CN113350507B

CN113350507B - Cep55作为靶点在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用

Info

Publication number: CN113350507B
Application number: CN202110813028.7A
Authority: CN
Inventors: 贺天珍; 叶思雨; 高永静
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-07-19
Also published as: CN113350507A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，本发明公开Cep55作为靶点在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用；还公开一种治疗结肠炎的药物，包括抑制Cep55 mRNA的核酸分子、重组载体、慢病毒或腺相关病毒中一种。另外还公开Cep55小分子抑制剂在制备预防或治疗结肠炎的药物中的应用；最后还公开了一种抑制Cep55表达在预防或治疗结肠炎方面的应用，包括以下步骤：S1、制备小鼠结肠炎模型；S2、TNBS诱导的小鼠结肠炎模型中Cep55基因表达是否增加；S3、抑制Cep55的表达是否能够缓解结肠炎的进展。本发明发现抑制Cep55表达或抑制其功能都能够有效缓解结肠炎，可将Cep55作为靶点，以抑制其表达和功能的抑制剂作为结肠炎的有效治疗药物。

Description

Cep55作为靶点在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及Cep55作为靶点在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用，具体涉及Cep55作为靶点在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用、一种治疗结肠炎的药物、Cep55小分子抑制剂在制备预防或治疗结肠炎的药物中的应用、一种抑制Cep55表达在预防或治疗结肠炎方面的应用。

背景技术

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一种肠道黏膜免疫紊乱造成的慢性非特异性炎症性疾病，包括克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）。IBD高发病率主要见于西方发达国家，但发展中国家的患者数量正逐年升高，原因可能是卫生条件改善后肠道感染减少，导致肠道免疫系统发育不成熟，因此，IBD已发展成为一种全球化的慢性消化道疾病。整个IBD病程漫长，常反复发作。对于IBD的治疗主要包括内科治疗和外科手术治疗两种方式。一般中轻度UC且无并发症者无需手术治疗；对于CD患者，炎性病变、无症状的肠内瘘、无症状的肠道狭窄、无症状的局限性小脓肿、无症状的肛瘘等无需手术治疗，尽管可采用糖皮质激素和TNF抑制剂等药物治疗，但会出现治疗无效或耐药或严重的副作用等情况。因此，从新的角度深入研究IBD的治疗以寻找有效的药物作用靶点具有重要的理论和实际意义。

55 kDa中心体蛋白（Centrosomal protein 55kDa，简称Cep55)，是一种由464 个氨基酸组成的蛋白质，含3个中央卷曲螺旋结构域。Cep55定位于间期细胞中的母中心粒，并在胞质分裂期间被募集到中间体。Cep55在睾丸和胸腺中高表达，但在小肠、结肠、骨髓、淋巴结和卵巢中的表达较低。因此，Cep55表达异常与多种疾病的发生发展都有关。有研究报道Cep55在肝癌组织、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤组织或细胞中表达增多，Cep55 表达较高的患者的存活率低于表达较低的患者。另外，Cep55高表达与晚期肿瘤淋巴结转移阶段相关并可降低患者的5年生存率。然而，尚未有报道Cep55直接参与结肠炎等炎症的发生发展。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供Cep55作为靶点在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用、一种治疗结肠炎的药物、Cep55小分子抑制剂在制备预防或治疗结肠炎的药物中的应用、一种抑制Cep55表达在预防或治疗结肠炎方面的应用，从而，探索出Cep55与结肠炎之间的关系，从而探索出抑制Cep55在诊断、预防及治疗结肠炎方面的应用。

为实现上述发明目的，本发明的实施例提供Cep55作为靶点在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用。

进一步地，所述治疗药物用于抑制Cep55的表达或功能；所述药物可以为核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白、干扰慢病毒或干扰腺相关病毒中的一种或多种。

本发明的实施例还提供一种治疗结肠炎的药物，其特征在于，包括抑制Cep55mRNA的核酸分子、重组载体、慢病毒或腺相关病毒中的一种。

优选的，所述抑制Cep55 mRNA的核酸分子为siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003中的一种；其中，siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003分别如下：

siRNA-001：CACCUAAGGUCAAGAUAUATT；

siRNA-002：GUUUAGAACUCGAUGAAUUUU；

siRNA-003：GAAAGAUGCUCUGGAGAAAUU。

优选的，所述siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003可采用甲氧基或胆固醇进行修饰。

优选的，所述抑制Cep55 mRNA的重组载体，包含能转录出抑制Cep55 mRNA的核酸分子的序列以及载体，所述序列嵌入载体中。

优选的，所述抑制Cep55 mRNA的慢病毒或腺相关病毒，由上述重组载体经病毒包装后获得。

本发明的实施例还提供Cep55小分子抑制剂在制备预防或治疗结肠炎的药物中的应用。

本发明的实施例另外还一种抑制Cep55表达在预防或治疗结肠炎方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备小鼠结肠炎模型，TNBS诱导小鼠产生结肠炎；

S2、TNBS诱导的小鼠结肠炎模型中Cep55基因表达是否增加；

S3、抑制Cep55的表达是否能够缓解结肠炎的进展。

进一步的，所述步骤S3具体包括以下过程：

S3-1、设计合成小鼠Cep55 siRNA；

S3-2、筛选高效靶向Cep55 siRNA；通过细胞系筛选出siRNA-001干扰靶基因；

S3-3、将C57BL/6J小鼠随机分成non-target siRNA对照组、Cep55 siRNA组，同时设置不做任何处理的正常对照组，每组3只小鼠；

S3-4、给Cep55 siRNA组的C57BL/6J小鼠连续3天腹腔注射Cep55 siRNA后，同时，在第3天注射siRNA 1小时后，给予2.5% TNBS/50%酒精100ul灌肠1次，到第9天时实验结束；

S3-5、监测小鼠每天的体重变化，收集结肠组织标本，记录结肠的长度，HE染色观察小鼠结肠组织炎症程度并评分，RT-PCR法检测小鼠结肠组织中Cep55 mRNA表达水平。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

（1）本发明的实施例通过挖掘公共GEO数据库，利用Lasso和SVM_RFE两种算法进行特征性选择，最终挑选出未被报道有抗炎功能且能通过实验验证的基因Cep55；通过2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导小鼠结肠炎模型，提取结肠的mRNA进行qPCR检测，本发明的实施例研究过程发现Cep55 mRNA水平在TNBS诱导的结肠炎模型维持阶段升高4-5倍，提示Cep55可能在结肠炎炎症维持阶段发挥作用；通过抑制Cep55表达或抑制其功能都能够有效缓解结肠炎，说明Cep55参与结肠炎的发生发展；本发明的实施例通过实验结果说明可以将Cep55作为研发治疗结肠炎药物的潜在靶点。

（2）本发明的实施例还通过利用TNBS诱导小鼠结肠炎模型，发现Cep55在结肠炎的维持阶段表达增加，促进结肠炎的发生发展，抑制Cep55表达或抑制其功能都能够有效缓解结肠炎，可将Cep55作为靶点，以抑制其表达和功能的抑制剂作为结肠炎的有效治疗药物。

附图说明

图1为本发明的实施例中TNBS诱导的小鼠结肠炎模型中Cep55基因表达增加的验证图；

其中，图1A和图1B分别为TNBS诱导小鼠结肠炎后小鼠体重和结肠长度的变化图；图1C和图1D分别为TNBS诱导小鼠结肠炎后小鼠结肠淋巴细胞和非淋巴细胞中Cep55 基因表达的变化图；图中数据代表means ± SEM (n = 3 或 4 )；与指定组相比，*P < 0.05,**P < 0.01。

图2 为本发明的实施例中Cep55 siRNA抑制TNBS诱导小鼠结肠炎的进展图；

其中，图2A 为实施例2中实验过程示意图，即为小鼠体内预先注射针对Cep55基因的经甲氧基修饰和胆固醇修饰的siRNA，特异性抑制Cep55的表达，第3天注射Cep55 siRNA1小时后给予小鼠灌肠2.5% TNBS 1次，监测小鼠的体重变化直至第9天实验结束，该过程的示意图；

图2B和图2C分别为 Cep55 siRNA对结肠炎小鼠体重和结肠长度的影响图；图2D为腹腔注射Cep55 siRNA后小鼠结肠中Cep55基因表达的变化图；图中数据代表means ± SEM(n = 3)。与指定组相比，*P < 0.05, **P < 0.01 , ***P < 0.001。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

TNBS与乙醇灌肠一次致炎是目前最为常用的结肠炎模型建立方法。该模型的作用机制是当TNBS溶于乙醇灌肠时，乙醇作为有机溶剂溶解肠黏膜表面的粘液，破坏肠粘膜屏障，然后进入局部肠组织，TNBS作为一种有机酸半抗原，可与小鼠体内结肠组织蛋白结合，形成全抗原，使T淋巴细胞致敏，从而引起肠壁一系列免疫应答反应，继而诱发结肠炎症。该模型持续时间较长，可充分体现急性炎症向慢性炎症迁延转化过程，并且其与临床上的结肠炎具有极高的相似度。

因此本发明通过TNBS诱导小鼠结肠炎模型，提取结肠的mRNA进行qPCR检测，发现Cep55 mRNA水平在TNBS诱导的结肠炎模型维持阶段升高4-5倍，提示Cep55可能在结肠炎炎症维持阶段发挥作用。

本发明通过抑制Cep55表达或抑制其功能都能够有效缓解结肠炎，说明Cep55参与结肠炎的发生发展。上述结果都说明可以将Cep55作为研发治疗结肠炎药物的潜在靶点。

基于上述研究，本发明的实施例通过TNBS诱导小鼠结肠炎模型检测小鼠Cep55mRNA水平。另外针对Cep55基因转录本设计了siRNA，并对其进行甲氧基修饰和胆固醇修饰，用以证明抑制Cep55表达能够缓解结肠炎的进展。

实施例1

Cep55在TNBS诱导的结肠炎的发生发展阶段表达增加

一、实验方法：

（1）TNBS诱导小鼠结肠炎模型的建立

将禁食24小时、不禁饮的C57BL/6J小鼠随机分成50%酒精对照组、TNBS结肠炎模型组，每组4只。50%酒精组给予50%酒精100μL灌肠1次；TNBS模型组给予2.5% TNBS/50%酒精100μL灌肠1次后，于第五天结束实验。监测小鼠每天的体重变化，小鼠处死后收集结肠组织标本，记录结肠的长度， RT-PCR法检测小鼠结肠组织中Cep55 mRNA表达水平。

（2）RNA提取及实时荧光定量PCR

按照Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取1μg总RNA，参考Vazyme公司HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit的说明进行逆转录反应。得到的cDNA产物稀释8倍用于实时荧光定量PCR的模板，每个PCR体系加入2μL模板，参考Vazyme公司AceQ qPCR SYBR GreenMaster Mix的说明进行，所用引物序列为：

Cep55 forward， 5′-CCTAGTAGCTCCAAGTCAGACA-3′

Cep55 reverse， 5′-ACCTTAGGTGGTCTTTGAGTCTC-3′

GAPDH forward， 5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′

GAPDH reverse， 5′-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3′

结果分析采用2-ΔΔCT法分析。

二、实验结果：

（1）TNBS诱导小鼠产生结肠炎

TNBS经灌肠的方式诱导小鼠结肠炎的产生。如图1A所示，TNBS模型组与对照组相比，TNBS模型组从给药后第3天开始体重显著降低（n=4，P < 0.05）。实验结束时，处死小鼠并取小鼠结肠，测量小鼠结肠长度。结果图1B所示，结果表明，与对照组相比，TNBS模型组小鼠结肠长度显著变短（n=4，P < 0.05）。体重减轻和结肠缩短说明TNBS诱导小鼠产生炎症，结肠炎模型建立成功。

（2）TNBS诱导的小鼠结肠炎模型中Cep55基因表达增加

利用TNBS经灌肠的方式诱导小鼠结肠炎产生。到第5天实验结束时，取小鼠结肠，通过qPCR分析结肠中Cep55基因表达情况。如图1C及图1D所示，炎症性结肠淋巴细胞和非淋巴细胞中Cep55 mRNA表达均显著性增加（n=3，P < 0.05 或P < 0.01）。这表明Cep55参与结肠炎的发生发展。

实施例2

抑制Cep55的表达能够缓解结肠炎的进展

1、实验方法

（1）设计合成小鼠Cep55 siRNA

通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中获取小鼠Cep55 mRNA的序列全长（NM_001164362.2），根据RNAi原理，结合设计软件，设计针对小鼠Cep55基因转录本的3个候选siRNA，经BLAST比对检查以保证和其他基因没有同源性，再进行化学合成。

3个候选siRNA的靶序列信息如下：

（2）筛选高效靶向Cep55的siRNA

以2 × 10⁵（个/孔）细胞数接种于24孔板中，待细胞生长汇合度达到70-90 % 时，通过Lipofectamine™ 3000转染试剂进行Cep55 siRNA干扰效率筛选实验。转染48小时后收集细胞，通过qPCR鉴定Cep55 siRNA的干扰效果。

（3）Cep55 siRNA对结肠炎进展的影响

将C57BL/6J小鼠随机分成non-target siRNA对照组、Cep55 siRNA组，同时设置不做任何处理的正常对照组，每组3只。给C57BL/6J小鼠连续3天腹腔注射Cep55 siRNA或对照siRNA（1 OD / mouse / day）后，同时在第3天注射siRNA 1小时后，给予2.5% TNBS/50%酒精100ul灌肠1次，到第9天时实验结束。监测小鼠每天的体重变化，收集结肠组织标本，记录结肠的长度，HE染色观察小鼠结肠组织炎症程度并评分，RT-PCR法检测小鼠结肠组织中Cep55 mRNA表达水平。

2、实验结果：

（1）Cep55 siRNA抑制TNBS诱导小鼠结肠炎的进展

通过细胞系筛选出siRNA-001干扰靶基因效果最好，选用此siRNA进行甲氧基修饰和胆固醇修饰，使siRNA在体内更稳定且不用借助于转染试剂直接在体内注射发挥RNA干扰作用。siRNA-001序列信息为：

正义链5′-CACCUAAGGUCAAGAUAUATT-3′；

反义链5′-UAUAUCUUGACCUUAGGUGTT-3′；

小鼠体内预先注射针对Cep55基因的经甲氧基修饰和胆固醇修饰的siRNA，特异性抑制Cep55的表达，第3天注射Cep55 siRNA 1小时后给予小鼠灌肠2.5% TNBS 1次，监测小鼠的体重变化直至第9天实验结束（图2A），检测Cep55 siRNA对小鼠结肠炎的影响。如图2B-2C所示，与non-targeting siRNA对照组相比，腹腔注射siRNA-001-2OMe+5Chol后可显著地抑制结肠炎引起的小鼠体重下降与结肠长度缩短（P < 0.001或P < 0.05，n = 3）。实时荧光定量PCR结果显示，如图2D所示，腹腔注射siRNA-001-2OMe+5Chol后，小鼠结肠中的Cep55mRNA水平显著下降（P < 0.05，n = 3）。这些结果表明抑制Cep55表达能够缓解TNBS诱导的结肠炎的进展。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.抑制Cep55作为靶点的抑制剂在制备诊断、预防或治疗结肠炎的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为抑制Cep55 mRNA的核酸分子, 所述核酸分子为siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003中的一种；其中，siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003分别如下：

siRNA-001：CACCUAAGGUCAAGAUAUATT；

siRNA-002：GUUUAGAACUCGAUGAAUUUU；

siRNA-003：GAAAGAUGCUCUGGAGAAAUU。

2.一种治疗结肠炎的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的抑制剂。

3.根据权利要求2所述的一种治疗结肠炎的药物，其特征在于，所述抑制Cep55 mRNA的核酸分子为siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003中的一种；其中，siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003分别如下：

siRNA-001：CACCUAAGGUCAAGAUAUATT；

siRNA-002：GUUUAGAACUCGAUGAAUUUU；

siRNA-003：GAAAGAUGCUCUGGAGAAAUU。

4.根据权利要求3所述的一种治疗结肠炎的药物，其特征在于，所述siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003采用甲氧基或胆固醇进行修饰。

5.Cep55小分子抑制剂在制备预防或治疗结肠炎药物中的应用，其特征在于，所述Cep55小分子抑制剂为抑制Cep55 mRNA的核酸分子，所述核酸分子为siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003中的一种；其中，siRNA-001、siRNA-002或siRNA-003分别如下：

siRNA-001：CACCUAAGGUCAAGAUAUATT；

siRNA-002：GUUUAGAACUCGAUGAAUUUU；

siRNA-003：GAAAGAUGCUCUGGAGAAAUU。