CN113340878B - 利用激光诱导击穿光谱技术对癌组织进行分子光谱成像来识别肿瘤边界的方法 - Google Patents
利用激光诱导击穿光谱技术对癌组织进行分子光谱成像来识别肿瘤边界的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种利用激光诱导击穿光谱技术对癌组织进行分子光谱成像来识别肿瘤边界的方法,属于成像领域。该方法包括以下步骤:(1)利用激光诱导击穿光谱技术对样本组织进行分子光谱成像,收集LIBS光谱;(2)对LIBS光谱进行基线校准后,提取CN分子谱线或C2分子谱线,获得谱线的强度相对值;(3)绘制出样本组织中的CN分子或C2分子分布热图;(4)将CN分子或C2分子分布热图进行聚类分析,即可识别出样本组织中的肿瘤区和坏死区边界。利用上述方法能够成功显示出肺癌患者癌组织或癌旁组织中肿瘤区和坏死区的边界,得到组织空间异质性信息。本发明提供的方法实现了对肺癌组织的分子光谱成像分析及肿瘤边界的识别,具有良好的应用前景和价值。
Description
技术领域
本发明属于成像领域,具体涉及一种利用激光诱导击穿光谱技术对癌组织进行分子光谱成像来识别肿瘤边界的方法。
背景技术
化学元素在人体的生理稳态中起着重要作用,元素的含量与分布失调可能导致病理变化,所以元素在生物组织中的含量与分布是有助于诊断和治疗,已有研究表明元素异常可能与癌症发生发展有关,因此人们尝试对癌组织的元素特征进行分析,与常用临床检测手段互补,解决肿瘤边界识别等难题。
医学上通常使用某些特殊的染色剂和指示剂的显色反应来检测生物组织中的金属元素。然而这些显色方法耗时长、灵敏度差、检测元素种类单一。一些更加灵敏的技术如透射电子显微镜结合能量色散X射线分析(TEM-EDX),同步辐射微分析(SXRF)或激光烧蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)在空间分辨率有一定的优势,但这些技术所需设备的复杂性以及较长的分析时间,难以用于常规的医学诊断。传统的组织病理学中广泛使用石蜡包埋法(FFPE)用于样本制备,上述的方法需要特殊的样品制备过程,无法直接对石蜡包埋样本进行分析,从而限制了其与传统组织病理学方法的互补性。
激光诱导击穿光谱(Laser Induced Breakdown Spectroscopy,LIBS)技术是一种对物质中的元素进行定量、定性分析的光谱分析技术。当一束高能脉冲激光聚焦到检测对象上时,会在极短时间内产生高温、高密度的等离子体,冷却时于激发态的原子跃迁回基态发出特定元素的原子谱线,用光谱仪直接收集样品表面等离子体产生的发射谱线信号,在计算机上记录得到特征光谱,可根据发射光谱的强度进行分析。LIBS技术具有多种优点,装置简单且便于搭建、实验样本不需要复杂的前处理,可远程探测,对样本损伤小,几乎不受样本相态以及元素种类限制,适用于固态、液态和气态样本。LIBS技术还具有在室温和环境压力条件下工作的能力,其高灵敏度可以探测ppm量级的元素含量,分辨率高达微米尺度。因此,LIBS技术十分适合用于生物组织中元素的快速、精确测量。
但是,目前已有的LIBS生物组织成像分析,研究多关注Na、钾、Ca、Mg等大量元素,这些元素易受到制样过程的影响。LIBS光谱中的分子谱线直接来源于烧蚀材料或来源于等离子体中的重组反应,反映了组织本身的特质以及激光组织的相互作用。然而目前已有的LIBS成像工作却忽视了分子光谱与生物组织空间异质性的联系,未见利用分子光谱成像来识别肿瘤边界的报道,更未见利用分子光谱成像来识别肺癌肿瘤边界的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用激光诱导击穿光谱技术对癌组织或癌旁组织进行分子光谱成像来识别肿瘤边界的方法。
本发明提供了一种识别肿瘤区和坏死区边界的方法,所述方法包括以下步骤:
(1)利用激光诱导击穿光谱技术对样本组织进行分子光谱成像,收集LIBS光谱;其中,所述样本组织为石蜡包埋后的肿瘤患者的组织;
(2)对LIBS光谱进行基线校准后,提取CN分子谱线或C2分子谱线,对CN分子谱线或C2分子谱线进行归一化处理,获得谱线的强度相对值;
(3)以颜色变化显示谱线的强度相对值变化,绘制出样本组织中的CN分子或C2分子分布热图,实现样本组织中CN分子或C2分子的可视化;
(4)将CN分子或C2分子分布热图进行聚类分析,即可识别出样本组织中的肿瘤区和坏死区边界。
进一步地,步骤(1)中,所述样本组织为石蜡包埋后的肿瘤患者的癌组织或癌旁组织。
进一步地,所述肿瘤患者为肺癌患者。
进一步地,所述肺癌为非小细胞肺癌。
进一步地,所述非小细胞肺癌为肺腺磷癌。
进一步地,步骤(1)中,所述激光诱导击穿光谱技术采用的设备包括以下部分:等离子激发装置、位移装置、信号采集装置、定位成像装置;所述激光诱导击穿光谱技术采用的设备的参数设置如下:激光能量20mJ,频率10Hz,延迟时间2μs,样品台步距100μm,速度5mm/s,分析过程中,持续的氩气气流通向分析区域。
进一步地,步骤(1)中,所述LIBS光谱的数量满足:对每平方厘米的样本组织采集10000条以上LIBS光谱。
进一步地,步骤(2)中,所述相对值为峰面积相对值或峰强度相对值,其中,峰面积相对值是对CN分子谱线387-389nm范围内的峰面积或对C2分子谱线515-518nm范围内的峰面积进行归一化处理后获得的,峰强度相对值是对CN分子谱线388.29nm处的峰强度或对C2分子谱线516.48nm处的峰强度进行归一化处理后获得的。
进一步地,步骤(4)中,所述聚类分析的方法为K-均值聚类算法。
进一步地,所述K-均值聚类算法中设置的K值≥4。
进一步地,所述方法还包括以下步骤:
(5)对LIBS光谱进行基线校准后,提取元素谱图的峰面积进行归一化处理,获得谱图峰面积相对值;所述元素选自Na、Ca、Mg、Al、Si、Fe、Cu元素中的一种或多种;
(6)以颜色变化显示元素谱图峰面积相对值变化,绘制出样本组织中的元素分布热图,实现样本组织中元素的可视化;
(7)将元素分布热图进行聚类分析,即可识别出样本组织中的肿瘤区和坏死区边界。
进一步地,所述Na元素谱图的峰面积为588.8-589.3nm范围内的峰面积;和/或,所述Ca元素谱图的峰面积为392.9-393.8nm范围内的峰面积;和/或,所述Mg元素谱图的峰面积为279.3-279.8nm范围内的峰面积;和/或,所述Al元素谱图的峰面积为395.9-396.3nm范围内的峰面积;和/或,所述Si元素谱图的峰面积为287.9-288.4nm范围内的峰面积;和/或,所述Fe元素谱图的峰面积为259.8-260.0nm范围内的峰面积;和/或,所述Cu元素谱图的峰面积为324.4-324.9nm范围内的峰面积。
关于本发明的使用术语的定义:除非另有说明,本文中术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该术语;对于本文没有具体定义的术语,应该根据公开内容和上下文,给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
本发明中,癌组织是指发生实质性癌变的组织。癌旁组织是指距肉眼可见肿瘤边缘外1cm的组织,也具有癌组织部分特征。正常组织是指远离肿瘤病灶无明显病变的组织。
癌组织可被划分出肿瘤区和坏死区;癌旁组织可被划分出肿瘤区,坏死区和正常区。
肿瘤区是指具有实体瘤的区域。坏死区是指在由于肿瘤生长过快导致营养缺乏,或药物刺激等原因造成的癌细胞坏死的区域。
分子光谱来源于组织中的蛋白质等有机物质,反映了组织本身的特质以及激光组织的相互作用,更能准确反映疾病发展状态;与元素分析相比,利用本发明基于LIBS技术获得的分子光谱来识别肿瘤区和坏死区边界的结果更准确。
实验结果表明,利用基于LIBS技术获得的CN分子谱线以及C2分子谱线均能够成功显示出肺癌患者癌组织或癌旁组织中肿瘤区和坏死区的边界,得到组织空间异质性信息。
本发明提供的方法实现了对肺癌组织的分子光谱成像分析及肿瘤边界的识别,具有良好的应用前景和价值。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1:本发明用于快速自动进行LIBS成像的装置的光路设计仿真图。
图2:本发明基于LIBS技术的分子光谱成像或元素成像来识别肺癌组织肿瘤边界的方法的流程示意图。
图3:分子谱成像结果,其中:a)癌组织,b)癌旁组织。
图4:分子谱聚类分析结果,其中:a)聚类示意图,b)癌组织,c)癌旁组织。
图5:多元素成像结果,其中:a)癌组织,b)癌旁组织,c)正常组织。
图6:癌组织的Na,Ca元素成像结果聚类分析。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品,通过购买市售产品所得。
实施例1:本发明用于快速自动进行LIBS成像的装置
本发明用于快速自动进行LIBS成像的装置设计主要包括四个部分:
(1)等离子激发装置:Nd:YAG激光器(Innolas,Germany)用于产生激光脉冲。激光束以较小的光斑尺寸聚焦到样品表面激发等离子体(图1)。具体为1064nm激光从设备后端小孔垂直入射到5X扩束镜上,激光经过扩束压缩发散角后继续入射进入激光/成像合轴系统,被1064R/532T二色分光镜反射转折90°再经过45mm焦距消色差物镜聚焦到待测样品上。
(2)位移装置:电动XYZ平台由来自数字延迟器的脉冲信号触发。随着样品被固定在位移台上按照设定的路径同步移动,激光在样品表面的不同位置产生等离子体从而对样品区域进行矩阵扫描。
(3)信号采集装置:光谱仪((本装置光谱仪可采用平面光栅及中阶梯光栅光谱仪,例如Avantes Technology,Netherlands)被同步外触发运行。等离子体信号由与激光光斑成45°角的光纤收集,然后传输到四通道光谱仪,该光谱仪配备有四个线性紧凑型电荷耦合器件(CCD),具有2048个像素用于光谱采集。收集的光谱覆盖了180-900nm的范围,分辨率为0.15nm。
(4)定位成像装置:对于定位装置,共焦绿色激光(532nm)通过光路到达样品,直接指示激光的焦点位置。对于成像装置,首先由照明系统照亮样品待测区域,经过样品漫反射的光被45mm焦距消色差物镜收集准直,其中532nm光线透过1064R/532T二色分光镜后经45°反射镜反射而转折90°,继续穿过450mm焦距消色差物镜并经过两个光路折叠反射镜成像在成像器件上。
上述装置实现了由激光同步操控样品移动与信号采集,自动化对组织样本进行高分辨率LIBS分析。
实施例2:基于LIBS技术的分子光谱成像来识别肺癌组织肿瘤边界的方法
本发明基于LIBS技术的分子光谱成像来识别肺癌组织肿瘤边界的方法包括以下步骤:
1、样本制备
对被诊断为腺磷癌的肺癌患者在手术切除后进行样本收集,收集癌组织,癌旁组织和正常组织三类组织;然后按标准病理方法进行石蜡包埋处理,并使用切片机对包埋组织的石蜡块进行切片,直至获得露出大部分组织的平整切面,后续LIBS分析直接在该切片后的石蜡块上进行。
同时收集5μm的连续切片进行H&E染色,并进行标准病理分析,用来作为LIBS成像分析结果的对照。
2、设置装置参数
采用实施例1的LIBS成像装置对步骤1切片后的石蜡块进行高分辨率LIBS分析,采集LIBS光谱,参数设置如下:
激光能量20mJ,频率10Hz,延迟时间2μs,样品台步距100μm,速度5mm/s,根据组织的面积大小设置扫描矩阵,对每平方厘米的样本采集10000条LIBS光谱。分析过程中,持续的氩气气流(1.5L/min)通向分析区域。
3、成像分析
对采集到的每一条LIBS光谱进行基线校准,得到预处理后的数据,然后提取CN分子谱线387-389nm范围内的峰面积以及C2分子谱线515-518nm范围内的峰面积,进行归一化处理,获得矩阵中每个点的分子光谱峰面积相对值。黑色对应0%的峰面积相对值,白色对应100%的峰面积相对值,以颜色变化显示光谱峰面积相对值变化,绘制出CN分子和C2分子分布热图,实现样本组织分子光谱分布的可视化。
癌组织和癌旁组织的CN分子、C2分子分布热图如图3所示。可以看出,CN分子谱和C2分子谱在癌组织,癌旁组织之间显示出了明显的差异。此外,通过与H&E染色切片对比,发现在肿瘤区CN强度明显升高,而C2强度明显减弱,CN与C2在肿瘤区显示出了相反的分布趋势。通过本发明的分子光谱成像方法,癌组织中的实体瘤区域(肿瘤区)被凸显(图3虚线)。
4、聚类分析:
通过K-Means(K-均值)聚类算法对成像结果进行聚类分析,设置不同的K值,将样本组织根据分子光谱的差异性划分成不同的簇,显示出肿瘤边界等异质性区域。
图4显示出了癌组织和癌旁组织中分子光谱聚类分析结果,其中K值代表聚类的簇的个数。通过与H&E染色切片对比,发现在癌组织中,当K=2时,组织与背景区域被清楚地区分开;随着K值增加到3,肺癌细胞的高密度区域被突出显示;当K=4时,CN分子和C2分子谱分析结果均显示出了肿瘤区和坏死区的边界(图4b)。在癌旁组织中,当K=4时,CN分子谱分析结果显示出了肿瘤区和坏死区的边界(图4c)。
上述结果表明,利用基于LIBS技术获得的CN分子谱线以及C2分子谱线能够成功显示出癌组织中肿瘤区和坏死区的边界;利用利用基于LIBS技术获得的CN分子谱线能够成功显示出癌旁组织中肿瘤区和坏死区的边界,
得到组织空间异质性信息。
实施例3:基于LIBS技术的元素成像来识别肺癌组织肿瘤边界的方法
本发明基于LIBS技术的元素成像来识别肺癌组织肿瘤边界的方法包括以下步骤:
1、样本制备
同实施例2。
2、设置装置参数
同实施例2。
3、成像分析
对采集到的LIBS光谱进行基线校准等数据预处理,然后提取Na(I)(588.8-589.3nm),Ca(Ⅱ)(392.9-393.8nm),Mg(I)(279.3-279.8nm),Al(I)(395.9-396.3nm),Si(I)(287.9-288.4nm),Fe(Ⅱ)(259.8-260nm)and Cu(I)(324.4-324.9nm)范围内的峰面积,进行归一化处理,获得矩阵中每个点的元素光谱峰面积相对值。黑色对应0%的峰面积相对值,白色对应100%的峰面积相对值,以颜色变化显示光谱峰面积相对值变化,绘制出元素分布热图,实现样本组织元素分布的可视化。
不同肺癌区域(癌组织,癌旁组织和正常组织)的多元素图像如图5所示。可观察到Ca、Mg、Na、Al、Fe、Si和Cu元素在癌组织,癌旁组织和正常组织表现出了差异性分布。通过与H&E染色切片对比,发现对于常量元素,首先,在与聚集的肺癌细胞相关的肿瘤区发现了高浓度Ca的聚集区域(图5);Mg的分布与Ca类似。在癌组织中(图5a),可以看到对应于肿瘤区的大面积高Ca和高Mg含量;在癌旁组织中(图5b),Ca和Mg热点也集中在剩余的肿瘤区,而坏死区的含量减少;在正常组织中(图5c),Ca和Mg的含量显著降低,无明显Ca和Mg信号积聚的热点区域。Na元素的分布则与Ca和Mg分布相反。对于微量元素,发现铜和铁在癌组织和癌旁组织中含量升高,肿瘤边界处出现Cu热点的分布(图5a和图5b),Al、Fe、Si也显示了差异性的分布。
4、聚类分析:
通过K-Means聚类算法对成像结果进行聚类分析,设置不同的K值,将样本组织根据元素的差异性划分成不同的簇,显示出肿瘤边界等异质性区域。
图6显示了癌组织中的Ca,Na元素聚类分析结果。通过与H&E染色切片对比,发现当K=4时,Ca突出癌组织中的肿瘤区域,显示出了肿瘤区和坏死区的边界;Na突出癌组织中的坏死/炎症组织,显示出了肿瘤区区和坏死区的边界。
上述结果表明,利用基于LIBS技术获得的多元素图像能够成功显示出肿瘤区区和坏死区的边界,得到组织空间异质性信息。
本发明基于LIBS技术获得的多元素图像和分子光谱图像均能够成功显示出肺癌肿瘤区和坏死区的边界,两种方法结合使用,对组织空间异质性信息的判断结果会更准确。
综上,本发明提供了一种利用激光诱导击穿光谱技术对癌组织或癌旁组织进行分子光谱成像来识别肿瘤边界的方法。实验结果表明,利用基于LIBS技术获得的CN分子谱线以及C2分子谱线均能够成功显示出肺癌患者癌组织或癌旁组织中肿瘤区和坏死区的边界,得到组织空间异质性信息。本发明提供的方法实现了对肺癌组织的分子光谱成像分析及肿瘤边界的识别,具有良好的应用前景和价值。
Claims (10)
1.一种识别肿瘤区和坏死区边界的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:
(1)利用激光诱导击穿光谱技术对样本组织进行分子光谱成像,收集LIBS光谱;其中,所述样本组织为石蜡包埋后的肿瘤患者的组织;
(2)对LIBS光谱进行基线校准后,提取CN分子谱线或C2分子谱线,对CN分子谱线或C2分子谱线进行归一化处理,获得谱线的强度相对值;
(3)以颜色变化显示谱线的强度相对值变化,绘制出样本组织中的CN分子或C2分子分布热图;
(4)将CN分子或C2分子分布热图进行聚类分析,即可识别出样本组织中的肿瘤区和坏死区边界。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述样本组织为石蜡包埋后的肿瘤患者的癌组织或癌旁组织。
3.根据权利要求1~2任一项所述的方法,其特征在于:所述肿瘤患者为肺癌患者。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述肺癌为非小细胞肺癌。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述非小细胞肺癌为肺腺磷癌。
6.根据权利要求1~2任一项所述的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述激光诱导击穿光谱技术采用的设备包括以下部分:等离子激发装置、位移装置、信号采集装置、定位成像装置;所述激光诱导击穿光谱技术采用的设备的参数设置如下:激光能量20mJ,频率10Hz,延迟时间2μs,样品台步距100μm,速度5mm/s,分析过程中,持续的氩气气流通向分析区域。
7.根据权利要求1~2任一项所述的方法,其特征在于:步骤(2)中,所述强度相对值为峰面积相对值或峰强度相对值,其中,峰面积相对值是对CN分子谱线387-389nm范围内的峰面积或对C2分子谱线515-518nm范围内的峰面积进行归一化处理后获得的,峰强度相对值是对CN分子谱线388.29nm处的峰强度或对C2分子谱线516.48nm处的峰强度进行归一化处理后获得的。
8.根据权利要求1~2任一项所述的方法,其特征在于:步骤(4)中,所述聚类分析的方法为K-均值聚类算法。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述K-均值聚类算法中设置的K值≥4。
10.根据权利要求1~2任一项所述的方法,其特征在于:所述方法还包括以下步骤:
(5)对LIBS光谱进行基线校准后,提取元素谱图的峰面积进行归一化处理,获得谱图峰面积相对值;所述元素选自Na、Ca、Mg、Al、Si、Fe、Cu元素中的一种或多种;
(6)以颜色变化显示元素谱图峰面积相对值变化,绘制出样本组织中的元素分布热图;
(7)将元素分布热图进行聚类分析,即可识别出样本组织中的肿瘤区和坏死区边界。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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