组的ORR和DCB比例，并采用Fisher精确检验的方法对两组的ORR和DCB比例进行比较。采用Cox回归模型进行多因素分析。
4.PCDHGB1突变与TMB、PD-L1基因表达、肿瘤内免疫细胞浸润程度、DDR通路基因突变频率相关性分析
肿瘤突变负荷(TMB)定义为每个患者每百万碱基(MB)基因组发生突变(SNV或插入缺失)的数量。通过Mann-Whitney U test对PCDHGB1-MUT和PCDHGB1-WT两组患者TMB进行比较。
将患者按照是否发生PCDHGB1突变分成PCDHGB1-MUT和PCDHGB1-WT两组。利用R包edgeR进行差异表达基因分析，差异表达基因的定义标准如下：p值<0.05和log2(foldchange)>0.58或<(-0.58)。PD-L1基因符合以上标准则认为该基因在两组患者中表达量具有显著差异。
使用TIMER软件来分析TCGA-LUAD和TCGA-LUSC队列中PCDHGB1-WT和PCDHGB1-MUT亚群之间CD8+ T细胞的浸润丰度。通过Mann-Whitney U test对PCDHGB1-MUT和PCDHGB1-WT两组患者CD8+ T细胞浸润程度进行比较。
与DDR通路相关的基因集来自Broad Institute MSigDB数据库(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)。通过Mann-Whitney U test对PCDHGB1-MUT和PCDHGB1-WT两组患者中DDR通路基因突变数目进行比较。
5.统计分析
通过Mann-Whitney U test比较连续变量，通过Fisher精确检验比较分类变量。生存分析由Kaplan Meier曲线进行估计，采用对数秩检验计算p值。P≤0.05为显著，所有统计分析采用R V.4.0.3软件进行。
实施例1在临床队列中分析PCDHGB1基因突变与免疫治疗疗效的关系
在Hellmann&Miao队列中，PCDHGB1突变患者有8例(6.1％)，PCDHGB1突变的患者接受免疫治疗后的中位PFS较PCDHGB1野生型患者长(中位OS:16.74vs.4.7个月；log-ranktest，p＝0.038)(图1)，提示PCDHGB1可作为免疫治疗疗效预测因子。
本实施例还分析了PCDHGB1基因突变与ORR的关系。PCDHGB1突变组的ORR为87.5％(7/8)，而在PCDHGB1野生型的患者中，这一比例仅为28.44％(33/116)，PCDHGB1突变组ORR显著高于PCDHGB1野生型组(Fisher精确检验，p＝0.0015；图2)。
进一步，本实施例还分析PCDHGB1基因突变与DCB的关系。PCDHGB1突变组的DCB为87.5％(7/8)，而在PCDHGB1野生型的患者中，这一比例为44.82％(44/116)，PCDHGB1突变组DCB比例显著高于PCDHGB1野生型组(Fisher精确检验，p＝0.027；图3)。
本实施例进一步利用Cox多因素回归分析方法，在同时考虑年龄、性别、吸烟史因素影响的情况下，对PCDHGB1对肺腺癌免疫治疗预后的预测效能进行分析。结果表明，PCDHGB1突变可作为肺腺癌免疫治疗预后的独立预测因子(HR值＝0.2345，95％CI:0.05626-0.9772,P＝0.0464)
因此，本实施例1通过对免疫治疗临床队列的分析，说明PCDHGB1基因突变可作为肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的预测因素，且PCDHGB1突变的存在是所述肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征；而且Cox多因素回归分析表明PCDHGB1突变可作为肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的独立预测因子。
实施例2 PCDHGB1基因突变与免疫治疗生物标志物PD-L1基因表达水平的相关性
基于免疫组织化学染色检测肿瘤PD-L1表达是目前免疫治疗应用最为广泛的生物标志物之一。在TGCA-LUAD队列中，同时进行了患者肿瘤组织突变和基因表达的检测，本实施例在TCGA-LUAD队列中探究了PCDHGB1基因突变与PD-L1基因表达水平的相关性。结果表明，PCDHGB1突变患者肿瘤组织PD-L1基因的表达量显著高于PCDHGB1野生型患者(log2(fold change)＝0.89，p＝0.043)(图5)。
本实施例在TCGA-LUAD队列中分析PCDHGB1突变与PD-L1基因表达水平的关系，说明PCDHGB1突变可作为PD-L1高表达的指征，并进一步提示PCDHGB1突变可能预测肺腺癌免疫治疗疗效。
实施例3 PCDHGB1基因突变与免疫治疗生物标志物TMB的相关性
TMB是广泛使用的免疫治疗疗效预测标记物之一，本实施例探究了PCDHGB1基因突变与TMB的关系。在Hellmann&Miao数据集中，PCDHGB1突变患者的TMB显著高于PCDHGB1野生型患者(中位TMB：55.30vs.14.03MUT/Mb，p＝0.0036(图6)。同样地，在TCGA-LUAD，PCDHGB1突变患者的TMB显著高于PCDHGB1野生型患者(图7)。
因此，本实施例在两个队列中验证PCDHGB1突变与TMB的关系，说明PCDHGB1突变可作为高TMB的指征，并进一步提示PCDHGB1突变可能预测肺腺癌免疫治疗疗效。
实施例4 PCDHGB1基因突变与免疫治疗生物标志物DDR通路基因突变的相关性
据研究报道DDR通路基因的突变与肿瘤中对免疫治疗的反应相关，本实施例进一步检查了PCDHGB1突变状态和DDR基因突变的相关性。观察到PCDHGB1突变组中DDR基因突变频率高的趋势。在Hellmann&Miao队列中,DDR相关的7种通路，即碱基切除修复(BER)、范科尼贫血(FA)、非同源端连接(NHEJ)、DNA损伤修复(DDR)、核酸切除修复(NER)、DNA双链断裂(DSB)和单链断裂(SSBs)均在PCDHGB1突变患者中发生更多突变；在TCGA-LUAD队列中,DDR相关的6种通路，即碱基切除修复(BER)，同源重组(HR)、错配修复(MMR)、范科尼贫血(FA)、DNA损伤修复(DDR)和单链断裂(SSB)均在PCDHGB1突变患者中富集更多突变(图8，图9)。
本实施例在Hellmann&Miao和TCGA-LUAD 2个队列中均验证了PCDHGB1突变与DDR通路突变的关系，说明PCDHGB1突变可作为高DDR通路突变频率的指征，进一步提示PCDHGB1突变可能预测肺腺癌免疫治疗疗效。
实施例5 PCDHGB1基因突变与CD8+ T细胞浸润程度之间的相关性
CD8+ T细胞是免疫治疗过程中发挥肿瘤杀伤作用的最主要的细胞类型，多项研究表面CD8+ T细胞浸润程度高的患者预后较好。在TGCA-LUAD队列中，同时进行了患者肿瘤组织突变和基因表达的检测。因此本实施例在TGCA-LUAD队列中分析PCDHGB1突变与CD8+ T细胞浸润程度之间的相关性。图10表明，PCDHGB1突变患者肿瘤组织中的CD8+ T细胞的浸润程度显著高于PCDHGB1野生型患者。
本实施例在TCGA-LUAD队列中验证PCDHGB1突变与肿瘤内CD8+ T细胞浸润程度的关系，说明PCDHGB1突变可作为肿瘤内CD8+ T细胞浸润程度高的指征，并进一步提示PCDHGB1突变可能预测肺腺癌免疫治疗疗效。
最后应说明的是，以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.PCDHGB1突变检测剂在制备用于预测肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用，其中PCDHGB1突变的存在是所述肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征；所述突变为点突变。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PCDHGB1突变的存在为PCDHGB1突变的独立存在。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述点突变包括但不限于单核苷酸多态性、或碱基取代/插入/缺失。
5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述检测剂于核酸水平进行检测；所述检测剂用于执行以下任一种方法：聚合酶链反应、变性梯度凝胶电泳、核酸测序法、核酸分型芯片检测、变性高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述检测剂于蛋白水平进行检测，所述检测剂用于执行以下任一种方法：生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
7.根据权利要求1或3任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测其他基因突变的试剂，所述其他基因包括但不限于POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种；所述样品选自所述肺腺癌患者的血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种；所述样品选自所述肺腺癌患者的血液。
10.一种用于预测、评估或筛查肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含用于PCDHGB1基因突变检测的试剂；所述试剂盒中还包括其他基因突变检测的试剂，所述其他基因包括但不限于POLE、POLD1、ARID1A、ARID1B、PCDH11X或NOTCH1-4之一或多个。
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