CN113368241A - 一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用 - Google Patents

一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113368241A
CN113368241A CN202110534100.2A CN202110534100A CN113368241A CN 113368241 A CN113368241 A CN 113368241A CN 202110534100 A CN202110534100 A CN 202110534100A CN 113368241 A CN113368241 A CN 113368241A
Authority
CN
China
Prior art keywords
3clpro
inhibitor
coronavirus
protease
main protease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110534100.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113368241B (zh
Inventor
李华
陈丽霞
孙德娟
张玉杰
苗燕涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenyang Pharmaceutical University
Original Assignee
Shenyang Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenyang Pharmaceutical University filed Critical Shenyang Pharmaceutical University
Priority to CN202110534100.2A priority Critical patent/CN113368241B/zh
Publication of CN113368241A publication Critical patent/CN113368241A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113368241B publication Critical patent/CN113368241B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/305—Mercury compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/63—Compounds containing para-N-benzenesulfonyl-N-groups, e.g. sulfanilamide, p-nitrobenzenesulfonyl hydrazide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，及其在制备抗病毒药物中的应用。抑制剂含具有抗炎作用的药物、天然产物中的一种或几种。所述冠状病毒蛋白酶3CLpro抑制剂，在制备抗冠状病毒药物中的应用。所述的病毒为含有病毒蛋白酶3CLpro的病毒，所述的冠状病毒包括如新型冠状病毒。本发明能有效地抑制疗冠状病毒蛋白酶3CLpro，可以用于制备抗病毒药物，可根据临床需要选择不同的给药方式或者剂型。

Description

一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，及其在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
冠状病毒主蛋白酶3CLpro也被称为3C-like protease(3CLpro)，因为其切割位点的特异性与微小RNA病毒(picornavirus)的3C蛋白酶(3C protease)很相似，两者并称为3CLpro。3CLpro能够处理病毒中的多聚蛋白，病毒RNA在进入人类细胞后最初被翻译成为多聚蛋白。3CLpro蛋白酶可从多聚蛋白中切割出12个更小的蛋白，而这些蛋白质将会参与病毒RNA的复制。由于3CLpro作为一个重要的蛋白酶，在抑制病毒复制的过程中起到了至关重要的作用且人体内没有同源蛋白，故3CLpro主蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点，此外，3CLpro在β冠状病毒中保守性高，筛选出的3CLpro抑制剂具有一定程度的广谱抗冠状病毒能力。目前还没有发现具有疗效好、特异性高的小分子冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，及其在制备抗病毒药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：抑制剂含具有抗炎作用的药物、天然产物中的一种或几种。
所述抑制剂含拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔分中的一种或几种。
所述的拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔分别为如下结构所示的药物：
Figure BDA0003069118170000021
其中：R1为H或CH3；R2为H，OCH3，OCH2OCH3或O-C-F3；R3为H，CH3或OCH3；R4为H，OCH3，OCHF2或吡咯环；
所述拉唑类药物为艾普拉唑、埃索美拉唑、奥美拉唑、雷贝拉唑钠、兰索拉唑或泮托拉唑，具体结构式为：
Figure BDA0003069118170000022
