CN113373088B - 贫营养优势好氧反硝化菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种贫营养优势好氧反硝化菌剂及其制备方法和应用，其中，该菌剂包括好氧反硝化细菌和用于固定所述好氧反硝化细菌的丝瓜络，并且该菌剂在贫营养条件下，具有不低于92％的硝酸盐去除率。本发明通过在水库沉积物中富集并筛选出优势贫营养好氧反硝化菌株，以丝瓜络为载体制备固定化好氧反硝化菌菌剂。本发明的菌剂不仅能够解决低碳源，尤其是贫营养微污染水源水的修复治理，显著提高硝酸盐脱除效率，而且能够解决现有技术中脱氮菌剂存在的易被流水冲走导致的脱氮效率低的技术缺陷。

Description

贫营养优势好氧反硝化菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及环境生物技术领域，具体地涉及一种反硝化菌剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种贫营养优势好氧反硝化菌剂制备方法和应用。
背景技术
贫营养水源水一般是微污染水。硝酸盐、有机物等水质指标均超过了《中国地表水环境质量标准》(GB3838-2002)的三级水要求。水体中硝酸盐过量会导致藻类增殖，水质恶化等一系列问题，严重影响饮用水水质。硝酸盐在人体内可转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐可将血红蛋白直接氧化成高铁血红蛋白，最终导致人体组织严重缺氧，影响人体健康。因此，减少饮用水库硝酸盐污染，保障饮用水安全已成为微污染水源急需解决的问题。
目前，去除硝酸盐最常用的处理方法有离子交换法、吸附法、电化学法、反渗透法、化学法和生物法，其中，生物处理可以完全还原气态氮的硝酸盐而不形成氮残基，显示出成本低、效率高、环境友好的优势，生物处理低营养硝酸盐微污染水具有广阔的发展前景。与生活污水和工业废水相比，水源水中碳水化合物含量通常较低，导致水环境营养不良。这类水通常的做法是加入醋酸、甲醇或葡萄糖作为碳源进行改进反硝化，但这会增加维护成本，并导致二次污染。因此，寻找一种既能解决碳源稀缺、又能提高反硝化效率的生物脱氮方法已迫在眉睫。
相关研究从水库沉积物中分离到能够在贫营养生态系统中进行好氧反硝化的新菌株。此外，游离的细菌菌体易被流水冲走，使得好氧反硝化菌浓度容易被稀释，脱氮效率由于菌体浓度的降低而下降，仍存在脱氮效果不稳定的技术缺陷。
另外，一方面，在现有污水处理中，微生物处理具有高碳氮比依赖性。另一方面，虽然目前有低营养条件硝酸盐去除的相关研究，但是仍然存在去除率低的问题。例如，在何绪刚等人的研究中，分离出一株假单胞菌属细菌菌株DM02，该菌株具有异养硝化-好氧反硝化能力，不过在碳氮比为2或4 时，硝酸盐去除率均低于50％。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明通过在水库沉积物中富集并筛选出优势贫营养好氧反硝化菌株，以丝瓜络为载体制备固定化好氧反硝化菌菌剂。本发明的贫营养好氧反硝化菌剂不仅能够解决低碳源微污染水源水的修复治理，而且能够解决现有技术中脱氮菌剂存在的易被流水冲走导致的脱氮效率低的技术缺陷。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供贫营养优势好氧反硝化菌剂，其特征在于，包括好氧反硝化细菌和用于固定所述好氧反硝化细菌的丝瓜络，并且所述菌剂在贫营养条件下，具有不低于92％的硝酸盐去除率。
根据本发明的贫营养优势好氧反硝化菌剂，优选地，所述好氧反硝化细菌为分离自湖泊沉积物的革兰氏阴性的食酸菌YD725，菌株于2021年05 月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2021536。
根据本发明的贫营养优势好氧反硝化菌剂，优选地，所述丝瓜络为氢氧化钠改性丝瓜络。
根据本发明的贫营养优势好氧反硝化菌剂，优选地，所述贫营养条件是指碳源浓度低于15mg/L。
本发明的第二方面，提供一种贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，其至少包括以下步骤：
(1)提供贫营养优势好氧反硝化细菌；
(2)提供氢氧化钠改性丝瓜络；
(3)在有机溶液存在和适于固定化的条件下进行所述细菌与氢氧化钠改性丝瓜络的固定化，得到所述菌剂。
根据本发明的贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，优选地，所述有机溶液为含有[C2H4O]n的水溶液，其质量体积比浓度为5-15g/mL。
根据本发明的贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，优选地，所述适于固定化的条件是指将所述有机溶液和所述细菌菌悬液混合物在交联溶液存在下0-8℃下交联12-36h。进一步优选地，该温度为1-6℃，交联时间为 18-30h。还优选地，温度为2-5℃，交联时间为20-30h。
根据本发明的贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，优选地，所述交联溶液为1-10％的氯化钙的饱和硼酸溶液。还优选地，所述交联溶液为1-5％的氯化钙的饱和硼酸溶液。
根据本发明的贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，优选地，所述贫营养是指碳源浓度低于15mg/L。
本发明第三方面，提供根据第一方面所述的贫营养优势好氧反硝化菌剂或第二方面制备方法制备得到的菌剂在微污染修复治理中的应用。
本发明的通过在水库沉积物中富集并筛选出优势贫营养好氧反硝化菌株，以丝瓜络为载体制备固定化好氧反硝化菌菌剂。本发明的贫营养好氧反硝化菌，适用于湖泊、水库等水源水的微污染修复治理，区别于分离自污水系统等环境的好氧反硝化菌，只适合在高碳氮比的环境下进行反硝化的局限。因此，本发明的贫营养好氧反硝化菌剂不仅能够解决低碳源微污染水源水的修复治理，而且能够解决现有技术中脱氮菌剂存在的易被流水冲走导致的脱氮效率低的技术缺陷。在微生物法去除水体硝酸盐应用中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的菌株系统发育树。
图2为本发明的菌剂脱氮效率。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明中，CCTCC是指中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCulture Collection)，是经国家专利局、教育部批准成立的专业培养物保藏机构，也是世界培养物保藏联盟(World Federation for Culture Collections, WFCC)、世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization,WIPO) 批准，成为布达佩斯条约(Budapest Treaty)确认的国际培养物保藏单位 (International DepositoryAuthority,IDA)，在国际上具有保藏专利培养物的资质。地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学。
[贫营养型好氧反硝化菌株]
本发明提供一种贫营养型好氧反硝化菌株。不同于污水或废水，本发明的菌株是通过水库或湖泊沉积物进行筛选后得到。分离纯化筛选方法不特别限定。优选地，用于菌株筛选用贫营养富集培养基包括下述组分：0.2-0.8g/L 的乙酸钠、0.02-0.30g/L的硝酸钠、0.02-0.30g/L的磷酸氢二钠、0.02-0.20g/L 的氯化钙、0.02-0.20g/L的硫酸镁和1-4ml的微量元素。进一步优选地，用于菌株筛选用贫营养富集培养基包括下述组分：0.4-0.6g/L的乙酸钠、0.08-0.20 g/L的硝酸钠、0.08-0.20g/L的磷酸氢二钠、0.02-0.08g/L的氯化钙、0.02-0.08 g/L的硫酸镁和1-3ml的微量元素。
优选地，上述微量元素包括下述组分：0.2-0.7g/L的EDTA、0.05-0.15g/L 的硫酸亚铁、0.05-0.15g/L的硫酸锌、0.002-0.02g/L的硫酸铜、0.01-0.10g/L 的氯化锰、0.01-0.10g/L的氯化钴。进一步优选地，上述微量元素包括下述组分：0.4-0.6g/L的EDTA、0.08-0.12g/L的硫酸亚铁、0.08-0.12g/L的硫酸锌、 0.008-0.01g/L的硫酸铜、0.03-0.06g/L的氯化锰、0.03-0.06g/L的氯化钴。
用于菌株筛选用贫营养选择培养基包括下述组分：0.05-0.2g/L的乙酸钠、0.01-0.03g/L的硝酸钠、0.01-0.03g/L的磷酸氢二钠、0.005-0.10g/L的氯化钙、0.005-0.10g/L的硫酸镁和1-4ml的微量元素。其中，微量元素具有如上所述的组分。
在前期筛选中，优选初始碳源浓度为100-200mg/L，进一步优选初始碳源浓度为120-150mg/L。优选溶解氧为2-15mg/L，进一步优选溶解氧为3-12 mg/L。优选初始氮源浓度低于17mg/L。本发明中，碳源浓度是重要的，富集后驯化培养基中碳源浓度优选低于30mg/L，进一步优选低于20mg/L，还优选低于10mg/L，例如9mg/L，8mg/L，7mg/L，6mg/L，5mg/L，4mg/L，甚至是3mg/L。
经菌落形态和16s rRNA鉴定，本发明的菌株为食酸菌属(Acidovorax sp.)。将其命名为Acidovorax sp.strain YD725。优选地，本发明的菌株与Acidovorax sp.KR1_RH06具有99.71％的相似性。需要说明的是，该菌剂在贫营养条件下(理论C/N值低于9)，具有不低于92％的硝酸盐去除率，优选是在初始硝氮浓度低于9mg/L，更优选低于8mg/L，例如7mg/L、6mg/L、5mg/L、4mg/L、 3mg/L、2mg/L，甚至1mg/L下，硝酸盐去除率不低于92％，优选93％，还优选大于94％，例如95％、96％、97％、98％，甚至99％。[贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法]
本发明提供贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，其中，贫营养优势好氧反硝化菌包括具有上述所定义的菌株。本发明的制备方法至少包括步骤 (1)-(3)，其中，在步骤(3)中，有机溶液为含有结构式为[C2H4O]n的水溶液，其质量体积比浓度为5-15g/mL，下标n表示聚合度，其质量体积比浓度优选为7-12g/mL，进一步优选为8-11g/mL。
本领域技术人员应理解，在上述步骤(1)-(3)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
实施例1
本实施例提供的技术路线如下：通过对水库沉积物进行梯度驯化，富集并筛选贫营养型好氧反硝化菌株，并制成脱氮菌剂用于微污染水源水修复。通过每3d降低10％的富集培养基浓度，直至降至20％选择培养基浓度，随后持续驯化一个月，取驯化后沉积物进行梯度稀释，划线接种到选择固体培养基上，挑取合适稀释梯度的单一菌落，反复进行划线重复3个周期，分离纯化筛选脱氮效果优势菌株。具体如下。
1.菌株筛选
表1-贫营养富集培养基
Figure BDA0003116031430000061
pH调节至7-7.5。
表2-微量元素溶液
Figure BDA0003116031430000071
表3-贫营养选择培养基
Figure BDA0003116031430000072
pH调节至7-7.5，选择性固体培养基则再加琼脂10g/L。
取200mL湖泊沉积物加入至装有500mL新鲜灭菌富集培养基的1L锥形瓶内，置于恒温振荡培养箱中，设置转速130r/min、温度30℃、控制溶解氧为7-9mg/L，初始碳源浓度为146.34mg/L，初始氮源浓度为16.47mg/L，每3d以10％的梯度降低培养基浓度，直至达到初始浓度的20％后，随后采用选择培养基进行恒定培养，使优势菌群适应贫营养的条件，以达到驯化目的。
驯化一个月后，取0.1m L沉积物加入0.9mL的灭菌水进行梯度稀释，稀释梯度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取以上稀释梯度的菌悬液0.1mL涂布于装有选择性固体培养基平板上，倒置放于恒温培养箱培养，设置温度30℃、转速130r/min。
待固体平板上长出菌落后，每天观察菌落形态，比较挑取长势良好的菌落于选择培养基中进行分离纯化，再将同一平板上长势良好的菌落挑取至选择培养基中，120r/min、30℃的摇床培养，每隔24h测量硝酸盐浓度，选取脱氮效果好的菌株。
经过筛选，得到一贫营养优势好氧反硝化菌，该菌落表面干燥光滑不透明，形态凸起，边缘整齐且无晕圈，颜色呈乳白色，有粘性，革兰氏染色结果为阴性。经过16srRNA比对，初步确定菌株YD725为食酸菌属(Acidovorax sp.)，将菌株YD725与同源性较高的食酸菌属进行系统发育分析(如图1所示)，该菌株Acidovorax sp.KR1_RH06有99.71％的相似性，因此命名为Acidovorax sp.strain YD725。菌株于2021年05月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2021536。
实施例2
本实施例提供根据实施例1的菌株制备的菌剂，主要技术路线如下：将丝瓜络置于高温的NaOH溶液浸泡，然后清洗去除NaOH溶液，干燥处理得到改性丝瓜络；将好氧反硝化菌在选择培养基培养，离心取菌沉淀用生理盐水稀释得到菌悬液；将PVA溶液与好氧反硝化菌菌悬液混合均匀，置于2％氯化钙的饱和硼酸溶液交联24h，用去离子水反复冲洗，制得好氧反硝化菌剂。本发明筛选并制作的贫营养型好氧反硝化菌，能解决低碳源微污染水源水的修复治理，解决现有技术中脱氮菌剂存在的易被流水冲走导致的脱氮效率低的技术缺陷。具体如下。
1.将丝瓜络剪成1cm×1cm×1cm的立方体，放置于4％的NaOH溶液中煮沸30min，然后用去离子水冲洗去除残留的NaOH溶液，然后放置于65℃烘箱中烘干6h至恒重，于干燥器中贮存得到改性丝瓜络。
2.称取10g PVA(聚乙烯醇)，加入90m去离子水均匀搅拌，浸泡过夜，将PVA溶液置于90℃的水浴锅中加热并不断搅拌至全部溶解，取出后放到室温下冷却至室温，将20mlPVA溶液与好氧反硝化细菌菌悬液(将稳定期的好氧反硝化细菌菌液1000mL在转速8000r/min离心10min，倾去上清液，用0.9％生理盐水定容至5mL)混合均匀。
3.将灭菌的丝瓜络放入混合液，待混合液充分进入丝瓜络的缝隙，用无菌镊子将浸满混合液的丝瓜络移至2％氯化钙的饱和硼酸溶液(称取40g 硼酸，加入20g氯化钙定容至1L)中，放置于4℃冰箱交联24h，将形成的丝瓜络块用无菌生理盐水充分冲洗后，转移到0.9％的生理盐水中，于 4℃冰箱中贮存备用。
4.实验结果
菌株脱氮效率结果如图2所示。
将制备好的菌剂用去离子水冲洗3遍，选取两颗菌剂加入到添加了 100ml选择培养基的250ml锥形瓶中，120r/min、30℃的摇床培养，分别在 0h、6h、12h、18h、24h用酚二磺酸光度法测定硝氮浓度。
硝氮浓度从初始硝氮浓度3.26mg/L降至24h的0.24mg/L，硝酸盐去除率达92.68％，好氧反硝化速率为0.1258mg·(L·h)，具有优秀的贫营养脱氮效果。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (6)

1.一种贫营养优势好氧反硝化菌剂，其特征在于，包括好氧反硝化细菌和用于固定所述好氧反硝化细菌的丝瓜络，并且所述菌剂在贫营养条件下，具有不低于92%的硝酸盐去除率，所述好氧反硝化细菌为食酸菌属(Acidovorax sp.)YD725菌株，菌株于2021年05月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2021536，其中所述丝瓜络为氢氧化钠改性丝瓜络，所述贫营养条件是指碳源浓度低于15 mg/L。
2.一种贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 提供贫营养优势好氧反硝化细菌，其中所述好氧反硝化细菌为食酸菌属(Acidovorax sp.)YD725菌株，菌株于2021年05月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2021536，其中所述贫营养是指碳源浓度低于15 mg/L；
(2) 提供氢氧化钠改性丝瓜络；
(3) 在有机溶液存在和适于固定化的条件下进行所述细菌与氢氧化钠改性丝瓜络的固定化，得到所述菌剂。
3.根据权利要求2所述的贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于，所述有机溶液为含有化学式为[C2H4O]n的水溶液，其质量体积比浓度为5-15g/mL。
4.根据权利要求2所述的贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于，所述适于固定化的条件是指将所述有机溶液和细菌菌悬液混合物在交联溶液存在下0-8℃下交联12-36h。
5.根据权利要求4所述的贫营养优势好氧反硝化菌剂的制备方法，其特征在于，所述交联溶液为1-10%的氯化钙的饱和硼酸溶液。
6.根据权利要求1所述的贫营养优势好氧反硝化菌剂在去除水体硝酸盐中的应用。
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