CN113373104A - 一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法 - Google Patents

一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113373104A
CN113373104A CN202010156101.3A CN202010156101A CN113373104A CN 113373104 A CN113373104 A CN 113373104A CN 202010156101 A CN202010156101 A CN 202010156101A CN 113373104 A CN113373104 A CN 113373104A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
probe
target
spreading
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010156101.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113373104B (zh
Inventor
方群
王宇
王慧峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202010156101.3A priority Critical patent/CN113373104B/zh
Publication of CN113373104A publication Critical patent/CN113373104A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113373104B publication Critical patent/CN113373104B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于稀有细胞高纯度分选的方法和装置，包括：(1)将细胞样品进行铺展；(2)对铺展后的细胞样品进行扫描成像；(3)根据成像结果，读取目标细胞的位置信息以及目标细胞与周围其他非目标细胞之间的距离信息，对得到的距离信息进行判断：如果所述距离信息不满足设定取样距离要求，则根据目标细胞的位置信息，对其所在区域进行取样，得到包含该目标细胞和周围其他非目标细胞的中间细胞样品，对得到的中间细胞样品进行再次铺展，并返回步骤(2)；如果所述距离信息满足设定取样距离要求，直接进行目标细胞的取样，实现目标细胞的分选。本发明的方法操作简便，具有细胞铺展速度快、通量高、目标细胞分选效率高、纯度高、遗漏率低、可重复等优点。

Description

一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法
技术领域
本发明涉及的领域为稀有细胞分选领域，特别涉及一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及其使用方法。
背景技术
细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本功能单元。对生物体生命活动规律的认识，须以细胞研究为基础，探索细胞在生物体生长与分化、代谢与繁殖、遗传与进化等生命活动过程中的变化规律。然而，由于生命过程的随机性和外界环境的复杂性，即使是来源相同的细胞在基因水平和蛋白水平方面都可能相差甚远。近年来，大量的实验证据表明，特定的单个细胞行为及其之间的个体化差异与异质性，在许多关键生命过程例如胚胎发育、细胞分化、疾病发生与发展等过程中均起着重要的作用。因此，在单细胞水平上开展生物医学研究，有望在更深的层次上揭示生命活动的本质和规律，为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更可靠的科学依据。为实现上述目标，发展能够对稀有细胞进行高纯度分选的新装置与新技术，是单细胞分析的关键技术，具有极其重要的意义。
目前稀有细胞分选方法主要有流式细胞术、微流控法、光镊法等，其基本原理为先将细胞逐个分离，再将相同类型细胞收集实现分选功能。
流式细胞术是指通过特异蛋白对目标细胞进行标记，再利用电场对目标细胞进行分离，实现目标细胞的分选与富集。该方法是目前稀有单细胞分选的主流方法，但存在参数阈值设定困难、对细胞数量有要求、无法重复分选、细胞损伤大、分选后细胞活性不高等问题。
微流控法利用微通道网络实现细胞分选，依据细胞形态、大小、物理化学性质等特征进行分离与捕获。不同的微流控芯片结构与分选方法，在分选通量、分选速度、识别准确率上具有很大的差异。
光镊法由于结构与操作复杂，分选速度和效率较低，目前无法应用于大样本的细胞分选。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及其使用方法。其装置具有结构简单、容易操作的特点，方法具有细胞铺展速度快、通量高、目标细胞分选效率高、纯度高、遗漏率低、可重复等优点，适用于单细胞分析与筛选、单分子分析与筛选、高通量基因筛选、蛋白质定向进化、抗体筛选、微生物研究、药物筛选等领域。
一种用于稀有细胞高纯度分选的装置，包括：
用于对中间细胞样品取样或目标细胞进行取样的探针；
用于将细胞样品进行初次铺展或对得到的中间细胞样品进行再次铺展的容器；
驱动探针进行取样操作的细胞驱动模块；
对铺展后的细胞样品进行扫描成像的成像检测器；
数据处理与装置控制模块，对扫描成像结果进行分析，并根据分析结果控制探针操作；
可选择的还包括受所述数据处理与装置控制模块控制，能够对所述探针或容器位置进行位置调整的移动台；或者还可以包括用于承载所捕获细胞的阵列芯片等。
根据本发明，所述的一种用于稀有细胞高纯度分选的装置，其中探针(或优选单细胞捕获探针)与细胞驱动模块相连接；探针-细胞驱动模块与用于细胞样品铺展的容器以及用于承载所捕获细胞的阵列芯片之间可利用移动台进行相对运动；用于细胞样品铺展的容器、用于细胞样品多次分散的容器以及用于承载所捕获细胞的阵列芯片与用于细胞检测的成像检测器之间可利用移动台进行相对运动。
本发明的取样探针可以进一步优选为单细胞捕获探针，以实现对单细胞的捕获和分选。
