CN113337619B - 一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体公开一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。所述用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针中，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，探针的序列如SEQ ID NO:3所示。利用本发明的引物和探针的组合，可实现对蓝圆鰺源成分的准确检测，且上述引物和探针组合的特异性强、灵敏度高，灵敏度可达到14pg/μL，同时，检测的准确度高，能够实现对蓝圆鰺源成分的快速检测，对于防止敏感人群食入蓝圆鰺鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义，具有较高的实用价值。

Description

一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术

蓝圆鰺(Decapterus maruadsi)属于脊索动物门(Chordata)、硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)，鲹科(Carangidae)，圆鲹属(Decapterus)的一种。蓝圆鰺具有高蛋白、低脂肪、矿物质含量丰富等特点，是我国重要的经济鱼类之一，其体内还有含有人体所需的多种氨基酸、维生素以及锰、铁、锌等丰富的微量元素，也是一种优质的动物性蛋白鱼类。蓝圆鰺的主要特点是形体较小，头和内脏所占的比例相对较大，生长速度快，但肉质极易腐烂变质，目前主要以鲜销为主，其加工制品主要集中在加工成咸干品、动物饲料以及休闲食品、调味品，鱼糜制品等。由于其体内含有丰富的游离组氨酸，并存在产组胺的微生物，在适宜条件下极易产生组胺，蓝圆鰺还属于高组胺鱼类。食入高组胺鱼肉后，敏感人群会表现为皮疹、荨麻疹、呕吐、头痛等症状，常被称为“组胺中毒”。因此，建立一种准确定量检测鱼肉制品中蓝圆鰺源性成分的方法，对于防止敏感人群食入蓝圆鰺鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用，特异性好，灵敏度高，能准确快速的检测出鱼肉制品中是否含有蓝圆鰺源性成分。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：

上游引物-F：5'-TGGCCTTCCCTCGAATGA-3'(SEQ ID NO:1)；

下游引物-R：5'-CGGCCCCGGCTTCA-3'(SEQ ID NO:2)；

所述探针的序列如下：5'-CTTCTGACTACTCCCTCCGTCCTTCCTGC-3'(SEQ ID NO:3)。

相对于现有技术，本发明提供的用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合具有以下优势：

本申请以蓝圆鰺线粒体细胞色素c氧化酶亚基I(cox I)基因序列为基础，特异性设计引物对和探针，能够特异性结合到蓝圆鰺源模板DNA上，准确检测出蓝圆鰺源成分，且与鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶等均无交叉扩增反应，特异性强；且上述引物和探针组合的灵敏度高，对蓝圆鰺源性成分DNA的灵敏度达到14pg/μL，能够实现对蓝圆鰺源成分的快速检测，同时检测的准确度高，用时短，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，可实现在非实验室条件下快速检测出蓝圆鰺源成分，对于防止敏感人群食入蓝圆鰺鱼肉制品后过敏现象的发生具有重要意义，具有较高的实用价值。

优选的，所述探针的5'端修饰有荧光素，3'端修饰有荧光猝灭基团。

优选的，所述探针为：5'-FAM-CTTCTGACTACTCCCTCCGTCCTTCCTGC-Eclipse-3'。

本发明还提供了上述用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制品中蓝圆鰺源成分中的应用。

本发明还提供了一种用于蓝圆鰺源成分检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合。

优选的，所述试剂盒还包括PerfectStart II Probe qPCR SuperMix和ddH₂O。

本发明还提供利用上述试剂盒检测鱼肉制品中蓝圆鰺源成分的方法，其特征在于：具体操作为：提取待测物的基因组DNA为模板，用所述试剂盒进行real-time PCR扩增，扩增完成后收集荧光信号。

上述检测鱼肉制品中蓝圆鰺源成分的方法，操作简单、反应时间短、反应结果直观准确，可用于蓝圆鰺源成分的快速检测。

优选的，所述real-time PCR扩增的反应体系包括以下试剂及用量：2×PerfectStart II Probe qPCR SuperMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL～2μL，探针1μL～2μL，DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为320nmol/L，所述探针的浓度为320mol/L。

优选的，所述real-time PCR扩增的条件为：95℃30s；95℃5s；60℃35s；40个循环。

上述优选的反应体系和扩增条件可进一步提高蓝圆鰺源成分的检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例2中real-time PCR方法的特异性试验结果图；

图2是本发明实施例3中real-time PCR方法的灵敏度试验结果图；

图3是本发明实施例3中线性关系图；

图4是本发明实施例4中real-time PCR方法的检出限试验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1 材料与方法

1.1 材料

鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶、虹鳟、大马哈鱼、鲤鱼、鲶鱼、蓝圆鰺，均为本实验室保存。

DNA提取试剂盒Wizard Genomic DNA Purification Kit和2×PerfectStart IIProbe qPCR SuperMix：购于北京全式金生物技术有限公司。

混合型球磨仪MM400：购于德国莱驰公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计：购于美国Thermo Scientific公司；QuantStudio5实时荧光PCR仪：购于美国ABI公司。

1.2方法

1.2.1引物设计

根据GenBank登录的蓝圆鰺线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(cox I)DNA序列设计引物和探针，设计得到的引物序列如表1所示，并由北京擎科生物有限公司合成。

表1引物和探针

上述引物序列扩增后的碱基序列如下所示(SEQ ID NO:4)：

TGGCCTTCCCTCGAATGAACAACATGAGCTTCTGACTACTCCCTCCGTCCTTCCTGCTGCTTCTAGCCTCTTCAGGCGTTGAAGCCGGGGCCG

1.2.2样品处理和基因组DNA的提取

分别取鱼肉放于料理机中制成肉泥，于65℃烘箱中放置16h烘干，然后置于混合型球磨仪MM400中研磨成粉末，过60目筛子后于4℃密封保存，不同样品的制备过程应避免污染。

以电子天平称量鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶、蓝圆鰺肉粉样本，每份样本总量为50mg。参照美国Promega公司Wizard Genomic DNAPurification Kit试剂盒操作说明，进行肉粉样品基因组DNA的提取，使用NanoDrop 2000C超微量分光光度计测定DNA浓度，-20℃保存备用。

1.2.3实时荧光PCR方法的建立及优化

上述试剂盒包括上游引物、下游引物、探针、PerfectStart II Probe qPCRSuperMix和ddH₂O。

以提取的蓝圆鰺基因组DNA为模板，配制25μL反应体系：2×PerfectStar t IIProbe qPCR SuperMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，ddH₂O补足至25μL。

采用real-time PCR对上述反应体系进行扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。

分别设计不同浓度的引物和探针组合，以能给出最低Ct值和最高荧光强度的组合为最佳组合。其中上游引物和下游引物终浓度分别为160nmol/L、240nmol/L、320nmol/L、400nmol/L、600nmol/L，探针终浓度分别为160nmol/L、240nmol/L、320nmol/L、400nmol/L、600nmol/L。

选择荧光信号最强、扩增曲线出现最早的引物探针组合：当上游引物和下游引物终浓度分别为320nmol/L、探针终浓度为320nmol/L时，蓝圆鰺源性成分特异性扩增曲线的荧光信号最强，出现扩增曲线时间最早。

实施例2特异性试验

以鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶、虹鳟、大马哈鱼、鲶鱼和蓝圆鰺基因组DNA为模板，根据1.2.2中公开的样品处理和基因组DNA的提取方法进行提取，同时以ddH₂O为空白对照，分别进行real-time PCR检测，检测结果如图1所示。从图1中可以看出，空白对照未出现扩增，说明反应体系未受污染；只有蓝圆鰺基因组DNA出现典型的“S”型扩增曲线，而鳕鱼、罗非鱼、鲅鱼、巴沙鱼、金枪鱼、鲤鱼、三文鱼、低眼巨鲶等其它物种均无扩增曲线，由此说明本申请建立的real-time PCR方法具有良好的特异性。

上述real-time PCR的反应体系：2×PerfectStart II Probe qPCRSuperMix12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，ddH₂O补足至25μL，其中上游引物和下游引物终浓度分别为320nmol/L、探针终浓度为320nmol/L。

上述real-time PCR的反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。

实施例3灵敏度试验

将实施例2中提取的蓝圆鰺基因组DNA浓度稀释至为1.4×10⁵pg/μL，进行10倍倍比稀释至1.4×10^-2pg/μL，以1μL不同浓度的基因组DNA作为模板，采用实施例1中所述的试剂盒进行real-time PCR荧光检测，real-time PCR的反应体系为：2×PerfectStart IIProbe qPCR SuperMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，ddH₂O补足至25μL，其中上游引物和下游引物终浓度分别为320nmol/L、探针终浓度为320nmol/L，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。每次试验设3个平行，检测结果如图2所示。

从图2中可以看出，当反应体系中模板量为14pg时，出现典型扩增曲线，Ct值为33.81；当模板量低于14pg时，均没有出现扩增曲线，即本申请提供的用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒能明确检测出蓝圆鰺源性成分，灵敏度高，对蓝圆鰺源性成分DNA的灵敏度达到14pg/μL。

根据不同浓度扩增的Ct值与基因组DNA浓度(pg/μL)的对数值建立蓝圆鰺实时荧光PCR方法的的标准曲线，以蓝圆鰺基因组DNA浓度的对数值为横轴，Ct值为纵轴，建立二者之间的线性关系，如图3所示，得到的线性回归方程为：y＝-4.335x+41.206，R²＝0.999，扩增效率为1.03，由此可知，本申请提供的蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒对检测鱼肉制品中的蓝圆鰺源成分可行性高，引物和探针组合对模板DNA的扩增效果优异。

实施例4检出限

将蓝圆鰺肉样与鳕鱼肉样按照以一定质量比例混合，制成蓝圆鰺肉样质量含量分别为50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％的混合样品，根据1.2.2公开的方法提取样品DNA。以1μL为模板，采用实施例1中所述的试剂盒进行real-time PCR荧光检测，real-time PCR的反应体系为：2×PerfectStart II Probe qPCR SuperMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，ddH₂O补足至25μL，其中上游引物和下游引物终浓度分别为320nmol/L、探针终浓度为320nmol/L，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。每次试验设3个平行，对该方法的检出限进行分析，结果如图4所示，从图中可以看出，本申请提供的用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒以及实时荧光PCR检测方法对蓝圆鰺源成分的检出限为0.1wt％。

实施例5市售商品检测

从市售商品烤鱼片、鱼肉肠、鱼罐头等鱼肉制品中选取280份基因组DNA为模板，根据1.2.2中公开的样品处理和基因组DNA的提取方法进行提取，然后采用实施例1中所述的试剂盒进行real-time PCR荧光检测，real-time PCR的反应体系为：2×PerfectStart IIProbe qPCR SuperMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL，探针1μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，ddH₂O补足至25μL，其中上游引物和下游引物终浓度分别为320nmol/L、探针终浓度为320nmol/L，反应条件为：95℃30s；95℃5s，退火温度为60℃35s，40个循环，在每次循环退火时收集荧光信号。每次试验设2个平行，检测结果为：其中5份样品出现典型的“S”型扩增曲线，表明其含有蓝圆鰺源性成分，并记录其Ct值，结果如表2所示。从表2中可以看出，5份样品中检出蓝圆鰺源性成分，样品的Ct值在20.42～29.45之间，其余样品未检出蓝圆鰺源性成分。

表2鱼肉制品中蓝圆鰺的检测结果

鱼肉制品编号	蓝圆鰺源性成分(Ct)
		1	20.42/20.50
2	22.42/22.50
		3	21.22/21.32
4	29.12/29.35
		5	29.43/29.45

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 石家庄海关技术中心

<120> 一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合、试剂盒及其应用

<130> 2021.7.8

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tggccttccc tcgaatga 18

<210> 2

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cggccccggc ttca 14

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cttctgacta ctccctccgt ccttcctgc 29

<210> 4

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tggccttccc tcgaatgaac aacatgagct tctgactact ccctccgtcc ttcctgctgc 60

ttctagcctc ttcaggcgtt gaagccgggg ccg 93

Claims (8)

1.一种用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合，其特征在于：包括引物对和探针，所述引物对的序列如下：

上游引物-F：5'-TGGCCTTCCCTCGAATGA-3'；

下游引物-R：5'-CGGCCCCGGCTTCA-3'；

所述探针-P的序列如下：5'-CTTCTGACTACTCCCTCCGTCCTTCCTGC-3'；

其中，所述探针的5'端修饰有荧光素，3'端修饰有荧光猝灭基团。

2.如权利要求1所述的用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合，其特征在于，所述探针为：5'-FAM-CTTCTGACTACTCCCTCCGTCCTTCCTGC-Eclipse-3'。

3.如权利要求1或2所述的用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合在非诊断性检测鱼肉制品中蓝圆鰺源成分中的应用。

4.一种用于蓝圆鰺源成分检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1或2所述的用于蓝圆鰺源成分检测的引物和探针组合。

5.如权利要求4所述的用于蓝圆鰺源成分检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PerfectStart II Probe qPCR SuperMix和ddH₂O。

6.利用权利要求5所述的试剂盒检测鱼肉制品中蓝圆鰺源成分的方法，其特征在于：具体操作为：提取待测物的基因组DNA为模板，用所述试剂盒进行real-time PCR扩增，扩增完成后收集荧光信号。

7.如权利要求6所述的检测鱼肉制品中蓝圆鰺源成分的方法，其特征在于：所述real-time PCR扩增的反应体系包括以下试剂及用量：2×PerfectStart II Probe qPCRSuperMix 12.5μL，上游引物和下游引物各1μL~2μL，探针1μL~2μL，DNA模板1μL，ddH₂O补足至25μL；其中，所述上游引物和下游引物的浓度均为320nmol/L，所述探针的浓度为320nmol/L。

8.如权利要求6所述的检测鱼肉制品中蓝圆鰺源成分的方法，其特征在于：所述real-time PCR扩增的条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60 ℃ 35 s；40个循环。

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