所述抑制剂含从姜科姜黄属植物、龙胆科獐芽菜属植物、爵床科穿心莲属植物、毛茛科翠雀属植物、马鞭草科牡荆属植物中提取出的化合物及其异构体或白皮杉醇或茶黄素。
所述从姜科姜黄属植物蓬莪术中提取出来的二苯庚烯类化合物如结构式(I)所示化合物或其异构体；
Figure BDA0003069118170000031
其中，R1和R3可相同或不同的选自H或OCH3；R2，R4和R5可相同或不同的选自H或OH；
从龙胆科獐芽菜属植物瘤毛獐牙菜或茄科假酸浆属植物假酸浆中提取出来的苯并色原酮类化合物如结构式(II)所示化合物或其异构体
Figure BDA0003069118170000032
其中：R1为H，D-葡萄糖或OH；R2，R3和R5可相同或不同的选自H或OH；R4为H，OCH3或OH；
从爵床科穿心莲属植物穿心莲或毛茛科翠雀属植物翠雀中提取，或者通过穿心莲内酯为基本母核合成得到的二萜类化合物，n大于等于1，如结构式(III)所示化合物或其异构体：
Figure BDA0003069118170000033
其中，R1为H，(CH2)nOH，CH3，酰胺或
Figure BDA0003069118170000034
R2为H，OH或
Figure BDA0003069118170000035
R3为H或OH；
从马鞭草科牡荆属植物蔓荆子中提取出来的黄酮类化合物，如结构式(IV)、(V)所示化合物或其异构体
Figure BDA0003069118170000036
其中，R1为H，OH，D-葡萄糖，L-鼠李糖，芸香糖或
Figure BDA0003069118170000041
R2，R3和R5各自独立地为H或OH；R4为H，OH或OCH3；R6为H，OH，D-葡萄糖，L-鼠李糖或芸香糖；
白皮杉醇结构式为(VI)，茶黄素结构式为(VII)，
Figure BDA0003069118170000042
所述天然产物为如下化合物1～16中任一种或该化合物的异构体；
Figure BDA0003069118170000043
Figure BDA0003069118170000051
Figure BDA0003069118170000061
所述抑制剂在制备靶向冠状病毒主蛋白酶3CLpro的抗病毒药物中的应用。
所述的含有冠状病毒蛋白酶3CLpro的病毒包括：多种冠状病毒，如新型冠状病毒、SARS病毒、MERS病毒等。
所述抗病毒药物含所述抑制剂和药学上可接受的载体。
所述的抗病毒药物的剂型为口服剂型、注射剂型和外用剂型。
所述的在药学上可接受的载体为适用于制成口服、注射、吸入、粘膜给药剂型的载体。给药方式可根据临床需要选择口服、注射或者局部外用，根据给药途径的选择相应的药物剂型，口服剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、微丸剂、微片剂、含片，注射剂型包括粉针剂、注射液、脂质体微球注射液，外用剂包括溶液、混悬液、乳剂等。
本发明技术方案的有益效果及特点：
本发明针对冠状病毒主要蛋白酶3CLpro的抑制剂为天然产物或对该蛋白酶具有抑制性的药物。本发明抑制剂能有效地抑制疗冠状病毒蛋白酶3CLpro，可以用于制备抗病毒药物；可根据临床需要选择不同的给药方式或者剂型。
本发明获得具有抗炎作用的药物以及天然产物，如拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔以及天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro，具有较强的结合亲和力并且直接抑制冠状病毒主蛋白酶3CLpro的酶活性。并且基于酶活性评价体系和MST结合力测定试验可见上述药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro具有较强的结合亲和力并且直接抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro的酶活性，可以作为冠状病毒蛋白酶3CLpro的抑制剂并用于抗病毒药物的制备。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的重组冠状病毒蛋白酶3CLpro的体外酶促表征和酶抑制试验。
(A)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的底物饱和曲线。
(B)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的EC50测定曲线。
(C)拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔对冠状病毒蛋白酶3CLpro抑制活性的量效曲线。
图2为本发明实施例2提供的MST方法测定拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro之间的结合亲和力。
图3为本发明实施例3提供的重组冠状病毒蛋白酶3CLpro的体外酶促表征和酶抑制试验。
(A)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的底物饱和曲线。
(B)冠状病毒主蛋白酶3CLpro的EC50测定曲线。
(C)天然产物对冠状病毒蛋白酶3CLpro抑制活性的量效曲线。
图4为本发明实施例4提供的MST方法测定天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro之间的结合亲和力。
具体实施方式
通过结合以下实施例对本发明作进一步阐释，同时便于本领域技术人员深入理解对使用到的实验方法与核心思想作较为详尽的描述。
下述酶活性评价试验是在50mM Tris-HCl(pH7.3)，1mM EDTA条件下进行的，首先用一定浓度的DMSO配制一系列浓度的待检测药物溶液，将3CLpro蛋白溶液稀释到所需浓度，底物(MCA-AVLQSGFR(Dnp)-Lys-NH2)溶于水中，配制成浓度为22μM的溶液，需要注意的是底物溶液需要现用现配。药物与3CLpro蛋白于室温下反应1小时，利用酶标仪进行荧光检测。检测时先加入底物溶液，后加入药物与3CLpro蛋白反应后的混合溶液，启动程序进行检测。检测结果利用GraphPad Prism 7.0软件进行分析，拟合回归曲线得到IC50值，IC50数值越小，表示该药物对3CLpro蛋白的抑制作用越强。
MST结合力测定试验是利用Nano Temper完成，在50mM Hepes(pH7.3)和1mM EDTA条件下进行，首先用一定浓度的DMSO配制一系列不同浓度的待检测药物溶液，用buffer将3CLpro蛋白稀释到所需浓度，加入染料后于暗处染色30min，完成后用空间排阻柱对3CLpro蛋白进行分离，收集分离后蛋白，并用Nano Temper对其进行检测，得到荧光吸收较好的3CLpro蛋白，该3CLpro蛋白与药物室温反应10min，再次利用Nano Temper进行检测，检测结果利用分析软件MO.AffinityAnalysis_x86进行处理，导入微量热泳动曲线，拟合出平衡解离常数Kd值。Kd值越小，表示药物和3CLpro蛋白的结和力越强。
基于酶活性评价体系以及靶向性验证，拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔能够靶向性的抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro活性。
实施例1
酶活性评价体系确定拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔靶向抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro活性
一、冠状病毒蛋白酶3CLpro的蛋白表达纯化；
冠状病毒蛋白酶3CLpro(NCBI ID 43740578)的表达和纯化的详细步骤参考本领域公开的文献记载方法(DOI：10.1126/science.1085658)。将编码冠状病毒蛋白酶3CLpro氨基酸3264-3569的基因序列，克隆到带有N端分泌信号肽和C端His标签的pGEX-6p-1载体中。将表达质粒转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)Condon Plus中，均匀涂布于带有氨苄抗性的固体平板上，37℃培养过夜。利用菌斑先培养少量细菌，而后进行大量培养，培养前加入相应抗生素，37℃培养4小时后，加IPTG，并于18℃下诱导表达16小时。在4100rpm/min下离心10min收集沉淀下来的细菌。利用lysis buffer(20mM Tris-HClPH8.0，300mM NaCl)重悬菌体，进行破碎。破碎后离心21500rpm/min，30min。取上清，其中加入终浓度为10mM咪唑，利用Ni-NTA琼脂糖亲和色谱进行纯化。上清液过后，wash buffer(bufferA)洗杂10ml(20mM Tris-HCl PH8.0，300mM NaCl,10mM咪唑)，用wash buffer(bufferA)将Ni-NTA重悬起来，加入3C酶后定容至10ml，进行柱上酶切过夜。酶切后的上清溶液通过Ni-NTA琼脂糖亲和色谱法继续纯化。Wash buffer(bufferA)洗脱10ml(20mM Tris-HCl PH8.0，300mM NaCl,10mM咪唑)，Elution buffer(bufferB)洗脱10ml(20mM Tris-HCl PH8.0，300mM NaCl,150mM咪唑)，将流穿液和Wash buffer(bufferA)收集起来进行浓缩，然后进行分子筛纯化(50mMTris-Hcl pH7.3,1mM EDTA)分离得到冠状病毒主蛋白酶3CLpro。经过上述分离纯化过程，最终得到均一性好、纯度高的3CLpro蛋白。
二、酶活性体系评价拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔靶向抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro；
酶抑制活性是通过连续动力学分析来测定拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔对冠状病毒蛋白酶3CLpro的抑制活性。底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(GL Biochem)，分别使用320nm和405nm的激发和发射波长进行测定。将上述所得3CLpro蛋白用50mMTris-Hcl pH7.3，1mM EDTA稀释至148nM，同时对所筛选化合物设置不同浓度梯度，设有浓度10个，数值依次为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.563μM、0.7810μM、0、3906μM、0.1953μM，3CLpro蛋白与上述各不同浓度的药物分别于20℃孵育1小时。孵育完成后立即与底物(22μM)混合，进行酶活性测定，其测定结果如表1所示。
使用BioTEK Synergy H1酶标仪在室温下，检测0-100μM不同浓度下MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2释放的荧光团的量及随时间增加的相对荧光强度升高速率(RFU/min)(图1A和1B)。由图1A初始速率Vi(ΔRFU/min中)与不同浓度的荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2的关系，通过关系数据拟合到伪一阶速率曲线来确定Vmax和Km，从而得出计算值和最佳拟合曲线，即Km＝27.24μM，Vmax＝23.55FRU/min，相应的最佳拟合曲线如图1-A所示。图1B通过曲线来确定冠状病毒主蛋白酶3CLpro最适反应浓度。将数据导入GraphPad Prism 5.01拟合回归方程计算IC50值，所述的回归是IC50＝Ki*(1+[S]/Km)，其中Ki代表初始反应速率，[S]代表底物浓度。
由上述获得回归方程计算获得各待测药物的酶活性结果如表1和图1C所示。
表1所测试药物对3CLpro蛋白的IC50值
Figure BDA0003069118170000091
由图1C中各药物抑制活性的量效曲线以及计算获得IC50值，通过数值表明拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔可以显著抑制3CLpro重组蛋白的酶活性。
实施例2
由上述实施例确定具有显著抑制3CLpro重组蛋白酶活性的药物，再进一步对其与冠状病毒蛋白酶3CLpro的结合亲和力进行检测，以表1中记载拉唑类药物为例，具体为：
1、冠状病毒蛋白酶3CLpro表达和纯化
方法同实施例1冠状病毒蛋白酶3CLpro表达和纯化。
2、微量热泳动法测定拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro的结合亲和力
微型热泳(MST)是一种基于荧光检测和热泳的技术，用于检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-小分子的相互作用。为了进一步验证酶活性测定的结果，使用MST方法评估拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro之间的结合亲和力(参见表2和图2)。
表2所测试药物与3CLpro的结合解离常数(Kd)
Figure BDA0003069118170000101
由上述表2和图2分析得各拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro的结合解离常数(Kd)，由结合解离常数(Kd)表明拉唑类药物与冠状病毒蛋白酶3CLpro具有很强的结合亲和力。
基于酶活性评价体系以及靶向性验证，天然产物能够靶向性的抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro活性。
实施例3
酶活性评价体系确定天然产物靶向抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro活性
一、冠状病毒蛋白酶3CLpro的蛋白表达纯化
冠状病毒蛋白酶3CLpro(NCBI ID 43740578)的表达和纯化的详细步骤参考本领域公开的文献记载的方法(DOI：10.1126/science.1085658)。将编码冠状病毒蛋白酶3CLpro氨基酸3264-3569的基因序列，克隆到带有N端分泌信号肽和C端His标签的pGEX-6p-1载体中。将表达质粒转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)Condon Plus中，均匀涂布于带有氨苄抗性的固体平板上，37℃培养过夜。利用菌斑先培养少量细菌，而后进行大量培养，培养前加入相应抗生素，37℃培养4小时后，加IPTG，并于18℃下诱导表达16小时。在4100rpm/min下离心10min收集沉淀下来的细菌。利用lysis buffer(20mMTris-HCl PH8.0，300mM NaCl)重悬菌体，进行破碎。破碎后离心21500rpm/min，30min。取上清，其中加入终浓度为10mM咪唑，利用Ni-NTA琼脂糖亲和色谱进行纯化。上清液过后，wash buffer(bufferA)洗杂10ml(20mMTris-HCl PH8.0，300mM NaCl,10mM咪唑)，用wash buffer(bufferA)将Ni-NTA重悬起来，加入3C酶后定容至10ml，进行柱上酶切过夜。酶切后的上清溶液通过Ni-NTA琼脂糖亲和色谱法继续纯化。Wash buffer(bufferA)洗脱10ml(20mMTris-HCl PH8.0，300mM NaCl,10mM咪唑)，Elution buffer(bufferB)洗脱10ml(20mMTris-HCl PH8.0，300mMNaCl，150mM咪唑)，将流穿液和Wash buffer(bufferA)收集起来进行浓缩，然后进行分子筛纯化(50mMTris-HCl PH7.3,1mM EDTA)分离得到冠状病毒主蛋白酶3CLpro。经过上述分离纯化过程，最终得到了均一性好、纯度高的3CLpro蛋白。
二、酶活性体系评价天然产物靶向抑制冠状病毒蛋白酶3CLpro
酶抑制活性是通过连续动力学分析来测定天然产物对冠状病毒蛋白酶3CLpro的抑制活性。底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(GL Biochem)，分别使用320nm和405nm的激发和发射波长进行测定。将所得3CLpro蛋白用50mMTris-Hcl PH7.3,1mM EDTA稀释至148nM，同时对所筛选天然产物设置不同浓度梯度，设有浓度10个，数值依次为100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.563μM、0.7810μM、0、3906μM、0.1953μM，而后将蛋白与上述设置不同浓度的各天然产物分别于20℃孵育1小时。孵育完成后立即与底物(22μM)混合，进行酶活性测定，其测定结果如表3所示。
使用BioTEK Synergy H1酶标仪在室温下，检测0-100μM不同浓度下MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2释放的荧光团的量及随时间增加的相对荧光强度升高速率(RFU/min)(图3A和3B)。
由图3A具体体现初始速率Vi(ΔRFU/min中)与不同浓度的荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2的关系，通过将实验数据拟合到伪一阶速率曲线来确定Vmax和Km，从而得出计算值和最佳拟合曲线，即Km＝27.24μM，Vmax＝23.55FRU/min，相应的最佳拟合曲线如图1-A所示。图1B通过曲线来确定冠状病毒主蛋白酶3CLpro最适反应浓度。将数据导入GraphPad Prism 5.01拟合回归方程计算IC50值，所述回归方程为IC50＝Ki*(1+[S]/Km)，其中Ki代表初始反应速率，[S]代表底物浓度。
由上述获得回归方程计算获得各待测药物的酶活性，如表3和图3C所示。。
表3天然产物对3CLpro蛋白的IC50值
Figure BDA0003069118170000121
由图3C中各药物抑制活性的量效曲线以及计算获得IC50值，通过数值表明这几种天然产物可以显著抑制3CLpro重组蛋白的酶活性。
实施例4
由上述实施例3获得具有显著抑制3CLpro重组蛋白的酶活性的天然物质再进一步对其与冠状病毒蛋白酶3CLpro的结合亲和力进行检测，以表3中记载天然产物为例，具体为：
1、冠状病毒蛋白酶3CLpro表达和纯化
方法同实施例1冠状病毒蛋白酶3CLpro表达和纯化。
2、微量热泳动法测定天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro的结合亲和力
微型热泳(MST)是一种基于荧光检测和热泳的技术，用于检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-小分子的相互作用。为了进一步验证酶活性测定的结果，使用MST方法评估天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro之间的结合亲和力(参见图4和表4)。
表4天然产物与3CLpro的结合解离常数(Kd)
Figure BDA0003069118170000122
由图4和表4分析得到了天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro的结合解离常数(Kd)，表明这几种天然产物与冠状病毒蛋白酶3CLpro具有很强的结合亲和力。
进而本发明所获得药物以及天然产物能有效地抑制疗冠状病毒蛋白酶3CLpro，可以用于制备抗病毒药物，可根据临床需要选择不同的给药方式或者剂型。

Claims (9)

1.一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：抑制剂含具有抗炎作用的药物、天然产物中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：所述抑制剂含拉唑类药物、磺胺嘧啶银、金诺芬、硫柳汞和布罗波尔分中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：所述拉唑类药物为艾普拉唑、埃索美拉唑、奥美拉唑、雷贝拉唑钠、兰索拉唑或泮托拉唑。
4.根据权利要求1所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：所述抑制剂含从姜科姜黄属植物、龙胆科獐芽菜属植物、爵床科穿心莲属植物、毛茛科翠雀属植物、马鞭草科牡荆属植物中提取出的化合物及其异构体或白皮杉醇或茶黄素。
5.根据权利要求4所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：所述从姜科姜黄属植物蓬莪术中提取出来的二苯庚烯类化合物如结构式(I)所示化合物或其异构体；
Figure FDA0003069118160000011
其中，R1和R3可相同或不同的选自H或OCH3；R2，R4和R5可相同或不同的选自H或OH；
从龙胆科獐芽菜属植物瘤毛獐牙菜或茄科假酸浆属植物假酸浆中提取出来的苯并色原酮类化合物如结构式(II)所示化合物或其异构体
Figure FDA0003069118160000012
其中：R1为H，D-葡萄糖或OH；R2，R3和R5可相同或不同的选自H或OH；R4为H，OCH3或OH；
从爵床科穿心莲属植物穿心莲或毛茛科翠雀属植物翠雀中提取，或者通过穿心莲内酯为基本母核合成得到的二萜类化合物，n大于等于1，如结构式(III)所示化合物或其异构体：
Figure FDA0003069118160000021
其中，R1为H，(CH2)nOH，CH3，酰胺或
Figure FDA0003069118160000022
R2为H，OH或
Figure FDA0003069118160000023
R3为H或OH；
从马鞭草科牡荆属植物蔓荆子中提取出来的黄酮类化合物，如结构式(IV)、(V)所示化合物或其异构体
Figure FDA0003069118160000024
其中，R1为H，OH，D-葡萄糖，L-鼠李糖，芸香糖或
Figure FDA0003069118160000025
R2，R3和R5各自独立地为H或OH；R4为H，OH或OCH3；R6为H，OH，D-葡萄糖，L-鼠李糖或芸香糖；
白皮杉醇结构式为(VI)，茶黄素结构式为(VII)，
Figure FDA0003069118160000026
6.根据权利要求5所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂，其特征在于：所述天然产物为如下化合物1～16中任一种或该化合物的异构体；
Figure FDA0003069118160000031
Figure FDA0003069118160000041
7.根据权利要求1-6任意一项所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂的应用，其特征在于：所述抑制剂在制备靶向冠状病毒主蛋白酶3CLpro的抗病毒药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂的应用，其特征在于：所述的抗病毒药物含权利要求1-6任意一项抑制剂和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求7所述的冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂的应用，其特征在于：所述的抗病毒药物的剂型为口服剂型、注射剂型和外用剂型。
CN202110534100.2A 2021-05-17 2021-05-17 一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用 Active CN113368241B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110534100.2A CN113368241B (zh) 2021-05-17 2021-05-17 一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110534100.2A CN113368241B (zh) 2021-05-17 2021-05-17 一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113368241A true CN113368241A (zh) 2021-09-10
CN113368241B CN113368241B (zh) 2022-11-08

Family

ID=77571191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110534100.2A Active CN113368241B (zh) 2021-05-17 2021-05-17 一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113368241B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114306317A (zh) * 2021-12-22 2022-04-12 复旦大学 野黄芩素甲基化衍生物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物中的应用
CN116236580A (zh) * 2020-02-21 2023-06-09 中国科学院上海药物研究所 金诺芬等老药及其组合物在抗单正链rna病毒中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.DU,ET AL: "Epigallocatechin-3-gallate, an active ingredient of Traditional Chinese Medicines, inhibits the 3CLpro activity of SARS-CoV-2", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》 *
B.J.OSO,ET AL: "Pharmacoinformatics and hypothetical studies on allicin, curcumin, and gingerol as potential candidates against COVID-19-associated proteases", 《JOURNAL OF BIOMOLECULAR STRUCTURE AND DYNAMICS》 *
BOJKOVA D，ET AL: "SAＲS-CoV-2 and SAＲS-CoV differ in their cell tropism and drug sensitivity profiles", 《BIOＲXIV》 *
JANG,ET AL: "Tea Polyphenols EGCG and Theaflavin Inhibit the Activity of SARS-CoV-2 3CL-Protease In Vitro", 《EVIDENCE-BASED COMPLEMENTARY AND ALTERNATIVE MEDICINE》 *
NI WJ,ET AL: "Study on the mechanism of active components of Liupao tea on 3CL(pro) based on HPLC-DAD fingerprint and molecular docking technique", 《JOURNAL OF FOOD BIOCHEMISTRY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116236580A (zh) * 2020-02-21 2023-06-09 中国科学院上海药物研究所 金诺芬等老药及其组合物在抗单正链rna病毒中的应用
CN116236580B (zh) * 2020-02-21 2024-05-24 中国科学院上海药物研究所 金诺芬等老药及其组合物在抗单正链rna病毒中的应用
CN114306317A (zh) * 2021-12-22 2022-04-12 复旦大学 野黄芩素甲基化衍生物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物中的应用
CN114306317B (zh) * 2021-12-22 2023-06-06 复旦大学 野黄芩素甲基化衍生物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113368241B (zh) 2022-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113368241B (zh) 一种冠状病毒主蛋白酶3CLpro抑制剂及其应用
Ozden et al. Inhibition of Chikungunya virus infection in cultured human muscle cells by furin inhibitors: impairment of the maturation of the E2 surface glycoprotein
Blond et al. The cyclic structure of microcin J25, a 21‐residue peptide antibiotic from Escherichia coli
ElAntak et al. The indispensable N-terminal half of eIF3j/HCR1 cooperates with its structurally conserved binding partner eIF3b/PRT1-RRM and with eIF1A in stringent AUG selection
Xie et al. Identification of a signalling molecule involved in bacterial intergeneric communication
Craven et al. Super-silent FRET sensor enables live cell imaging and flow cytometric stratification of intracellular serine protease activity in neutrophils
Minuesa et al. A 1536-well fluorescence polarization assay to screen for modulators of the MUSASHI family of RNA-binding proteins
Wu et al. In vivo antiviral activity and disassembly mechanism of novel 1-phenyl-5-amine-4-pyrazole thioether derivatives against Tobacco mosaic virus
WO2021068910A1 (zh) 一种抗肿瘤药物的筛选靶点、应用及筛选方法
Liu et al. Discovery of Camellia sinensis catechins as SARS-CoV-2 3CL protease inhibitors through molecular docking, intra and extra cellular assays
Poreba et al. Potent and selective caspase-2 inhibitor prevents MDM-2 cleavage in reversine-treated colon cancer cells
CN104293794A (zh) 一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子及其应用
Heltweg et al. A microplate reader-based nonisotopic histone deacetylase activity assay
Kusov et al. Membrane association and RNA binding of recombinant hepatitis A virus protein 2C
CN113599536A (zh) 阻断冠状病毒感染靶细胞的纳米颗粒-rhACE-2复合物、制备方法及其应用
Wang et al. Novel inhibitors of plasminogen activator inhibitor-1: development of new templates from diketopiperazines
Santoro et al. New Aβ (1–42) ligands from anti-amyloid antibodies: Design, synthesis, and structural interaction
Buzder-Lantos et al. Substrate based peptide aldehyde inhibits bacterial type I signal peptidase
Qiao et al. Preparation and characterization of nanobodies targeting SARS-CoV-2 papain-like protease
CN114306339A (zh) 3CLpro蛋白酶抑制剂及其抗病毒应用
Li et al. A bicyclic pentapeptide-based highly potent and selective pan-SIRT1/2/3 inhibitor harboring Nε-thioacetyl-lysine
EP2487183A1 (en) Ubiquitin-isopeptide probes
Hamissa et al. Total synthesis of inubosin B
Deutschmann-Olek et al. Defining substrate selection by rhinoviral 2A proteinase through its crystal structure with the inhibitor zVAM. fmk
AU2014252354A1 (en) Potent inhibitors of human matriptase derived from McotI-II variants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant