CN113368310A - 一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，可用于骨缺损修复领域。本发明以原位骨组织工程修复理念为核心，鲍鱼壳微粒作为一种天然无机功能粒子，丰富的钙物质可以作为骨无机质的钙源，同时其所含的蛋白、多糖以及微量元素等都可以为骨组织修复提供引导，聚己内酯是一种人工合成的可降解高分子材料，可塑性强、机械性能好，借助3D打印技术的便捷性，构建鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架，生物相容性良好，原料来源广泛，成本低廉，制备流程简单，操作便捷，有望成为一种新型的骨修复材料。

Description

一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法
技术领域
本发明属于复合材料领域，具体涉及一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架材料的制备方法。
背景技术
骨作为人体的硬组织，具有支持和保护身体，制造血细胞、储藏矿物质等作用，在机体的生命活动中承担着重要的职责。自然骨中无机成分约占70%，主要为羟基磷灰石，有机成分约占 20%~30%，主要为水、胶原蛋白、多糖以及其他蛋白质多糖的混合物。随着人口老龄化的进一步加快，以及车祸、疾病、感染等非自然原因导致骨组织受损的患者日益增多，高昂的治疗费用及病痛的折磨，给患者的日常生活带来极大的困扰。对于骨缺损的治疗，早在17世纪人们就开始摸索使用骨移植来治疗骨缺损，随着医疗技术水平的不断提高，以及研究人员的辛勤探索，骨移植已经衍生出了自体移植、异体移植治疗手段，但这些治疗方法都存在相应的缺陷，前者治疗中面临着供体不足的问题，后者面临免疫排斥、伦理道德的问题，进而限制了其在临床的大面积使用。
组织工程的出现为骨缺损的治疗提供的新的思路，主要研究内容分为以下三个方面：种子细胞、支架材料和细胞-支架复合物的构建，通过模拟机体内的微环境，设计与骨组织结构相类似的支架材料，将成骨细胞与支架材料在体外进行培养，提高移植物的生物活性，进而移植到体内促进骨修复。组织工程技术对骨缺损的治疗虽被广泛推崇，但受限于组织工程三要素的制约，过程复杂且细胞-支架复合物在体外培养时，所选用的培养基、pH值、细胞数量、细胞类型、活性因子的数量等多方面的影响。
在组织工程基础上，研究人员提出了“原位组织工程”这一新概念。利用外部支架材料诱导损伤部位进行自我修复，最终修复的组织与机体本身具有良好的相容性和适应性，原位组织工程依然遵循组织工程对支架材料的要求。有研究表明，人体骨组织中存在大量的内源性干细胞，这些干细胞可以被招募到骨损伤部位促进骨再生，骨髓间充质干细胞是最容易被招募的干细胞，且具有较强的成骨作用，骨组织受损时通过血管进入到损伤部位进行修复。在原位组织工程的研究过程中，研究者侧重于无细胞支架的设计，摆脱了细胞-支架复合物在体外培养的诸多限制，简化了流程，将具有骨组织基质微环境类似的生物活性支架植入骨缺损区域，刺激内源性干细胞归集至支架表面促进新骨的形成，该方法大大降低了由于植入外源性干细胞和生长因子而引起免疫排斥反应的潜在风险。
鲍鱼壳主要由碳酸钙和少量有机质构成，鲍鱼壳中含有丰富的氨基酸和矿物盐，矿物层的沉积在有机质调控下规则排列，与体内骨的形成基质相似，具有一定的骨诱导能力。还含有镁、铁、铜等微量元素，从外到内包括角质层、棱柱层和珍珠层三个部分，又名石决明，具有一定的药用价值，只有极少部分鲍鱼壳被作为药材使用，大量废弃鲍鱼壳无食用价值，贝类加工后的空壳被废弃在海岛、渔村、及城镇周边，不仅造成了自然资源的浪费，而且对环境也造成严重的二次污染。
聚己内酯是由ε-己内酯单体在催化剂的催化作用下合成的产品，属于人工合成的聚合物材料，具有一定韧性，生物相容性良好，可塑性强，在载药微球、支架材料等制备中应用颇多，其降解速率缓慢，适合作为长期植入的支架材料。
3D打印技术是集工程学、材料学、信息学等诸多学科于一身的科技成果，通过计算机建立数据模型，驱动打印喷头在空间喷出原料，层层堆积，形成多孔结构支架，原料通常为粉末状固体或溶液，具有快速、便捷、可控等特点。3D打印技术的出现突破了传统材料制备方法的局限性，可以对复杂结构组织进行打印。
本发明选用鲍鱼壳粉末、聚己内酯为原料，鲍鱼壳中矿物层沉积与人体骨的形成类似，丰富的钙物质可作为骨无机质的钙源，所含的蛋白、多糖以及微量元素等可诱导骨组织修复。聚己内酯具有良好的韧性和可加工性，以鲍鱼壳微粒作为无机质，提高支架的骨诱导能力，通过 3D打印技术制备微纳杂化骨修复支架，支架可为新生细胞提供支撑、黏附，加速骨的修复，进而更好的应用于骨移植、骨缺损等骨科疾病问题的治疗。
发明内容
本发明目的在于提供一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架材料及其制备方法，从资源再生利用的角度出发，以原位骨组织工程修复理念为核心，选取天然无机成分鲍鱼壳和人工合成可降解聚合物聚己内酯为主要原料，通过 3D打印技术实现有机/无机杂化，制备出生物相容性良好的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架，原料来源广泛，成本低廉，制备流程简单，操作便捷，安全无毒副作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架，利用天然鲍鱼壳粉末作为材料的无机基质，人工合成高分子聚己内酯作为材料的有机基质，通过3D打印技术快速成型，制备骨修复用鲍鱼壳粒子微纳杂化支架。
所述的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架材料的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将鲍鱼壳使用电锉刀将外层去除，仅留下内珍珠质层，后将内珍珠质层粉碎研磨，将得到的鲍鱼壳粉末经200目筛网过筛，即得鲍鱼壳微粒；
（2）将聚己内酯粉末和步骤（1）所得的鲍鱼壳微粒震动混合，使其混合均匀，即得支架原料粉体；
（3）使用SolidWorks软件设计三维多孔复合支架模型，将支架材料的关键数据导入软件系统，步骤（2）所得原料粉体加入3D打印机的原料仓，进行打印，即得鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架。
步骤（1）中所使用的鲍鱼壳为皱纹盘鲍、杂色鲍、褶鲍、澳洲鲍、羊鲍、耳鲍、白鲍的鲍鱼壳中的一种或几种。
步骤（2）中震动混合时间为30~90 min，使用时优选为60 min；聚己内酯粉末和鲍鱼壳粉末按照质量进行配比混合，两者之和为100%，聚己内酯粉末加入量为85 wt%~97wt%，鲍鱼壳粉末加入量为3 wt%~15 wt%。
步骤（3）中在进行支架制备之前，先使用聚己内酯粉末作为清洗剂，冲洗打印机的原料仓至打印针头之间的管道，以免影响样品的成分组成；后使用紫外灯进行灭菌30 min；支架的设计参数为：支架内部相邻两条打印线之间距离为200 μm，支架高度为2 mm，直径为5 mm；3D打印机的工作参数为：打印温度125 ℃，打印速度0.6 mm/s，挤出压力0.8 MPa，平台温度4 ℃，所用打印针头规格400 μm。
本发明鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架相对于其他骨修复材料方法有如下优点：
（1）采用聚己内酯和鲍鱼壳微粒作为主要原料，聚己内酯虽具有优良的生物相容性，但生物活性较低，聚己内酯表面的强疏水性对支架上的细胞生长和分化是不利的，鲍鱼壳粒子的掺杂可提高聚己内酯的生物活性，并且实现天然原料的循环利用，减轻环境负担，提升废弃资源的高附加值利用；
（2）以仿生思想和原位骨组织工程修复理念为指导，借助3D打印技术的便利性，打破了材料传统制备作方法的局限性，将机械性能良好的聚己内酯和鲍鱼壳微粒相交融，二者优势互补，克服了单一鲍鱼壳微粒支架材料不易成型、脆性大的缺点；
（3）鲍鱼壳中矿物层沉积与人体骨的形成类似，丰富的钙物质可作为骨无机质的钙源，所含的蛋白、多糖以及微量元素等可诱导骨组织修复；
（4）鲍鱼壳微粒均匀分布于支架，鲍鱼壳粒子的引入可提升支架的骨诱导能力和力学性能，为羟基磷灰石的形成提供形核位点，促进材料表面矿化；
（5）鲍鱼壳的多层结构受到有机质调控，类似于体内骨组织的形成机制，有机质中包含多种蛋白和多糖，如骨形态发生蛋白，在体内可以刺激骨髓细胞，促使骨组织生成；鲍鱼壳中所含的天然有机质有望为骨组织的再生起到调控作用，促进骨缺损修复；
（6）单一的聚己内酯支架力学性能较差，鲍鱼壳粒子的引入可以提升支架的力学性能，可通过调节鲍鱼壳粒子的含量，改善材料的力学性能；
（7）原料来源广，价格低，操作简便。
附图说明
图1是鲍鱼壳粒子微纳杂化支架的设计模型图示；
图2是实施例1、4所得的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架材料表面的SEM图（A1、B1放大50倍，A2、B2放大300倍）；
图3是实施例1、2、3、4所得的骨修复支架材料的FTIR图谱；
图4是实施例1、2、3、4所得的骨修复支架材料的XRD图；
图5是实施例1、2、3、4所得的骨修复支架材料的压缩强度；
图6是实施例1、2、3、4所得的骨修复支架材料浸提液与成骨细胞共培养后的细胞活力。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将鲍鱼壳使用电锉刀将外层去除，仅留下内珍珠质层，后将内珍珠质层粉碎研磨，将得到的鲍鱼壳粉末经200目筛网过筛，即得实验用鲍鱼壳粉；
（2）用触发式振动仪将鲍鱼壳粉和聚己内酯粉末震动混合60 min，至混合均匀，即得支架原料粉体，实验取1.5 g鲍鱼壳粉和8.5 g聚己内酯粉混合，确保混合后鲍鱼壳粉所占质量比为15 wt%，聚己内酯占比为85 wt%；
（3）原料仓中加入实验用聚己内酯粉末，启动打印机冲洗打印机的管道及打印针头；
（4）将支架的关键数据输入打印系统，支架原料粉体加入打印机原料仓，启动打印机，进行样品打印，即得成形支架。
实施例2
一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将鲍鱼壳使用电锉刀将外层去除，仅留下内珍珠质层，后将内珍珠质层粉碎研磨，将得到的鲍鱼壳粉末经200目筛网过筛，即得实验用鲍鱼壳粉；
（2）用触发式振动仪将鲍鱼壳粉和聚己内酯粉末震动混合60 min，至混合均匀，即得支架原料粉体，实验取0.5 g鲍鱼壳粉和9.5 g聚己内酯粉混合，确保混合后鲍鱼壳粉所占质量比为5 wt%，聚己内酯占比为95 wt%；
（3）原料仓中加入实验用聚己内酯粉末，启动打印机冲洗打印机的管道及打印针头；
（4）将支架的关键数据输入打印系统，支架原料粉体加入打印机原料仓，启动打印机，进行样品打印，即得成形支架。
实施例3
一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）将鲍鱼壳使用电锉刀将外层去除，仅留下内珍珠质层，后将内珍珠质层粉碎研磨，将得到的鲍鱼壳粉末经200目筛网过筛，即得实验用鲍鱼壳粉；
（2）用触发式振动仪将鲍鱼壳粉和聚己内酯粉末震动混合60 min，至混合均匀，即得支架原料粉体，实验取0.3 g鲍鱼壳粉和9.7 g聚己内酯粉混合，确保混合后鲍鱼壳粉所占质量比为3 wt%，聚己内酯占比为97 wt%；
（3）原料仓中加入实验用聚己内酯粉末，启动打印机冲洗打印机的管道及打印针头；
（4）将支架的关键数据输入打印系统，支架原料粉体加入打印机原料仓，启动打印机，进行样品打印，即得成形支架。
实施例4（不含鲍鱼壳粒子）
一种聚己内酯骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
（1）原料仓中加入实验用聚己内酯粉末，启动打印机冲洗打印机的管道及打印针头；
（2）将支架的关键数据输入打印系统，将聚己内酯粉末加入打印机原料仓，启动打印机，进行样品打印，制备不含鲍鱼壳的支架材料。
图2为支架的微观形貌，打印的支架具有相对均匀的孔间距，在高倍数下观察可以发现，与实施例4单一的聚己内酯支架相比，鲍鱼壳粒子的引入使材料表面的粗糙度增加，且伴有裸露的鲍鱼壳粒子。
图3为支架的红外光谱图，图中2943 cm-1和2865 cm-1处为C-H的伸缩振动吸收峰，1721 cm-1处为C=O的伸缩振动吸收峰，1293 cm-1和1163 cm-1处为C-O-C的伸缩振动吸收峰，这些特征吸收峰都是PCL中官能团所产生。此外，由于鲍鱼壳粒子的引入，在实施例1中863cm-1出现了CO3 2-的吸收峰，由于掺杂量较少，吸收峰强度较弱，表明鲍鱼壳粒子与聚己内酯分子间没有发生化学反应或产生其他分子间作用力。
图4为支架的XRD图谱，从图中可以明显看到聚己内酯和鲍鱼壳的特征吸收峰，相比于实施例4聚己内酯支架，实施例1、2、3复合支架的图谱中聚己内酯的峰强度有明显下降，但未影响材料的晶型，且随着掺杂量的不同有递减趋势，主要是因为鲍鱼壳粒子的掺杂对聚己内酯结晶区密度起到稀释作用，降低了聚己内酯的结晶度，从而导致峰强度有所差异，表明鲍鱼壳粒子已经成功引入到复合支架中，材料的性质及晶型并未发生本质变化。
图5为支架的压缩强度，可以发现鲍鱼壳粒子的适量引入可提升聚己内酯的力学性能，掺杂量过高时，由于鲍鱼壳粒子无机质含量高，刚性较大，不能分担应力，在支架中易造成应力集中现象，使材料的力学性能降低，可通过调节鲍鱼壳粒子的掺杂量来调节材料的力学性能。
图6为成骨细胞与支架浸提液共培养后的细胞活力，由图可知，鲍鱼壳粒子的引入并未产生细胞毒性，支架的生物相容性良好，此外，鲍鱼壳中有机质以及微量金属元素的释放可以促进成骨细胞增殖，具备一定的骨诱导能力，成骨细胞的活力随着鲍鱼壳粒子掺杂量的提高而提高。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，其特征在于：利用天然鲍鱼壳粉末作为材料的无机基质，人工合成高分子聚己内酯作为材料的有机基质，结合3D打印技术快速成型，制备鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架。
2.根据权利要求1所述的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使用电锉刀将鲍鱼壳外层去除，仅留下内珍珠质层，后将内珍珠质层粉碎研磨，将得到的鲍鱼壳粉末经200目筛网过筛，即得鲍鱼壳微粒；
（2）将聚己内酯粉末和步骤（1）所得的鲍鱼壳微粒震动混合，使其混合均匀，即得支架原料粉体；
（3）使用Solidworks软件设计三维多孔复合支架模型，将支架材料的关键数据导入软件系统，步骤（2）所得原料粉体加入3D打印机的原料仓，进行打印，即得鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架。
3.根据权利要求2所述的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所使用的鲍鱼壳为皱纹盘鲍、杂色鲍、褶鲍、澳洲鲍、羊鲍、耳鲍、白鲍的鲍鱼壳中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤（2）中震动混合时间为30~90 min；聚己内酯粉末和鲍鱼壳粉末按照质量进行配比混合，聚己内酯粉末加入量为85 wt%~97 wt%，鲍鱼壳粉末加入量为3 wt%~15 wt%，两者之和为100%。
5.根据权利要求2所述的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，其特征在于：步骤（3）中在进行支架制备之前，先使用聚己内酯粉末作为清洗剂，冲洗打印机的原料仓至打印针头之间的管道，以免影响样品的成分组成，后使用紫外灯进行灭菌30 min。
6.根据权利要求2所述的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，其特征在于：支架的设计参数为：支架内部相邻两条打印线之间距离为200 μm，支架高度为2 mm，直径为5mm。
7.根据权利要求2所述的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架的制备方法，其特征在于：3D打印机的工作参数为：打印温度125℃，打印速度0.6 mm/s，挤出压力0.8 MPa，平台温度4℃，所用打印针头规格400 μm。
8.一种如权利要求1-7任一项所述方法制备的鲍鱼壳粒子微纳杂化骨修复支架在骨修复领域的应用。
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