作为一种实施方案，用于将细胞样品进行铺展或对得到的中间细胞样品进行再次铺展的容器，可以是同一个容器，也可以是单独设置的不同的容器，比如可以包括用于细胞样品铺展的容器以及用于细胞样品多次分散的容器；当然也可以是集成在一起的多个容器。
根据本发明，所述的用于细胞样品铺展的容器和用于细胞样品多次分散(或者成多次铺展)的容器中用于铺展或分散细胞的区域为平面结构，或为加工有有利于容留或束缚细胞位置的微结构阵列的结构，包括培养皿、多孔细胞培养板、平底容器、微坑阵列芯片、微柱阵列芯片、集成芯片或其他细胞铺展与分散容器。作为优选，用于细胞样品铺展的容器和用于细胞样品多次分散的容器中用于铺展或分散细胞的区域的表面进行防止细胞粘附的表面处理，或在表面涂覆具有防止细胞粘附的涂层。其中，多孔细胞培养板可通过填充固体物质的方式调节孔洞深度或进行表面处理。优选地，为方便细胞铺展和观察，所述的用于细胞铺展与多次分散的容器底面平整且透明。用于细胞样品铺展的容器、用于细胞样品多次分散的容器的表面经过抗细胞粘附处理，可以有效降低细胞捕获难度，提高单细胞捕获成功率。
根据本发明，成像检测器用于细胞的检测，所述成像检测器采用光谱方法，或电化学方法、或质谱方法，或色谱方法对细胞进行成像检测。作为优选，所述的用于细胞检测的成像检测器采用可见吸收和荧光方法对细胞进行成像检测；作为优选，所述成像检测器选择电动显微镜，以扫描得到检测区域的明场与荧光图像。
本发明根据需要，还可以同时设置移动台，利用移动台，用于细胞检测的成像检测器与用于细胞样品铺展的容器、用于细胞样品多次分散的容器以及用于承载所捕获细胞的阵列芯片之间，进行相对运动，实现对全部细胞样品或指定区域细胞样品的扫描检测。
所述的数据处理与装置控制模块可以采用微处理机、计算机或者控制芯片等，对扫描检测得到的成像数据进行处理，实现对阳性细胞(及目标细胞)的识别和定位。优选地，基于机器视觉技术，荧光细胞识别可以在进行高斯模糊、图像腐蚀、图像膨胀后，使用阈值识别、轮廓识别、卷积神经网络识别等方法实现。
优选地，介绍一种基于阈值识别的荧光阳性细胞识别方法：检测前利用特异性抗体对目标细胞进行荧光标记，利用成像检测器得到荧光图像(比如可以利用电动显微镜扫描得到对应的明场与荧光图像，见图10)，先分离出扫描图像中最能代表荧光信号的RGB通道，得到对应的单通道图像，利用高斯模糊算法降低图像底噪。再设置某一信号阈值(像素值)，若图像中像素点的信号值高于阈值，则该像素点信号值变为最大信号值(比如255)，反之则变为最小信号值(比如0)，从而使图像二值化，阈值设置的大小，可以通过预先多次试验得到。之后，利用椭圆形内核(或者其他内核)对二值化后的图像进行先膨胀再腐蚀的形态学处理，尽量消除不连续的噪点信号，得到区分目标细胞的连续无噪点黑白图像(图12)，其中包含了细胞的形状与边界信息，具体轮廓见参考图11。最后，利用二值化图像的边界找出目标细胞的轮廓，并计算出目标细胞在图像中的像素面积及其质心坐标、最小外切矩形，依据像素面积、轮廓形状、最小外切矩形中的目标细胞面积占比等条件(可依据对目标细胞预先的检测得到，也可以通过若干次的条件实验得到)可筛除绝大部分非目标信号(包括非目标细胞图像以及其他不满足设定筛选条件要求的噪音图像等)，至此即可实现基于阈值识别的荧光阳性细胞识别与定位。
优选地，先利用荧光标记过的目标细胞图像训练出能够准确识别阳性目标细胞的卷积神经网络模型，再利用该模型对扫描图像中的阳性目标细胞进行识别，也是一种有效的基于人工智能的阳性细胞识别方法。优选地，先将初始图像格式化为特定尺寸与存储结构，并将完整图像分割成若干部分。利用卷积核(一种权重矩阵，初始卷积核为默认设置或随机生成，在训练过程中逐步调整)将每个部分中的特征提取出来，最后将所有特征汇总，完成目标细胞的识别。卷积神经网络由若干个神经网络层组成，包括卷积层(初步提取特征)、池化层(提取主要特征)、全连接层(汇总所有特征)、分类层(产生分类器进行目标识别)，根据实际需要进行组合。利用多张目标细胞图像，经过若干次重复训练，卷积神经网络可成为能够对特定图像具有较高识别准确度的分类器。
作为优选，可以综合不同激发波长下的荧光图像识别结果，判断目标细胞的位置，并统计其数量，进一步提高识别精度。
根据本发明，所述的探针(优选单细胞捕获探针)，其功能在于将目标细胞捕获，将细胞在选定位置释放，或进行液体吸取、液体注射、液滴生成等液体操作。作为优选的方案，所述的捕获探针(或者单细胞捕获探针为)具有通道的毛细管形结构，或是在捕获探针尖端加工有能捕获单细胞的微结构的实心探针结构，或是加工有微通道网络的微流控芯片结构，或是加工有其他能捕获细胞的结构的探针。当采用毛细管形单细胞捕获探针时，该毛细管单细胞捕获探针的尖端的形状和通道直径与所捕获的目标细胞的尺寸相匹配。作为优选，毛细管尖端通道的直径为目标细胞直径的1-2倍。作为优选，对毛细管单细胞捕获探针的尖端通道的内壁和外壁进行防止或降低细胞吸附的表面处理。
所述的单细胞捕获探针与液体驱动模块相连接，所述细胞驱动模块能提供将细胞吸入取样探针(即上述的探针或者捕获探针)或吸在取样探针口部的负压；还能提供将捕获的细胞推出取样探针的正压，或者能提供其他能够使得目标细胞被捕获到取样探针以及与取样探针脱离的驱动力，所述驱动力包括介电、电磁、声波、光镊、热效应驱动力。
根据本发明，所述的细胞驱动模块，可采用机械驱动系统或非机械驱动系统，驱动力可来自机械形变或位移驱动、电动力驱动、磁动力驱动、声波驱动、热动力驱动、光致驱动力或其他驱动力。以上驱动模块均通过驱动流体对细胞施加负压或正压，实现细胞的捕获与注射。
根据本发明，所述的用于承载所捕获细胞的阵列芯片上，加工有能够承载包裹所捕获细胞的液滴的微结构的阵列。所述的微结构阵列包括微坑阵列、或微柱阵列、或由选择性亲水/疏水化处理所形成的微区域阵列、或其他构型的微结构阵列。微结构阵列可以限制细胞或包含细胞的液滴的位置，使得细胞或包含细胞的液滴在二维平面上排列。作为优选，通过在芯片上标记微坑或微柱的坐标，可以对目标细胞或包含细胞的液滴进行二维编码，有利于进行后续的可寻址的多步操作，包括药物实验、细胞培养、细胞迁移、细胞测序和分析等。
本发明还提供了一种用于稀有细胞高纯度分选的方法，包括：
(1)将细胞样品进行铺展；
(2)对铺展后的细胞样品进行扫描成像；
(3)根据成像结果，读取目标细胞的位置信息以及目标细胞与周围其他非目标细胞之间的距离信息，对得到的距离信息进行判断：
如果所述距离信息不满足设定取样距离要求，则根据目标细胞的位置信息，对其所在区域进行取样，得到包含该目标细胞和周围其他非目标细胞的中间细胞样品，对得到的中间细胞样品进行再次铺展，并返回步骤(2)；
如果所述距离信息满足设定取样距离要求，直接进行目标细胞的取样，实现目标细胞的分选。
根据需要可以进行多次铺展，可以在每次铺展后进行扫描成像，也可以在起始阶段，先进行多次铺展后，再进行扫描成像，均可根据实际情况调整。对于交易分选的细胞样品，可能经过初次铺展后的即可达到设定取样距离要求，即可直接实现对目标细胞的分选。利用本发明的方法，可以进行单细胞的分选，也可以对设定数量细胞的分选。或者也可以实现对多个目标细胞的分选。
所述初次铺展或再次铺展可在具有平面结构或者加工有有利于容留或束缚细胞位置的微结构阵列结构的容器中进行。对于容器的详细介绍，在装置部分已经详细说明，可参见装置部分的说明，不再赘述。
本发明还提供了一种用于稀有细胞高纯度分选的装置的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，将细胞样品以单层或多层形式铺展在用于细胞样品铺展的容器内的细胞铺展区域；
步骤二，使用用于细胞检测的成像检测器对铺展的全部细胞样品或指定区域的细胞样品进行扫描成像检测；
步骤三，利用数据处理与装置控制模块，对成像检测器扫描检测得到的成像数据进行处理，在大量阴性细胞(即非目标细胞)中识别所要捕获的阳性目标细胞，并获取阳性目标细胞的定位坐标信息；
步骤四，根据阳性目标细胞的定位坐标信息，数据处理与装置控制模块控制装置的单细胞捕获探针和液体驱动模块，将目标细胞捕获至捕获探针内；
步骤五，若被捕获进入捕获探针的细胞样品内除含单个目标细胞外，还含有其他目标细胞或非目标的干扰细胞，则采用将捕获进入捕获探针的细胞样品在用于细胞样品多次分散的容器上进行再次分散的方法，将目标细胞与其他非目标细胞(包括多余的目标细胞和非目标的干扰细胞)之间的间距增加到大于单细胞捕获的安全距离；
步骤六，重复进行步骤三和四的操作，直至将单个目标细胞捕获至捕获探针内，并且探针内不存在其他的干扰细胞；
步骤七，将捕获探针内的单个目标细胞转移至用于承载所捕获细胞的阵列芯片上，形成包含单个细胞的液滴，或将捕获探针内的单个目标细胞转移至培养容器内，进行后续的操作。
上述操作步骤可采用全自动方式进行，或采用手动方式进行，或采用自动与手动结合的方式进行。
根据本发明，步骤三中定位方法包括人工定位、仪器自动定位、仪器辅助人工定位或其他定位方法。即基于得到的成像结果，可以通过人眼识别，人工确定待捕获的阳性目标细胞，并获取阳性目标细胞的定位坐标信息等。也可以通过数据处理与装置控制模块实现自动识别。
根据本发明，步骤一中，或者步骤(1)中，控制细胞样品的细胞铺展层数在3到5层以内，通过控制细胞密度、细胞沉降时间、细胞样品的震荡频率或其他条件或使用刮片辅助，避免细胞形成团簇，使细胞尽可能均匀分散在用于细胞样品铺展的容器内；步骤一中，依次使用乙醇、水、乙二胺四乙酸(EDTA)溶液或其他抗细胞粘附试剂对容器表面或探针表面进行抗粘附处理；所述的步骤一中，通过调节细胞样品中培养液成分、酸碱度、温湿度保持细胞活性。
根据本发明，步骤二中，或者步骤(2)中，可通过多层扫描、重复扫描、综合分析的方式，可以对多层细胞样品进行无遗漏的扫描检测。步骤二中，通过调节液面弧度、曲面校正、倒置观察等方法减少曲面液面对扫描检测的影响。步骤二中，通过液面封合、降低液面高度、降低移动速度与加速度等方式，减少细胞运动过程的晃动，减少重影与定位误差。步骤二中使用用于细胞检测的成像检测器对细胞样品进行扫描成像检测。相似的，检测手段还可包括肉眼观察、吸光光度检测、其他光谱检测、电化学检测、色谱检测、电泳检测、质谱检测或其他检测方法。优选地，步骤三中可以根据识别结果进行目标计数，计数方法包括人工计数、机器计数、机器辅助人工计数或其他计数方法。
根据本发明，步骤三或者步骤(3)中，在大量阴性细胞中识别阳性目标细胞的方法包括肉眼识别、特征信号识别、阈值识别、人工智能综合分析识别或其他识别方法。其中，特征信号识别是指针对信号的频率、波形、峰宽、峰高等特征进行目标识别；阈值识别是指通过筛选特定阈值范围内的特征信号实现目标识别；人工智能综合分析是指利用人工智能算法综合分析多种样品信息，实现目标识别。
根据本发明，所述的步骤四或者步骤(3)中单细胞的捕获操作时，通过控制毛细管尖端的内径和外径、毛细管内外表面性质、毛细管尖端距离目标细胞的距离、毛细管尖端与容器或芯片底面的夹角、毛细管吸入细胞和液体的流速和时间等条件，提高毛细管捕获目标细胞的成功率，降低毛细管捕获非目标干扰细胞的概率。优选地，当使用毛细管捕获探针时，使用经疏水化表面处理的毛细管探针，在毛细管探针尖端与容器或芯片底面夹角为45°-90°时，毛细管探针内径为1-2倍细胞直径，吸取细胞流速在10-1000纳升/秒，吸取体积在1-100纳升范围内，对于目标细胞的捕获比较有利。
根据本发明，采用所述的步骤五中将捕获进入捕获探针的细胞样品进行再次分散方法，提高在大量阴性细胞中捕获阳性目标细胞的效率，即在细胞样品在用于细胞样品铺展的容器内进行第一次铺展(初次铺展)时，采用较高的细胞排布密度(即层数较多的细胞铺展形式)，以减少细胞成像检测器的检测工作量和检测时间；在将捕获进入捕获探针的细胞样品进行再次分散(再次铺展)时，采用包括探针辅助分散与非探针辅助分散的方法，将目标细胞与其他非目标细胞(包括多余的目标细胞和非目标的干扰细胞)之间的间距增加到大于单细胞捕获的安全距离。其中，探针辅助分散包括稀释分散、重复吸取注射分散、探针运动中注射分散或其他分散方法；非探针辅助分散包括震荡分散、搅拌分散、声波分散、磁力分散、升温分散、微波分散或其他可使细胞分散的方法。
根据本发明，所述的单细胞捕获安全距离与探针平均捕获半径和期望捕获纯度有关。细胞均匀分散后，其在平面内的分布符合泊松分布，细胞间的间距有大有小。当探针对准目标细胞进行捕获时，若周围其他细胞也在探针捕获范围内，则会捕获包括目标细胞在内的多个细胞，而非单个目标细胞，影响单细胞分选纯度。其中，若细胞平均间距与探针平均捕获半径相等，则单细胞捕获纯度仅为36.8％；若细胞平均间距为
Figure BDA0002404091540000091
倍的探针平均捕获半径，则单细胞捕获纯度为81.9％；若细胞平均间距为
Figure BDA0002404091540000092
倍的探针平均捕获半径，则单细胞捕获纯度为90.5％；若细胞平均间距为
Figure BDA0002404091540000093
倍的探针平均捕获半径，则单细胞捕获纯度为95.1％。不同期望分选纯度下的细胞平均间距称为单细胞捕获安全距离。作为优选，单细胞捕获的安全距离为探针平均捕获半径的3倍以上时，可实现90％以上的单细胞捕获成功率。
作为优选，在对细胞样品进行再次分散后，使用用于细胞检测的成像检测器对重新铺展的细胞样品再次进行扫描成像检测，以评估分散结果，如细胞分散结果满足单细胞捕获的安全距离的要求，则进行单细胞捕获操作；如细胞分散结果不能满足单细胞捕获的安全距离的要求，则再次进行细胞样品的分散操作。以此方法实现接近100％的单细胞捕获成功率。
根据本发明，步骤六中主要利用多次分散与捕获实现对单个目标细胞的捕获。由于探针尖端内径、细胞粘附性、探针捕获角度、探针捕获高度等条件不同，探针平均捕获半径通常为1-5倍细胞直径，所以若希望一次分选即达到95％的细胞分选纯度，则至少需要将细胞稀释至单层紧密排列的20-500倍面积，将大大增加扫描检测的耗费时间，并限制所能检测与分选的细胞总量。相反，若不经过大幅度稀释，则从密集的细胞组合中一次分选出单个目标细胞的概率微乎其微。但是，根据长期的实际操作与理论研究经验，3次左右的重复分散与捕获可以极大地提高细胞富集效率与分选纯度。当稀有细胞含量为0.1％，探针一次平均捕获6.3个细胞时，连续三次分散与捕获的单细胞捕获纯度分别为0.18％、74.8％、95.0％，而若欲单次捕获即达到95％的单细胞捕获纯度，则需要将初始样品稀释至原先的126倍。由于扫描检测是该方法中主要的时间耗费步骤，所以此时多次分散与捕获方法的分选效率约为单次分选方法的40倍。因此，利用多次分散与捕获实现对单个目标细胞的捕获，是针对稀有细胞高纯度分选的关键步骤。对于细胞密度较高、目标细胞含量很少的稀有细胞分选，该方法可以大幅度提高单个目标细胞的分选纯度与分选效率，是本发明方法的主要目标。
此外，如在细胞首次铺展过程中即发生目标细胞粘附于铺展容器表面而无法被吸取或捕获至探针内的情况，则可采用探针尖端直接接触细胞推或顶其脱离容器表面，或利用探针先单独在目标细胞周围注射适量细胞消化液(如EDTA或胰蛋白酶)，待目标细胞脱离容器表面后，再进行单细胞吸取捕获操作。
根据本发明，步骤七提供了细胞分离、容纳、培养和进一步实验的方法。对于需要进一步培养或观察的细胞，可以将其转移至培养皿等容器内；对于需要进行后续操纵和处理的细胞，也可以将其存放于液滴内方便操作。
根据本发明，以上步骤可采用自动化三维平移台与计算机联用的方式，实现细胞的自动铺展、自动检测、自动识别、自动定位、自动分选、自动转移等操作。
与现有技术相比，本发明的优点主要在于：
本发明的用于稀有细胞高纯度分选的装置及其使用方法，该装置包括用于细胞样品铺展的容器、用于细胞样品多次分散的容器、用于细胞检测的成像检测器、单细胞捕获探针、细胞驱动模块、数据处理与装置控制模块、移动台和用于承载所捕获细胞的阵列芯片。先将细胞铺展，利用细胞成像检测器对待测细胞进行大规模面阵扫描检测，再使用单细胞捕获探针利用流体压差无损伤地捕获目标细胞，最后将目标细胞或包含单个目标细胞的液滴在阵列芯片或其他容器中收纳，实现稀有细胞的高纯度分选。其装置具有结构简单，操作简便的特点，方法具有细胞铺展速度快、通量高、目标细胞分选效率高、纯度高、遗漏率低、可重复等优点，适用于单细胞分析与筛选、单分子分析与筛选、高通量基因筛选、蛋白质定向进化、抗体筛选、微生物研究、药物筛选等领域。
与微通道、微孔阵列、微柱阵列等微流控芯片相比，该方法对于细胞铺展后的排列规整度没有要求，同样的检测面积下，细胞检测通量显著提高。与极限稀释等单细胞分选方法相比，该方法可以准确捕获单个稀有目标细胞，重复分选的方法也能大幅降低检测时间，目标单细胞分选的成功率更高。与流式细胞术等单细胞分选方法相比，该方法可以对原始样品进行重复检测，避免因阈值设置不当而导致的目标遗漏，有利于提升目标样品的回收率。而且，该方法仅依靠流体压差进行细胞捕获，属于十分轻柔的单细胞分选方法，不会对细胞活性产生显著影响，有利于对细胞进行后续培养与实验研究。此外，使用多种检测方式对样品进行检测，也可以实现目标细胞的多指标检测，降低假阳性率。同时，目标细胞被铺展在平面或独立包裹于液滴内部，也有利于对单个细胞进行试剂引入、物质提取等后续操作与处理。
附图说明
图1是实施例1中装置结构示意图；
图2是本发明中单细胞分选操作原理示意图；
图3是本发明中探针辅助细胞分散方法示意图；
图4是实施例1中细胞成像检测器结构示意图；
图5是实施例1中稀有细胞分选操作示意图；
图6是实施例1中稀有细胞分选后单细胞液滴阵列排布示意图；
图7是实施例2中装置结构示意图；
图8是实施例2中稀有细胞分选操作示意图；
图9是实施例3中装置结构示意图；
图10是针对某一细胞样品获得的初始荧光(绿色和红色荧光)图像；
图11为图10所示图像中发出红色荧光的细胞被识别与标注轮廓的图像。
图12为图10所示图像中发出红色荧光的细胞经过形态化处理后得到的二值化黑白图像。
附图标记说明：
1、用于细胞样品铺展的容器；2、用于细胞样品多次分散的容器；3、用于细胞检测的成像检测器；4、单细胞捕获探针；5、细胞驱动模块；6、数据处理与装置控制模块；7、移动台；8、用于承载所捕获细胞的阵列芯片；9、细胞样品；10、目标细胞；11、非目标的干扰细胞；12、单细胞液滴12；13、细胞样品的悬液；14、用于细胞检测的成像检测器的光源；单细胞捕获探针尖端与用于细胞样品铺展或分散的容器底面的夹角(15)；16、油相；17、微坑阵列；18、微柱；19、集成芯片。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，以下将详细描述根据本发明的优选实施例。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1实施例1中装置结构如图1所示。
一种用于稀有细胞高纯度分选的装置，包括用于细胞样品铺展的容器1、用于细胞样品多次分散的容器2、用于细胞检测的成像检测器3、单细胞捕获探针4、细胞驱动模块5、数据处理与装置控制模块6、移动台7和用于承载所捕获细胞的阵列芯片8。
所述的单细胞捕获探针4与细胞驱动模块5相连接；单细胞捕获探针4-细胞驱动模块5与用于细胞样品铺展的容器1以及用于承载所捕获细胞的阵列芯片8之间可利用移动台7进行相对运动，实现相对位置的调整；用于细胞样品铺展的容器1、用于细胞样品多次分散的容器2以及用于承载所捕获细胞的阵列芯片8与用于细胞检测的成像检测器3之间可利用移动台7进行相对运动，实现相对位置的调整。
所述的用于细胞检测的成像检测器3采用光谱方法，或电化学方法、或质谱方法，或色谱方法对细胞进行成像检测。作为优选，所述的用于细胞检测的成像检测器3采用可见吸收和荧光方法对细胞进行成像检测。利用移动台7，用于细胞检测的成像检测器3与用于细胞样品铺展的容器1、用于细胞样品多次分散的容器2以及用于承载所捕获细胞的阵列芯片8之间，进行相对运动，实现对全部细胞样品或指定区域细胞样品的扫描检测。所述的数据处理与装置控制模块6对扫描检测得到的成像数据进行处理，实现对目标细胞10的识别和定位。
所述的单细胞捕获探针4为具有通道的毛细管形结构，或是在捕获探针4尖端加工有能捕获单细胞的微结构的实心探针结构，或是加工有微通道网络的微流控芯片结构，或是加工有其他能捕获细胞的结构的探针。当采用毛细管形单细胞捕获探针4时，该毛细管单细胞捕获探针4的尖端的形状和通道直径与所捕获的目标细胞10的尺寸相匹配。实施例中，重点以采用上述毛细管形单细胞捕获探针4作为取样探针或者捕获探针为例进行说明。作为优选，毛细管形单细胞捕获探针4尖端通道的直径为目标细胞10直径的1-2倍。作为优选，对毛细管单细胞捕获探针4的尖端通道的内壁和外壁进行防止或降低细胞(10-11)吸附的表面处理。所述的单细胞捕获探针4与细胞驱动模块5相连接，细胞驱动模块5可提供将目标细胞10吸入毛细管单细胞捕获探针4或吸在毛细管单细胞捕获探针4口部的负压，还可提供将捕获的细胞推出毛细管探针4的正压，或者可提供其他能够使得目标细胞10被捕获到毛细管探针4和与毛细管探针4脱离的驱动力，如介电、电磁、声波、光镊、热效应等驱动力。作为一种优选的方案，当单细胞捕获探针4采用具有通道的毛细管形结构时，其细胞驱动模块5可以直接采用能够按照设定程序提供负压或者正压的压力驱动机构，比如可以采用常见的微量注射泵及其相关组件等，或者采用气泵以及相关的组件等。
实施例具体实施时，在取样时，毛细管捕获4尖端与容器或芯片(1、2或8)底面夹角为45°-90°时，对于目标细胞10的捕获比较有利。同时单细胞捕获的安全距离(及设定取样距离)为捕获探针4平均捕获半径的3倍以上时，可实现90％以上的单细胞捕获成功率。捕获探针4平均捕获半径取通常为1-5倍细胞(可以是目标细胞10)直径。
所述的用于细胞样品铺展的容器1主要实现对样品的初次铺展，用于细胞样品多次分散的容器2主要用于实现一次或者多次再次铺展，容器1或者容器2中用于铺展或分散细胞(10-11)的区域为透明的平面结构，或为加工有有利于容留或束缚细胞(10-11)位置的微结构阵列的结构。作为优选，用于细胞样品铺展的容器1和用于细胞样品多次分散的容器2中用于铺展或分散细胞(10-11)的区域的表面进行防止细胞(10-11)粘附的表面处理，或在表面涂覆具有防止细胞(10-11)粘附的涂层。
所述的用于承载所捕获细胞的阵列芯片12上，加工有能够承载包裹所捕获细胞10的液滴12的微结构的阵列。所述的微结构阵列包括微坑阵列17(见图2)、或微柱阵列、或由选择性亲水/疏水化处理所形成的微区域阵列、或其他构型的微结构阵列。
作为一种具体的实施方式，稀有细胞分选方法如下：
依次使用乙醇、水、EDTA清洗平底玻璃容器(可以采用图1所示的集成平底容器，也可以采用单独设置的平底容器，比如可以采用培养皿等)，将已用荧光抗体标记目标细胞的细胞悬液(即细胞样品9的悬液)倒入平底玻璃容器1中，震荡使细胞均匀分散，自然沉降3-5分钟，使细胞铺展为3层以内的细胞层(图2)。
检测前利用特异性抗体对目标细胞进行荧光标记，如图4所示，使用细胞成像检测器3(激光诱导荧光细胞成像检测器，如图4)配合使用光源14，扫描检测区域的荧光信号，并利用基于阈值与轮廓计算的计算机机器视觉软件自动识别，其中的荧光细胞(包括目标细胞以及能够发出荧光的非目标细胞)，综合多种荧光信号(对不同荧光信号分别进行识别，发出特定荧光组合的细胞即为目标细胞，比如：发红、绿荧光。)，判断目标细胞的位置，并统计其数量。
如图4所示，使用激光诱导荧光细胞成像检测器3配合使用光源14，扫描检测区域的明场与荧光图像。先分离出扫描图像中最能代表荧光信号的RGB通道，得到对应的单通道图像，利用高斯模糊算法降低图像底噪。再设置某一阈值，若图像中像素点的像素值高于阈值，则该像素点像素值变为最大像素值，反之则变为最小像素值，从而使图像二值化。之后，利用椭圆形内核对二值化后的图像进行先膨胀再腐蚀的形态学处理，尽量消除不连续的噪点信号。最后，利用二值化图像的边界找出目标细胞的轮廓，并计算出目标细胞在图像中的像素面积及其质心坐标、最小外切矩形，依据像素面积、轮廓形状、最小外切矩形中的目标细胞面积占比等条件(可依据对目标细胞预先的检测得到，也可以通过若干次的条件实验得到)可筛除绝大部分非目标信号，实现基于阈值识别的荧光阳性细胞识别与定位。综合多种激发波长下的识别结果，即可依据特定荧光信号组合(如红、绿、非蓝)，判断目标细胞的位置，并统计其数量。
将尖端内径为15-20微米(可针对实际细胞大小调整尖端尺寸)的疏水化锥形尖端毛细管作为细胞分选捕获探针4，移动到目标细胞10所在位置附近，探针与底部平面的夹角15为60°，通过利用细胞驱动模块5中的微量注射泵抽取溶液，吸取目标细胞10及其周围溶液13(图5，图2)。吸取细胞流速在20-1000纳升/秒，吸取体积在5-50纳升范围内，毛细管探针尖端距离细胞垂直距离范围为0-50微米。
将捕获到的细胞及溶液注射到另一个包含培养液的平底玻璃容器2，利用流体吹散或重复吸取-注射吹散方法(图3)，使捕获到的细胞进行分散。当检测到目标细胞与周围细胞距离足够满足单细胞捕获的安全距离要求时，进行细胞捕获操作，实现单个目标细胞的精准捕获。
如图2和图6，将捕获到的单个目标细胞10注射到覆盖有氟油的微坑阵列芯片中，形成包含有目标单细胞的液滴12的阵列，利用探针进行诸如后续的细胞培养、药物实验、迁移实验、单细胞测序、单细胞组学分析等操作。
实施例2
实施例2中装置结构如图7所示。
将包含已用荧光抗体标记目标细胞10和非目标的干扰细胞11的细胞悬液倒入培养皿1中，于培养箱中培养30分钟左右，此时贴壁细胞可以形成紧密堆积的单细胞层贴壁生长。加入适量胰酶细胞消化液，使细胞消化，在培养皿底部形成低黏附性的单细胞层。
使用电动显微镜3扫描检测区域的明场与荧光图像，并利用基于人工智能的图像分类软件自动识别其中的荧光细胞(参见实施例1)综合不同激发波长下的荧光图像识别结果，判断目标细胞的位置，并统计其数量。也可以组合多个神经网络，或训练能够同时分析多种荧光信号的神经网络，或训练能够对多种荧光信号进行综合分析的分类器。
使用电动显微镜3扫描检测区域的明场与荧光图像，并利用基于人工智能的图像分类软件自动识别其中的荧光细胞，综合不同激发波长下的荧光图像识别结果，即可依据特定荧光信号组合(如红、绿、非蓝)，判断目标细胞的位置，并统计其数量。其中，基于人工智能的图像分类软件为特定的卷积神经网络结构，需事先针对特定检测目标进行训练，具体包括：先将初始图像格式化为特定尺寸与存储结构，并将完整图像分割成若干部分。利用卷积核(一种权重矩阵，初始卷积核为默认设置或随机生成，在训练过程中逐步调整)将每个部分中的特征提取出来，最后将所有特征汇总，完成目标细胞的识别。卷积神经网络由若干个神经网络层组成，包括卷积层(初步提取特征)、池化层(提取主要特征)、全连接层(汇总所有特征)、分类层(产生分类器进行目标识别)，根据实际需要进行组合。利用专家标注过的目标细胞图像进行若干次重复训练，该卷积神经网络可成为能够对特定图像具有较高识别准确度的分类器。
将尖端内径约为目标细胞直径1.5倍的锥形尖端毛细管作为细胞分选探针4，探针与培养皿底部的夹角为60°。移动探针尖端到目标细胞所在位置毛细管探针尖端距离细胞垂直距离范围为0-30微米，利用气泵驱动模块中的气泵施加一定负压，吸取目标细胞及其周围溶液。
采用探针运动中注射分散的方法(图3)对捕获到探针内的细胞样品进行分散，即在保持探针水平移动的条件下，将捕获到探针内的细胞及溶液注射到另一个包含培养液的培养皿，或采取反复进行探针水平移动数十至数百微米-由探针推出数纳升溶液的操作的方法分散细胞样品，或采用提高探针尖端距培养皿底部距离进行注射的方法使捕获到的细胞分散。当检测到目标细胞与周围细胞距离足够满足单细胞捕获的安全距离要求时(对明场图像进行轮廓分析，可以算出视场内每个细胞的位置坐标，计算目标细胞与周围细胞之间的距离。)，进行细胞捕获操作，实现单个目标细胞的精准捕获(图8)。还可以将捕获到的细胞及溶液注射到另一个包含培养液的平底玻璃容器2的细胞富集区域，待全部目标细胞都被转移至该富集区域后，利用搅拌或震荡溶液的方法，使目标细胞实现较均匀的分散与稀释。经过分散后，当检测到目标细胞与周围细胞距离足够满足单细胞捕获的安全距离要求时，进行细胞捕获操作，实现单个目标细胞的精准捕获。
将捕获到的单个目标细胞注射到接收培养皿8中，实现目标细胞的高纯度高活性富集，可在完成目标细胞分选后进行高活性培养，进行后续的细胞定向进化等研究。
实施例3
实施例3中装置结构如图9所示。
采用集成芯片19进行实验，集成芯片上加工有带有微结构(包括微坑阵列和微柱阵列18)阵列的细胞铺展区域(相当于容器1)、细胞多次分散区域(相当于容器2)和承载所捕获细胞液滴的区域(相当于芯片8)。将含有目标细胞的细胞悬液倒入集成芯片的细胞铺展区域，通过自然沉降和刮板控制，形成单层的细胞铺展层，细胞被束缚在微坑内或微柱之间的间隙。样品扫描区域事先进行表面改性，抑制蛋白质非特异性吸附，降低细胞在其表面的粘附性。
使用快速高灵敏细胞成像检测器3(激光诱导荧光细胞成像检测器)扫描大范围细胞铺展区域的明场和荧光图像，利用基于机器学习的目标检测方法自动识别其中的目标细胞，判断目标细胞的位置，并统计其数量。
将尖端内径为目标细胞直径1.5倍的疏水化锥形尖端毛细管作为单细胞分选探针4，移动到目标细胞所在位置附近，探针与底部平面的夹角为90°，通过细胞驱动模块5施加稳定且准确的负压，吸取目标细胞及其周围溶液。毛细管探针吸取细胞流速在1-1000纳升/秒，吸取体积在1-100纳升范围内，毛细管探针尖端距离细胞垂直距离范围为0-100微米。因为微结构(包括微坑阵列或微柱阵列)阵列芯片中微结构对细胞的间隔作用，可获得较高的单细胞捕获成功率。如在吸取过程中，仍有除目标细胞以外的干扰细胞进入探针，可采用再次分散的方法实现单细胞捕获。
此外，如在细胞首次铺展过程中即发生目标细胞粘附于铺展容器表面而无法被吸取或捕获至探针内的情况，则可采用以探针尖端直接接触细胞推其脱离容器表面的方法，或利用探针先单独在目标细胞周围注射100皮升至1纳升细胞消化液(如EDTA或胰蛋白酶)，待目标细胞脱离容器表面后，再进行单细胞吸取捕获操作。
将探针捕获到的单个目标细胞注射到的微坑阵列芯片中，形成目标单细胞液滴阵列。操作过程中利用加湿器保持环境湿度，避免液滴蒸发。最后，利用探针进行诸如细胞裂解、蛋白酶解、代谢物衍生及其分离分析等后续操作。

Claims (10)

1.一种用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，包括：
(1)将细胞样品进行铺展；
(2)对铺展后的细胞样品进行扫描成像；
(3)根据成像结果，读取目标细胞的位置信息以及目标细胞与周围其他非目标细胞之间的距离信息，对得到的距离信息进行判断：
如果所述距离信息不满足设定取样距离要求，则根据目标细胞的位置信息，对其所在区域进行取样，得到包含该目标细胞和周围其他非目标细胞的中间细胞样品，对得到的中间细胞样品进行再次铺展，并返回步骤(2)；
如果所述距离信息满足设定取样距离要求，直接进行目标细胞的取样，实现目标细胞的分选。
2.根据权利要求1所述的用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，所述铺展可在具有平面结构或者加工有有利于容留或束缚细胞位置的微结构阵列结构的容器中进行。
3.根据权利要求1所述的用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，中间细胞样品的取样或者目标细胞的取样采用探针进行。
4.根据权利要求3所述的用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，所述探针为带有取样通道的毛细管结构，或者为尖端加工有能捕获单细胞的微结构的实心探针结构，或是加工有微通道网络的微流控芯片结构，或是加工有其他能捕获细胞的结构的探针。
5.根据权利要求3或4所述的用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，取样时，探针取样端与铺展平面的夹角为45°-90°。
6.根据权利要求3或4所述的用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，取样时，所述设定取样距离为2倍或2倍以上探针平均捕获半径，其中探针的平均捕获半径为1-5倍目标细胞直径。
7.根据权利要求1所述的用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，进行再次铺展时，采用包括探针辅助分散与非探针辅助分散的方法，将目标细胞与其他非目标细胞之间的间距增大；其中探针辅助分散包括稀释分散、重复吸取注射分散、运动中注射分散或其他分散方法；非探针辅助分散包括震荡分散、搅拌分散、声波分散、磁力分散、升温分散、微波分散或其他可使细胞分散的方法。
8.根据权利要求1所述的用于稀有细胞高纯度分选的方法，其特征在于，检测前，对目标细胞进行荧光标记，步骤(2)得到对应的荧光图像，对该图像进行如下处理：
(I)选择最能代表荧光信号的RGB通道，得到对应的单通道图像，利用高斯模糊算法降低图像噪音；
(II)对得到的图像进行二值化；
(III)对二值化后的图像进行先膨胀再腐蚀的形态学处理；
(IV)求取每个细胞的轮廓，并计算出细胞在图像中的像素面积及其质心坐标、最小外切矩形，依据像素面积、轮廓形状、最小外切矩形中的目标细胞面积占比筛除非目标信号，实现目标细胞识别与定位；
或者先利用荧光标记过的目标细胞图像训练出能够准确识别阳性目标细胞的卷积神经网络模型，再利用该模型对扫描图像中的阳性目标细胞进行识别。
9.一种用于稀有细胞高纯度分选的装置，其特征在于，包括：
用于对中间细胞样品取样或目标细胞进行取样的探针；
用于将细胞样品进行铺展或对得到的中间细胞样品进行再次铺展的容器；
驱动探针进行取样操作的细胞驱动模块；
对铺展后的细胞样品进行扫描成像的成像检测器；
数据处理与装置控制模块，对扫描成像结果进行分析，并根据分析结果控制探针操作；
可选择的还包括受所述数据处理与装置控制模块控制，能够对所述探针或容器位置进行位置调整的移动台。
10.根据权利要求8所述的用于稀有细胞高纯度分选的装置，其特征在于，所述成像检测器采用光谱方法，或电化学方法、或质谱方法，或色谱方法对细胞进行成像检测；所述细胞驱动模块能提供将细胞吸入探针或吸在探针口部的负压；还能提供将捕获的细胞推出探针的正压，或者能提供其他能够使得目标细胞被捕获到探针以及与探针脱离的驱动力，所述驱动力包括介电、电磁、声波、光镊、热效应驱动力；所述容器为具有平面结构或者加工有有利于容留或束缚细胞位置的微结构阵列结构的容器。
CN202010156101.3A 2020-03-09 2020-03-09 一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法 Active CN113373104B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010156101.3A CN113373104B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010156101.3A CN113373104B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113373104A true CN113373104A (zh) 2021-09-10
CN113373104B CN113373104B (zh) 2022-11-18

Family

ID=77569462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010156101.3A Active CN113373104B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113373104B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114486830A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 复旦大学 用于单细胞中单分子蛋白质与生物分子计数的系统与方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140073043A1 (en) * 2011-09-25 2014-03-13 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
WO2014172688A1 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 California Institute Of Technology Parallelized sample handling
CN105492621A (zh) * 2013-03-28 2016-04-13 英属哥伦比亚大学 微流控装置及其在多细胞分泌检测中的使用方法
CN206052034U (zh) * 2016-07-20 2017-03-29 国家纳米科学中心 用于表达egfr的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片
CN106916725A (zh) * 2017-03-20 2017-07-04 东华大学 一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片及其应用
CN109182081A (zh) * 2018-08-22 2019-01-11 长春长光辰英生物科学仪器有限公司 一种基于图像处理模型的单细胞分选系统
CN109908986A (zh) * 2019-02-21 2019-06-21 浙江大学 一种基于出口不对称毛细管的液滴生成系统及使用方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140073043A1 (en) * 2011-09-25 2014-03-13 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
CN105492621A (zh) * 2013-03-28 2016-04-13 英属哥伦比亚大学 微流控装置及其在多细胞分泌检测中的使用方法
WO2014172688A1 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 California Institute Of Technology Parallelized sample handling
CN206052034U (zh) * 2016-07-20 2017-03-29 国家纳米科学中心 用于表达egfr的单细胞分选和多基因位点检测的微流控芯片
CN106916725A (zh) * 2017-03-20 2017-07-04 东华大学 一种包埋功能化纳米纤维膜的微流控芯片及其应用
CN109182081A (zh) * 2018-08-22 2019-01-11 长春长光辰英生物科学仪器有限公司 一种基于图像处理模型的单细胞分选系统
CN109908986A (zh) * 2019-02-21 2019-06-21 浙江大学 一种基于出口不对称毛细管的液滴生成系统及使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨忠等: "基于最短距离的细胞图像分离", 《成都信息工程学院学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114486830A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 复旦大学 用于单细胞中单分子蛋白质与生物分子计数的系统与方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113373104B (zh) 2022-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3445490B1 (en) High density deposition for array production
US20080063251A1 (en) Method and Device for Identifying an Image of a Well in an Image of a Well-Bearing
US20090081773A1 (en) Microfluidic apparatus for manipulating imaging and analyzing cells of a cytological specimen
US20150132766A1 (en) Imaging cell sorter
CN112175824B (zh) 一种基于数字微流控技术的全自动单细胞捕获芯片及其应用
US7403647B2 (en) Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
US20140065637A1 (en) Determining Information for Cells
US11156545B2 (en) Fluid sample enrichment system and method
CN113164952B (zh) 用于细胞的微滴检测的装置和方法
US20220396757A1 (en) Method of collecting fine particles, microchip for sorting fine particles, device for collecting fine particles, method of producing emulsion, and emulsion
CN113373104B (zh) 一种用于稀有细胞高纯度分选的装置及方法
US20230042115A1 (en) Microdroplet manipulation method
Francz et al. Subnanoliter precision piezo pipette for single-cell isolation and droplet printing
Wang et al. A microfluidic robot for rare cell sorting based on machine vision identification and multi-step sorting strategy
CN113588522B (zh) 基于微流控和图像识别的循环肿瘤检测与分选方法及系统
Diao et al. Artificial intelligence‐assisted automatic and index‐based microbial single‐cell sorting system for One‐Cell‐One‐Tube
CN109929747B (zh) 一种数字pcr检测装置与检测方法
JP4679847B2 (ja) 細胞の解析方法
CN114252385A (zh) 一种便携式白细胞亚类检测装置及方法
CN111896456A (zh) 一种基于微流控和高光谱成像的单细胞分析方法
US20190358623A1 (en) A system for microdroplet manipulation
CN114137195B (zh) 一种基于图像拍摄分析的高通量生化检测系统及其方法
CN115161198B (zh) 基于微孔微流控芯片的高捕获率单细胞标记装置及应用
WO2024020264A2 (en) Systems, methods, and apparatus for a microfluidic chip having a microchannel design which asymmetrically focuses particles
Zhang Microfluidic tools for connecting single-cell optical and gene expression phenotype

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant