CN113396897B - 一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法 - Google Patents
一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113396897B CN113396897B CN202110845609.9A CN202110845609A CN113396897B CN 113396897 B CN113396897 B CN 113396897B CN 202110845609 A CN202110845609 A CN 202110845609A CN 113396897 B CN113396897 B CN 113396897B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stabilizer
- plasma
- biological matrix
- whole blood
- levodopa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
Abstract
本发明公开了一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，在生物基质中加入稳定剂，所述稳定剂中包括体积分数5%的酸化试剂和质量分数10%的抗氧化剂。本发明基于调节pH值和添加抗氧化剂，达到保护生物基质中CD/LD的目的，最终使含有CD/LD的生物基质样品能够在多种环境中储存。使用本发明，能够使含有CD/LD的全血样品在2‑8℃条件下保存2小时，血浆样品在2‑8℃条件下保存20小时，在低于‑60℃条件下保存30天，能够经历4次冻融循环。满足了CD/LD临床前/临床试验中样品的收集、运输、储存与检测需求，为CD/LD的药代动力学研究提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，尤其涉及一种满足卡比多巴/左旋多巴临床前/临床试验中样品的收集、运输、储存和检测需求的方法，属于生物技术领域。
背景技术
左旋多巴(Levodopa，LD)是治疗帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的最有效药物，它是多巴胺(Dopamine，DA)的前体药物。它可以通过血脑屏障，并在脑内被多巴脱羧酶(Dopa decarboxylase，DDC)脱羧转化成DA而发挥作用。由于DDC不仅存在于脑中，在其他脏器和血管壁细胞内也广泛存在，如单用LD，仅约1％药物能进入中枢，故临床上多采用LD合并外周多巴脱羧酶抑制剂(Dopadecarboxylase inhibitor，DDCI)如卡比多巴(Carbidopa，CD)或苄丝肼(Benserazide，BSZ)制成复方制剂，以此提高LD进入中枢的量。
卡比多巴(Carbidopa，CD)是外周脱羧酶抑制剂(DDCI)，由于其不透过血脑屏障可抑制外周组织中左旋多巴脱羧，提高进入中枢的左旋多巴含量，从而使低剂量的左旋多巴产生有效的多巴血药浓度，并降低外周的副作用。卡比多巴可单用，也可与左旋多巴联用，两者合用能使左旋多巴达到治疗作用所需的剂量减少75％，减少由进入外周组织所带来的呕吐、不自主运动等副作用。
在临床前和临床研究中，药代动力学研究是一种直观反映生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律的科学。前期的资料反映，CD/LD在全血、血浆等生物基质中均存在稳定性问题，如果不能解决，实验中的检测数据就无法真实反映药物在体内的情况。关于CD/LD药代动力学研究也就无从谈起。为了推动CD/LD临床前和临床研究，需要有一种方法保证生物基质中的CD/LD在收集、运输、储存和检测处于稳定状态。
发明内容
本发明的目的旨在提出一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，以此解决卡比多巴/左旋多巴临床前/临床试验中样品收集、运输、储存和检测时的稳定性需求，该方法操作简单快速，操作性强。
为实现上述目的，本发明提供一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，在生物基质中加入稳定剂，所述稳定剂中包括体积分数5％的酸化试剂和质量分数10％的抗氧化剂。
优选地，所述稳定剂中包括体积分数5％的三氟乙酸和质量分数10％的焦亚硫酸钠。
优选地，所述生物基质包括血浆、全血、排泄物、组织匀浆液中的一种。
优选地，所述稳定剂与全血的体积比为5:95。
优选地，所述稳定剂与血浆的体积比为2.5:97.5。
优选地，所述稳定剂的配制方法为：称取焦亚硫酸钠，加入灭菌注射用水完全溶解，再加入三氟乙酸，混匀，获得稳定剂。
优选地，具体包括：在预冷的EDTA·K2抗凝管中添加50μL稳定剂，再加入0.95mL全血，混匀，置于冰上；全血样品2-8℃条件下，3000g离心10min；离心后血浆于-60℃以下保存。
优选地，具体包括：在预冷的EP管中添加25μL稳定剂，再加入0.975mL血浆，混匀后-60℃以下保存。
本发明所达到的有益效果：
(1)本方法采用一种特定配比的稳定剂，基于调节pH值和添加抗氧化剂，利用调节PH值和抗氧化剂的协同作用对生物基质中的CD/LD进行保护，达到稳定CD/LD的目的，最终使含有CD/LD的生物基质样品能够在多种环境中储存。稳定剂中包括体积分数5％的三氟乙酸和质量分数10％的焦亚硫酸钠，三氟乙酸可以降低生物基质的PH值，低PH环境可以抑制基质中酶的活性，降低酶促反映，从而达到保护CD/LD的目的；焦亚硫酸钠作为一种常用抗氧化剂，常用于抑制氧化反应带来的物质变化，加入一定浓度的焦亚硫酸钠可以抑制CD/LD的氧化反应，二者协同作用，既降低了酶促反应，又抑制氧化反应，从而达到稳定CD/LD的目的。
(2)使用本发明，能够使含有CD/LD的全血样品在2-8℃条件下保存2小时，血浆样品在2-8℃条件下保存20小时，在低于-60℃条件下保存30天，能够经历4次冻融循环。满足了CD/LD临床前/临床试验中样品的收集、运输、储存与检测需求，为CD/LD的药代动力学研究提供基础。
(3)本发明是一种全新的稳定生物基质中CD/LD方法，能够满足CD/LD临床前/临床试验中样品收集、运输、储存和检测时的稳定性需求。本发明不仅适用于血浆和全血，还适用于排泄物和组织匀浆液等多种生物基质。本方法相对于其它方法，既保证了CD/LD的稳定性，又操作简单，且使用试剂易于获得、存储，对环境污染小。
附图说明
图1为含20％FA+10％SP的全血；
图2为含5％TFA+10％SP的全血；
图3为不含稳定剂的全血。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明中所采用的试剂和仪器均为市场上常见，均可从市场上购得。
实施例1
量取9mL灭菌注射用水完全溶解，再加入1000μL甲酸，获得稳定剂10％FA；
在预冷的EP管中添加25μL稳定剂10％FA，再加入0.975mL血浆，混匀后加入100μL0.03mg/mL CD/LD，再次混匀后平行分装3份。第1份样品立即取适量进行定量检测，第2份湿冰环境下放置3小时后进行定量检测，第3份湿冰环境下放置20小时后进行定量检测。结果见表1、表2。
实施例2
量取8mL灭菌注射用水完全溶解，再加入2000μL甲酸，获得稳定剂20％FA；
在预冷的EP管中添加25μL稳定剂20％FA，再加入0.975mL血浆，混匀后加入100μL0.03mg/mL CD/LD，再次混匀后平行分装3份。第1份样品立即取适量进行定量检测，第2份湿冰环境下放置3小时后进行定量检测，第3份湿冰环境下放置20小时后进行定量检测。结果见表1、表2。
实施例3
量取9.5mL灭菌注射用水，再加入500μL三氟乙酸，获得稳定剂5％TFA；
在预冷的EP管中添加25μL稳定剂5％TFA，再加入0.975mL血浆，混匀后加入100μL0.03mg/mL CD/LD，再次混匀后平行分装3份。第1份样品立即取适量进行定量检测，第2份湿冰环境下放置3小时后进行定量检测，第3份湿冰环境下放置20小时后进行定量检测。结果见表1、表2。
实施例4
称取1g焦亚硫酸钠，加入9mL灭菌注射用水完全溶解，再加入1000μL甲酸，获得稳定剂10％FA+10％SP；
在预冷的EP管中添加25μL稳定剂10％FA+10％SP，再加入0.975mL血浆，混匀后加入100μL 0.03mg/mL CD/LD，再次混匀后平行分装3份。第1份样品立即取适量进行定量检测，第2份湿冰环境下放置3小时后进行定量检测，第3份湿冰环境下放置20小时后进行定量检测。结果见表1、表2。
实施例5
称取1g焦亚硫酸钠，加入8mL灭菌注射用水完全溶解，再加入2000μL甲酸，获得稳定剂20％FA+10％SP；
在预冷的EP管中添加25μL稳定剂20％FA+10％SP，再加入0.975mL血浆，混匀后加入100μL 0.03mg/mL CD/LD，再次混匀后平行分装3份。第1份样品立即取适量进行定量检测，第2份湿冰环境下放置3小时后进行定量检测，第3份湿冰环境下放置20小时后进行定量检测。结果见表1、表2。
在预冷的EDTA·K2抗凝管中添加50μL稳定剂2％FA+1％SP，再加入0.95mL全血，混匀，置于冰上。全血样品2-8℃条件下，3000g离心10min。结果见图1。
实施例6
称取1g焦亚硫酸钠，加入9.5mL灭菌注射用水完全溶解，再加入500μL三氟乙酸，获得稳定剂5％TFA+10％SP(本发明使用稳定剂)；
在预冷的EP管中添加25μL稳定剂5％TFA+10％SP，再加入0.975mL血浆，混匀后加入100μL 0.03mg/mL CD/LD，再次混匀后平行分装3份。第1份样品立即取适量进行定量检测，第2份湿冰环境下放置3小时后进行定量检测，第3份湿冰环境下放置20小时后进行定量检测。结果见表1、表2。
在预冷的EDTA·K2抗凝管中添加50μL稳定剂5％TFA+10％SP，再加入0.95mL全血，混匀，置于冰上。全血样品2-8℃条件下，3000g离心10min。结果见图2。
在预冷的EDTA·K2抗凝管中加入0.95mL全血，样品2-8℃条件下，3000g离心10min。结果见图3。
表1不同稳定剂血浆中LD稳定性数据
表2不同稳定剂血浆中CD稳定性数据
通过对比表1与表2结果，血浆中加入实施例5与实施例6(本发明方法)中的稳定剂，在放置20小时后，CD/LD的剩余量均大于90％，能满足实验需求。实施例1、实施例2、实施例3、与实施例4放置20小时后剩余量均小于90％，不能满足实验需求。
通过对比图1至图3结果，实施例5全血出现明显的碳化现象，离心后基本无法分离血浆，不能满足实验需求。实施例6(本发明方法)分离的血浆量基本和未加稳定剂的全血相当。
综上所述，本发明基本能够满足CD/LD临床前/临床试验中样品的收集、运输、储存和检测时的稳定性需求。
为确保本发明的重现性和可靠性，又设计了实施例7与实施例8。
实施例7
称取1g焦亚硫酸钠，加入9.5mL灭菌注射用水完全溶解，再加入500μL三氟乙酸，获得稳定剂5％TFA+10％SP；
在预冷的EDTA·K2抗凝管中添加100μL稳定剂5％TFA+10％SP，再加入1.9mL全血，混匀后置于冰上备用。
取上述含稳定剂全血0.9mL至预冷的EP管中，加入0.1mL 600ng/mL CD/LD，获得全血低浓度样品(LQC)。
平行分装2份，第1份全血样品立即在2-8℃条件下，3000g离心10min，取适量血浆进行定量检测，第2份全血样品在湿冰环境下放置2小时后，在2-8℃条件下，3000g离心10min，取适量血浆进行定量检测。
重复上述步骤获得全血高浓度样品(HQC)数据。结果见表3、表4。
表3本方法下的全血中LD稳定性数据
表4本方法下的全血中CD稳定性数据
实施例8
称取1g焦亚硫酸钠，加入9.5mL灭菌注射用水完全溶解，再加入500μL三氟乙酸，获得稳定剂5％TFA+10％SP；
在预冷的EP管中添加50μL稳定剂5％TFA+10％SP，再加入1.95mL血浆，混匀后置于冰上备用。
取上述含稳定剂血浆0.9mL至预冷的EP管中，加入0.1mL 600/300ng/mL CD/LD，获得血浆低浓度样品(LQC)。
平行分装4份，第1份样品立即取适量进行定量检测，第2份湿冰环境下放置20小时后进行定量检测，第3份湿冰-60℃环境下反复冻融4次时后进行定量检测，第4份于低于-60℃环境下保存30天后进行定量检测。
重复上述步骤获得血浆高浓度样品(HQC)数据。结果见表5、表6。
表5本方法下的血浆中LD稳定性数据
表6本方法下的血浆中CD稳定性数据
结果(表3-表6)表明在本发明的方法下：全血样品能够在湿冰环境下保持两小时稳定，为从动物体内抽离的全血至血浆的分离提供了支持；血浆样品在湿冰环境下保持20小时稳定，为样品的定量检测提供了支持；血浆在湿冰/-60℃条件下四次冻融保持稳定，为样品的存取提供了支持；血浆在-60℃条件下30天保持稳定，为样品的长期储存，长途运输提供了支持。故本方法能够满足CD/LD临床前/临床试验中样品的收集、运输和储存时的稳定性需求，且重现性、可操作性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，其特征在于，在生物基质中加入稳定剂，所述稳定剂中包括体积分数5%的三氟乙酸和质量分数10%的焦亚硫酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，其特征在于，所述生物基质包括血浆、全血、排泄物、组织匀浆液中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，其特征在于，所述稳定剂与全血的体积比为5:95。
4.根据权利要求2所述的一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，其特征在于，所述稳定剂与血浆的体积比为2.5:97.5。
5.根据权利要求1所述的一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，其特征在于，所述稳定剂的配制方法为：称取焦亚硫酸钠，加入灭菌注射用水完全溶解，再加入三氟乙酸，混匀，获得稳定剂。
6.根据权利要求3所述的一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，其特征在于，具体包括：在预冷的EDTA·K2抗凝管中添加50 μL稳定剂，再加入0.95 mL全血，混匀，置于冰上；全血样品2-8℃条件下，3000 g离心10 min；离心后血浆于-60℃以下保存。
7.根据权利要求4所述的一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法，其特征在于，具体包括：在预冷的EP管中添加25 μL稳定剂，再加入0.975 mL血浆，混匀后 -60℃以下保存。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110845609.9A CN113396897B (zh) | 2021-07-26 | 2021-07-26 | 一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110845609.9A CN113396897B (zh) | 2021-07-26 | 2021-07-26 | 一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113396897A CN113396897A (zh) | 2021-09-17 |
| CN113396897B true CN113396897B (zh) | 2022-06-07 |
Family
ID=77687655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110845609.9A Active CN113396897B (zh) | 2021-07-26 | 2021-07-26 | 一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113396897B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113925125A (zh) * | 2021-09-29 | 2022-01-14 | 广西中医药大学 | 一种猫豆保存方法及其在左旋多巴生产中的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2360759T3 (es) * | 2003-08-29 | 2011-06-08 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Composiciones farmacéuticas y procedimiento de utilización de la levodopa y de la carbidopa. |
| ES2967693T3 (es) * | 2014-03-13 | 2024-05-03 | Neuroderm Ltd | Composiciones del inhibidor de la dopa descarboxilasa |
| CN105372109A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-03-02 | 苏州药明康德新药开发股份有限公司 | 添加稳定剂的生物基质的制备方法 |
-
2021
- 2021-07-26 CN CN202110845609.9A patent/CN113396897B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113396897A (zh) | 2021-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Worrall et al. | Modulation of in vivo alloreactivity by inhibition of inducible nitric oxide synthase. | |
| Burd et al. | Placental production and foetal utilisation of lactate and pyruvate | |
| Kang et al. | PGC-1α overexpression by in vivo transfection attenuates mitochondrial deterioration of skeletal muscle caused by immobilization | |
| JP2018199724A (ja) | サイクリックａｍｐエンハンサーおよび／またはｅｐリガンドを含む組成物、ならびにこれを調製および使用する方法 | |
| Golden et al. | Bupropion in depression: I. Biochemical effects and clinical response | |
| Taniguchi et al. | High concentration of gamma-aminobutyric acid in pancreatic beta cells | |
| CN113396897B (zh) | 一种稳定生物基质中卡比多巴/左旋多巴的方法 | |
| Paul et al. | Leucine oxidation and protein turnover in clofibrate-induced muscle protein degradation in rats | |
| Yu et al. | Lactulose accelerates liver regeneration in rats by inducing hydrogen | |
| Mise et al. | Shaping up mitochondria in diabetic nephropathy | |
| Keane et al. | Lung angiotensin converting enzyme activity in rats with pulmonary hypertension. | |
| Senbel et al. | Evaluation of l-arginine on kidney function and vascular reactivity following ischemic injury in rats: protective effects and potential interactions | |
| Chen et al. | Hydrogen sulphide attenuates renal and cardiac injury after total hepatic ischemia and reperfusion | |
| Yang et al. | Determination of extracellular glutathione in livers of anaesthetized rats by microdialysis with on-line high-performance liquid chromatography | |
| Noda et al. | Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats | |
| Du et al. | Glycolysis and glucose oxidation by the sheep conceptus at different oxygen concentrations | |
| Jung et al. | Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes | |
| Orstadius et al. | Plasma‐transaminase and transferase activities in pigs affected with muscular and liver dystrophy | |
| CN112326905A (zh) | 水杨酸毒扁豆碱在含酯键药物体内药物分析中的用途 | |
| Shinozaki et al. | Evaluation of endothelial free radical release by vascular tension responses in insulin-resistant rat aorta | |
| Pinto et al. | Concentrations of nitric oxide in equine preovulatory follicles before and after administration of human chorionic gonadotropin | |
| Karwinski et al. | 60 min normothermic liver ischemia in rats: allopurinol improves energy status and bile flow during reperfusion | |
| Kuwaki et al. | Improvement of ischaemia-reperfusion injury by lazaroid U74389G in rat lung transplantation model | |
| Borsook et al. | The energy of urea synthesis | |
| Illsley et al. | The effects of anoxia on human placental metabolism and fetal substrate profiles investigated by an in vitro placental perfusion technique |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |