CN113365562A - 设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活检设备，该活检设备包括尖端构件，尖端构件具有用于活检程序的面向后面的切割部分。活检程序包括将设备引入并操纵到受试者的组织中并获得活检样品。活检设备包括细长柔性杆构件，该杆构件具有限定第一纵轴的近端和远端，以及具有限定第二纵轴的近端和远端的尖端构件。尖端构件位于或朝向细长构件的远端并且定位或可定位成使得尖端构件的纵轴相对于细长构件的纵轴成角度地偏移。尖端构件的远端还被配置为穿透受试者的组织并且尖端构件的近端包括用于切割受试者的组织的切割部分。

Description

设备

本发明涉及一种活检设备，所述活检设备包括具有用于活检程序的面向后面的切割部分的尖端构件。活检程序包括将设备引入并操纵到受试者的组织中并获得活检样品。

心内膜心肌活检是一种成熟的诊断方式，主要用于移植后排斥监测，但也用于各种心脏病，如心肌病、传染病和肿瘤疾病。难以诊断的活检率被描述为过低，部分原因是该程序固有的风险和低诊断率。与其他现代亚毫米尺寸的血管内介入设备相比，心内膜心肌活检钳是相对较大的设备，这使得它们具有创伤性并且难以转向心脏的所有部分以及身体的其他部分(如果需要进行活检)。因此，在当前实践中，由于这些设备的固有特性，心内膜心肌活检仅限于心脏的某些部分。

因此，活检通常仅限于右心室的间隔壁，其心肌可能不能代表左心室(LV)，而左心室(LV)存在许多难以诊断的病理。本发明涉及一种设备，该设备可以制造成更小、更可操纵的活检钳，可以更容易并且更安全地进入LV心肌的大部分部分以及身体的其他部分，从而使活检具有更高的诊断率并提高整体安全性。

本发明的另一个目的是提供一种改进的活检设备，该活检设备能够从心脏的任何部分获得更小和更均匀的组织样品，同时对被取样的受试者的组织造成最小的损伤。该设备可用于任何活检程序，而不仅仅是用于从心脏获得活检样品。例如，该设备还适用于通过推进该设备穿过患者的血管内系统或患者的支气管内系统来从肺肿瘤获得活检样品。

具体实施方式

根据本发明，提供一种活检设备，所述活检设备包括：

具有限定第一纵轴的近端和远端的细长柔性杆构件；和

具有限定第二纵轴的近端和远端的尖端构件，所述尖端构件位于或朝向细长杆构件的远端并且定位或可定位成使得尖端构件的纵轴相对于细长杆构件的纵轴成角度地偏移，其中尖端构件的远端被配置为穿透受试者的组织，并且尖端构件的近端包括用于切割受试者的组织的切割部分。

根据本发明的另一方面，提供一种成套部件，所述成套部件包括一次性使用的无菌预包装成套部件形式的如上定义的活检设备。

根据本发明的另一方面，提供一种使用如上定义的设备从受试者获得活检的方法，其中该方法包括：

将如上定义的设备递送到身体位置；

将设备的尖端构件的远端推进到组织中，使得整个尖端构件推进到组织中；和

从组织中取出尖端构件。

根据本发明的另一方面，提供如上定义的活检设备用于从受试者获得活检的用途。

根据本发明的另一方面，提供一种制造根据本发明的设备的方法。

根据本发明的另一方面，提供一种对尺寸小于约10mg、优选小于0.1mg的组织样品进行取样和/或分析的方法，任选地其中所述样品已根据如本文所述的方法或通过使用如本文所述的活检设备获得。

定义

近端：定义活检设备的相关部分的端部，该端部在使用设备时最靠近医生。

远端：定义活检设备的相关部分的端部，该端部在使用设备时离医生最远。

杆构件纵轴：沿着杆构件长度的轴线，该长度由杆构件的远端和近端限定。杆构件可以是柔性的，并且因此，纵轴不必是直的，而是当杆构件处于弯曲构型时也可以沿着弯曲路径延伸。

尖端构件纵轴：沿着尖端构件的长度的轴线，该长度由尖端构件的远端和近端限定。

杆构件和尖端构件之间的角度偏移：尖端构件定位或可定位成使得尖端构件的纵轴相对于细长杆构件的纵轴成角度偏移，这意味着尖端构件的纵轴和细长杆构件在一个点上交叉。本领域技术人员会理解，纵轴实际上不必交叉。例如，在其中尖端构件和细长杆构件通过铰链部分连接的实施方式中(意味着尖端构件和细长杆构件没有物理地彼此附接)，它们的纵轴没有物理地交叉。然而，如果纵轴延伸超过杆构件和尖端构件的远端和近端，它们将不可避免地在单点交叉并且彼此成角度偏移。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，可以最好地理解本发明的实施方式及其优点，在附图中，相同的特点通过相同的数字表示。

图1是本发明的活检设备的一个实施方式的侧视图。

图2是图1所示的活检设备的侧视图，其中杆构件的第一纵轴和尖端构件的第二纵轴被识别。

图3从正面透视图显示图1和图2的设备。

图4显示根据本发明的尖端构件的实施方式的多个视图。

图5显示目前使用的活检钳与本发明设备在仍可用于获得活检样品的同时可以制造到的规模之间的尺寸比较。

图6A显示通过本发明的设备获得并用May-Grunwald-giemsa染色剂染色的组织样品。图6B显示通过本发明的设备获得的染色的组织样品以确认组织中肌钙蛋白I的存在。图6C显示其中突出显示条纹的组织样品。

图7显示通过本发明的设备获得的24个样品微活检钳的比对分数。

图8显示图7的24个样品的基因映射。

图9显示通过本发明的设备获得的组织样品的PCA分析结果。

除了独立权利要求中存在的那些特征之外，不应将本发明解释为限于任何以下实施方式或在这些实施方式中描述的任何特征。此外，设想在适当且相当合理的情况下，实施方式中的所有特征可以与其他实施方式中的其他特征组合。

根据本发明，公开了一种活检设备，所述活检设备包含具有限定第一纵轴的近端和远端的细长柔性杆构件。该设备还包括尖端构件，该尖端构件具有限定第二纵轴的近端和远端。

尖端构件位于或朝向细长杆构件的远端并且定位或可定位使得尖端构件的纵轴相对于细长构件的纵轴成角度地偏移。术语“朝向”是指尖端构件位于杆构件的远端并且直接连接到杆构件或经由连接部分例如铰链部分连接。

尖端构件的远端被构造成能够穿透受试者的组织，并且尖端构件的近端包括用于切割受试者的组织的切割部分。优选地，尖端构件的远端呈能够穿透受试者的组织的尖锐尖端的形式。例如，尖端构件的远端可以是锥形尖端、斜角尖端或法兰(三角形)尖端的形式。

在一个实施方式中，尖端构件的远端是实心的，也就是说它不包括中空腔和/或尖端构件的远端的能够穿透受试者的组织的面是实心的。

便利地，尖端构件的远端为相对于尖端构件的纵轴成锐角的斜尖端的形式，用于穿透受试者的组织。在这样的实施方式中，该锐角可为约1°至约45℃，例如约1°至约30℃，例如约5°至约30°，优选约10℃至约30℃并且更优选约10°至约20°。

优选地，尖端构件的总长度(即，从尖端构件的远端部分的最末端到尖端构件的近端部分的最末端的长度)为约500μm至约5000μm，对于例如约1000μm至约4000μm，例如约1000μm至约3000μm。

有利地，尖端构件的宽度为约100μm至约1000μm，例如约100μm至约500μm，例如约200μm至约500μm，优选约300μm至约500μm。

至于杆构件，该构件的宽度优选为约50μm至约500μm，例如约100μm至约400μm，例如约100μm至约300μm，优选约200μm至约300μm。对于杆构件的长度没有限制。

在使用中，该设备被递送到受试者的身体部分。例如，可以通过使用引导导管将设备递送到受试者的身体部分。引导导管是用于插入体腔、导管或血管的中空柔性管。引导导管的长度通常为至少约100cm，并且在某些情况下可达约150cm。在使用中，引导导管的远端通过体腔朝向感兴趣的身体位点前进。在被递送到感兴趣的身体位点时，根据本发明的活检设备可以通过位于引导导管近端的入口被引入并且推进通过引导导管的内腔。

优选地，通过患者的血管内或支气管内系统将设备(和引导导管，如果使用的话)推进到感兴趣的身体部位。

在到达引导导管的远端时，活检设备然后可以从位于其远端处的引导导管的出口推进。尖端构件的远端是活检设备的第一部分，其离开引导导管的出口，从而在进一步前进时，尖端构件穿透感兴趣的身体位点的组织。

可选地，活检设备可以容纳在微导管内，微导管本身位于引导导管内。当将设备从引导导管中推出时，这可以与微导管同时进行，一旦设备离开引导导管，它可以进一步推进，同时微导管保持在适当位置(或缩回)以暴露设备。

在穿透组织时，该设备进一步推进到希望从中获取样品的组织深度。当穿透组织时，在一个实施方式中，尖端构件的纵轴和杆构件的纵轴可以重叠。也就是说，尖端构件和杆构件可以定位成主要在相同的方向上并且沿着相同的轴线延伸。在达到期望的组织深度时，此时可以操纵尖端构件，例如通过滑轮线，以便相对于细长构件的纵轴偏移尖端构件的纵轴。例如，在该实施方式中，尖端构件可以通过铰接部分连接到杆构件，尖端构件可以围绕该铰接部分枢转。

或者，尖端构件和杆构件可以刚性地彼此固定，使得当尖端构件穿透受试者的组织时，尖端构件的纵轴已经在所需的角度下成角度偏移到杆构件的纵轴。

因此，术语“可定位的”被设想为包括其中尖端构件和杆构件刚性地彼此固定以使得它们的纵轴永久偏移以及其中尖端构件位于杆构件上并且能够被操纵以改变两个纵轴之间的偏移角的情况。

此外，杆构件和/或尖端构件本身可以是刚性的，也就是说，制成它们的材料基本上是刚性的。

优选地，尖端构件的纵轴定位或可定位成相对于细长杆构件的纵轴以约1°至约60°的角度偏移。例如，偏移角可以是约1°至约50°，例如约1°至约40°，或者约1°至约20°。优选地，偏移角可以是约5°至约20°并且更优选地是约10°至约20°。理想地，偏移角为60°或以下，以允许尖端构件的远端容易地穿透组织，并且当设备从组织缩回时仍使切割部分能够穿透尖端构件的远端未穿透的组织。

如上所述，设备的远端包括用于切割受试者的组织的切割部分。由于尖端构件的纵轴与杆构件的纵轴成角度地偏移，这允许尖端构件的切割部分切割在穿透时未被尖端的远端损坏的组织，并且还允许由于组织样品将从由穿透产生的孔中取出，获得更均匀的样品。

有利地，尖端构件的切割部分包括尖刀片，其中刀片的尖端基本上在尖端构件的纵轴的近侧方向上延伸。也就是说，刀片的尖端在尖端构件的纵轴的方向的20°内，例如15°、10°或5°内的方向上延伸。

便利地，尖端构件的切割部分包括两个尖刀片，其中刀片的尖端基本上在尖端构件的纵向轴线的近侧方向上延伸(术语“基本上”在前一段中进行描述)。

优选地，刀片基本上在尖端构件的纵轴的近侧方向上彼此平行地延伸。

在切割部分为尖刀片或多刀片形式的情况下，刀片的长度优选为约100μm至约2000μm，例如约100μm至约1000μm，例如约100μm至约500μm，优选约200μm至约500μm，更优选约200μm至约400μm。

切割部分也可以是相对于尖端构件的纵轴成锐角的斜边的形式。优选地，在穿透部分和切割部分都为斜面形式的情况下，斜面的尖端沿完全相反方向延伸。也就是说，当从侧角观察时，尖端构件采用平行四边形或伪平行四边形的形式(如果斜角不同)。

在切割部分呈斜边形式的这种实施例中，其也可包括如本文详述的尖刀片，锐角可为约1°至约45°，例如约1°至约35°，例如约5°至约35°，优选约10°至约35°，更优选约20°至约35°。

有利地，切割部分包括彼此面对的两个单刃刀片，其中刀片彼此间隔开以在刀片之间的切割部分中限定空隙或狭缝。优选地，空隙的宽度为约50μm至约500μm，例如约50μm至约400μm，例如约50μm至约300μm，优选约100μm至约300μm。

本发明的另一个优点是，由于该设备的独特配置，获得比目前使用的活检设备更可靠和更均匀的样品尺寸。

本发明的另一个优点是该设计允许设备以小尺寸生产和发挥作用，使得整个设备适合微导管，这使得系统灵活且侵入性最小。

此外，与目前使用的设备获得的样品相比，通过本设备获得的样品受到的损坏要少得多。结果，该设备可以制造成比目前使用的活检设备小得多，因此，通过本发明的设备获得的组织样品的质量可以在毫克或甚至亚毫克范围内，同时仍然适合于细胞学和生化评价，包括转录组学、蛋白质组学和遗传分析。例如，通过根据本发明的设备获得的样品质量可以小于约10mg，例如小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mg。优选地，由设备获得的样品质量在约0.01mg至约5mg的范围内，例如约0.01至约1mg和约0.01至约0.1mg的范围内。

这具有额外的好处，即与目前使用的设备相比，本发明的设备可以对组织，即样品组织和留在体内的组织两者造成更少的损伤。

此外，由于能够将设备制造成比目前使用的设备小得多的尺寸，本发明的设备可用于接近和取样目前使用的设备不能接近的组织。

在感兴趣的组织内达到所需的深度后，活检设备进入组织的推进停止。如果尚未如此定位，则尖端构件的纵轴与杆构件的纵轴成角度地偏移。之后，通过使用尖端构件的切割部分获得组织样品。

优选地，为了获得样品，尖端构件在推进后首先旋转，然后在近端方向上缩回。获得样品所需的旋转量没有限制，并且这取决于具体情况。例如，设备可以旋转90°、180°、270°或甚至完整的360°。同样，对设备旋转的方向没有限制，无论是顺时针还是逆时针，并且这将取决于切割部分的构造。

便利地，杆构件包括位于其远端的槽，并且优选地，杆构件的槽定位成与尖端构件的切割部分相对并面向尖端构件的切割部分。在设备在切割部分中包括空隙的情况下，槽也可以定位成与空隙相对并面向空隙。在切割部分已经切割组织样品之后，槽构件有利地提供进一步的空间以保持组织样品。

优选地，槽的深度为杆构件宽度的约20％至70％，例如杆构件宽度的约20％至约60％，优选地为杆构件宽度的约30％至约50％。

有利地，杆构件可滑动且可旋转地布置在护套构件的内腔内，其中护套包括近端和远端，杆构件从护套构件的远端延伸。

在一个实施方式中，护套构件的外径为约100μm至约1000μm，例如约100μm至约500μm，例如约200μm至约500μm，优选约300μm至约500μm。

优选地，护套构件的内腔具有约100μm至约1000μm，例如约100μm至约500μm，例如约200μm至约500μm，优选约200μm至约400μm的直径。在任何情况下，护套构件的内腔直径都小于护套构件的外径。

便利地，护套构件包括在护套构件的远端处的砧座，从而在使用中它可以与尖端构件的切割部分形成刀片和砧座关系。优选地，砧座围绕护套构件远端处的内腔的至少一部分或优选地整个边缘延伸。更优选地，砧座在护套构件的远端处围绕内腔的整个边缘均匀且对称。术语“砧座”是指护套构件的远端是钝边，或是锋利的边，例如斜边。

优选地，砧座呈斜边的形式(其可以是锋利的)，其形成约1°至约45°的锐角，例如约1°至约30°，例如约5°约30°，优选约10°至约30°，更优选约10°至约20°。

在活检设备包括护套构件的实施方式中，杆构件可以在穿透组织之前处于缩回位置，使得尖端构件的近端邻接护套构件的远端。也就是说，杆构件缩回到护套构件内，使得尖端构件的近端在其到达护套构件的远端并抵靠护套构件的远端时停止。然而，尖端构件的远端保持在护套构件的外部，使得尖端在推进时可以穿透组织。该设备可以在它被推进到组织中并且尖端构件、杆构件和护套一起推进时保持在这种构造中，尖端构件的近端首先穿透感兴趣的组织。在达到某个预定深度时，护套构件进入组织的通道可以被停止并且设备的尖端构件和杆构件可以进一步推进到组织中并且离开护套。

在达到最终所需的组织深度时，可以通过旋转尖端构件如上文详述的那样获得组织样品。在旋转之后，杆构件可以缩回护套构件内并且尖端构件的近端部分的切割部分因此切割组织的一部分，并且当杆构件缩回护套内时，护套构件的砧座可以用作进一步切割刃以切割组织并将所需尺寸的样品保留在杆的槽内。

在替代实施方式中，可以同时进行尖端构件旋转以切割组织和杆构件缩回到护套中。在另外的实施方式中：在杆已经缩回到护套内使得尖端构件的近端如上文概述那样邻接护套的远端后，然后将该设备从组织缩回并最终从受试者的身体中缩回。

将杆构件缩回到护套中并且使尖端构件朝向护套构件的远侧部分缩回的优点在于，组织样品容纳在护套内，至少部分地，优选地容纳在杆构件的槽内，以便在回缩时样品是安全的并且无法逃脱。例如，如果该设备用于获得心脏组织样品，则如果样品未固定，它可能会逃脱到患者的血管内系统中并导致栓塞。

有利地，护套构件包括用作位于远端近侧的侵入深度限制构件的套环。例如，套环可以是突出边缘的形式以为使用者提供限定的停止点，以帮助将护套正确插入到组织中所需的深度。

优选地，套环可具有约100μm至约2000μm，例如约100μm至约1000μm，例如约500μm至约1000μm，优选约500μm至约800μm的总宽度。

套环可以刚性地固定到护套构件上，或者，套环可以在护套构件上是可移动的，以允许使用者定制护套在使用中将穿透组织的深度。例如，套环可以围绕护套的外圆周滑动。作为另一个实施例，护套的外部可以包括围绕其圆周延伸的螺纹，并且套环可以是具有内腔的管，内腔还包括与护套的螺纹相对的螺纹并且被配置为使得套环可以是穿在护套上。这将允许使用者定制护套构件在使用中穿透的深度并提供更通用的设备。

方便地，套环由金属，优选金、铂或其他不透射线的金属构成。

优选地，设备的任何部件，包括尖端构件、杆构件和/或护套构件，可以独立地由形状记忆合金，优选镍和钛的合金的镍钛诺构成。有利地，形状记忆合金由约20重量％至约60重量％钛和约80重量％至约40重量％镍，例如约30重量％至约50重量％钛和约70重量％至约50重量％镍，优选约40重量％至约50重量％钛和约60重量％至约50重量％镍组成。

根据本发明的另一方面，提供一种成套部件，其包括上文限定的一次性使用的无菌预包装成套部件形式的活检设备。优选地，套件还包括微导管和/或引导导管，并且这些另外的部件以及套件中的任何其他部件可以与活检设备在相同的包装中或在单独的包装中提供。

还可以设想，设备本身可以以套件中的单独部件(即，杆构件、尖端构件和护套构件)提供并且用户在使用之前组装该设备。

根据本发明的另一方面，提供一种使用如上定义的设备从受试者获得活检的方法，其中该方法包括：

将如上定义的设备递送到身体位置；

将设备的尖端构件的远端推进到组织中，使得整个尖端构件推进到组织中；和

从组织中取出尖端构件。

使用方法可包括以上详述的任何步骤。

优选地，在穿透组织之后且在缩回之前，尖端构件在组织中旋转。

有利地，在设备包括在将设备推进到组织中时的护套部分的情况下，杆构件缩回到护套部分内，使得尖端构件的近端邻接护套部分的远端。

方便地，在将设备推进到组织中之后，杆构件伸出护套部分，从而使尖端和杆构件进一步穿透组织中。

优选地，在从组织撤回尖端构件时，杆构件首先缩回到护套部分中，并且可选地，当活检设备包括具有位于远端的砧座的护套构件时，这可以提供在使用中的尖端构件的切割部分的刀片和砧座的关系。

有利地，当根据本发明使用时由设备获得的样品质量可以小于约10mg，例如小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mg。优选地，由设备获得的样品质量在约0.01mg至约5mg的范围内，例如约0.01至约1mg和约0.01至约0.1mg。

根据本发明的另一方面，提供如上定义的活检设备用于从受试者获得活检的用途。

根据本发明的另一方面，提供一种制造根据本发明的设备的方法。

如上所述，根据本发明的设备可用于从患者的许多部分例如心脏或肺获得组织样品，并且设备的尺寸可根据其预期用途进行修改。

本设备的一个优点是它可以制造成比目前使用的活检钳小得多的尺寸，因此，由该设备获得的样品尺寸可以比由当前设备获得的样品尺寸小得多。

发明人设计一种用于制备用于进一步分析的组织样品的新方案，其中组织样品比在大多数已知制备和分析方法中使用所需的组织样品小得多。已经发现，尽管获得/使用的组织样品的尺寸很小，但发明人设计的方案允许对小组织样品进行准确和可重复的分析和取样。

因此，根据本发明的另一方面，提供一种分析具有小于约10mg尺寸的组织样品的方法，任选地其中所述样品已经根据如本文所述的方法或如本文所述的活检设备的使用获得。优选地，在分析组织样品的方法中使用的样品先前已经通过活检设备和/或本文所述的方法获得。

有利地，组织样品可以具有小于约9、8、7、6、5、4、3、2或1mg的尺寸。优选地，组织样品尺寸为约0.01mg至约5mg，例如约0.01至约1mg和约0.01至约0.1mg。

便利地，所进行的分析可以选自组织学、细胞学、蛋白质组学、转录组学和遗传分析组成的列表。

优选地，在获得样品之后，无论是通过使用根据本发明的设备或通过另一种设备或方法，立即冷冻样品，优选通过将组织样品放入容器中并使容器与干冰接触以便保存样品以供进一步分析。在此上下文中，术语“立即”是指在获得组织样品后的10分钟内，例如在获得组织样品后的9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟内。最优选地，组织样品被放置在容器中，然后在取样的不到一分钟内将其放置在干冰上。

有利地，将约10μL至约200μL的裂解缓冲液加到组织样品，例如约10μL至约100μL，优选约10μL至约50μL。之后，可以将样品均质化，优选通过在台式涡旋器上涡旋1至60秒，例如5至30秒，并且优选10至20秒。

方便地，将样品离心，优选在台式微量离心机上离心5秒至两分钟，例如5秒至60秒，优选5秒至30秒。

有利地，如上所概述将样品均质化并离心至少一次，例如另外两次、三次、四次或五次。

优选地，将样品在35℃至40℃，例如35℃至38℃的温度下孵育10至60分钟，例如10至30分钟。

有利地，根据上述方法将组织样品均质化并再离心一次，优选样品再经历两次均质化和离心步骤。

便利地，在均质化和离心之后向样品中加入约25μL至约500μL，例如约25μL至约250μL，例如约25μL至约100μL的缓冲液。

优选地，然后将磁珠加到样品中，其中磁珠被配置为通过固相可逆固定在磁珠表面上来结合RNA。在以下步骤中，从组织样品中提取RNA并结合到磁珠表面，从而可以清洗样品。

有利地，样品在约20℃至约40℃，例如约20℃至约30℃，优选约20℃至约25℃的温度下经历另一孵育步骤约5至约30分钟，例如约5至约25分钟，优选约5至约20分钟。

便利地，将样品置于磁体上约5至30分钟，例如约5至约20分钟。之后，优选倒出上清液。

理想地，然后用缓冲液洗涤样品，优选数次(例如2、3、4或5次)。优选地，将约20μL至约200μL的缓冲液加入到样品中以对其进行洗涤，例如约20μL至约100μL的缓冲液，优选约20μL至约80μL的缓冲液。之后，将样品放在如上所述的磁体上，并倒出上清液。

有利地，然后用乙醇溶液洗涤样品，优选使用包含约75体积％至95体积％乙醇和约25体积％和5体积％水的乙醇溶液，例如约80体积％至约90体积％乙醇和约20体积％和10体积％水。之后，优选将样品置于如上所述的磁体上并倾析上清液。

优选地，当用乙醇洗涤时，样品用约50μL至约500μL前一段所述的溶液洗涤，例如约50μL至约200μL，优选约100μL至约200μL。

优选地，向样品中加入约1μL至约100μL的DNAse溶液，例如约1μL至约50μL，优选约3μL约10μL的DNAse溶液。

在加入DNAse后，将样品在35℃至40℃，例如35℃至38℃的温度下孵育5至30分钟，例如10至20分钟。

有利地，在约20℃至约40℃，例如约20℃至约30℃，优选约20℃至约25℃的温度下将约10μL至约200μL的洗涤缓冲液加到样品，例如约10μL至约100μL的洗涤缓冲液，并且优选地，将样品孵育约1至约20分钟，例如约1至约15分钟，优选约1至约10分钟。

便利地，然后将样品置于磁体上约1分钟至约20分钟，例如约1分钟至约10分钟。之后，优选去除上清液。

优选地，然后向样品中加入乙醇溶液以洗涤样品。有利地，乙醇溶液包含约75体积％至95体积％乙醇和约25体积％和5体积％水，例如约80体积％至约90体积％乙醇和约20体积％和10体积％水。之后，优选将样品置于如上所述的磁体上并倾析上清液。

优选地，当用乙醇洗涤时，样品用约50μL至约500μL前一段所述的溶液洗涤，例如约50μL至约200μL，优选约100μL至约200μL。

方便地，除去上清液后，磁珠在室温下干燥约1分钟至约30分钟，例如约1分钟至约20分钟，优选约1分钟至约10分钟。

有利地，在干燥后将磁珠重新悬浮在核酸酶水中以释放结合到磁珠表面的RNA。优选地，所用核酸酶水的体积为约1μL至约50μL，例如约1μL至约30μL，例如约1μl至约20μl，优选约1μl至约10μl。

优选地，然后将重新悬浮的珠在室温下孵育约1分钟至约10分钟，例如约1分钟至约5分钟，然后返回至磁力架。

方便地，然后将洗脱的RNA转移到新容器中进行储存。

现在将参考附图描述本发明的具体实施方式。

图1至图3示出本发明的活检设备(100)的实施例，其具有细长的柔性杆构件(108)和尖端构件(102)。柔性杆构件包括远端(110)和近端(112)，其中尖端构件(102)朝向杆构件的远端(110)定位。

尖端构件(102)还包括远端(104)和近端(106)。在该实施方式中，远端为能够穿透受试者的组织的斜切尖端的形式。从图1中提供的角度来看，尖端构件的近端切割部分端部也呈斜角形式，近端的点与尖端的远端的点相对，使得尖端构件在侧部突出呈平行四边形。

尖端构件(102)的远端(104)和近端(106)限定了跨越尖端构件(102)的纵向长度的纵向轴线(202)，如图2所示。杆构件(108)的远端(110)和近端(112)在杆构件处于直线构型时限定杆构件的纵向轴线(204)。

尖端构件相对于杆构件的纵轴成角度偏移，使得尖端构件和杆构件的纵轴形成它们相交的点(206)，如图2所示。

图3示出尖端构件的近端的切割部分为具有单个边缘的两个尖刀片(302)的形式，其中刀片彼此间隔开以限定空隙。在该实施方式中，刀片的尖端在尖端构件的纵轴的近侧方向上彼此平行地延伸并且刀刃彼此面对。

杆构件(108)包括槽部(114)，其定位成与尖端构件的切割部(106)相对并且面向尖端构件的切割部(106)，从而位于两个尖刃(302)之间的空隙下方。

图1至3的活检设备被配置为使得杆构件(108)可滑动且可旋转地设置在护套构件(116)的管腔内，其中尖端构件(102)不能进入护套构件(116)由于尖端构件和杆构件的纵向轴线之间的角度偏移，并且当杆构件(108)缩回时尖端构件(102)邻接护套构件(116)的开口。护套构件包括远端(118)和近端(120)，远端包括斜切刃(122)，该斜切刃(122)对称地设置在远端边缘处的整个内腔周围。

朝向护套构件(120)的近端，定位有套环(124)，套环充当侵入深度限制构件，以便允许控制护套构件可以推进到受试者的组织中的最大深度。

在使用中，该设备独立地或通过使用引导导管或类似的常用设备指向受试者的身体位点。在到达感兴趣的身体位点时，活检设备朝着身体组织前进，并且总是位于护套构件外部的尖尖端构件穿透组织。此时，杆构件处于护套构件内的完全缩回位置，使得护套构件的远端的切割刃邻接尖端构件的近端。

在穿透组织时，该设备进一步推进到组织中并且在护套上的套环到达组织并阻止护套进一步穿透到组织中时停止在所需位置或停止推进。

在该实施方式中，尖端构件和杆构件彼此刚性固定，使得尖端构件的纵轴相对于杆构件的纵轴永久偏移。然而，也可以设想该设备可以被构造成使得当该设备穿透组织时尖端构件和杆构件的纵轴主要沿着相同的线延伸并且只有当尖端达到所需深度时尖端构件枢转以便与杆构件成角度地偏移。

在到达所需深度后，通过将杆构件可滑动地推进到护套构件外，使得杆构件的槽被暴露，从而将尖端和杆构件进一步推进到组织中。

为了获得样品，杆和尖端构件旋转并且然后缩回到护套构件内，其中位于护套构件远端的斜切割刃用作第二切割刃以从相反方向切割组织至尖端构件的切割部分。

继续缩回直到杆构件再次完全容纳在护套构件内并且护套构件的远端邻接尖端构件的近端。该动作导致组织样品被容纳在部分容纳在护套中的杆构件的槽内，或如果组织样品尺寸大于槽，组织样品可能被切割部分捕获在槽区域内。

作为该方法的微小变化，这些步骤可以同时发生，而不是依次发生尖端构件的旋转和缩回。

该设备和使用该设备的方法导致将预测尺寸的均匀样品容纳在杆构件的槽内，而对所制造的组织的损伤最小。然而，当需要更大的组织样品时，可以设想杆构件在旋转后不缩回护套内，并且在旋转后，设备完全从受试者身体缩回，从而带来更大的样品尺寸组织。

实施例

通过参考以下实例将进一步描述本发明，这些实例不旨在限制本发明的范围。

设备制造方法

下面提供用于制造根据本发明的设备的示例性方法。通过该示例性方法制备的本发明的设备由三部分组成：a)尖端构件，其是镍钛诺管的约2mm长的研磨和激光切割部分，b)由镍钛诺丝制成的杆构件，尖端构件连接到该杆构件上，和c)具有研磨的远端的护套构件镍钛诺外壳部分。

镍钛诺是本领域公认的术语，并且是一种镍钛合金，因其形状记忆和超弹性特性而区别于其他材料。

用于构建本发明的活检设备的材料可以是外径和内径分别为380和280μm的镍钛诺管，以及直径为228μm的镍钛诺丝。

在该示例性方法中，形成尖端构件(102)的第一步包括以15°角横跨管横截面研磨管。将管旋转45度，并在每侧进行20°研磨。两种研磨在管的中轴线的尖点处相遇。该管随后在距研磨尖端2mm处进行激光切割，如图4所示。在设备的近端加工完成后，将其旋转90度并切断，在近端(302)处产生两个锋利边缘。

在加工尖端构件后，然后将其连接到已手动弯曲成16-19°角度的丝上。它被组装在丝的顶部，然后用氰基丙烯酸酯胶固定到位。任何氰基丙烯酸酯残留物都可以用激光加工掉。设备的尖端用激光磨尖，与最初完成的研磨相匹配。在组装后，尖端构件的远端角度在组装后为约20度，如图4所示。如图1和3所示，在靠近尖端构件近端的远端向远侧加工该线以形成空腔(槽，(114))。腔从侧面加工并切割成平行四边形，尺寸如图4所示。

丝被放置在管内并且运动由近端扭矩设备控制，该近端扭矩设备允许远端部分的旋转并限制平移运动。

护套部件可以通过围绕镍钛诺管远端的整个圆周研磨20°锥度并随后用氰基丙烯酸酯胶从远端粘合1-20毫米(取决于所需的采样深度)的金套环来制造。任何最终研磨和氰基丙烯酸酯残留物都用激光去除。连接到丝的设备的远端部分通过反向安装放置在护套构件的近端内，并且远端部分的运动由连接到丝的扭矩设备控制，允许远端部分旋转并且限制平移运动。整个设备设计为安装在临床可用的2.7F高流量微导管中以在通过身体导航期间提供支撑并保护尖锐的尖端。

取样程序

在取样程序中测试的所有设备都由锥形锋利的外壳部分(护套构件)和连接到远端的切割尖端(尖端构件)的丝(杆构件)组成，该切割尖端被推进猪的心内膜，然后旋转并且当设备系统通过引导导管缩回时，缩回以“夹住”将其楔入收集袋中的小组织样品。

测量通过该设备获得的五个样品的重量，并且获得的样品的平均质量为0.052mg，单个重量为0.04、0.04、0.09、0.06和0.03mg。

深度限制套环可提供荧光透视检查的可见性，并将心室壁意外穿孔的风险降至最低。当该设备从身体中取出时，显微手术钳用于在显微镜监测下提取组织样品，并立即储存在显微镜载玻片上进行组织学分析，或如果需要进行分子分析，则储存在0.2ml PCR管中。在从微型活检钳中提取组织片时，使用手术显微镜或解剖显微镜对其进行检查，并根据尺寸、外观和质地给出尺寸评分(1-4，由单个操作者评估)。评分系统在下表1中描述。

表1

离体和模拟器评价

使用该设备对死后心肌进行离体组织学评价，以评价产率。设备还在定制的模拟器中测试，该模拟器由塑料管和丙烯酸玻璃室构成，其中可以在真实的解剖情况下评价使用原型的导航和取样。

体内评价

在设备齐全的临床级3D血管导管插入实验室的猪模型中，对23头平均体重为37kg、体重范围为29-48.5kg的成年猪进行迭代体内评价。简而言之，动物用镇静剂预先给药并被带到临床血管造影室，在接受标准手术麻醉护理的同时进行插管和机械通气。

在整个干预过程中，使用ECG、有创血压测量、氧饱和度、温度和尿量监测动物的并发症。动物用75mg胺碘酮iv治疗，如果干预持续时间超过3小时，则额外剂量为75mg。使用8.6F可偏转护套(Agilis NXT,Saint Jude Medical,Saint Paul,MI,USA)使用经颈静脉进入右心室对初始设备进行了测试。随着设备的小型化，它们在包括左心室(LV)的两个心室中进行了测试。所有左心室活检均使用经股方法获得。

使用5F或7F短护套进入股动脉，使用标准5F或4F直诊断导管(Torcon NB优势，Cook Medical，美国)进入LV，并从那里进入2.7法式微导管容纳活检钳，是先进的。使用标准心内膜心肌钳活检钳(3F或5.2F柔性心肌活检钳，Cook Medical，美国或6F Jawz心内膜心肌活检钳，Argon Medical Devices，Frisco，TX，美国)获得活检对照。还获得全血和来自肢体的骨骼肌作为测序的对照组织。从一些猪刮下左心室的心内膜层作为额外的对照样品。取样后，使用过量的戊巴比妥钠处死动物。

体内随访评价

在体重在27-31.9kg之间、平均体重为28.75kg的6头猪中，在7天随访期期间单独(n＝3)或结合常规心内膜心肌活检(n＝3)评价本发明的设备的安全性。这些动物是按顺序招募的，但在麻醉和干预开始之前预先指定该组。动物被安置在专门的大型动物饲养设施中，专门工作人员在大型动物饲养和临床监测方面培训，并由兽医监督。除了使用吸入麻醉剂(异氟醚)而不是戊巴比妥钠外，初始程序与非随访组一样进行。在干预后，动物从麻醉中苏醒并饲养7天，接受标准的术后护理，并监测并发症。在第7天，通过额外的微生物活检和常规活检进行后续干预，之后处死动物并检查心脏。使用RNA-seq对一部分样品进行测序，并评价mRNA表达中的纵向变化。

组织学

在体内评价研究中获得的微活检钳样品太小，无法可靠地切片到载玻片上。相反，将组织片直接放置在显微镜载玻片上，并以类似于制备细胞学标本的方式进行压缩。使用May-Grunwald-giemsa或免疫组织化学，使用间接荧光方法染色肌钙蛋白I(兔抗猪主要抗体，Abcam，Cambridge，UK)染色载玻片。

RNA分离和测序

来自体内评价组中的动物的RNA被分离处理并送去进行RNA测序。在一轮试点测序中，对24个样品进行测序，包括由全血和来自常规活检的心肌组成的对照。随后对来自5头猪的57个样品进行第二轮测序，加入骨骼肌和心内膜组织作为额外的对照证实结果。对于样品处理和RNA分离，通常使用以下方案。

通常使用的取样方案如下。在活检设备收回后，立即将组织样品从活检设备转移到带有微型钳的0.2ml PCR管中。立即将样品置于干冰上并冷冻直至进一步处理。

将31μl专有裂解缓冲液加到样品中，然后通过在台式涡旋器上涡旋15秒来破碎和均质组织样品。之后，将样品在台式微量离心机上离心15秒。该过程重复两次。然后将样品在37℃下孵育25分钟，然后如上文详述的那样将样品涡旋并再离心两次。

将52.3μl专有结合缓冲液(试剂盒)(包括磁珠)添加到样品中，并将样品在室温下孵育10分钟。

在孵育后，将样品置于磁体上6至20分钟，直至溶液变清，随后倒出上清液。

然后通过添加77μl专有洗涤缓冲液(试剂盒)、移液溶液、置于磁铁上5分钟并倒出上清液，将样品洗涤数次。

然后加入100μl至200μl 85体积％的乙醇，混合样品，置于磁体上，随后去除上清液。

可选地，(取决于下游文库制备方案)加入7.7μl DNAse溶液，并将样品在37℃下孵育15分钟。

加入42.3μL洗涤缓冲液，并且室温孵育4分钟，置于磁体上7分钟，然后去除上清液。

将100-200μl 85体积％乙醇加入样品中，并将样品置于磁体上5分钟。然后去除上清液并重复洗涤步骤两到三次。然后让磁珠在室温下干燥5分钟。

然后将磁珠重新悬浮在3-10μl核酸酶水中，并在室温下孵育2分钟，然后返回到磁力架。然后将洗脱的RNA转移到新的板或管中进行储存。

然后总RNA用试剂盒和方案的几种组合中的任一种(修改的或原样的)处理，并且在测序平台，例如我们的研究中用于概念验证的Illumina上测序。

还使用试剂盒和方案的组合来制备文库，无论是修改的或用作标准。

数据分析和统计方法

使用R统计计算语言3.4.1版(维也纳，奥地利，https://www.R-project.org/)进行统计分析。除非另有说明，描述性统计以中位数(范围)表示。RNA-seq数据使用STAR、Cutadapt、FastQC进行基准测试和处理以进行质量控制，最后使用R进行更高级别的统计。

微活检钳设计的结果

对65种原型设计进行评价，所有原型设计均基于锋利外壳部分的核心原理，该部分包含可穿透心肌并“夹断”一小块组织的带有切割尖端的丝。最终设备设计的外径为约0.4mm(不透射线标记处为0.68mm)，并安装在为栓塞设计的2.7F高流量微导管中(RenegadeHi-Flo，Boston Scientific，Marlborough，MA，USA或Carnelian,Tokai MedicalProducts,Aichi,Japan)。使用有角度的尖端“引导”导管，允许微活检钳系统在心脏内被引导和导航。在当前的方案中，4F或5F标准诊断导管被用作包含该设备的微导管的“引导”导管。设计的迭代改进提高了活检成功率、产量(使用定性评分系统测量)和设备的易用性。用于体内随访研究的最终设计在图1至图3中显示。图5显示根据本发明的活检钳可以制造成仍适用于获得良好组织样品与目前使用的临床设备相比的尺寸的比较。

体内研究结果

微活检钳和常规活检在所有动物中均成功(对于原型和常规活检组合，n＝6，n＝3)。使用本发明的设备，成功率达到94％。由于未知原因，本研究中的所有动物在干预开始前都有心动过速，并且与非随访组相比，短暂性室性心律失常的趋势增加。

然而，所有动物都能很好地耐受微活检钳程序，在此阶段不需要特殊治疗。在进行常规活检的动物中，活检钳很难穿过主动脉弓并进入LV。从最后一次常规活检后开始，一只动物的室性心动过速持续大约60分钟。静脉注射300mg胺碘酮，之后动物稳定并且可以醒来而没有并发症。另一只进行两种活检的动物在干预期间稳定，但在从麻醉中醒来后不久出现呼吸功能不全和随后的心脏骤停。大体病理评价显示小心脏和异常小的LV，符合心肌病。因此，该动物被排除在后续分析外。所有动物都有少量(<10ml)带血的心包积液，并且在活检部位有可见的痕迹。对任何动物的心脏进行肉眼检查，均未发现梗塞或心室破裂的宏观迹象。

总之，用我们的新型设备反复进行心脏活检的所有三只动物都被成功唤醒并在7天后带回血管造影套件进行额外取样。在用我们的新型设备和常规设备进行心脏活检的三只动物中，存在两只被成功唤醒并带回进行后续取样。

组织学和免疫组化的组织鉴定结果

为了验证样品仅包含心肌组织，对样品子集进行组织学和免疫组织化学。May-Grunwald-giemsa染色显示固体组织碎片具有相当大的挤压伪影(图6A)。大多数样品中未切片组织的厚分层排除病理学评价。在许多情况下，样品不容易被识别为心肌组织。因此，免疫组织化学用于确认组织块中肌钙蛋白I的存在(图6B和6C)。

RNA测序结果

在第一轮测序中提交给测序设施的所有24个样品的RNA测序均成功。微活检和对照的比对分数相对一致(见图7)。心肌样品和血液对照之间的基因定位不同，大多数心肌样品具有较低比例的读数映射到基因，而大部分读数映射到未知特征(图8)。用原型或常规获得的心肌样品之间的多重映射和未映射读数的比率相当。

在接下来的一轮测序中，所有57个样品在读取数量和整体读取质量方面都取得成功。然而，由于对猪基因组的映射率较低，排除一份心脏活检样品。由于文库复杂性低，另外五个样品被排除在外，其中三个样品是用新型仪器采集的。总共有51/57个样品用于基因表达分析。表2显示基线质量控制数据。

表2

转录组分析结果

为了进一步确认微活检样本的组织类型，进行了主成分分析(PCA)，并评估与对照的聚类模式(图9)。与全血相比，心肌的微活检钳更接近于常规的心肌活检聚类。骨骼肌形成独特的簇，与血液和心脏样品分开。心内膜组织与心脏活检样品聚类在一起。与常规的心肌活检相比，微活检钳的传播更大。个别样品间比较显示预期转录本的丰度高，例如心脏样品中的MYH7、骨骼肌样品中的MYH8和血液中与血红蛋白相关的转录本。心肌(与血液相比)中差异表达最高的基因的基因本体显示，微活检样本中与心肌细胞功能和发育相关的基因富集。

Claims (26)

1.一种活检设备，所述活检设备包含：

具有限定第一纵轴的近端和远端的细长柔性杆构件；和

具有限定第二纵轴的近端和远端的尖端构件，所述尖端构件位于或朝向所述细长构件的远端并且定位或可定位成使得所述尖端构件的纵轴与相对于所述细长构件的纵轴成角度偏移；

其中所述尖端构件的远端构造成穿透受试者的组织，并且所述尖端构件的近端包括用于切割受试者的组织的切割部分。

2.根据权利要求1所述的活检设备，其中所述尖端构件的纵轴定位或可定位成使得相对于所述细长构件的纵轴以约1°至约80°的角度偏移。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的活检设备，其中所述尖端构件的切割部分包括尖刀片，其中所述刀片的尖端基本上在所述尖端构件的纵轴的近侧方向上延伸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的活检设备，其中所述尖端构件的切割部分包括两个尖刀片，其中所述刀片的尖端沿所述尖端构件的纵轴的近侧方向延伸。

5.根据权利要求4所述的活检设备，其中所述刀片在所述尖端构件的纵轴的近侧方向上彼此平行地延伸。

6.根据权利要求5所述的活检设备，其中所述刀片是彼此面对的单个刀片，其中所述刀片彼此间隔开以在所述刀片之间的切割部分中限定空隙。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的活检设备，其中所述杆构件包括位于其远端处的槽。

8.根据权利要求7所述的活检设备，其中所述杆构件的所述槽定位成与所述切割部分和/或所述尖端构件的所述切割部分中的空隙相对并面对。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的活检设备，其中所述杆构件可滑动且可旋转地布置在护套构件的管腔内，其中所述护套包括近端和远端，所述杆构件从所述护套构件的远端延伸。

10.根据权利要求9所述的活检设备，其中所述护套构件包括砧座，使得在使用中其可以与所述尖端构件的切割部分形成刀片和砧座关系。

11.根据权利要求10所述的活检设备，其中所述砧座围绕在所述护套构件的远端处的所述管腔的至少一部分并且优选地整个边缘延伸。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的活检设备，其中所述护套构件包括用作位于所述远端的近侧的侵入深度限制构件的套环。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的活检设备，其中所述尖端构件的远端为相对于所述尖端构件的纵轴成锐角的斜尖端的形式，用于穿透受试者的组织。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的活检设备，其中所述杆构件和尖端构件彼此刚性固定。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的活检设备，其中所述套环由金属，优选地金、铂或其他不透射线的金属构成。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的活检设备，其中所述尖端构件、杆构件和/或护套构件中的至少一个由形状记忆合金，优选镍钛诺构成。

17.一种成套部件，所述成套部件包括一次性使用的无菌预包装成套部件形式的根据权利要求1至16中任一项所述的活检设备。

18.根据权利要求17所述的成套部件，其中所述套件还包括微导管和/或引导导管，其中所述微导管和/或引导导管可以与所述活检设备在同一包装中或在单独包装中。

19.一种使用根据权利要求1至16中任一项所述的设备从受试者获得活检组织的方法，其中所述方法包括：

将根据权利要求1至16中任一项所述的设备递送至身体位置；

将所述设备的尖端构件的远端推进到组织中，使得整个所述尖端构件推进到所述组织中；和

从所述组织中取出所述尖端构件。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在穿透所述组织之后且在缩回之前，所述尖端构件在所述组织中旋转。

21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述设备是根据权利要求9至16中任一项所述的设备，并且其中在将所述尖端构件推进到所述组织中时，所述杆构件缩回到所述护套部分内，使得所述尖端构件的近端邻接所述护套部分的远端。

22.根据权利要求21所述的方法，其中在将所述尖端构件推进到所述组织中之后，所述杆构件延伸出所述护套部分并进一步穿透到所述组织中。

23.根据权利要求22所述的方法，其中在从所述组织中抽出所述尖端构件时，首先将所述杆构件缩回到所述护套部分中，任选地其中所述活检设备包括砧座，所述砧座在所述杆构件缩回时提供与使用中的所述尖端构件的切割部分的刀片和砧座关系。

24.根据权利要求1至16中任一项所述的活检设备用于从受试者获得活检的用途。

25.一种制造根据权利要求1至16中任一项所述的设备的方法。

26.一种分析尺寸小于约10mg的组织样品的方法，任选地其中所述样品根据权利要求19至23中任一项所述的方法或通过使用根据权利要求24所述的活检设备获得。

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