CN113286610A - 抗her2多肽和其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及跨BBB并且结合于脑实质中的HER2的抗HER2构建体，如Fc多肽二聚体‑抗体可变区融合蛋白。在一些实施方案中，所述抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体‑抗体可变区融合蛋白)在结合于HER2时保留效应子功能，但不会体内大体上消耗网状细胞。本公开还涉及用于跨BBB胞转抗HER2抗体可变区并且治疗HER2阳性癌症和其转移性病灶的方法。
Description
背景技术
目前，治疗如乳腺癌等癌症的脑转移展现令人生畏的临床挑战。在乳腺癌患者中，脑转移的发病率高达50％。临床数据指示，HER2阳性乳腺癌具有转移至脑的倾向。值得注意的是，已证明抗HER2疗法可用于控制颅外肿瘤，但不可用于控制颅内病灶。这些疗法不能控制转移性病灶(如HER2阳性乳腺癌的脑转移)的原因主要在于治疗剂不能跨血脑屏障(BBB)并且进入脑实质。因此，需要可跨BBB并且靶向脑实质中的HER2的新型治疗剂。
发明内容
在一些方面，本文提供Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：(a)能够结合人类表皮生长因子受体2(HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；和(b)修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的一个或多个氨基酸修饰的第一Fc多肽。所述抗体可变区可以包括重链可变区和轻链可变区。
在一些实施方案中，所述蛋白质包括(i)抗体轻链的两个拷贝，(ii)与所述第一Fc多肽融合的第一重链可变区，和(iii)与第二Fc多肽融合的第二重链可变区。每一轻链可以与所述重链可变区之一配对，所述第一和第二Fc多肽可一起形成Fc二聚体。所述第一重链可变区可(从N末端至C末端)与CH1结构域融合，所述CH1结构域又与铰链区融合，所述铰链区又与所述第一Fc多肽融合，和/或所述第二重链可变区可(从N末端至C末端)与CH1结构域融合，所述CH1结构域又与铰链区融合，所述铰链区又与所述第二Fc多肽融合。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:70的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ IDNO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQID NO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:76的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:253的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:251的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，TfR结合位点是在修饰的CH3结构域内。在一些实施方案中，修饰的CH3结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域。在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的CH3结构域在包含380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421的一组氨基酸位置中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一个取代。在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的CH3结构域包含在位置380处的Glu、Leu、Ser、Val、Trp、Tyr或Gln；在位置384处的Leu、Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val；在位置386处的Leu、Thr、His、Pro、Asn、Val或Phe；在位置387处的Val、Pro、Ile或酸性氨基酸；在位置388处的Trp；在位置389处的脂肪族氨基酸、Gly、Ser、Thr或Asn；在位置390处的Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala、Asp、Glu、Asn、Arg或Thr；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr、Pro、Ile或His；在位置415处的Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在位置416处的Thr、Arg、Asn或酸性氨基酸；和/或在位置421处的芳香族氨基酸、His或Lys。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白结合于TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，所述Fc多肽之一含有氨基酸修饰，在Fc多肽二聚体结合于TfR时，所述修饰降低FcγR结合(例如，但在不结合于TfR时具有有限的结合或不会使结合降低)。根据EU编号，所述修饰可以在第一Fc多肽上的位置234处和在位置235处包含Ala。在一些实施方案中，两种Fc多肽均含有降低FcγR结合的氨基酸修饰(例如，两种多肽在位置234处和在位置235处均含有Ala)。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合物是岩藻糖缺乏的或无岩藻糖基化的(例如，如本文所述)。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。在一些实施方案中，根据EU编号，增加血清半衰期的氨基酸修饰包含(i)在位置428处的Leu和在位置434处的Ser，或(ii)在位置434处的Ser或Ala。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽还包含杵突变T366W并且第二Fc多肽包含臼突变T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67和68中任一者的氨基酸序列。
在其他方面，本文提供Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:70的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ IDNO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQID NO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:76的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:253的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:251的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在其他方面，本文提供Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:70的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ IDNO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQID NO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:76的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:253的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:251的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在其他方面，本文提供Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:70的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ IDNO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQID NO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:76的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:253的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:251的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在其他方面，本文提供Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:70的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ IDNO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQID NO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:76的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:253的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个(例如，所有六个)选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQID NO:251的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，修饰的Fc多肽二聚体不会大体上消耗网状细胞。在一些实施方案中，在施用Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白后所消耗网状细胞的量少于在施用对照后所消耗网状细胞的量。在一些实施方案中，所述对照是相应TfR结合多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其具有完全效应子功能和/或不含降低FcγR结合的突变。
在其他方面，本文提供抗体重链，其包含：(a)抗人类HER2抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，其含有产生TfR结合位点的修饰。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽包括在结合于TfR时降低FcγR结合的一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ IDNO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ IDNO:71的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ IDNO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ IDNO:252的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TfR结合位点是在修饰的CH3结构域内。在一些实施方案中，修饰的CH3结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域。在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的CH3结构域在包含380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421的一组氨基酸位置中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一个取代。在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的CH3结构域包含在位置380处的Glu、Leu、Ser、Val、Trp、Tyr或Gln；在位置384处的Leu、Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val；在位置386处的Leu、Thr、His、Pro、Asn、Val或Phe；在位置387处的Val、Pro、Ile或酸性氨基酸；在位置388处的Trp；在位置389处的脂肪族氨基酸、Gly、Ser、Thr或Asn；在位置390处的Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala、Asp、Glu、Asn、Arg或Thr；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr、Pro、Ile或His；在位置415处的Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在位置416处的Thr、Arg、Asn或酸性氨基酸；和/或在位置421处的芳香族氨基酸、His或Lys。
在一些实施方案中，根据EU编号，在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰包含在位置234处和在位置235处的Ala。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽还包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。在一些实施方案中，根据EU编号，增加血清半衰期的氨基酸修饰包含(i)在位置428处的Leu和在位置434处的Ser，或(ii)在位置434处的Ser或Ala。在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的Fc多肽还包含杵突变T366W。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在其他方面，本文提供抗体重链，其包含：(a)抗人类HER2抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W。
在一些实施方案中，抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ IDNO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ IDNO:71的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ IDNO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ IDNO:252的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列。
在其他方面，本文提供抗体重链，其包含：(a)抗人类HER2抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S。
在一些实施方案中，抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ IDNO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ IDNO:71的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ IDNO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列；和(c)重链CDR3，其包含SEQ IDNO:252的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链可变区包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列。
在其他方面，本文提供一种药物组合物，其包含本文所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和药学上可接受的载体。
在其他方面，本文提供一种跨内皮胞转能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段的方法，所述方法包括使内皮与包含本文所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合物接触。在一些实施方案中，内皮是BBB。
在其他方面，本文提供一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含本文所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述癌症是HER2阳性癌症。在一些实施方案中，所述HER2阳性癌症是HER2阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述HER2阳性癌症是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌。所述HER2阳性癌症是转移癌。
在其他方面，本文提供一种用于治疗受试者的HER2阳性癌症的脑转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含本文所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述HER2阳性癌症是HER2阳性乳腺癌。在一些实施方案中，所述HER2阳性癌症是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌。
在一些实施方案中，施用不同的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合(例如，结合于HER2的子结构域IV和II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合)。在一些实施方案中，向受试者施用第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区(即，抗HER2子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)，并且其中所述第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ IDNO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区(即，抗HER2子结构域II Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)。在一些实施方案中，抗HER2子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用或与抗HER2子结构域IIFc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白组合施用。在一些实施方案中，抗HER2子结构域II Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用或与抗HER子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白组合施用。在某些实施方案中，抗HER2子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用。在某些实施方案中，抗HER2子结构域II Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用。
在一些实施方案中，施用不同的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合(例如，结合于HER2的子结构域II和I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合)。在一些实施方案中，向受试者施用第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区(即，抗HER2子结构域II Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)，并且其中所述第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区(即，抗HER2子结构域I Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)。在一些实施方案中，抗HER2子结构域II Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用或与抗HER2子结构域IFc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白组合施用。在一些实施方案中，抗HER2子结构域I Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用或与抗HER子结构域II Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白组合施用。在某些实施方案中，抗HER2子结构域II Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用。在某些实施方案中，抗HER2子结构域I Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用。
在一些实施方案中，施用不同的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合(例如，结合于HER2的子结构域IV和I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合)。在一些实施方案中，向受试者施用第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区(即，抗HER2子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)，并且其中所述第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区(即，抗HER2子结构域IFc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)。在一些实施方案中，抗HER2子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用或与抗HER2子结构域I Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白组合施用。在一些实施方案中，抗HER2子结构域I Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用或与抗HER子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白组合施用。在某些实施方案中，抗HER2子结构域IV Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用。在某些实施方案中，抗HER2子结构域I Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可单独施用。
在一些实施方案中，包含Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合物拮抗HER2活性。在一些实施方案中，受试者先前未用抗HER2疗法和/或针对转移性疾病的化学疗法治疗。
另一方面，本公开提供一种用于治疗受试者的癌症或治疗癌症的脑转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的结合于(a)人类HER2的子结构域I或II和(b)转铁蛋白受体(TfR)的抗HER2构建体，其中单独的所述抗HER2构建体对于治疗所述癌症是治疗上有效的。
在这方面的一些实施方案中，抗HER2构建体包含结合于人类HER2的子结构域I或II的抗体可变区。抗HER2构建体可以包含修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽。举例来说，抗HER2构建体是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。
在这方面的其他实施方案中，抗HER2构建体包含结合TfR的抗体可变区。举例来说，抗HER2构建体可以是双特异性构建体，其包含结合于人类HER2的子结构域I或II的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区。
在一些实施方案中，抗HER2构建体作为单一疗法施用于受试者。在一些实施方案中，抗HER2构建体是与化学疗法或放射疗法组合施用。
在一些实施方案中，抗HER2构建体特异性地结合于同一细胞上的HER2和TfR。
另一方面，本公开提供一种用于治疗受试者的癌症或治疗癌症的脑转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的：
(a)第一抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域II；和
(b)第二抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域IV，或
(a)第一抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域I；和
(b)第二抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域IV，或
(a)第一抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域I；和
(b)第二抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域II，
其中所述第一和/或所述第二抗HER2构建体也结合TfR。
在这方面的一些实施方案中，第一抗HER2构建体而非第二抗HER2构建体结合TfR。第一抗HER2构建体可特异性地结合于同一细胞上的TfR和HER2。
在一些实施方案中，第二抗HER2构建体而非第一抗HER2构建体结合TfR。第二抗HER2构建体可特异性地结合于同一细胞上的TfR和HER2。
在这方面的一些实施方案中，第一和/或第二抗HER2构建体包含抗体可变区，其结合于人类HER2的子结构域I、II或IV；和修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽。在某些实施方案中，第一抗HER2构建体是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。在某些实施方案中，第二抗HER2构建体是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。在某些实施方案中，第一和第二抗HER2构建体是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含结合于HER2的子结构域II的两个重链可变区和两个轻链可变区，其中所述两个重链可变区中的每一者包含重链CDR1(CDR-H1)、CDR H2和CDR H3，并且所述两个轻链可变区中的每一者包含轻链CDR1(CDR-L1)、CDR L2和CDR L3，并且其中：
(1)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(2)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(3)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(4)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(5)所述CDR-L2包含相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代的序列；并且
(6)所述CDR-L3包含相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代的序列。
在结合于HER2的子结构域II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的一些实施方案中，两个重链可变区中的每一者包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列并且两个轻链可变区中的每一者包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含结合于HER2的子结构域I的两个重链可变区和两个轻链可变区，其中所述两个重链可变区中的每一者包含重链CDR1(CDR-H1)、CDR H2和CDR H3，并且所述两个轻链可变区中的每一者包含轻链CDR1(CDR-L1)、CDR L2和CDR L3，并且其中：
(1)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(2)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(3)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(4)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(5)所述CDR-L2包含相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代的序列；并且
(6)所述CDR-L3包含相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代的序列。
在结合于HER2的子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的一些实施方案中，两个重链可变区中的每一者包含与SEQ ID NO:256的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列并且两个轻链可变区中的每一者包含与SEQ ID NO:257的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含结合于HER2的子结构域IV的两个重链可变区和两个轻链可变区，
其中所述两个重链可变区中的每一者包含重链CDR1(CDR-H1)、CDR H2和CDR H3，并且所述两个轻链可变区中的每一者包含轻链CDR1(CDR-L1)、CDR L2和CDR L3，并且其中：
(1)所述CDR-H1包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(2)所述CDR-H2包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(3)所述CDR-H3包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(4)所述CDR-L1包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于其具有最多两个氨基酸取代的序列；
(5)所述CDR-L2包含相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代的序列；并且
(6)所述CDR-L3包含相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代的序列。
在结合于HER2的子结构域IV的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的一些实施方案中，两个重链可变区中的每一者包含与SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列并且两个轻链可变区中的每一者包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列。
在这方面的一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的Fc多肽中的TfR结合位点包含修饰的CH3结构域。所述修饰的CH3结构域可以源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域。根据EU编号，所述修饰的CH3结构域可以在包含380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421的一组氨基酸位置中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一个取代。
在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的CH3结构域包含在位置380处的Glu、Leu、Ser、Val、Trp、Tyr或Gln；在位置384处的Leu、Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val；在位置386处的Leu、Thr、His、Pro、Asn、Val或Phe；在位置387处的Val、Pro、Ile或酸性氨基酸；在位置388处的Trp；在位置389处的脂肪族氨基酸、Gly、Ser、Thr或Asn；在位置390处的Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala、Asp、Glu、Asn、Arg或Thr；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr、Pro、Ile或His；在位置415处的Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在位置416处的Thr、Arg、Asn或酸性氨基酸；和/或在位置421处的芳香族氨基酸、His或Lys。
在本公开的这方面的一些实施方案中，抗HER2构建体结合于TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽二聚体包含第一Fc多肽，所述第一Fc多肽包含在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰。在某些实施方案中，根据EU编号，氨基酸修饰包含在位置234处和在位置235处的Ala。在一些实施方案中，存在于Fc多肽二聚体中的一种或两种Fc多肽包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。在某些实施方案中，根据EU编号，增加血清半衰期的氨基酸修饰包含(i)在位置428处的Leu和在位置434处的Ser，或(ii)在位置434处的Ser或Ala。
在本公开的这方面的一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽还包含杵突变T366W，并且Fc多肽二聚体中的第二Fc多肽包含臼突变T366S、L368A和Y407V。举例来说，在一些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67和68中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合于人类HER2的子结构域II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：
(a)具有SEQ ID NO:38的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:55的序列的第二重链；
或
(b)具有SEQ ID NO:46的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:55的序列的第二重链；
或
(c)具有SEQ ID NO:30的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:55的序列的第二重链。
在一些实施方案中，结合于人类HER2的子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：
(a)具有SEQ ID NO:267的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:290的序列的第二重链；
或
(b)具有SEQ ID NO:275的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:290的序列的第二重链；
或
(c)具有SEQ ID NO:259的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:290的序列的第二重链。
在一些实施方案中，结合于人类HER2的子结构域IV的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：
(a)具有SEQ ID NO:10的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:27的序列的第二重链；
或
(b)具有SEQ ID NO:18的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:27的序列的第二重链；
或
(c)具有SEQ ID NO:2的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:27的序列的第二重链。
在这方面的其他实施方案中，第一和/或第二抗HER2构建体包含结合TfR的抗体可变区。举例来说，第一抗HER2构建体可以是双特异性构建体，其包含结合于人类HER2的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区。第二抗HER2构建体可以是双特异性构建体，其包含结合于人类HER2的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区。第一和第二抗HER2构建体两者均可以是双特异性构建体，其包含结合于人类HER2的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区。
在本公开的这方面的一些实施方案中，癌症是HER2阳性乳腺癌。HER2阳性癌症可以是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌。
另一方面，本公开提供一种降低细胞表面上的TfR表达水平的方法，其是通过使所述细胞与结合于(a)人类HER2的子结构域I、II或IV和(b)转铁蛋白受体(TfR)的抗HER2构建体接触来实施，其中所述单独的抗HER2构建体在降低所述细胞的细胞表面上的TfR表达水平方面有效，并且其中所述抗HER2构建体结合于同一细胞上的TfR和HER2两者。在这方面，所述抗HER2构建体可以是本文所述构建体中的任一者，如Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白(其包括能够结合于人类HER2的抗体可变区；和修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽)或抗HER2双特异性构建体(其包括能够结合于人类HER2的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区)。
另一方面，本公开提供一种使构建体结合于细胞上表达的TfR和人类HER2(例如，同一细胞上表达的TfR和人类HER2)的方法，其包括使所述细胞与结合于(a)人类HER2的子结构域I、II或IV和(b)转铁蛋白受体(TfR)的抗HER2构建体接触，其中当细胞与抗HER2构建体接触时，所述抗HER2构建体降低所述细胞的细胞表面上的TfR表达水平。在这方面，结合于TfR和人类HER2的构建体可以是本文所述构建体中的任一者，如Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白(其包括能够结合于人类HER2的抗体可变区；和修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽)或抗HER2双特异性构建体(其包括能够结合于人类HER2的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区)。
在一些实施方案中，当细胞与融合蛋白接触时，抗HER2构建体使所述细胞的细胞表面上的TfR表达水平降低至少10％(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％)。
在一些实施方案中，抗HER2构建体包含结合于人类HER2的子结构域I、II或IV的抗体可变区。在某些实施方案中，抗HER2构建体可以包含结合于人类HER2的子结构域I、II或IV的抗体可变区；和修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽。举例来说，抗HER2构建体可以是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。在其他实施方案中，抗HER2构建体可以是双特异性构建体，其包含结合于人类HER2的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区。
在本文所述的任一方面，在一些实施方案中，细胞是癌细胞(例如，转移性癌细胞)。在某些实施方案中，癌细胞表达HER2和TfR两者。在一些实施方案中，细胞可以是乳腺癌细胞(例如，HER2阳性癌细胞)。在本文所述的任一方面的一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如人类细胞(例如，人类癌细胞)。
在本文所述的任一方面，在一些实施方案中，细胞是在哺乳动物(如人类)中。在一些实施方案中，人类患有或已被诊断患有HER2阳性癌症。在某些实施方案中，HER2阳性癌症是转移癌。在特定实施方案中，HER2阳性转移癌已转移至脑。
附图简述
图1A和图1B示出BiacoreTM数据。图1A示出使用抗HER2_DIV、HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA、抗HER2_DII和HER2_DII-35.23.1.1cisLALA时对HER2细胞外结构域的结合亲和力。图1B示出使用HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA和HER2_DII-35.23.1.1cisLALA时对人类顶端hTfR的结合亲和力。
图2示出使用WST1试剂时BT474细胞的生长抑制分析，其示出抗HER2_DIV、HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA、抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合和HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合在第6天对癌细胞增殖的抑制。
图3示出Western印迹数据，其证明在用抗HER2_DIV和HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA处理的BT474细胞中，磷酸化AKT(p-AKT)减少。
图4示出使用WST1试剂时BT474细胞的生长抑制分析，其示出在神经调节蛋白-1存在下抗HER2_DIV、HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA、抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合和HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合在第6天的癌细胞增殖反应。
图5示出在神经调节蛋白-1存在下用抗HER2_DIV和HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA、抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合和HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合处理的BT474细胞中磷酸化AKT(p-AKT)的蛋白质水平的Western印迹数据。
图6示出使用HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA时SK-BR-3细胞中的ADCC活性。
图7A-7C示出在SCID小鼠中，ATV:HER2-DIV和ATV:HER2-DII在BT474异种移植物肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效。图7A示出与抗HER2-DIV+抗HER2-DII相比，在用ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII治疗的动物中，肿瘤生长抑制显著更高。图7B示出使用3mg/kg、10mg/kg和20mg/kg剂量的每一测试物品时的剂量-反应关系，其示出ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII比抗HER2-DIV+抗HER2-DII更有效。图7C示出抗HER2-DIV+抗HER2-DII和ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII两者的治疗显著降低pAKT水平，这与其中靶向HER2可消除在HER2+肿瘤中活化的PI3K/Akt信号传导途径的机制一致。“ATV”是指结合TfR的Fc多肽。
图8A-8C示出用ATV:HER2-DIV和ATV:HER2-DII治疗的TfRmu/hu KI小鼠的血浆暴露、脑摄取和脑:血浆比率。
图9A和图9B示出使用ATV:HER2-DIV时BT474细胞和OE19细胞的生长抑制分析，其示出在抗HER2_DIV抗性HER2+癌细胞系中，与抗HER2_DIV相比，ATV:HER2-DIV具有增加的抗增殖效应。
图10A和图10B示出使用ATV:HER2-DII时BT474细胞和OE19细胞的生长抑制分析，其示出ATV:HER2-DII具有优于抗HER2-DII的生长抑制，而ATV:对照和具有或不具有抗HER2-DII的抗TfR组在HER2+癌细胞系中具有极小效应。
图11示出使用ATV:HER2-DI时OE19细胞的生长抑制分析，其示出在HER2+癌细胞系中，ATV:HER2-DI具有优于抗HER2-DI的生长抑制。
图12示出使用ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII时在不具有NRG1的情形下BT474细胞的生长抑制分析，其示出在具有或不具有NRG1的情形下，ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII的组合在生长抑制方面比抗HER2-DIV+抗HER2-DII的组合更有效。
图13A-13C示出用ATV:HER2-DIV、ATV:HER2-DII和ATV:HER2-DIV与ATV:HER2-DII的组合处理的BT474细胞中的细胞表面TfR表达。ATV:HER2-DIV和ATV:HER2-DII的处理在内化条件(37℃，30min)时增强细胞表面TfR表达的下调。
具体实施方式
I.引言
我们已开发出能够跨BBB的抗HER2构建体。一般说来，所述抗HER2构建体包括能够结合于人类HER2(例如，人类HER2的子结构域I、II或IV)的抗体可变区。在一些实施方案中，抗HER2构建体包括能够结合HER2的抗体可变区，所述HER2与已经工程改造以包括非原生TfR结合位点的修饰的Fc多肽融合，其在本文中还称作“Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白”。举例来说，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可以包括与包括TfR结合位点的修饰的Fc多肽二聚体融合的抗HER2 Fab。
在其他实施方案中，抗HER2构建体包括能够结合HER2(例如，人类HER2的子结构域I、II或IV)的抗体可变区和能够结合TfR的抗体可变区。
因此，本公开部分地涉及Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和其片段，其已经工程改造以结合HER2的子结构域IV、子结构域II或子结构域I，结合TfR，在结合于TfR时具有降低的效应子功能(例如，ADCC或CDC)，但在Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白结合于HER2时仍保留并且展现一定程度的效应子功能(例如，ADCC或CDC)。本公开还部分地涉及用于跨BBB递送抗HER2治疗性构建体并且治疗HER2阳性癌症以及HER2阳性癌症的转移的方法。令人惊讶地，如本文所述，发现使用靶向HER2子结构域IV和II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合比使用抗HER2子结构域IV和抗HER2子结构域II抗体的组合更有效用于抑制乳腺癌细胞生长。此外，在一些实施方案中，使用靶向HER2子结构域IV和I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合比使用抗HER2子结构域IV和抗HER2子结构域I抗体的组合更有效用于抑制乳腺癌细胞生长。此外，在一些实施方案中，使用靶向HER2子结构域II和I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合比使用抗HER2子结构域II和抗HER2子结构域I抗体的组合更有效用于抑制乳腺癌细胞生长。
此外，使用单独的靶向HER2子结构域IV、子结构域II或子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比分别使用抗HER2子结构域IV抗体、抗HER2子结构域II抗体或抗HER2子结构域I抗体更有效用于抑制乳腺癌细胞生长。此外，使用单独的靶向HER2子结构域IV、子结构域II或子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比分别使用抗HER2子结构域IV抗体与抗TfR抗体的组合、抗HER2子结构域II抗体与抗TfR抗体的组合或抗HER2子结构域I抗体与抗TfR抗体的组合更有效用于抑制乳腺癌细胞生长。
在其他实施方案中，本公开还部分地涉及使用抗HER2构建体以抑制乳腺癌细胞生长，所述抗HER2构建体包括能够结合HER2(例如，人类HER2的子结构域I、II或IV)的抗体可变区和能够结合TfR的抗体可变区。使用对HER2(例如，人类HER2的子结构域I、II或IV)和TfR具有双特异性的此类抗HER2构建体比使用单独的抗HER2抗体(例如，抗HER2子结构域I抗体、抗HER2子结构域II抗体或抗HER2子结构域IV抗体)更有效用于抑制乳腺癌细胞生长。
II.定义
除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，单数形式“一(a、an)”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，对“多肽”的提及可以包括两种或更多种此类分子等。
如本文所用，术语“约”和“大约”当用于修饰以数值或范围指定的量时，指示所述数值以及相对本领域技术人员已知的值的合理偏差(例如±20％、±10％或±5％)是在所陈述的值的预期含义内。
术语“人类表皮生长因子受体2”、“HER2”、“HER2/neu”和“ERBB2”(还称作CD340、受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2、原癌基因和Neu)是指由人类的ERBB2基因编码的酪氨酸受体激酶蛋白质，它是人类表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员。HER2的扩增或过表达在某些侵袭性类型的癌症(包括乳腺癌)的发生和进展中起显著作用。人类HER2核苷酸序列的非限制性实例陈述于GenBank参考号NP_001005862、NP_001289936、NP_001289937、NP_001289938和NP_004448中。人类HER2肽序列的非限制性实例陈述于GenBank参考号NP_001005862、NP_001276865、NP_001276866、NP_001276867和NP_004439中。
HER2的细胞外结构域含有大约600个氨基酸，其包括四个子结构域(子结构域I、II、III和IV)。子结构域I和III形成配体结合位点。富含半胱氨酸的子结构域II和IV参与受体同源二聚化和异源二聚化。抗HER2治疗性构建体可以结合于特定子结构域(例如，子结构域II或子结构域IV)。
当HER2在细胞中扩增或过表达时，所述细胞被称为“HER2阳性”或“HER2+”。HER2阳性细胞中HER2扩增或过表达的水平通常表述为在0至3范围内的评分(即，HER2 0、HER2 1+、HER2 2+或HER23+)，其中较高的评分对应于较大的表达程度。
HER2测试方法包括免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、ELISA和RNA定量(例如，HER2表达的RNA定量)方法，如RT-PCR和微阵列分析。可对考虑进行抗HER2疗法的受试者(例如患者)执行HER2测试。
如本文所用，术语“抗HER2构建体”是指结合于(a)人类HER2的子结构域I、II或IV和(b)转铁蛋白受体(TfR)的分子(例如蛋白质)构建体。抗HER2构建体可以包括能够结合于人类HER2的抗体可变区。在一些实施方案中，抗HER2构建体是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包括能够结合于人类HER2的抗体可变区和修饰的Fc多肽二聚体，所述修饰的Fc多肽二聚体包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽。在其他实施方案中，抗HER2构建体是双特异性构建体，其包括能够结合于人类HER2的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区。如本文所述的抗HER2构建体可以结合于人类HER2的子结构域I、II或IV。
如本文所用，术语“抗HER2-DI”、“抗HER2-DII”或“抗HER2-DIV”是指分别结合于人类HER2的子结构域I、II或IV的抗体。
如本文所用，术语“Fc多肽”是指天然存在的免疫球蛋白重链多肽的C末端区，其特征在于Ig折叠作为结构域。Fc多肽含有包括至少CH2结构域和/或CH3结构域的恒定区序列并且可以含有铰链区的至少一部分。一般说来，Fc多肽不含可变区。
“修饰的Fc多肽”是指与野生型免疫球蛋白重链Fc多肽序列相比具有至少一个突变(例如取代、缺失或插入)，但保留原生Fc多肽的总体Ig折叠或结构的Fc多肽。
如本文所用，术语“Fc多肽二聚体”是指两个Fc多肽的二聚体。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体能结合Fc受体(例如，FcγR)。在Fc多肽二聚体中，所述两个Fc多肽通过两个CH3抗体恒定结构域之间的相互作用二聚化。在一些实施方案中，所述两个Fc多肽也可经由在两个二聚化Fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键二聚化。Fc多肽二聚体可以是野生型Fc多肽二聚体或修饰的Fc多肽二聚体。野生型Fc多肽二聚体是通过两个野生型Fc多肽的二聚化而形成。Fc多肽二聚体可以是异源二聚体或同源二聚体。
如本文所用，术语“修饰的Fc多肽二聚体”是指含有至少一个修饰的Fc多肽的Fc多肽二聚体。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽二聚体含有两个修饰的Fc多肽。修饰的Fc多肽二聚体可以是同源二聚体(即，含有两个相同的修饰的Fc多肽)或异源二聚体(即，含有两个不同的Fc多肽，其中所述两个Fc多肽中的至少一者是修饰的Fc多肽)。
如本文所用，“转铁蛋白受体”或“TfR”是指转铁蛋白受体蛋白1。人类转铁蛋白受体1多肽序列陈述于SEQ ID NO:102中。也已知来自其他物种的转铁蛋白受体蛋白1序列(例如黑猩猩，登录号XP_003310238.1；恒河猴，NP_001244232.1；狗，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；和鸡，NP_990587.1)。术语“转铁蛋白受体”还涵盖示例性参考序列(例如人类序列)的等位基因变体，其是由转铁蛋白受体蛋白1染色体基因座处的基因编码。全长TfR蛋白包括短的N末端细胞内区、跨膜区和大的细胞外结构域。细胞外结构域的特征在于三个结构域：蛋白酶样结构域、螺旋结构域和顶端结构域。人类转铁蛋白受体1的顶端结构域序列陈述于SEQ ID NO:103中。
如本文所用，术语“Fcγ受体”或“FcγR”是指一种类型的Fc受体，其是基于其所识别的抗体类型而分类。FcγR包括若干成员FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)，其因分子结构不同而在其抗体亲和力方面不同。FcγR结合于IgG抗体类别的Fc部分，并且对于诱导经调理微生物的吞噬作用至关重要。FcγR发现于免疫系统中的细胞的细胞表面上。FcγR负责引发免疫系统效应子功能并且在抗体的Fc部分结合于受体后活化。FcγR介导免疫功能，例如结合于附着于受感染细胞或侵袭性病原体的抗体、通过抗体介导的吞噬作用或ADCC刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞破坏微生物或受感染细胞。
如本文所用，术语“降低FcγR结合”是指修饰的Fc多肽或修饰的Fc多肽二聚体，其在修饰的Fc多肽的CH3结构域中含有突变，其中与不含降低FcγR结合的突变的Fc多肽(例如野生型Fc多肽二聚体)的亲和力相比，所述突变使修饰的Fc多肽对FcγR的亲和力减少0.01％至90％(例如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％)。FcγR结合可以使用例如表面等离子体共振(SPR)方法(例如BiacoreTM系统)来测量。或者，FcγR结合可以使用功能分析来测量，例如ADCC分析，如本文所述者(例如，细胞杀死的体内或体外分析)。FcγR结合的降低可以在修饰的Fc多肽二聚体结合于TfR时测量。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽或Fc多肽二聚体在结合于TfR时可以具有降低的FcγR结合，但在不结合于TfR时降低有限(例如降低小于25％、20％、15％、10％、8％、5％、3％、2％或1％)或不会降低。
如本文进一步描述，修饰的Fc多肽二聚体可以含有同时具有TfR结合位点和在结合于TfR时降低FcγR结合的突变的第一Fc多肽和不具有TfR结合位点并且也不具有降低FcγR结合的突变的第二Fc多肽。因此，在TfR接合后，具有所述第一和第二Fc多肽的所得不对称Fc多肽二聚体对FcγR的亲和力可以总体上降低。相比之下，在不结合于TfR时，FcγR结合的降低有限(例如，如上文所述)或不会降低。
术语“FcRn”是指新生儿Fc受体。Fc多肽与FcRn的结合降低Fc多肽的清除率并且增加其血清半衰期。人类FcRn蛋白是由大小约50kDa的与主要组织相容性(MHC)I类蛋白类似的蛋白质和大小约15kDa的β2-微球蛋白构成的异源二聚体。
如本文所用，“FcRn结合位点”是指Fc多肽中结合于FcRn的区。在人类IgG中，如使用EU编号方案所编号，FcRn结合位点包括L251、M252、I253、S254、R255、T256、M428、H433、N434、H435和Y436。所述位置对应于SEQ ID NO:99的位置21至26、198和203至206。
如本文所用，“原生FcRn结合位点”是指Fc多肽中结合于FcRn并且与天然存在的Fc多肽中结合于FcRn的区具有相同氨基酸序列的区。
如本文所用，术语“不会大体上消耗网状细胞”或“不会体内大体上消耗网状细胞”意指由本文所述的效应子功能阳性、结合TfR的Fc多肽二聚体或本文所述的含有效应子功能阳性、结合TfR的Fc多肽二聚体的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白引起的网状细胞的减少(例如，骨髓网状细胞或循环网状细胞的减少)小于由对照(例如具有完全效应子功能和/或不含降低FcγR结合的突变的相应结合TfR的Fc二聚体或Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或含有具有完全效应子功能和/或不含降低FcγR结合的突变的相应结合TfR的Fc二聚体的抗体)引起的网状细胞的减少(例如，骨髓网状细胞或循环网状细胞的减少)(例如，小80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、8％、5％、3％、2％或1％)。
术语“不会大体上消耗网状细胞”或“不会体内大体上消耗网状细胞”也可意指在给予本文所述的效应子功能阳性、结合TfR的Fc多肽二聚体或本文所述的含有效应子功能阳性、结合TfR的Fc多肽二聚体的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白后，剩余网状细胞(例如，骨髓中或循环中的剩余网状细胞)的量或百分比多于在给予对照(例如，具有完全效应子功能和/或不含降低FcγR结合的突变的相应结合TfR的Fc二聚体或Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或含有具有完全效应子功能和/或不含降低FcγR结合的突变的相应结合TfR的Fc二聚体的抗体)后，剩余网状细胞(例如，骨髓中或循环中的剩余网状细胞)的量或百分比(例如，多至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％)。
网状细胞消耗(例如，骨髓中或循环中的网状细胞消耗)的量或百分比或剩余网状细胞(例如，骨髓中或循环中的剩余网状细胞)的量或百分比可以在经工程改造以用人类顶端结构域/小鼠嵌合TfR蛋白替代小鼠TfR的人类TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠(例如，人类TfR顶端结构域敲入小鼠(“hTfR顶端敲入小鼠”))中或在非人类灵长类动物(如食蟹猴)中测量。可以通过给予(例如向TfRms/hu KI小鼠)修饰的Fc二聚体或对照(例如25mg/kg至50mg/kg，静脉内)进行测量，并且如本文所述，循环网状细胞可以在给药后24h使用Advia 120血液学系统通过细胞化学反应来测量。如本文所述，骨髓网状细胞可以使用FACS分选来测量以确定Ter119+、hCD71hi和FSC低群体的群体。
如本文所用，术语“CH3结构域”和“CH2结构域”是指免疫球蛋白恒定区结构域多肽。在IgG抗体的情况下，CH3结构域多肽是指如根据EU编号方案所编号从约位置341至约位置447的氨基酸区段，并且CH2结构域多肽是指如根据EU编号方案所编号从约位置231至约位置340的氨基酸区段。CH2和CH3结构域多肽也可以通过IMGT(ImMunoGeneTics)编号方案来编号，其中根据IMGT Scientific图表编号(IMGT网站)，CH2结构域编号是1-110并且CH3结构域编号是1-107。CH2和CH3结构域是免疫球蛋白Fc区的一部分。在IgG抗体的情况下，Fc区是指如根据EU编号方案所编号从约位置231至约位置447的氨基酸区段。如本文所用，术语“Fc区”也可以包括抗体铰链区的至少一部分。说明性铰链区序列陈述于SEQ ID NO:104中。
术语“可变区”是指抗体重链或轻链中源自于生殖系可变(V)基因、多样性(D)基因或连接(J)基因(并且不源自于恒定(Cμ和Cδ)基因区段)的结构域，并且其给予抗体对结合于抗原的特异性。通常，抗体可变区包含四个保守“框架”区，散布有三个高变“互补决定区”。
关于CH3或CH2结构域的术语“野生型”、“原生”和“天然存在”在本文中用于指具有存在于自然界中的序列的结构域。
如本文所用，关于突变多肽或突变多核苷酸的术语“突变”可以与“变体”互换使用。关于给定野生型CH3或CH2结构域参考序列的变体可以包括天然存在的等位基因变体。“非天然”存在的CH3或CH2结构域是指不存在于自然界中的细胞中并且是通过对原生CH3结构域或CH2结构域多核苷酸或多肽进行遗传修饰(例如使用遗传工程改造技术或诱变技术)产生的变体或突变结构域。“变体”包括相对于野生型包含至少一个氨基酸突变的任一结构域。突变可以包括取代、插入和缺失。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成氨基酸，以及作用方式与天然存在的氨基酸类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷丝氨酸。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同基础化学结构(即，结合于氢的α碳、羧基、氨基和R基)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。“氨基酸模拟物”是指结构与氨基酸的一般化学结构不同，但作用方式与天然存在的氨基酸类似的化合物。
天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)和其组合。
氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。
术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用以指呈单链的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可以包含完全L-氨基酸、完全D-氨基酸或L和D氨基酸的混合物。
如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽或单链多肽的二聚体(即，两种)或多聚体(即，三种或更多种)。蛋白质的单链多肽可由共价键(例如二硫键)或非共价相互作用接合。
术语“保守取代”、“保守突变”或“保守修饰的变体”是指使得氨基酸经可分类为具有类似特征的另一氨基酸取代的改变。以这种方式定义的保守氨基酸组的类别的实例可以包括：“带电/极性组”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳香族组”，包括Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)、Trp(色氨酸或W)和(组氨酸或H)；和“脂肪族组”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在每一组内，也可鉴别子组。举例来说，可将带电或极性氨基酸组细分成包括以下的子组：“带正电子组”，其包含Lys、Arg和His；“带负电子组”，其包含Glu和Asp；和“极性子组”，其包含Asn和Gln。在另一实例中，可将芳香族或环状组细分成包括以下的子组：“氮环子组”，其包含Pro、His和Trp；和“苯基子组”，其包含Phe和Tyr。在另一进一步实例中，可将脂肪族组细分成子组，例如“脂肪族非极性子组”，其包含Val、Leu、Gly和Ala；和“脂肪族略微极性子组”，其包含Met、Ser、Thr和Cys。保守突变的类别的实例包括上述子组内的氨基酸的氨基酸取代，如但不限于：Lys取代Arg或反之亦然，使得可维持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，使得可维持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，使得可维持游离-OH；和Gln取代Asn或反之亦然，使得可维持游离-NH2。在一些实施方案中，疏水性氨基酸取代天然存在的疏水性氨基酸(例如在活性位点中)以保持疏水性。
在两个或更多个多肽序列的情况下，术语“同一”或“同一性”百分比是指，当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以获得最大对应时，如使用一种序列比较算法或通过人工比对和目视检查所测量，两个或更多个序列或子序列相同或在指定区域内具有指定百分比的同一氨基酸残基(例如至少60％同一性、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更大)。
对于多肽的序列比较，通常一个氨基酸序列用作参考序列，候选序列与其进行比较。可以使用本领域技术人员可获得的各种方法来执行比对，例如目视比对或使用已知算法使用可公开获得的软件以达成最大比对。此类程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可以确定用于比对的参数以达成最大比对。出于本申请的目的，对于多肽序列的序列比较，使用BLASTP算法，即用预设参数比对两个蛋白质序列的标准蛋白质BLAST。
当在多肽序列中鉴别给定氨基酸残基的情况下使用时，术语“对应于”、“参考......确定”或“参考......编号”是指当给定氨基酸序列与参考序列进行最大比对和比较时，所述指定参考序列的残基的位置。因此，例如，在与SEQ ID NO:99进行最佳比对时，当多肽中的氨基酸残基与SEQ ID NO:99中的氨基酸比对时，所述残基“对应于”SEQ ID NO:99的区中的氨基酸。与参考序列比对的多肽不需要与参考序列的长度相同。
如本文所用，当提及包含如本文所述的修饰的CH3结构域的多肽时，术语“特异性地结合”或“选择性地结合”至靶(例如TfR或FcγR)是指结合反应，其中多肽以与其结合于在结构上不同的靶相比更大的亲和力、更大的亲合力和/或更长的持续时间结合于靶。在典型实施方案中，当在相同的亲和力分析条件下进行分析时，与不相关的靶相比，多肽对特定靶(例如TfR或FcγR)的亲和力为至少5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大。如本文所用，术语“特异性结合”特定靶(例如例如TfR或FcγR)、“特异性地结合于”特定靶(例如例如TfR或FcγR)或对特定靶(例如例如TfR或FcγR)“具有特异性”可例如通过分子对其所结合的靶的平衡解离常数KD为例如10-4M或更小(例如10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M)来展现。在一些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽特异性地结合于TfR上的表位，所述TfR在物种之间保守(例如，在物种之间结构上保守)，例如在非人类灵长类动物与人类物种之间保守(例如，在非人类灵长类动物与人类物种之间结构上保守)。在一些实施方案中，多肽可仅结合于人类TfR。
如本文所用，术语“结合亲和力”是指两个分子(例如多肽上的单一结合位点与其所结合的靶(例如TfR))之间的非共价相互作用的强度。因此，举例来说，除非另外指示或从上下文清楚，否则所述术语可指多肽与其靶之间的1:1相互作用。结合亲和力可以通过测量平衡解离常数(KD)来定量，所述常数是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1M-1)。KD可以通过测量复合物形成和解离的动力学来测定，例如使用表面等离子体共振(SPR)方法，例如BiacoreTM系统；动力学排除分析，如
和生物层干涉(例如使用
平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包括形式结合亲和力，如反映多肽与其靶之间的1:1相互作用的那些亲和力，并且还包括表观亲和力，其KD经过计算可以反映亲合结合。
术语“抗原结合部分”和“抗原结合片段”在本文中可互换使用，并且是指抗体可变区中保留特异性地结合于抗原(例如HER2)的能力的一个或多个片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)、F(ab’)2片段(包含两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区通过二硫桥连接)、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(dsFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、纳米抗体、双价抗体，其各自经由可变区结合抗原，以及如Spiess等人，Mol.Immun.67(2015)95-106中所述的其他形式，所述文献是以引用的方式并入本文中。
术语“互补决定区”或“CDR”是指每一链中的三个高变区，其中断由轻链和重链可变区确立的四个框架区。CDR主要负责抗体结合于抗原的表位。每一链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，其从N末端开始依序编号，并且通常也由特定CDR所处的链鉴别。因此，VH CDR3或CDR-H3位于发现其的抗体重链的可变区中，而VL CDR1或CDR-L1为CDR1，其来自发现其的抗体轻链的可变区。
不同轻链或重链的“框架区”或“FR”在物种内是相对保守的。抗体的框架区(即组成型轻链和重链的组合框架区)用于定位并且对齐三维空间中的CDR。框架序列可从包括生殖系抗体基因序列的公共DNA数据库或已发表的参考文献获得。举例来说，人类重链和轻链可变区基因的生殖系DNA序列可以在人类和小鼠序列的“VBASE2”生殖系可变基因序列数据库中发现。
CDR和框架区的氨基酸序列可以使用本领域中的各种众所周知的定义来确定，例如Kabat、Chothia、国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)、AbM和所观察到的抗原接触(“接触”)。在一些实施方案中，CDR是根据接触定义来确定。参见MacCallum等人，J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)。在一些实施方案中，CDR是通过Kabat、Chothia和接触CDR定义的组合来确定。
如本文中可互换使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿类动物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)、兔、牛、猪、马和其他哺乳动物物种。在一个实施方案中，患者是人类。
术语“治疗(treatment/treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效应。“治疗(treating/treatment)”可以指在治疗或改善癌症(例如HER2阳性和/或转移性癌症)方面获得成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，如减轻、缓解、患者存活改进、存活时间或存活率增加、症状减少或使患者更能耐受所述疾病、退化或衰退的速率减缓或患者的身体或精神健康状况改进。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数。治疗的效应可以与不接受所述治疗的个体或个体池进行比较，或与在治疗之前或在治疗期间不同时间的同一患者进行比较。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指在生物学上或药理学上适用于人类或动物中的非活性医药成分，如但不限于缓冲剂、载体或防腐剂。
如本文所用，构建体(例如，如本文所述的抗体)的“治疗量”或“治疗有效量”是所述构建体治疗、缓和、减轻或降低受试者的疾病的症状的严重程度的量。“治疗量”或“治疗有效量”的构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链)可改进患者存活、增加存活时间或存活率、减少症状、使损伤、疾病或疾患(例如癌症，如HER2阳性和/或转移性癌症)更耐受、减缓退化或衰退的速率或改进患者的身体或精神健康状况。
术语“施用”是指将构建体、化合物或组合物递送至生物作用的期望位点的方法。所述方法包括但不限于表面递送、肠胃外递送、静脉内递送、真皮内递送、肌肉内递送、鞘内递送、结肠递送、直肠递送或腹膜内递送。在一个实施方案中，如本文所述的抗体是以静脉内方式施用。
III.FC多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白
在一些方面，本公开提供Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其能够结合于人类表皮生长因子2(HER2)并且经修饰以结合于转铁蛋白受体(TfR)，由此使得所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白能够跨血脑屏障(BBB))。在一些实施方案中，本文所提供的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白在结合于HER2时保留效应子功能，但在结合TfR时效应子功能降低。以这种方式，所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白能够跨BBB转运抗HER2抗体可变区(例如，其形成Fab结构域的一部分)而不实质性消耗网状细胞(其在细胞表面上还含有TfR)，并且仍展现可以靶向癌细胞(例如，HER2阳性癌细胞或其转移)的效应子功能。
在一些实施方案中，本文提供具有顺式构型的效应子功能阳性的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，这意味着Fc多肽二聚体中仅有一个(而非两个)Fc多肽经修饰以具有TfR结合位点和在结合于TfR时降低FcγR结合的修饰。在所述实施方案中，Fc多肽二聚体中的另一Fc多肽不含TfR结合位点或大体上降低FcγR结合的修饰。修饰的Fc多肽二聚体的反式构型是指其中两个Fc多肽之一含有TfR结合位点，而另一Fc多肽含有例如在结合于TfR时例如降低效应子功能的修饰的Fc多肽二聚体。具有顺式构型但不具有反式构型的修饰的Fc多肽二聚体能够降低血液和骨髓中的网状细胞消耗。
在一些实施方案中，本文提供的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白不会大体上消耗网状细胞(例如在骨髓中和/或在循环中)。在一些实施方案中，所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白不会体内大体上消耗网状细胞。在一些实施方案中，在施用Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白后所消耗网状细胞的量少于在施用对照后所消耗网状细胞的量。在一些实施方案中，对照是相应TfR结合多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其具有完全效应子功能和/或不含降低FcγR结合的突变。在一些情况下，对照是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中第一Fc多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、81、83、85、87、89、91、93、95、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278或280中所陈述的氨基酸序列(即，特异性地结合TfR的第一Fc多肽，其包含TfR结合位点但不含LALA取代或降低FcγR结合的其他修饰)，并且第二Fc多肽不含TfR结合位点或降低FcγR结合的任何修饰。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，HER2的子结构域II或IV)的抗体可变区或其抗原结合片段；和(b)修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽。在一些实施方案中，所述修饰的Fc多肽二聚体包含不含TfR结合位点的第二Fc多肽。在一些实施方案中，第一Fc多肽包括在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第二Fc多肽包括在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一和第二Fc多肽包括在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc多肽包括在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，根据EU编号，在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰包含在位置234处和在位置235处的Ala。
在一些实施方案中，第一和/或第二Fc多肽包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一Fc多肽包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第二Fc多肽包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。在一些实施方案中，第一和第二Fc多肽包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。在一些实施方案中，根据EU编号，增加血清半衰期的氨基酸修饰包含(i)在位置428处的Leu和在位置434处的Ser，或(ii)在位置434处的Ser或Ala。
在一些实施方案中，抗体可变区形成Fab结构域的一部分。
抗HER2可变区
抗HER2_DIV
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SE Q ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ IDNO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)至(f)中的两者、三者、四者、五者或全部六者。在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)的重链CDR1、(b)的重链CDR2和(c)的重链CDR3。在一些实施方案中，抗体可变区包含(d)的轻链CDR1、(e)的轻链CDR2和(f)的轻链CDR3。在一些实施方案中，具有最多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，具有最多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有两个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述最多两个氨基酸取代是保守取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ IDNO:72的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)至(f)中的两者、三者、四者、五者或全部六者。在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)的重链CDR1、(b)的重链CDR2和(c)的重链CDR3。在一些实施方案中，抗体可变区包含(d)的轻链CDR1、(e)的轻链CDR2和(f)的轻链CDR3。
在一些实施方案中，抗体可变区包含：(a)重链可变区，其包含(i)与SEQ ID NO:59至少75％的序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)和(ii)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别与SEQ ID NO:69、70和71同一；和/或(b)轻链可变区，其包含(i)与SEQ ID NO:60至少75％的序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)和(ii)CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别与SEQ ID NO:72、73和74同一。
在一些实施方案中，抗体可变区包含含有与SEQ ID NO:59具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体可变区包含含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含含有与SEQ ID NO:60具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体可变区包含含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
抗HER2_DII
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ IDNO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)至(f)中的两者、三者、四者、五者或全部六者。在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)的重链CDR1、(b)的重链CDR2和(c)的重链CDR3。在一些实施方案中，抗体可变区包含(d)的轻链CDR1、(e)的轻链CDR2和(f)的轻链CDR3。在一些实施方案中，具有最多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，具有最多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有两个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述最多两个氨基酸取代是保守取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ IDNO:78的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)至(f)中的两者、三者、四者、五者或全部六者。在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)的重链CDR1、(b)的重链CDR2和(c)的重链CDR3。在一些实施方案中，抗体可变区包含(d)的轻链CDR1、(e)的轻链CDR2和(f)的轻链CDR3。
在一些实施方案中，抗体可变区包含：(a)重链可变区，其包含(i)与SEQ ID NO:61至少75％的序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)和(ii)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别与SEQ ID NO:75、76和77同一；和/或(b)轻链可变区，其包含(i)与SEQ ID NO:62至少75％的序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)和(ii)CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别与SEQ ID NO:78、79和80同一。
在一些实施方案中，抗体可变区包含含有与SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体可变区包含含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含含有与SEQ ID NO:62具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体可变区包含含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
抗HER2_DI
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)至(f)中的两者、三者、四者、五者或全部六者。在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)的重链CDR1、(b)的重链CDR2和(c)的重链CDR3。在一些实施方案中，抗体可变区包含(d)的轻链CDR1、(e)的轻链CDR2和(f)的轻链CDR3。在一些实施方案中，具有最多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有一个氨基酸取代。在一些实施方案中，具有最多两个氨基酸取代的CDR相对于参考序列具有两个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述最多两个氨基酸取代是保守取代。
在一些实施方案中，抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列；(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列；(d)轻链CDR1，其包含SEQ IDNO:253的氨基酸序列；(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；和(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)至(f)中的两者、三者、四者、五者或全部六者。在一些实施方案中，抗体可变区包含(a)的重链CDR1、(b)的重链CDR2和(c)的重链CDR3。在一些实施方案中，抗体可变区包含(d)的轻链CDR1、(e)的轻链CDR2和(f)的轻链CDR3。
在一些实施方案中，抗体可变区包含：(a)重链可变区，其包含(i)与SEQ ID NO:256至少75％的序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)和(ii)CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其分别与SEQ ID NO:250、251和252同一；和/或(b)轻链可变区，其包含(i)与SEQ ID NO:257至少75％的序列同一性(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)和(ii)CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其分别与SEQ ID NO:253、254和255同一。
在一些实施方案中，抗体可变区包含含有与SEQ ID NO:256具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体可变区包含含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含含有与SEQ ID NO:257具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体可变区包含含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
说明性Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白
本文所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白可以包含上文所述的抗HER2可变区的任一组合。在一些实施方案中，第一Fc多肽包含含有修饰的CH3结构域的TfR结合位点。可用于组合物和方法中的修饰的CH3结构域的非限制性实例在本文中描述于标题为“结合TfR的Fc多肽”的部分中。在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽还包含杵突变T366W并且第二Fc多肽包含臼突变T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:63具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:67或68具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67和68中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，根据EU编号，第一Fc多肽还包含臼突变T366S、L368A和Y407V并且第二Fc多肽包含杵突变T366W。在一些实施方案中，第一Fc多肽包含与SEQ ID NO:64具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二Fc多肽包含与SEQ ID NO:65或66具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，第二FC多肽包含SEQ ID NO:65和66中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A以及杵突变T366W，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点或降低FcγR结合的任何修饰。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列的第一重链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列的第一重链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A以及杵突变T366W，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列的第一重链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A以及臼突变T366S、L368A和Y407V，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:6、14、22和86中任一者的氨基酸序列的第一重链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:34、42、50和94中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:263、271、279和287中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:294的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A、臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:8、16、24和88中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:36、44、52和96中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:265、273、281和289中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:294的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A以及臼突变T366S、L368A和Y407V，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:6、14、22和86中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:34、42、50和94中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:263、271、279和287中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:295的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A、臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:8、16、24和88中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:36、44、52和96中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:265、273、281和289中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:295的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和臼突变T366S、L368A和Y407V，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:5、13、21和85中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:33、41、49和93中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:262、270、278和286中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:294的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:7、15、23和87中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:35、43、51和95中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:264、272、280和288中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:294的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和臼突变T366S、L368A和Y407V，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:5、13、21和85中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:33、41、49和93中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:262、270、278和286中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:295的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：(a)能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:7、15、23和87中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:35、43、51和95中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:264、272、280和288中任一者的氨基酸序列的第一重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:295的氨基酸序列的第二重链。在一些实施方案中，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
抗体重链
在其他方面，本文提供抗体重链。在一些实施方案中，所述抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，其含有产生TfR结合位点的修饰。所述抗体重链可以包含上文在标题为“抗HER2可变区”的部分中所述的抗HER2可变重链CDR和/或重链可变区序列中的任一者。修饰的Fc多肽可以包含本文所述的任一TfR结合位点(例如，修饰的CH3结构域)和/或本文所述的增加血清半衰期或降低FcγR结合(例如，在结合于TfR时)的任一修饰。
在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的Fc多肽还包含杵突变T366W。在一些实施方案中，修饰的多肽包含与SEQ ID NO:63具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，根据EU编号，修饰的Fc多肽还包含臼突变T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，修饰的多肽包含与SEQ ID NO:64具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，修饰的Fc多肽包含SEQID NO:64的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A以及杵突变T366W。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A以及臼突变T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ IDNO:6、14、22和86中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:34、42、50和94中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:263、271、279和287中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、氨基酸修饰L234A和L235A、臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:8、16、24和88中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:36、44、52和96中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:265、273、281和289中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和臼突变T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:5、13、21和85中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:33、41、49和93中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:262、270、278和286中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体重链包含：(a)抗HER2(例如人类HER2)抗体重链可变区或其片段；和(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:7、15、23和87中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQ ID NO:35、43、51和95中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体重链包含SEQID NO:264、272、280和288中任一者的氨基酸序列。
IV.结合TFR的FC多肽
这一部分描述结合于TfR并且能够跨血脑屏障(BBB)转运的修饰的Fc多肽。
CH3 TfR结合多肽
在一些实施方案中，修饰的Fc多肽含有修饰的人类Ig CH3结构域，如IgG CH3结构域。CH3结构域可为任一IgG亚型，即来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗体的情况下，CH3结构域是指如根据EU编号方案所编号从约位置341至约位置447的氨基酸区段。除非另外指定，否则参考EU编号方案、SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:99的氨基酸111-217来确定CH3结构域中为了鉴别用于TfR结合的相应氨基酸位置组的位置。还参考EU编号方案或SEQ ID NO:99来确定取代，即氨基酸相对于EU编号方案或SEQ ID NO:99中的相应位置处的所述氨基酸被视为取代。
如上文所指示，CH3结构域中可以修饰的残基组在本文中是参考EU编号方案或SEQID NO:99来编号。任一CH3结构域(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域)均可以在一组或多组残基中具有修饰(例如氨基酸取代)，所述一组或多组残基对应于如在EU编号方案或SEQ ID NO:99中所注明的位置处的残基。可以容易地确定IgG1、IgG2、IgG3和IgG4序列中的每一者中对应于EU编号方案或SEQ ID NO:99的任一给定位置的位置。
本领域技术人员应理解，通过鉴别其他免疫球蛋白同型(例如IgM、IgA、IgE、IgD等)的CH3结构域中对应于本文所述的氨基酸位置的氨基酸，可以同样修饰那些结构域。也可以对来自其他物种(例如非人类灵长类动物、猴、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、鸡等)的免疫球蛋白的相应结构域进行修饰。
在一个实施方案中，特异性地结合TfR的修饰的CH3结构域多肽在包含全长人类TfR序列(SEQ ID NO:102)的位置208的表位处结合于TfR的顶端结构域，所述位置208对应于SEQ ID NO:103中所陈述的人类TfR顶端结构域序列的位置11。SEQ ID NO:103对应于人类TfR-1uniprotein序列P02786(SEQ ID NO:102)的氨基酸198-378。在一些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽在包含全长人类TfR序列(SEQ ID NO:102)的位置158、188、199、207、208、209、210、211、212、213、214、215和/或294的表位处结合于TfR的顶端结构域。修饰的CH3结构域多肽可以结合于TfR而不阻断或以其他方式抑制转铁蛋白与受体的结合。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合大体上不受抑制。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合的抑过程度小于约50％(例如，小于约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)。在一些实施方案中，转铁蛋白与TfR的结合的抑过程度小于约20％(例如，小于约19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。根据EU编号方案，展现这一结合特异性的说明性CH3结构域多肽包括在位置380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421处具有氨基酸取代的多肽。
CH3 TfR结合组：380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421
在一些实施方案中，根据EU编号方案，修饰的CH3结构域多肽在包含380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421的一组氨基酸位置中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一个取代(CH3C组)。可以在这些位置处引入的说明性取代示于表5中。其他取代示于表6中。在一些实施方案中，位置388和/或421处的氨基酸是芳香族氨基酸，例如Trp、Phe或Tyr。在一些实施方案中，位置388处的氨基酸是Trp。在一些实施方案中，位置388处的氨基酸是Gly。在一些实施方案中，位置421处的芳香族氨基酸是Trp或Phe。
在某些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个选自以下的位置：在位置380处的Glu、Leu、Ser、Val、Trp、Tyr或Gln；在位置384处的Leu、Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val；在位置386处的Leu、Thr、His、Pro、Asn、Val或Phe；在位置387处的Val、Pro、Ile或酸性氨基酸；在位置388处的Trp；在位置389处的脂肪族氨基酸、Gly、Ser、Thr或Asn；在位置390处的Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala、Asp、Glu、Asn、Arg或Thr；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr、Pro、Ile或His；在位置415处的Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在位置416处的Thr、Arg、Asn或酸性氨基酸；和/或在位置421处的芳香族氨基酸、His或Lys。
在一些实施方案中，特异性地结合TfR的修饰的CH3结构域多肽与SEQ ID NO:177-180中任一者的氨基酸111-217具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，此类修饰的CH3结构域多肽包含SEQ ID NO:177-180中任一者的氨基酸154-160和/或183-191。在一些实施方案中，此类修饰的CH3结构域多肽包含SEQ ID NO:177-180中任一者的氨基酸150-160和/或183-191。在一些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽包含SEQ ID NO:177-180中任一者的氨基酸150-160和/或183-196。
在一些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽与SEQ ID NO:99的氨基酸111-217具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，条件是同一性百分比不包括SEQ ID NO:99的位置154、156、157、158、159、160、183、186和191的集合(根据EU编号方案，位置384、386、387、388、389、390、413、416和421)。在一些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽包含如SEQ ID NO:177-180中的任一者中所陈述的氨基酸154-160和/或氨基酸183-191。
在一些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽与SEQ ID NO:177-180中的任一者具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，条件是至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个对应于SEQ ID NO:177-180中任一者的位置150、154、156、157、158、159、160、161、162、183、184、185、186、191、194和196(根据EU编号方案，位置380、384、386、384、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424和426)的位置不会发生缺失或取代。
在一些实施方案中，修饰的CH3结构域多肽与SEQ ID NO:177-180中的任一者具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，并且还在至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个如下位置处包含：在位置380处的Trp、Tyr、Leu、Gln或Glu；在位置384处的Leu、Tyr、Met或Val；在位置386处的Leu、Thr、His或Pro；在位置387处的Val、Pro或酸性氨基酸；在位置388处的芳香族氨基酸(例如Trp)；在位置389处的Val、Ser或Ala；在位置390处的Ser或Asn；在位置391处的Ser、Thr、Gln或Phe；在位置392处的Gln、Phe或His；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置414处的Lys、Arg、Gly或Pro；在位置415处的Glu或Ser；在位置416处的Thr或酸性氨基酸；在位置421处的Trp、Tyr、His或Phe；在位置424处的Ser、Thr、Glu或Lys；和在位置426处的Ser、Trp或Gly。
在其他实施方案中，TfR结合多肽包含SEQ ID NO:177-180中任一者的氨基酸157-194、氨基酸153-194或氨基酸153-199。在其他实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:177-180中任一者的氨基酸157-194或与SEQ ID NO:177-180中任一者的氨基酸153-194或氨基酸153-199具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:177-180中的任一者。在其他实施方案中，所述多肽可以与SEQ ID NO:177-180中的任一者具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。
FcRn结合位点
本文所述的可以跨BBB转运的多肽可以另外包含FcRn结合位点。在一些实施方案中，所述FcRn结合位点是在修饰的Fc多肽或其片段内。
在一些实施方案中，FcRn结合位点包含原生FcRn结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点不包含相对于原生FcRn结合位点的氨基酸序列的氨基酸变化。在一些实施方案中，原生FcRn结合位点是IgG结合位点，例如人类IgG结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点包含改变FcRn结合的修饰。
在一些实施方案中，FcRn结合位点具有一个或多个发生突变(例如取代)的氨基酸残基，其中所述突变增加血清半衰期或不会大体上缩短血清半衰期(即，当在相同条件下分析时，与在突变位置处具有野生型残基的配对物蛋白质相比，血清半衰期缩短不超过25％)。在一些实施方案中，FcRn结合位点具有一个或多个在位置21至26、198和203至206处被取代的氨基酸残基，其中所述位置是参考SEQ ID NO:99来确定。
在一些实施方案中，FcRn结合位点相对于原生人类IgG序列包含一个或多个延长修饰的多肽的血清半衰期的突变。在一些实施方案中，在如参考SEQ ID NO:99确定的位置14-27、49-54、77-87、153-160和198-205中的一者或多者处引入突变(例如取代)(所述位置对应于使用EU编号的位置244-257、279-284、307-317、383-390和428-435)。在一些实施方案中，在如参考SEQ ID NO:99确定的位置21、22、24、25、26、77、78、79、81、82、84、155、156、157、159、198、203、204或206处引入一个或多个突变(所述位置对应于使用EU编号的位置251、252、254、255、256、307、308、309、311、312、314、385、386、387、389、428、433、434或436)。在一些实施方案中，将突变引入至如参考SEQ ID NO:99确定的位置22、24和25(其对应于使用EU编号的位置252、254和256)中的一者、两者或三者处。在一些实施方案中，突变是如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E。在一些实施方案中，本文所述的修饰的Fc多肽还包含突变M22Y、S24T和T26E。在一些实施方案中，将突变引入至如参考SEQ ID NO:99确定的位置198和204(其对应于使用EU编号的位置428和434)中的一者或两者中。在一些实施方案中，突变是如参考SEQ ID NO:99编号的M198L和N204S。在一些实施方案中，本文所述的修饰的Fc多肽还包含具有或不具有M198L的突变N204S。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽在根据EU编号的位置T307、E380和N434(其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的T77、E150和N204)中的一者、两者或所有三者处包含取代。在一些实施方案中，突变是T307Q和N434A(SEQ ID NO:99，T77Q和N204A)。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽包含突变T307A、E380A和N434A(SEQ ID NO:99，T77A、E150A和N204A)。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽在位置T250和M428处(其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的T20和M198)包含取代。在一些实施方案中，Fc多肽包含突变T250Q和/或M428L(SEQ ID NO:99，T20Q和M198L)。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽在位置M428和N434处(其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的M198和N204)包含取代。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽包含取代M428L和N434S(其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的M198L和N204S)。在一些实施方案中，修饰的Fc多肽包含N434S或N434A取代(其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的N204S或N204A)。
V.降低效应子功能或FCγR结合的突变
如本文所提供的Fc多肽(例如，其经过修饰以结合TfR并且启动跨BBB的转运)也可以包含其他突变以降低效应子功能。如本文所述，通过同时引入TfR结合位点和降低TfR介导的FcγR与Fc多肽二聚体的同一Fc多肽结合的突变，有可能降低结合TfR时的效应子功能，使得结合TfR而不会实质性消耗网状细胞，但在Fc多肽二聚体融合至治疗性Fab并且结合于Fab的靶抗原时仍维持并且展现一定程度的效应子功能(例如，ADCC或CDC)。
在一些实施方案中，包含修饰的CH3结构域的Fc多肽具有效应子功能，即在结合于介导效应子功能的效应细胞上所表达的Fc受体时诱导某些生物功能的能力。效应细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans’cell)、天然杀手(NK)细胞和细胞毒性T细胞。
效应子功能的实例包括但不限于C1q结合和CDC、Fc受体结合、ADCC、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如，B细胞受体)下调和B细胞活化。效应子功能可随抗体类别而变化。举例来说，原生人类IgG1和IgG3抗体可以在结合于存在于免疫系统细胞上的适当Fc受体时引发ADCC和CDC活性；并且原生人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4可以在结合于存在于免疫细胞上的适当Fc受体时引发ADCP功能。
在一些实施方案中，具有如本文所述的TfR结合位点的Fc多肽可以包括降低效应子功能(即在结合TfR时降低效应子功能)的其他修饰。Fc多肽二聚体在结合TfR时具有降低的效应子功能是合意的，因为这使得网状细胞消耗降低(由于网状细胞在细胞表面上也具有TfR)。如本文详细描述，具有顺式构型的Fc多肽二聚体(即同时具有TfR结合位点和降低对Fc多肽二聚体的同一Fc多肽的效应子功能的突变的Fc多肽二聚体)展现TfR结合而不会实质性消耗网状细胞，但在Fc多肽二聚体融合至治疗性Fab并且结合于Fab的靶抗原时仍维持一定程度的效应子功能(例如，ADCC)。当Fc多肽二聚体融合至与Fab的靶抗原结合的治疗性Fab时具有效应子功能在例如癌症治疗剂(例如，脑癌治疗剂)中是合意的。
调节效应子功能的说明性Fc多肽突变包括但不限于CH2结构域中的取代，例如在对应于SEQ ID NO:99的位置4和5(根据EU编号方案的位置234和235)的位置处。在一些实施方案中，修饰的CH2结构域中的取代包含在SEQ ID NO:99的位置4和5处的Ala。在一些实施方案中，修饰的CH2结构域中的取代包含在SEQ ID NO:99的位置4和5处的Ala和在位置99处的Gly。
调节效应子功能的其他Fc多肽突变包括但不限于一个或多个在位置238、265、269、270、297、327和329处(EU编号方案，其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的位置8、35、39、40、67、97和99)的取代。说明性取代(如EU编号方案所编号)包括以下：位置329可以具有其中脯氨酸经甘氨酸或精氨酸取代的突变或破坏在Fc的脯氨酸329与FcγRIII的色氨酸残基Trp 87和Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面的足够大的氨基酸残基。其他说明性取代包括S228P、E233P、L235E、N297A、N297D和P331S。也可存在多个取代，例如人类IgG1 Fc区的L234A和L235A；人类IgG1 Fc区的L234A、L235A和P329G；人类IgG4 Fc区的S228P和L235E；人类IgG1 Fc区的L234A和G237A；人类IgG1 Fc区的L234A、L235A和G237A；人类IgG2 Fc区的V234A和G237A；人类IgG4 Fc区的L235A、G237A和E318A；和人类IgG4 Fc区的S228P和L236E。在一些实施方案中，Fc多肽可以具有一个或多个调节ADCC的氨基酸取代，例如根据EU编号方案，在Fc区的位置298、333和/或334处的取代。
在一些实施方案中，如本文所述的多肽可以具有一个或多个增加或降低ADCC的氨基酸取代或可以具有改变C1q结合和/或CDC的突变。
在特定实施方案中，具有TfR结合位点的Fc多肽可以经过修饰以降低效应子功能，即降低FcγR结合。在一些实施方案中，具有TfR结合位点的Fc多肽可以包括突变L234A和L235A(EU编号方案，其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的位置4和5)。在其他实施方案中，具有TfR结合位点的Fc多肽可以包括突变L234A、L235A和P329G(EU编号方案，其对应于如参考SEQ ID NO:99编号的位置4、5和99)。
VI.测量效应子功能或FcγR结合
用于分析Fc多肽或Fc多肽二聚体与FcγR之间的结合亲和力、结合动力学和交叉反应性的方法是本领域中已知的。这些方法包括但不限于固相结合分析(例如，ELISA分析)、免疫沉淀、表面等离子体共振(例如，BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、动力学排除分析(例如，
)、流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)、生物层干涉(例如，
(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))和Western印迹分析。在一些实施方案中，使用ELISA来测定结合亲和力和/或交叉反应性。用于执行ELISA分析的方法是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用动力学排除分析来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用生物层干涉分析来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。
ADCC是一种类型的免疫反应，其中抗体结合于致病性或致瘤性靶细胞表面上的抗原并且鉴别出所述抗原以通过效应细胞(例如外周血单核细胞(例如，天然杀手(NK)细胞、T细胞和B细胞))达成破坏。带有FcγR的效应细胞识别并且结合与靶细胞结合的抗体的Fc区。因此，所述抗体赋予杀死靶细胞的特异性。当C1q(经典补体途径的启动组分)结合于靶结合抗体的Fc区时，启动CDC。ADCC和CDC活性可以在细胞杀死的标准体内或体外分析中测定。本领域中可获得用于测定ADCC和CDC活性的方法。在一些实施方案中，所述方法可涉及用放射性材料(如51Cr)或荧光染料(如钙黄绿素-AM)标记靶细胞。标记的细胞可以与抗体和效应细胞一起孵育，并且可以通过放射性或荧光的释放来检测通过ADCC或CDC实现的靶细胞的杀死。
测量ADCC和CDC活性的其他分析包括例如乳酸脱氢酶(LDH)释放分析。当细胞膜以任何方式受害或受损时，细胞质中可溶但稳定的酶LDH释放至周围细胞外间隙中。这种酶在培养基中的存在可以用作细胞死亡标记物。接着可以通过使用比色或荧光LDH细胞毒性分析测量所释放LDH的量来定量培养基内活细胞和死细胞的相对量。
VII.包含修饰的CH3结构域多肽的FC区中的其他突变
如本文所提供的Fc多肽(例如，其经过修饰以结合TfR并且启动跨BBB的转运)也可以包含其他突变，例如以增加血清稳定性或血清半衰期、调节效应子功能、影响糖基化、降低人类中的免疫原性和/或提供Fc多肽的杵和臼异源二聚化。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的Fc多肽与相应野生型Fc多肽(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
本文所述的修饰的Fc多肽也可以具有在指定氨基酸组以外引入的其他突变，例如以影响糖基化、增加血清半衰期或对于CH3结构域来说提供包含修饰的CH3结构域的多肽的杵和臼异源二聚化。通常，所述方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并且在第二多肽的界面处引入相应空腔(“臼”)，从而使得突起可定位于空腔中以便促进异源二聚体形成并且阻碍同源二聚体形成。突起通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来建构。大小与突起同一或相似的补偿性空腔通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链而在第二多肽的界面中产生。此类其他突变在多肽中的位置不会对修饰的CH3结构域与TfR的结合具有负面效应。
在用于二聚化的杵和臼方法的一个说明性实施方案中，对应于将要二聚化的第一Fc多肽亚单位的SEQ ID NO:99的位置136的位置具有代替原生苏氨酸的色氨酸，并且二聚体的第二Fc多肽亚单位在对应于SEQ ID NO:99的位置177的位置处具有代替原生酪氨酸的缬氨酸。Fc多肽的第二亚单位可以进一步包含取代，其中在对应于SEQ ID NO:99的位置136的位置处的原生苏氨酸经丝氨酸取代并且在对应于SEQ ID NO:99的位置138的位置处的天然亮氨酸经丙氨酸取代。
如本文所述的修饰的Fc多肽也可以进行工程改造以含有用于异源二聚化的其他修饰，例如CH3-CH3界面内的接触残基的静电工程改造，其为天然带电或疏水性补丁修饰。
在一些实施方案中，可以引入增强血清半衰期的修饰。举例来说，在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽包含含有以下的CH2结构域：在对应于SEQ ID NO:99的位置22的位置处的Tyr、在对应于SEQ ID NO:99的24的位置处的Thr和在对应于SEQ ID NO:99的位置26的位置处的Glu。或者，如本文所述的修饰的Fc多肽可以包含如参考SEQ ID NO:99编号的M198L和N204S取代。或者，如本文所述的修饰的Fc多肽可以包含如参考SEQ ID NO:99编号的N204S或N204A取代。
包含其他突变的说明性Fc多肽
如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以包含其他突变，包括杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))和/或增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E，或(ii)如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有杵突变。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有杵突变和调节效应子功能的突变。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考SEQID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E，或(ii)如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E，或(ii)如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ IDNO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有臼突变。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ IDNO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有臼突变和调节效应子功能的突变。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E，或(ii)如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的Fc多肽(例如，克隆CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.23和CH3C.35.23.1.1中的任一者)可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ IDNO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，(i)如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E，或(ii)如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:177-180中任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:177-180中任一者的序列的修饰的Fc多肽可以经过修饰以具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
克隆CH3C.35.23.3
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)，并且与SEQ ID NO:105的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:105的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:106或107的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:106或107的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:108的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:108的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:109的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:109的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:110或111的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:110或111的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:112或113的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:112或113的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)，并且与SEQ ID NO:114的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:114的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:115或116的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:115或116的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:117的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:117的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:118的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:118的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:119或120的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ IDNO:119或120的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.3可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:121或122的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO:121或122的序列。
克隆CH3C.35.23.4
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)，并且与SEQ ID NO:123的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:123的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:124或125的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:124或125的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:126的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:126的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:127的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:127的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:128或129的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:128或129的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:130或131的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:130或131的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)，并且与SEQ ID NO:132的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:132的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:133或134的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:133或134的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:135的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:135的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:136的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:136的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:137或138的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ IDNO:137或138的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.4可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:139或140的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO:139或140的序列。
克隆CH3C.35.23
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)，并且与SEQ ID NO:141的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:141的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:142或143的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:142或143的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:144的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:144的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:145的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:145的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:146或147的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:146或147的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有杵突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:148或149的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:148或149的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)，并且与SEQ ID NO:150的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变的克隆CH3C.35.23具有SEQID NO:150的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:151或152的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:151或152的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ IDNO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:153的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:153的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ IDNO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:154的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:154的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:155或156的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQ ID NO:155或156的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23可以具有臼突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:99编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:157或158的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23具有SEQID NO:157或158的序列。
克隆CH3C.35.23.1.1
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有杵突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136W)，并且与SEQ ID NO:159的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:159的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有杵突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:160或161的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:160或161的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有杵突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:162的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:162的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有杵突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:163的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:163的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有杵突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:164或165的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:164或165的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有杵突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136W)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:166或167的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有杵突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:166或167的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有臼突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136S、L138A和Y177V)，并且与SEQ ID NO:168的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:168的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有臼突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))，并且与SEQ ID NO:169或170的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和调节效应子功能的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:169或170的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有臼突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQID NO:1编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:171的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:171的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有臼突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136S、L138A和Y177V)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQID NO:1编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:172的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:172的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有臼突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的M22Y、S24T和T26E)，并且与SEQ ID NO:173或174的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQID NO:173或174的序列。
在一些实施方案中，克隆CH3C.35.23.1.1可以具有臼突变(例如，如参考SEQ IDNO:1编号的T136S、L138A和Y177V)、调节效应子功能的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的L4A、L5A和/或P99G(例如，L4A和L5A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如，如参考SEQ ID NO:1编号的具有或不具有M198L的N204S)，并且与SEQ ID NO:175或176的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有臼突变、调节效应子功能的突变和增加血清稳定性或血清半衰期的突变的克隆CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO:175或176的序列。
VIII.TFR结合蛋白的形式
在一些实施方案中，如本文所述的修饰的TfR结合多肽是蛋白质二聚体的亚单位。在一些实施方案中，所述二聚体是异源二聚体。在一些实施方案中，所述二聚体是同源二聚体。在一些实施方案中，所述二聚体包含结合于TfR受体的单一Fc多肽，即对于TfR受体结合为单价。在一些实施方案中，所述二聚体包含结合于TfR受体的第二多肽。所述第二多肽可以包含相同的修饰的Fc多肽以提供二价同源二聚体蛋白，或本文所述的第二修饰的Fc多肽可以提供第二TfR受体结合位点。
本文所述的TfR结合多肽和构成二聚体或多聚体蛋白的多肽可以具有广泛的结合亲和力，例如基于多肽的形式。举例来说，在一些实施方案中，包含如本文所述的修饰的Fc多肽的多肽对TfR的亲和力是在1pM至10μM中的任一范围内。在一些实施方案中，亲和力可以单价形式来测量。在其他实施方案中，亲和力可以二价形式来测量，例如作为包含修饰的Fc多肽的蛋白质二聚体。
用于分析结合亲和力、结合动力学和交叉反应性以分析与TfR的结合的方法是本领域中已知的。这些方法包括但不限于固相结合分析(例如，ELISA分析)、免疫沉淀、表面等离子体共振(例如，BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、动力学排除分析(例如，
)、流式细胞术、荧光活化细胞分选(FACS)、生物层干涉(例如，
(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))和Western印迹分析。在一些实施方案中，使用ELISA来测定结合亲和力和/或交叉反应性。用于执行ELISA分析的方法是本领域中已知的，并且还描述于下文实施例部分中。在一些实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用动力学排除分析来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用生物层干涉分析来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。也可以使用这些类型的分析来评估TfR结合多肽的FcRn结合。FcRn结合通常是在酸性条件下进行分析，例如在约5至约6的pH下。
IX.TFR结合蛋白缀合物
在一些实施方案中，结合TfR并且启动跨BBB转运的抗HER2构建体(例如Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或包含如本文所述的修饰的Fc多肽的抗体重链可以进一步包含部分或全部铰链区。铰链区可以来自任何免疫球蛋白亚类或同型。说明性免疫球蛋白铰链是IgG铰链区，如IgG1铰链区，例如人类IgG1铰链氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ IDNO:104)。
在其他实施方案中，本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)可融合至用于蛋白质纯化中的肽或蛋白质，例如多组氨酸、表位标签(例如FLAG、c-Myc、血球凝集素标签等)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G或麦芽糖结合蛋白(MBP)。在一些实施方案中，纯化标签可以与抗体重链融合。在一些情形下，与抗HER2构建体融合的肽或蛋白质可以包含蛋白酶裂解位点，如Xa因子或凝血酶的裂解位点。在某些实施方案中，键联可由中枢神经系统中存在的酶裂解。
也可使非多肽剂附接至抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)。此类剂包括细胞毒性剂、成像剂、DNA或RNA分子或化合物。在一些实施方案中，所述剂可以是治疗性或成像化合物。在一些实施方案中，所述剂是小分子，例如小于1000Da、小于750Da或小于500Da。
呈多肽或非多肽的剂可以附接至Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链的N末端或C末端区，或附接至Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链的任一区，只要所述剂不干扰TfR结合多肽与TfR的结合即可。
在各个实施方案中，可以使用众所周知的化学交联试剂和方案来产生缀合物。举例来说，存在大量的本领域技术人员已知并且可用于使抗HER2构建体与相关剂交联的化学交联剂。举例来说，所述交联剂是异型双官能团交联剂，其可以用于以逐步方式连接分子。异型双官能团交联剂使得能够设计更具特异性的用于结合蛋白质的偶合方法，由此减少不期望的副反应(如同型蛋白质聚合物)的发生。
相关剂可以是治疗剂(包括细胞毒性剂等)或化学部分。在一些实施方案中，所述剂可以是肽或小分子治疗剂或成像剂。
X.TFR和HER2的共靶向
除了使用TfR结合作为使得能够跨BBB递送的手段以外，TfR也在各种癌症中高度表达，包括某些HER2+乳腺癌。使癌细胞获得增加的TfR表达的机制有可能与肿瘤细胞增殖和增加的代谢需求(如铁摄取)有关。由于本文所述的脑渗透性TfR结合抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗HER2抗体可变区融合蛋白)含有TfR结合部分(例如，结合TfR的Fc多肽)以使得能够跨BBB转运，因此在结合于也表达TfR的HER2+肿瘤细胞后可存在额外抗肿瘤益处。特定地，由于这些抗HER2构建体可以同时结合TfR和HER2两者(例如，结合于同一细胞上表达的TfR和HER2两者)，这可以增强其效能和/或功效。
如实例中所证明，我们已经开发出结合TfR的Fc多肽二聚体-抗HER2抗体可变区融合蛋白，并且所述融合蛋白已经显示能够跨BBB并且能够跨BBB转运治疗剂。此外，我们已经证明由这些融合蛋白共靶向TfR和HER2(例如，HER2的子结构域I、II和/或IV)会增强细胞生长抑制和细胞杀死。特定说来，如实施例11-14中所示，所述融合蛋白有效增强细胞生长抑制，而相比之下，当仅靶向HER2或当组合使用单独的抗TfR和抗HER2分子时却无效应，表明用同一分子结合于TfR和HER2两者有益于在这种情况下达成细胞杀死。因此，实验结果支持由单一分子同时结合并且交联TfR和HER2可以增强对HER2+癌细胞系的生长抑制。
因此，本文公开一种用于治疗受试者的癌症或治疗癌症的脑转移的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的结合于(a)人类HER2的子结构域I、II或IV(例如，人类HER2的子结构域I或II)和(b)转铁蛋白受体(TfR)的抗HER2构建体，其中单独的所述抗HER2构建体对于治疗所述癌症是治疗有效的。抗HER2构建体可以作为单一疗法施用于受试者。在一些实施方案中，抗HER2构建体是与化学疗法或放射疗法组合施用。抗HER2构建体可以结合于同一细胞上的HER2和TfR。
本文还公开一种用于治疗受试者的癌症或治疗癌症的脑转移的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的：
(a)第一抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域II；和
(b)第二抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域IV，或
(a)第一抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域I；和
(b)第二抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域IV，或
(a)第一抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域I；和
(b)第二抗HER2构建体，其结合于人类HER2的子结构域II，
其中所述第一和/或所述第二抗HER2构建体也结合TfR。在这种方法的一些实施方案中，所述第一和所述第二抗HER2构建体中的仅一者结合于HER2和TfR两者。
在一些实施方案中，结合于HER2和TfR两者的抗HER2构建体可以是Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含结合于人类HER2的子结构域I、II或IV的抗体可变区和修饰的Fc多肽二聚体，所述修饰的Fc多肽二聚体包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽。
举例来说，在一些实施方案中，结合于人类HER2的子结构域II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：
(a)具有SEQ ID NO:38的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:55的序列的第二重链；
或
(b)具有SEQ ID NO:46的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:55的序列的第二重链；
或
(c)具有SEQ ID NO:30的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:55的序列的第二重链。
举例来说，在一些实施方案中，结合于人类HER2的子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：
(a)具有SEQ ID NO:267的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:290的序列的第二重链；
或
(b)具有SEQ ID NO:275的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:290的序列的第二重链；
或
(c)具有SEQ ID NO:259的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:290的序列的第二重链。
举例来说，在一些实施方案中，结合于人类HER2的子结构域IV的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含：
(a)具有SEQ ID NO:10的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:27的序列的第二重链；
或
(b)具有SEQ ID NO:18的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:27的序列的第二重链；
或
(c)具有SEQ ID NO:2的序列的第一重链、具有SEQ ID NO:27的序列的第二重链。
在其他实施方案中，结合于HER2和TfR两者的抗HER2构建体可以是双特异性构建体，其包含结合于人类HER2(例如，人类HER2的子结构域I、II或IV)的抗体可变区和结合TfR的抗体可变区。
XI.增加效应子功能的方法
对于一些应用，期望向本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和抗体重链中引入增加效应子功能(例如，ADCC)的修饰。一种用于增加效应子功能的方法涉及产生无岩藻糖基化或岩藻糖缺乏型抗HER2构建体和/或抗体重链。
一种用于产生岩藻糖缺乏型抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和抗体重链的方法是使用岩藻糖类似物，如2-氟岩藻糖(2-FF)。岩藻糖类似物可以消耗或降低GDP-岩藻糖的可用性，所述GDP-岩藻糖是岩藻糖基转移酶将岩藻糖并入至蛋白质中所需的底物。
一种常用于商业生产的用于产生岩藻糖缺乏型抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和抗体重链的替代方法是采用用于表达抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链的α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)剔除细胞系。适宜FUT8剔除细胞系的非限制性实例是中国仓鼠卵巢(CHO)FUT8剔除细胞系，其可自Lonza Biologics获得。此外，如Mori等人(Biotechnol.Bioeng.(2004)88:901-908；以全文引用的方式并入本文中)中所述，FUT8小干扰RNA(siRNA)可以用于转化CHO细胞系(例如，通过FUT8 siRNA的组成型表达)以供产生岩藻糖缺乏型蛋白质。
XII.核酸、载体和宿主细胞
如本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和抗体重链通常使用重组方法来制备。因此，提供包含编码如本文所述的抗HER2构建体或抗体重链中的任一者的核酸序列的分离的核酸，和其中引入核酸以用于复制编码多肽的核酸和/或表达抗HER2构建体或抗体重链的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如人类细胞。
另一方面，提供多核苷酸，其包含编码本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链的核苷酸序列。所述多核苷酸可以是单股或双股的。在一些实施方案中，所述多核苷酸是DNA。在特定实施方案中，所述多核苷酸是cDNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸是RNA。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包括于核酸构建体内。在一些实施方案中，所述构建体是可复制的载体。在一些实施方案中，所述载体是选自质粒、病毒载体、噬粒、酵母染色体载体和非游离型哺乳动物载体。
在一些实施方案中，所述多核苷酸可操作地连接至表达构建体中的一个或多个调控性核苷酸序列。在一系列实施方案中，调适核酸表达构建体以用作表面表达库。在一些实施方案中，针对酵母中的表面表达调适库。在一些实施方案中，针对噬菌体中的表面表达调适库。在另一系列的实施方案中，调适核酸表达构建体以在允许以毫克或克的量分离多肽的系统中表达抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链。在一些实施方案中，所述系统是哺乳动物细胞表达系统。在一些实施方案中，所述系统是酵母细胞表达系统。
用于产生重组抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链的表达媒介包括质粒和其他载体。举例来说，适宜载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞(如大肠杆菌(E.coli))中表达的pBR322源性质粒、pEMBL源性质粒、pEX源性质粒、pBTac源性质粒和pUC源性质粒。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg源性载体是适用于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。或者，如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或艾司坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP源和p205)等病毒的衍生物可以用于在真核细胞中瞬时表达多肽。在一些实施方案中，可以期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组抗HER2构建体或抗体重链。此类杆状病毒表达系统的实例包括pVL源性载体(如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW源性载体(如pAcUW1)和pBlueBac源性载体。其他表达系统包括腺病毒、腺相关病毒和其他病毒表达系统。
载体可以转化至任何适宜宿主细胞中。在一些实施方案中，可以调适宿主细胞(例如细菌或酵母细胞)以用作表面表达库。在一些细胞中，载体在宿主细胞中表达以表达相对较大量的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链。此类宿主细胞包括哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和原核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞、NS0细胞、Y0细胞、HEK293细胞、COS细胞、Vero细胞或HeLa细胞。
可以在适当条件下培养经编码抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链的表达载体转染的宿主细胞以容许发生抗HER2构建体或抗体重链的表达。抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链可以从含有抗HER2构建体或抗体重链的细胞和培养基的混合物分泌并且分离。或者，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链可以保留于细胞质中或膜部分中，并且收获细胞，溶解，并且使用期望方法分离抗HER2构建体或抗体重链。
XIII.治疗方法
在一些方面，本文提供跨内皮胞转能够结合HER2(例如，人类HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使内皮与包含本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)的组合物接触。在一些实施方案中，内皮是血脑屏障(BBB)。
在其他方面，本文提供用于治疗受试者的癌症(例如，HER2阳性癌症)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)。可以根据本文所提供的方法治疗任何数量的HER2阳性癌症。非限制性实例包括HER2阳性乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰脏癌和非小细胞肺癌(NSCLC)以及HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌。在一些实施方案中，HER2阳性癌症是HER2阳性乳腺癌。在一些实施方案中，HER2阳性癌症是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌。在一些实施方案中，HER2阳性癌症是转移癌。
在其他方面，本文提供用于治疗癌症(例如，HER2阳性癌症)的转移的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)。在一些实施方案中，转移是上文所述的HER2阳性癌症的脑转移。在一些实施方案中，转移是HER2阳性乳腺癌的脑转移。在一些实施方案中，转移是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌的脑转移。
在一些实施方案中，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)包含抗HER2子结构域IV抗体可变区。在一些实施方案中，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)包含抗HER2子结构域II抗体可变区。在一些实施方案中，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)包含抗HER2子结构域I抗体可变区。在一些实施方案中，向受试者施用包含抗HER2子结构域IV抗体可变区的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和包含抗HER2子结构域II抗体可变区的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)两者。在一些实施方案中，向受试者施用包含抗HER2子结构域IV抗体可变区的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和包含抗HER2子结构域I抗体可变区的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)两者。在一些实施方案中，向受试者施用包含抗HER2子结构域I抗体可变区的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和包含抗HER2子结构域II抗体可变区的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)两者。
在一些实施方案中，向受试者施用第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。在一些情况下，所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。在一些情况下，所述第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。在一些情况下，所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，施用靶向HER2的子结构域IV和子结构域II两者的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合比仅施用靶向子结构域IV或子结构域II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白时产生更大的治疗益处。在一些实施方案中，施用靶向HER2的子结构域IV和子结构域I两者的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合比仅施用靶向子结构域IV或子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白时产生更大的治疗益处。在一些实施方案中，施用靶向HER2的子结构域II和子结构域I两者的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合比仅施用靶向子结构域II或子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白时产生更大的治疗益处。
在一些实施方案中，施用单独的靶向HER2子结构域IV的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比使用单独的抗HER2子结构域IV抗体更有效地抑制乳腺癌细胞生长。在一些实施方案中，施用单独的靶向HER2子结构域II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比使用单独的抗HER2子结构域II抗体更有效地抑制乳腺癌细胞生长。在一些实施方案中，施用单独的靶向HER2子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比使用单独的抗HER2子结构域I抗体更有效地抑制乳腺癌细胞生长。
此外，在一些实施方案中，施用单独的靶向HER2子结构域IV的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比使用抗HER2子结构域IV抗体与抗TfR抗体的组合更有效地抑制乳腺癌细胞生长。在一些实施方案中，施用单独的靶向HER2子结构域II的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比使用抗HER2子结构域II抗体与抗TfR抗体的组合更有效地抑制乳腺癌细胞生长。在一些实施方案中，施用单独的靶向HER2子结构域I的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白比使用抗HER2子结构域I抗体与抗TfR抗体的组合更有效地抑制乳腺癌细胞生长。
在其他实施方案中，使用包括能够结合HER2(例如，人类HER2的子结构域I、II或IV)的抗体可变区和能够结合TfR的抗体可变区的抗HER2构建体比仅使用抗HER2抗体(例如，抗HER2子结构域I抗体、抗HER2子结构域II抗体或抗HER2子结构域IV抗体)或使用单独抗TfR和抗HER2(例如，抗HER2子结构域I、抗HER2子结构域II或抗HER2子结构域IV)抗体的组合更有效地抑制乳腺癌细胞生长。
在一些实施方案中，治疗益处可以包含肿瘤生长降低或减缓、肿瘤大小(例如体积)降低、肿瘤细胞存活率降低、转移性病灶的数目减少、癌症(例如HER2阳性癌症)的一个或多个病征或症状改善和/或患者存活增加。在一些实施方案中，肿瘤细胞存活、肿瘤生长、肿瘤大小和/或转移性病灶的数目降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施方案中，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)拮抗HER2活性。在一些实施方案中，HER2活性受抑制(例如，抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)。
在一些实施方案中，受试者先前未用抗HER2疗法治疗。在一些实施方案中，受试者先前未用针对转移性疾病的化学疗法治疗。在一些实施方案中，受试者先前未用抗HER2疗法和/或针对转移性疾病的化学疗法治疗。
在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用一种或多种其他治疗剂或治疗。所述其他治疗剂或治疗可以包含例如化学疗法、免疫疗法、放射疗法、激素疗法、分化剂、小分子药物或其组合。
在一些实施方案中，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)是以治疗有效量或剂量施用于受试者。可以使用约0.01mg/kg至约500mg/kg、或约0.1mg/kg至约200mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg、或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。然而，剂量可根据数种因素变化，包括所选施用途径、组合物的制剂、患者反应、疾患的严重程度、受试者体重和处方医生的判断。视个别患者的需要，剂量可随时间增加或降低。在某些情况下，最初给予患者较低剂量，接着将其增加至患者可耐受的有效剂量。有效量的确定充分在本领域技术人员的能力范围内。
如本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)的施用途径可为口服、腹膜内、经皮、皮下、静脉内、肌肉内、鞘内、吸入、表面、病灶内、直肠、支气管内、鼻、经粘膜、肠、眼或耳递送或本领域中已知的任何其他方法。在一些实施方案中，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)是口服、静脉内或腹膜内施用。
可以一起或分开、同时或在不同时间执行多种抗HER2构建体(例如，多种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)与另一治疗剂的共施用。在施用时，视需要，治疗剂可以独立地每天一次、两次、三次、四次或通常更多次或更少次地施用。在一些实施方案中，所施用的治疗剂每天施用一次。在一些实施方案中，所施用的治疗剂是在相同时间施用，例如作为混合物。在一些实施方案中，一种或多种治疗剂是以持续释放制剂形式施用。
在一些实施方案中，同时施用多种抗HER2构建体(例如，多种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)的组合或抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)与另一治疗剂的组合。在一些实施方案中，各剂依序施用。举例来说，第一剂(例如，第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)可以在施用第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或另一剂之前施用持续约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天或更多天，或反之亦然。
在一些实施方案中，在一段延长时期内向受试者施用抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)(和任选地另一治疗剂)，例如持续至少30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、150天、200天、250天、300天、350天或更长时间。
XIV.药物组合物和试剂盒
另一方面，提供包含本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)和/或抗体重链的药物组合物和试剂盒。在一些实施方案中，所述药物组合物和试剂盒是用于跨受试者的内皮(例如BBB)胞转能够结合HER2的抗体可变区。在一些实施方案中，所述药物组合物和试剂盒是用于治疗HER2阳性癌症或其转移性病灶(例如，在受试者中)。
药物组合物
在一些实施方案中，提供包含抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有抗HER2子结构域IV抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有抗HER2子结构域II抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有抗HER2子结构域I抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有抗HER2子结构域IV抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链和含有抗HER2子结构域II抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有抗HER2子结构域IV抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链和含有抗HER2子结构域I抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述药物组合物包含含有抗HER2子结构域I抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链和含有抗HER2子结构域II抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。
在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链，并且还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。药学上可接受的载体包括生理学上可相容并且优选地不干扰或以其他方式抑制活性剂的活性的任何溶剂、分散介质或包衣。各种药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的。
在一些实施方案中，载体适用于静脉内、肌肉内、口服、腹膜内、鞘内、经皮、表面或皮下施用。药学上可接受的载体可以含有一种或多种用于例如稳定组合物或增加或降低活性剂的吸收的生理学上可接受的化合物。生理学上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质；降低活性剂的清除率或水解的组合物；或赋形剂；或其他稳定剂；和/或缓冲液。其他药学上可接受的载体和其制剂是本领域中众所周知的。
本文所述的药物组合物可以本领域技术人员已知的方式来制造，例如借助于常规混合、溶解、造粒、糖衣丸制备、乳化、封装、包埋或冻干过程。以下方法和赋形剂仅为示例性并且决不具有限制性。
对于口服施用，抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链可以通过使其与本领域中众所周知的药学上可接受的载体组合来配制。此类载体使得能够将所述化合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、乳液、亲脂性和亲水性悬浮液、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以供待治疗的患者口服摄取。用于口服使用的药物制剂可以通过以下方式来获得：使所述化合物与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，并且必要时在添加适宜辅助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。适宜赋形剂包括例如填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要时，可以添加崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(如海藻酸钠)。
抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链可配制用于通过注射肠胃外施用，例如通过团注或连续输注。对于注射来说，所述一种或多种化合物可以通过溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂(如植物油或其他类似油、合成脂肪族酸甘油酯、高级脂肪族酸或丙二醇的酯)中而配制成制剂；并且必要时，与如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂等常规添加剂一起配制。在一些实施方案中，化合物可以在水溶液、优选地生理学上可相容的缓冲液，如汉克氏溶液(Hanks’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液中配制。注射用制剂可以单位剂型(例如在安瓿中或在多剂量容器中)呈递，并且添加防腐剂。所述组合物可以采取如油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液等形式，并且可以含有如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配制剂。
通常，用于体内施用的药物组合物是无菌的。灭菌可以根据本领域中已知的方法，例如热灭菌、蒸汽灭菌、无菌过滤或照射来实现。
本公开的药物组合物的剂量和期望药物浓度可以视所设想的特定用途而变化。适当剂量或施用途径的确定是本领域技术人员众所周知的。本文还描述适宜剂量。
试剂盒
在一些实施方案中，提供试剂盒，其包含如本文所述(例如，如上文所述)的抗HER2构建体(例如，Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白)或抗体重链或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有抗HER2子结构域IV抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有抗HER2子结构域II抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有抗HER2子结构域I抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有抗HER2子结构域IV抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链和含有抗HER2子结构域II抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有抗HER2子结构域IV抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链和含有抗HER2子结构域I抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有抗HER2子结构域I抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链和含有抗HER2子结构域II抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白或抗体重链。在一些实施方案中，所述试剂盒是用于跨受试者的内皮(例如BBB)胞转能够结合HER2的抗体可变区。在一些实施方案中，所述试剂盒是用于治疗HER2阳性癌症或其转移性病灶(例如，在受试者中)。
在一些实施方案中，试剂盒还包含含有用于实践本文所述方法的指示(即方案)的指导性材料(例如，使用试剂盒内容物来治疗如HER2阳性癌症等癌症或其转移性病灶的说明书)。虽然所述指导性材料通常包含书面或印刷材料，但其并不限于此。能够存储此类说明书并且将其传送至最终用户的任何介质均涵盖在内。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁盘、芯片)、光学介质(例如，CD-ROM)等。此类介质可以包括提供此类指导性材料的互联网站点的地址。
XV.实施例
包括以下实施例以证明本公开的具体实施方案。本领域技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术代表在本公开的实践中运行良好的技术，并且由此可以被视为构成针对本公开的实践的具体模式。然而，本领域技术人员鉴于本公开应了解，可以在不背离本公开的精神和范围的情形下对所公开的具体实施方案作出许多改变并且仍获得相同或相似的结果。
实施例1.具有顺式LALA构型并且具有针对子结构域II和IV的HER2结合位点的Fc多肽二聚体-Fab融合蛋白的产生
我们已经工程改造出一种TfR结合多肽，其中Fc多肽二聚体在呈顺式构型的一个Fc多肽中含有LALA突变。这种TfR结合多肽能够减弱小鼠中的血液和骨髓网状细胞消耗，其先前在具有WT IgG的TfR结合多肽中可见。重要的是，在结合于Fab靶后，具有顺式LALA构型的TfR结合多肽能够引发体外Fab靶介导的ADCC和CDC，并且引发针对相关靶的体内效应子功能免疫反应。基于这些结果，我们合理地认为这一分子可能与特定Fab臂配对，并且成为既可保留网状细胞安全性并且还针对相关治疗靶引发效应子功能的脑渗透性治疗剂。
在这一实施例以及下文实施例2-5中，产生Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中HER2结合位点被工程改造至TfR结合多肽的Fab臂中。利用使用抗HER2_DIV(包含分别具有SEQ ID NO:97和57中所陈述的氨基酸序列的重链和轻链)和抗HER2_DII(包含分别具有SEQ ID NO:98和58中所陈述的氨基酸序列的重链和轻链)的疗法对HER2阳性乳腺癌进行治疗已经取得极大成功。
这一实施例和下文实施例2-5中所用的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白是利用与修饰的Fc多肽二聚体融合的HER2 Fab结合位点来产生，所述修饰的Fc多肽二聚体具有作为TfR结合多肽的第一Fc多肽(CH3C.35.23.1.1，具有LALA突变)和不具有TfR结合位点或降低FcγR结合的任何修饰的第二Fc多肽-这些抗HER2构建体被称作HER2-35.23.1cisLALA。具体说来，抗HER2子结构域IV构建体HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA是具有包含SEQ ID NO:2的第一重链、包含SEQ ID NO:27的第二重链和包含SEQ ID NO:57的两条轻链的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，并且抗HER2子结构域II构建体HER2_DII-35.23.1.1cisLALA是具有包含SEQ ID NO:30的第一重链、包含SEQ ID NO:55的第二重链和包含SEQ ID NO:58的两条轻链的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。
为了确认Fc中TfR结合位点的存在不会改变对HER2的结合亲和力，我们使用BiacoreTM测定对HER2细胞外结构域蛋白的结合系数(KD)。如所预期，对HER2(使用细胞外结构域蛋白)的结合亲和力在Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白中并未改变，所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白在Fab臂中具有针对HER2子结构域IV或II的HER2结合序列(图1A和表1)。将这些结果与抗HER2_DIV和抗HER2_DII的结合亲和力进行比较。
表1.对HER2细胞外结构域的结合亲和力。
| 分子 | 同型 | K<sub>D</sub>(nM) |
| 抗HER2_DIV | huIgG1 | 1.2 |
| 35.23.1.1:HER2_DIV | huIgG1 | 0.8 |
| 35.23.1.1:HER2_DIV | huIgG1.LALA.杵 | 1.1 |
| 35.23.1.1:HER2_DIV | huIgG1.LALA | 0.8 |
| 抗HER2_DII | huIgG1 | 2.0 |
| 35.23.1.1:HER2_DII | huIgG1.LALA.杵 | 1.5 |
为了确认添加HER2结合位点不会改变Fc多肽中的TfR结合结构域处对TfR的结合亲和力，我们还比较各种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的TfR结合亲和力。在HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA之间，对TfR的亲和力无显著差异(分别为601nM和620nM)(图1B和表2)。
表2.对顶端hTfR的结合亲和力。
实施例2.具有HER2 Fab结合位点的Fc多肽二聚体-Fab融合蛋白对BT474的抑制
在HER2阳性乳腺癌细胞系中评估HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA抑制癌细胞增殖的能力。将BT474细胞以10,000个细胞/孔接种于96孔板中过夜，利用60μL相关分子的1:3连续稀释液(以25,000ng/mL开始)处理。在第3天补充培养基和药物。在第6天，使用5μL WST-1试剂在50μL生长培养基中测定细胞生长。所述板在WST-1试剂存在下孵育持续4小时，并且在440nm下测定吸光度。生长抑制/增殖百分比针对未处理的对照标准化。
HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA能够抑制BT474细胞的生长，其方式与抗HER2_DIV类似。在Fc处添加TfR结合位点不会干扰生长抑制的程度(图2和表3)。
表3.BT474生长抑制分析的IC50值。
| 分子 | IC<sub>50</sub>(nM) |
| 抗HER2_DIV | 1.30±0.22 |
| 35.23.1.1<sup>cisLALA</sup>:HER2_DIV | 0.986±0.30 |
| 抗HER2_DIV+抗Her2_DII | 1.66±0.18 |
| 35.23.1.1<sup>cisLALA</sup>:Her2_DIV+35.23.1.1<sup>cisLALA</sup>:Her2_DII | 0.500±0.056 |
实施例3.HER2阳性乳腺癌细胞系BT474中pAKT蛋白质水平降低
已知HER2扩增使下游PI3K/Akt信号传导途径失调。靶向HER2的小分子抑制剂或抗体降低磷酸化AKT(pAKT)，并且阻止HER2阳性乳腺癌细胞中的EGFR活化和下游信号传导机制。pAKT蛋白质水平的降低用作测定靶接合的可用读出。重要的是，抗HER2_DIV强劲地降低各种乳腺癌细胞系(包括BT474)中的pAkt蛋白质水平。相反地，在pAkt水平增加的肿瘤中，还观察到对抗HER2_DIV治疗的抗性增加。
使用免疫印迹来评价在用HER2_DIV-35.23.11cisLALA处理后BT474中的pAKT的蛋白质表达水平。将BT474细胞以100,000-200,000个细胞/孔接种于24孔板中过夜。细胞以50μg/mL处理持续2小时，用PBS洗涤两次，并且使用含有全蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液收获溶解产物。将8μl蛋白质溶解产物添加至每一孔中，并且使用抗pAKT、抗AKT和抗b-肌动蛋白以1:1,000对蛋白质点出印迹并且进行分析。使用Li-CORE成像系统对条带进行肉眼观察和分析。
与BT474细胞中的生长抑制特性一致，与未处理的对照相比，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA显著降低pAKT蛋白质水平(图3)。这一数据证明，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA通过抑制下游PI3K/Akt信号传导途径以与抗HER2_DIV类似的方式接合HER2阳性乳腺癌细胞。
实施例4.用于抑制BT474细胞的组合治疗。
抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合在转移癌中已经证明优异的临床活性，并且目前是用于HER2阳性乳腺癌患者的护理标准。抗HER2_DII结合于HER2的子结构域II并且阻止与HER3和EGFR的异源二聚化。有趣的是，单独的抗HER2_DII不如单独的抗HER2_DIV有效。当抗HER2_DII与抗HER2_DIV组合时，其在HER2阳性乳腺癌中的抗肿瘤活性强于抗HER2_DIV单一疗法。重要的是，在对抗HER2_DIV具有抗性的肿瘤中，组合疗法还证明更大的有效性。
如上文所提及，除HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA以外，还产生具有针对HER2子结构域II的结合位点的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白(HER2_DII-35.23.1.1cisLALA)。利用两种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合处理BT474细胞；通过如上文所述的WST1存活率分析评估生长抑制。令人注目地，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合比抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合导致更有效的生长抑制(图2)。
因为也已知抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合疗法克服肿瘤抗性，我们接下来测试HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合在神经调节蛋白1诱发的抗性模型中克服肿瘤抗性的能力。神经调节蛋白1(NRG-1)是HER3的配体并且富含于脑微环境中，并且在HER2扩增的乳腺癌细胞系中已经显示强效诱导对PI3K抑制剂的抗性。具体说来，NRG-1使HER3信号传导途径活化并且启动HER2-HER3二聚化。这进而导致PI3K/Akt途径的活化并且使肿瘤细胞对抗HER2_DIV治疗更具抗性。在NRG1(50ng/mL)存在下，BT474乳腺癌细胞确实对抗HER2_DIV或HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA具有抗性(图4)。尽管如此，通过抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合治疗在子结构域IV和II处结合HER2克服了这种抗性，与已公开的数据一致(图4)。此外，如通过在BT474细胞中的WST1生长抑制分析所测定，在NRG1存在下，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合比抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合更有效(图4和表4)。这些结果证明，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合不仅在体外降低乳腺癌细胞增殖，并且令人惊讶地还比抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合更有效。
因为越来越多的临床前和临床数据表明HER2阳性乳腺癌脑转移(BCBM)比外周肿瘤对抗HER2_DIV更具抗性，并且靶向HER2-HER3二聚化是克服这种抗性的策略，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合可以使得能够1)跨血脑屏障递送治疗剂以进入HER2阳性BCBM，和2)抑制由于脑微环境而对抗HER2_DIV变得具有抗性的癌细胞增殖。
表4.BT474生长抑制分析的IC50值。
| 分子 | IC<sub>50</sub>(nM) |
| 抗HER2_DIV | - |
| 35.23.1.1<sup>cisLALA</sup>:Her2_DIV | - |
| 抗HER2_DIV+抗Her2_DII | 4.63±0.55 |
| 35.23.1.1<sup>cisLALA</sup>:Her2_DIV+35.23.1.1<sup>cisLALA</sup>:Her2_DII | 1.61±0.18 |
与抗HER2_DIV类似，抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合强劲地降低pAKT蛋白质水平。HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的组合还强劲地降低pAKT蛋白质水平(图5)。在NRG1(50ng/mL)(如通过增加的pAKT蛋白质水平所证明，其导致肿瘤细胞抗性增加)存在下，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA与HER2_DII-35.23.1.1cisLALA]的组合(各自50μg/mL，2小时)还强劲地降低pAKT蛋白质水平(图5)。这一结果与在BT474细胞中在NRG1诱导的抗性时观察到的生长抑制一致(图4)。
实施例5.Fc多肽二聚体-Fab融合蛋白在HER2阳性乳腺癌细胞中引发Fab介导的ADCC
越来越多的文献指示，如ADCC等效应子功能是抗HER2_DIV的抗肿瘤机制的重要组分。另外，对FcγR剔除小鼠的研究显示，抗HER2_DIV的抗肿瘤效应显著减弱。与靶向TfR以供BBB进入的多肽疗法相关的一个挑战是网状细胞安全性。出于这一原因，引入LALA突变以解开TfR表达多肽中的FcγR结合。另一方面，对于其中需要效应子功能的应用来说，LALA突变在需要血脑屏障进入和效应子功能反应的治疗中产生治疗限制。
在HER2阳性乳腺癌细胞系中评估Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白引发Fab介导的ADCC的能力。使用表达高HER2水平的靶细胞(SK-BR-3)来评估HER2介导的ADCC以确保保留效应子功能。接种靶细胞以10,000个细胞/孔接种靶细胞，调理，与NK细胞一起以25:1效应物:靶细胞比率孵育，并且通过LDH表达评估细胞毒性。用(1)对照IgG、(2)抗HER2_DIV、(3)具有TfR结合位点和HER2 Fab结合位点的hIgG1(HER2_DIV-35.23.1.1WT_IgG)和(4)HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA调理靶细胞。与先前在具有顺式构型的TfR结合多肽中所观察到的Fab介导的ADCC一致，在具有HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA的HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3中观察到ADCC，这证明效应子功能得以保留(图6)。
实施例6.在BT474细胞系的HER2+异种移植物模型中，Fc多肽二聚体-Fab融合蛋白具有优异的抗肿瘤效能
我们接下来利用SCID小鼠中的BT474异种移植物肿瘤模型来检查与抗HER2-DIV与抗HER2-DII的组合相比，HER2_DIV-35.23.4cisLALA与HER2_DII-35.23.4cisLALA的组合的体内抗肿瘤功效。具体说来，HER2_DIV-35.23.4cisLALA具有包含SEQ ID NO:18的第一重链、包含SEQ ID NO:27的第二重链和包含SEQ ID NO:57的两条轻链。HER2_DII-35.23.4cisLALA具有包含SEQ ID NO:46的第一重链、包含SEQ ID NO:55的第二重链和包含SEQ ID NO:58的两条轻链。抗HER2_DIV具有包含SEQ ID NO:97的两条重链和包含SEQ ID NO:57的两条轻链。抗HER2_DII具有包含SEQ ID NO:98的两条重链和包含SEQ ID NO:58的两条轻链。
将源自于BT474细胞的肿瘤片段经皮下植入于SCID小鼠的侧腹。当肿瘤大小达到平均100mm3时，以3mg/kg、10mg/kg或20mg/kg每一测试物品和40mg/kg对照IgG作为对照每周两次处理动物持续4周。每周两次测量肿瘤体积；当动物已经到达1000mm3的实验终点时或直至研究60天时，将其处死。如图7A中所示，在中等剂量10mg/kg下，与抗HER2-DIV+抗HER2-DII相比，用ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII(HER2_DIV-35.23.4cisLALA和HER2_DII-35.23.4cisLALA)处理的动物中的肿瘤生长抑制显著更高。使用每一测试物品3mg/kg、10mg/kg和20mg/kg剂量的剂量-反应关系显示，ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII比抗HER2-DIV+抗HER2-DII更有效(图7B)。在第4个剂量后24h处死一个动物群组。收获肿瘤并且使用MSDphospho AKT(Ser473)/总AKT分析全细胞溶解产物试剂盒根据制造商的方案使用溶解产物来测定pAKT和总AKT蛋白质表达水平。简单说来，用制造商的阻断溶液阻断分析板持续1h。溶解产物上清液样品和分析对照在所述板上孵育持续1h。随后添加检测抗体，并且使用MSD读板仪对所述板读数。如所预期，抗HER2-DIV+抗HER2-DII和ATV:HER2-DIV+ATV:HER2-DII两者的处理显著降低pAKT水平，这与靶向HER2可能消除在HER2+肿瘤中活化的PI3K/Akt信号传导途径的机制一致(图7C)。
实施例7.与标准hIgG相比，Fc多肽二聚体-Fab融合蛋白具有增加的脑浓度和脑:血浆比率
为评估ATV:HER2-DIV(HER2_DIV-35.23.4cisLALA)和ATV:HER2-DII(HER2_DII-35.23.4cisLALA)分子的血浆暴露和脑摄取，在第0天用50mg/kg的抗HER2-DIV、抗HER2-DII、ATV:HER2-DIV和ATV:HER2-DII处理TfRmu/hu KI小鼠。在第1天、第2天、第4天和第7天收集血浆样品，同时在第1天和第7天收获脑。使用夹心ELISA定量小鼠血浆和脑样品中通过hIgG测量获得的抗体浓度(图8A和图8B)。简单说来，384孔MaxiSorp板用对Fc片段具有特异性的多克隆驴抗人类IgG捕捉抗体涂布过夜。使用各自的给药溶液作为抗体定量的标准。使脑样品在1％NP40溶解缓冲液中均质化。在RT下将标准品、稀释的血浆和脑溶解产物添加至阻断的板中持续2小时，随后与检测抗体(对Fc片段具有特异性的HRP结合多克隆山羊抗人类IgG)一起孵育1小时。使用标准曲线来确定hIgG浓度。
由于TfR在外周组织中普遍表达，预期用TfR结合分子实现靶介导的药物处置。实际上，ATV:HER2-DIV和ATV:HER2-DII结合TfR的能力使得这些分子能够跨血脑屏障转运。在50mg/kg剂量后24h之后，HER2-ATV的脑浓度为33-42nM并且抗HER2分子的脑浓度为约4.5nM(图8B)，而HER2-ATV抗HER2抗体的脑:血浆比率高约10倍(图8C)。综上所述，这些数据支持这些多肽二聚体-Fab融合蛋白可能具有抗HER2抗体的效应，但另外具有BBB渗透特征。
实施例8.其他Fc多肽二聚体-Fab融合蛋白的表征
在第一Fc多肽中使用CH3C.35.23.4来建构其他Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。测试这些抗HER2构建体对人类TfR顶端结构域和HER2的细胞外结构域的结合亲和力，并且与其中第一Fc多肽包含CH3C.35.23.1.1的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白进行比较。
使用BiacoreTM8K通过表面等离子体共振来测定Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白对人类TfR顶端结构域和HER2 ECD的亲和力。使用人类Fab捕捉试剂盒(GE，#28-9583-25)在BiacoreTMSeries S CM5传感器芯片(GE，#29149604)上捕捉Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白以用于测量人类TfR顶端结构域结合，或使用人类Fc捕捉试剂盒(GE，#29234600)以用于测量人类HER2-ECD结合(ACROBiosystems,HE2-H5225)。以30μL/min的流速注射每一抗原的连续3倍稀释液。监测抗原与捕捉的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的结合持续30至300秒，并且接着在HBS-EP+电泳缓冲液中监测其解离持续30-4,200秒。通过从空白流动槽减去RU来校正结合反应。使用k缔合和k解离的同时拟合的1:1Languir模型进行动力学分析。
如下表7中所示，35.23.4抗HER2构建体和35.23.1.1抗HER2构建体均结合TfR(“WT_IgG”指示Fc多肽均不含LALA修饰；“cisLALA”指示LALA突变存在于含有产生TfR结合位点的突变的Fc多肽上，但不存在于另一Fc多肽上)。HER2_DII-35.23.1.1cisLALA曲线的向上漂移有可能引起这一抗HER2构建体的KD值的人为增加。此外，由于Fab结构域呈这种分析形式(即，其中Fc多肽经由抗人类Fab捕捉)，未观察到TfR亲和力的差异。
表7.对顶端hTfR的结合亲和力。
| 分子 | K<sub>D</sub>(nM) |
| HER2_DIV-35.23.4<sup>WT_IgG</sup> | 498 |
| HER2_DIV-35.23.4<sup>cisLALA</sup> | 458 |
| HER2_DII-35.23.4<sup>cisLALA</sup> | 445 |
| HER2_DIV-35.23.1.1<sup>cisLALA</sup> | 660 |
| HER2_DII-35.23.1.1<sup>cisLALA</sup> | 534 |
| 抗BACE-35.23.4<sup>WT_IgG</sup> | 439 |
如下表8中所示，包含抗HER2子结构域IV和子结构域II抗体可变区的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白以与抗HER2_DIV(用作参考标准)类似的亲和力(和动力学)结合于HER2-ECD。
表8.对HER2 ECD的结合亲和力。
| 分子 | K<sub>D</sub>(nM) |
| HER2_DIV-35.23.4<sup>WT_IgG</sup> | 2.0 |
| HER2_DIV-35.23.4<sup>cisLALA</sup> | 1.4 |
| HER2_DII-35.23.4<sup>cisLALA</sup> | 1.8 |
| HER2_DIV-35.23.1.1<sup>cisLALA</sup> | 1.8 |
| HER2_DII-35.23.1.1<sup>cisLALA</sup> | 2.1 |
| 抗HER2_DIV | 2.1 |
实施例9.与靶向TfR的修饰的Fc多肽融合的HER2靶向Fab
产生结合HER2结构域I、II和IV的人类IgG1抗HER2抗体，我们分别将其称为抗HER2-DI、抗HER2-DII和抗HER2-DIV。将源自于这些mAb(VH+CH1)的重链Fd区克隆至表达载体中，所述表达载体包含编码经过工程改造以结合于人类TfR的Fc多肽(CH3C.35.23.4)的序列。所述Fc多肽编码序列还含有“杵”(T366W)突变以阻止同源二聚化并且促进与包含“臼”(T366S/L368A/Y407V)突变的Fc多肽的异源二聚化。另外，修饰的Fc多肽序列含有突变L234A和L235A，其减弱FcγR结合。还将Fd区克隆至相应“臼”载体中，所述“臼”载体包含编码具有臼突变但缺少TfR结合突变以及L234A和L235A突变两者的Fc多肽的序列。
将上文所提及的相应杵和臼载体连同相应轻链载体以1:1:2的杵:臼:轻链比率共转染至ExpiCHO或Expi293细胞中。通过蛋白质A色谱法纯化所表达的蛋白质，随后进行制备型尺寸排阻色谱法(SEC)以分离纯化的蛋白质，我们将所述蛋白质称为ATV:-HER2-DI(HER2_DI-35.23.4cisLALA)、ATV:-HER2-DII(HER2_DII-35.23.4cisLALA)和ATV:-HER2-DIV(HER2_DIV-35.23.4cisLALA)。我们还制备ATV:对照，其含有与HER2_DI/DII/DIV-35.23.4cisLALA相同的修饰的Fc多肽，但具有与在后续研究中不在相关细胞上表达的无关抗原(Abeta)结合的Fab。
具体说来，HER2_DI-35.23.4cisLALA具有包含SEQ ID NO:275的第一重链、包含SEQID NO:290的第二重链和包含SEQ ID NO:293的两条轻链。HER2_DII-35.23.4cisLALA具有包含SEQ ID NO:46的第一重链、包含SEQ ID NO:55的第二重链和包含SEQ ID NO:58的两条轻链。HER2_DIV-35.23.4cisLALA具有包含SEQ ID NO:18的第一重链、包含SEQ ID NO:27的第二重链和包含SEQ ID NO:57的两条轻链。
此外，类似地产生含有未修饰的人类IgG1恒定区的抗HER2-DI、抗HER2-DII、抗HER2-DIV和抗TfR mAb。
实施例10.测量HER2结合分子和TfR结合分子的亲和力
使用Biacore T200或Biacore 8K，通过SPR来测量mAb和结合TfR的Fc多肽的亲和力。BiacoreTM Series S CM5传感器芯片固定有用于HER2亲和力测量的单克隆小鼠抗人类IgG(Fc)抗体或用于TfR亲和力测量的小鼠抗人类Fab(来自GE Healthcare的人类抗体或Fab捕捉试剂盒)。以30μL/min的流速注射分析物(重组HER2细胞外结构域或重组TfR顶端结构域)的连续3倍稀释液。使用3分钟缔合和10分钟解离来分析每一样品。在每次注射后，使用3M MgCl2使芯片再生。通过从以相似密度捕捉无关IgG的流动槽减去RU来校正结合反应。使用k缔合和k解离的同时拟合的1:1Languir模型进行动力学分析。
表10.SPR数据。
NB＝无结合
实施例11.TfR和HER2-DIV的共靶向
许多肿瘤细胞和肿瘤细胞系(如BT474和OE19)表达HER2和TfR两者。虽然已充分确立靶向HER2-DIV的抗体能够在一些HER2+细胞系中抑制肿瘤细胞生长并且降低肿瘤细胞存活率，但我们寻求了解共靶向HER2-DIV和TfR是否将导致增强的细胞杀死。
我们首先在对抗HER2疗法敏感的HER2+肿瘤细胞系BT474的生长抑制分析中比较HER2_DIV-35.23.4cisLALA与抗HER2-DIV和ATV:对照。将BT474细胞以10,000个细胞/孔接种于96孔板中过夜，用60μL以166nM(25,000ng/mL)开始的相关分子的1:3连续稀释液处理。在第3天补充培养基(RPMI)和药物。在第6天，在50μL生长培养基中使用5μL WST-1试剂(SigmaAldrich)测定细胞生长。所述板在WST-1试剂存在下孵育持续4小时，并且在440nm下测定吸光度。基于A440 nM计算生长抑制/增殖百分比并且针对未处理的对照标准化。抗HER2-DIV相对于对照降低BT474细胞存活率，其中IC50为1.1nM并且最大抑制为64％。相反地，不结合于任何细胞抗原的ATV:对照对细胞存活率不具有任何效应，而HER2_DIV-35.23.4cisLALA(ATV:HER2-DIV)显示与抗HER2-DIV相比类似的生长抑制(图9A)。
接下来，我们用对抗HER2疗法具有抗性的另一HER2+癌细胞系OE19比较HER2_DIV-35.23.4cisLALA与抗HER2-DIV和ATV:对照。不同于BT474(其中HER2_DIV-35.23.4cisLALA与抗HER2-DIV的效应之间无差异)，OE19细胞系在HER2_DIV-35.23.4cisLALA处理时具有75％的最大抑制，而其对抗HER2-DIV无反应(图9B)。这些结果表明，在抗HER2抗性细胞系中，与仅靶向HER2-DIV相比，共靶向HER2-DIV和TfR导致增强的细胞生长抑制。
实施例12.TfR和HER2-DII的共靶向
我们接下来确定使用与结合TfR的Fc多肽融合的抗HER2-DII Fab(ATV:HER2-DII；HER2_DII-35.23.4cisLALA)共靶向HER2-DII和TfR是否可以增强针对BT474和OE19肿瘤细胞的细胞生长抑制。使用先前所述的相同生长抑制分析，我们确定与抗HER2-DIV处理相比，抗HER2-DII处理对BT474和OE19细胞的存活率无影响(图10A和图10B)。同样，用单独的ATV:对照或抗TfR处理细胞或当与抗HER2-DII组合时不抑制BT474细胞生长。相比之下，用HER2_DII-35.23.4cisLALA处理BT474和OE19细胞使得细胞存活率降低，其中IC50分别为1.17nM和0.725nM，并且最大抑制分别为51.2％和77.5％(图10A和图10B)。由于单独的抗TfR或抗TfR与抗HER2-DII的组合均不对BT474细胞存活率具有任何影响(图10A)，因此我们得出如下结论：在这种情况下需要用相同分子(HER2_DII-35.23.4cisLALA)结合于TfR和HER2-DII两者来达成细胞杀死。这些结果支持由单一分子同时结合TfR和HER2-DII并且可能使之交联可以加强对HER2+癌细胞系的生长抑制。
实施例13.TfR和HER2-DI的共靶向
为进一步确定共靶向TfR和HER2蛋白是否将更广泛地适用于HER2的其他结构域，我们也在OE19细胞系的生长抑制分析中通过使用抗HER2-DI和HER2_DI-35.23.4cisLALA(ATV:HER2-DI)靶向HER2-DI。与HER2-DII类似，OE19细胞对抗HER2-DI无反应，但在HER2_DI-35.23.4cisLALA处理时具有84％的最大抑制(图11)。这一数据与我们的假设一致，即由单一分子同时结合TfR和HER2-DI并且可能使之交联可以加强对HER2+癌细胞系的生长抑制。综上所述，在同时TfR接合时，HER2子结构域靶中的肿瘤生长抑制可以得到加强，即使当所述结构域不正常反应时当单独靶向时还是如此。
实施例14.ATV:HER2-DIV与ATV:HER2-DII的组合
我们接下来使用先前所述的生长抑制分析来评估ATV:HER2-DIV(HER2_DIV-35.23.4cisLALA)与ATV:HER2-DII(HER2_DII-35.23.4cisLALA)的组合对抗HER2-DIV与抗HER2-DII的组合在BT474细胞中的效应。实际上，与抗HER2_DIV与抗HER2_DII的组合相比，在ATV:HER2-DIV与ATV:HER2-DII的组合处理后，我们观察到生长抑制效能增加大约2.5倍(图12)。
我们还测试组合ATV:HER2-DIV(HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA)和ATV:HER2-DII(HER2_DII-35.23.1.1cisLALA)是否可能克服神经调节蛋白1诱导的抗性模型中的肿瘤抗性。本文所用的经过工程改造以结合于人类TfR的Fc多肽是CH3C.35.23.1.1。具体说来，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA具有包含SEQ ID NO:2的第一重链、包含SEQ ID NO:27的第二重链和包含SEQ ID NO:57的两条轻链。HER2_DII-35.23.1.1cisLALA具有包含SEQ ID NO:30的第一重链、包含SEQ ID NO:55的第二重链和包含SEQ ID NO:58的两条轻链。
神经调节蛋白1(NRG-1)是HER3的配体，其富含于脑微环境中并且使HER3信号传导途径活化并且启动HER2-HER3二聚化。这进而使得PI3K/AKT途径活化并且使肿瘤细胞对抗HER2-DIV治疗具有抗性。在NRG1(50ng/mL)存在下，BT474乳腺癌细胞确实对抗HER2-DIV具有抗性，其显示细胞生长抑制仅为约15％(图4)。用HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA(ATV:HER2-DIV)交联HER2-DIV和TfR使得生长抑制增强高达约40％(图4)，但这相对于未经NRG-1处理的细胞(抑制高达约70％，图9A和图9B)来说仍是减弱的。尽管如此，这些结果证明，除如先前所证明的靶向HER2-DII的那些分子以外，使用靶向HER2-DIV的分子也可以通过交联HER2与TfR实现肿瘤细胞杀死的增强。
用靶向HER2-DIV和HER2-DII两者的分子的组合共处理经NRG1处理的BT474细胞产生>80％的细胞杀死。如所预期，相对于抗HER2-DIV+抗HER2-DII，HER2_DIV-35.23.1.1cisLALA+HER2_DII-35.23.1.1cisLALA的效应增强(图4)，再次可能是由于HER2与TfR的交联。
实施例15.抗HER2/TfR处理后的细胞表面TfR表达
经由通过流式细胞术测量表面TfR蛋白表达，我们测试ATV:HER2-DII(HER2_DII-35.23.4cisLALA)和/或ATV:HER2-DIV(HER2_DIV-35.23.4cisLALA)的处理是否可能导致TfR内化增加。如图13A-13C中所指示，BT474细胞与测试物品或对照一起在37℃下孵育持续30分钟，所述测试物品或对照包括：PBS、ATV:对照、抗HER2-DIV和/或抗HER2-DII、ATV:对照与抗HER2-DIV或抗HER2-DII的组合和ATV:HER2-DIV和/或ATV:HER2-DII。孵育后，细胞用冷的PBS洗涤2次，用与APC结合的抗TfR(CD71)抗体(Fisher Scientific)在冰上染色持续20min，并且使用BD Canto II通过流式细胞术评估中值荧光强度(MFI)。通过FlowJo软件分析结果。
用大于约100pM的ATV:HER2-DIV和/或ATV:HER2-DII处理的BT474细胞在37℃下孵育30min后具有显著降低的表面TfR表达(图13A-13C)，而抗HER2-DII或抗HER2-DIV处理对TfR表达无影响。还应注意，结合TfR但不结合HER2的ATV:对照对TfR表达无影响，这表明HER2-TfR交联有助于受体消耗。此机制可能有助于针对TfR-HER2交联分子所观察到的增强的细胞杀死(参见先前实施例)。
实施例16.结合于TfR的修饰的Fc多肽
这一实施例描述赋予TfR结合和跨BBB转运的对Fc多肽的修饰。
除非另外指示，否则这一部分中氨基酸残基的位置是基于人类IgG1野生型Fc区的EU索引编号进行编号。
包含在位置384、386、387、388、389、390、413、416和421处的修饰的Fc多肽(CH3C克
隆)的产生和表征
如下文所述产生含有Fc区的酵母库，所述Fc区具有在包括氨基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416和421的位置处引入的修饰。结合于TfR的说明性克隆示于表5和表6中。
在另外两轮分选之后，对单克隆进行定序并且鉴别出四个独特序列。这些序列在位置388处具有保守的Trp，并且在位置421处均具有芳香族残基(即，Trp、Tyr或His)。在其他位置处存在大量多样性。
从所述库选择的四个克隆在CHO或293细胞中表达为与Fab片段的Fc融合物，并且通过蛋白质A和尺寸排阻色谱法进行纯化，并且接着在全铁转铁蛋白(holo-Tf)存在或不存在下通过ELISA筛选与人类TfR的结合。所有克隆均结合于人类TfR，并且结合不受过量(5μM)全铁转铁蛋白的添加影响。还测试克隆与293F细胞的结合，所述细胞内源性地表达人类TfR。所述克隆结合于293F细胞，但总体结合大体上弱于高亲和力阳性对照。
接下来，使用克隆CH3C.3作为测试克隆来测试克隆是否可以在TfR表达细胞中内化。使粘附型HEK 293细胞在96孔板中生长至约80％汇合，去除培养基，并且以1μM浓度添加样品：克隆CH3C.3、抗TfR基准阳性对照抗体(Ab204)、抗BACE1基准阴性对照抗体(Ab107)和人类IgG同型对照(自Jackson Immunoresearch获得)。所述细胞在37℃和8％CO2浓度下孵育持续30分钟，接着洗涤，用0.1％TritonTM X-100进行渗透并且用抗人类-IgG-Alexa
488二级抗体染色。在额外洗涤后，所述细胞在高含量荧光显微镜(即，OperaPhenixTM系统)下成像，并且定量每个细胞的斑点数。在1μM下，克隆CH3C.3显示出与阳性抗TfR对照类似的内化倾向，而阴性对照不显示内化。
克隆的进一步工程改造
使用软随机化方法产生额外库以改进初始命中针对人类TfR的亲和力，其中基于原始四个命中中的每一者产生DNA寡核苷酸以引入软诱变。鉴别出结合TfR的其他克隆并且加以选择。所选克隆分成两个一般序列组。组1克隆(即，克隆CH3C.18、CH3C.21、CH3C.25和CH3C.34)具有在位置384处的半保守Leu、在位置386处的Leu或His、分别在位置387和389处的保守和半保守Val和分别在位置413、416和421处的半保守P-T-W基序。组2克隆具有在位置384处的保守Tyr、在位置386-390处的基序TXWSX和分别在位置413、416和421处的保守基序S/T-E-F。克隆CH3C.18和CH3C.35在其他研究中用作每一序列组的代表性成员。
表位定位
为了确定经过工程改造的Fc区是否结合于TfR的顶端结构域，在噬菌体的表面上表达TfR顶端结构域。为适当折叠并且展示顶端结构域，必须截短一个环并且序列需要环状排列。将克隆CH3C.18和CH3C.35涂布于ELISA板上并且遵循噬菌体ELISA方案。简单说来，在用1％PBSA洗涤并且阻断后，添加噬菌体展示物的稀释液并且在室温下孵育持续1小时。随后洗涤所述板并且添加抗M13-HRP，并且在额外洗涤之后，所述板用TMB底物显影并且用2NH2SO4淬灭。在这一分析中，克隆CH3C.18和CH3C.35两者均结合于顶端结构域。
互补位定位
为了理解Fc结构域中哪些残基对于TfR结合最重要，产生一系列突变克隆CH3C.18和克隆CH3C.35Fc区，其中每一突变体在TfR结合寄存器(TfR binding register)中具有单一位置突变回野生型。将所得变体重组表达为Fab-Fc融合物并且测试与人类或食蟹猴TfR的结合。对于克隆CH3C.35来说，位置388和421对于结合是重要的；将这些位置中的任一者回复突变为野生型完全地消除与人类TfR的结合。
成熟克隆的结合表征
如上文所述，用纯化的Fab-Fc融合变体与涂布于板上的人类或食蟹猴TfR进行结合ELISA。来自克隆CH3C.18成熟库的变体(克隆CH3C.3.2-1、克隆CH3C.3.2-5和克隆CH3C.3.2-19)以大约相等的EC50值结合人类和食蟹猴TfR，而亲代克隆CH3C.18和CH3C.35与人类TfR的结合比与食蟹猴TfR的结合大10倍以上。
接下来，测试修饰的Fc多肽是否在人类和猴细胞中内化。使用上文所述的方案，测试在人类HEK 293细胞和恒河猴LLC-MK2细胞中的内化。与克隆CH3C.35相比，类似地结合人类和食蟹猴TfR的变体(克隆CH3C.3.2-5和CH3C.3.2-19)在LLC-MK2细胞中具有显著改进的内化。
克隆的额外工程改造
对其他亲和力成熟克隆CH3C.18和CH3C.35的额外工程改造涉及向经由直接相互作用、第二壳相互作用或结构稳定化增强结合的位置添加额外突变。此举是经由“NNK步移(NNK walk)”或“NNK斑块(NNK patch)”库的产生和选择来实现。NNK步移库涉及对在互补位附近的残基进行逐一NNK突变。通过观察与FcγRI(PDB ID:4W4O)结合的Fc的结构，将原始修饰位置附近的44个残基鉴别为研究候选者。具体说来，靶向以下残基以进行NNK诱变：K248、R255、Q342、R344、E345、Q347、T359、K360、N361、Q362、S364、K370、E380、E382、S383、G385、Y391、K392、T393、D399、S400、D401、S403、K409、L410、T411、V412、K414、S415、Q418、Q419、G420、V422、F423、S424、S426、Q438、S440、S442、L443、S444、P4458、G446和K447。使用Kunkel诱变产生44个单点NNK库，并且如上文针对其他酵母库所描述汇集产物并经由电穿孔引入至酵母。
这些小型库(其各自具有一个突变位置，从而产生20个变体)的组合产生小库，使用酵母表面展示在其中选择任何导致较高亲和力结合的位置。如上文所述，使用TfR顶端结构域蛋白执行选择。在三轮分选后，对来自富集酵母库的克隆进行定序，并且鉴别出若干个“热点”位置，其中某些点突变显著地改进与顶端结构域蛋白的结合。对于克隆CH3C.35，这些突变包括E380(突变为Trp、Tyr、Leu或Gln)和S415(突变为Glu)。克隆CH3C.35单一突变体和组合突变体的序列陈述于SEQ ID NO:177和185-195中。对于克隆CH3C.18，这些突变包括E380(突变为Trp、Tyr或Leu)和K392(突变为Gln、Phe或His)。克隆CH3C.18单一突变体的序列陈述于SEQ ID NO:181-186中。
改进克隆CH3C.35亲和力的其他成熟库
如针对先前酵母库所描述，产生另一库以鉴别来自NNK步移库的突变组合，同时在这些突变的外围上增加若干其他位置。在这个库中，YxTEWSS(SEQ ID NO:196)和TxxExxxxF(SEQ ID NO:197)基序保持恒定，并且六个位置被完全随机化：E380、K392、K414、S415、S424和S426。包括位置E380和S415，因为其为NNK步移库中的“热点”。包括位置K392、S424和S426，因为其构成可定位结合区的核心的一部分，而选择K414是由于其与位置415毗邻。
如先前所描述，仅用食蟹猴TfR顶端结构域对这个库进行分选。在五轮之后对所富集的池进行定序，并且所鉴别的独特克隆的修饰区的序列陈述于SEQ ID NO:198-215中。
设计接下来的库以进一步探索主要结合互补位中的可接受的多样性。用NNK密码子使原始位置(384、386、387、388、389、390、413、416和421)中的每一者加上两个热点(380和415)个别地随机化以在酵母上产生一系列单一位置饱和诱变库。另外，使每一位置个别地回复突变为野生型残基，并且这些个别克隆展示于酵母上。注意到位置380、389、390和415是仅有的在回复突变为野生型残基后保留与TfR的实质性结合的位置(针对413回复突变为野生型观察到一些残余但显著减弱的结合)。
单一位置NNK库针对人类TfR顶端结构域进行三轮分选以收集前面约5％的缀合物，并且接着从每一库定序至少16种克隆。结果指示在克隆CH3C.35的情况下，每一位置可以耐受哪些氨基酸而不会显著降低与人类TfR的结合。汇总如下：
位置380：Trp、Leu或Glu；
位置384：Tyr或Phe；
位置386：仅Thr；
位置387：仅Glu；
位置388：仅Trp；
位置389：Ser、Ala或Val(尽管野生型Asn残基似乎保留一些结合，但在库分选之后未出现)；
位置390：Ser或Asn；
位置413：Thr或Ser；
位置415：Glu或Ser；
位置416：仅Glu；和
位置421：仅Phe。
以上残基当作为单一变化或以组合形式被取代至克隆CH3C.35中时，代表保留与TfR顶端结构域的结合的互补位多样性。在这些位置处具有突变的克隆包括表6中所示的那些，并且这些克隆的CH3结构域的序列陈述于SEQ ID NO:177-180、192-195、214和216-249中。
实施例17.方法
噬菌体展示库的产生
合成编码野生型人类Fc序列的DNA模板，并且将其并入至噬粒载体中。所述噬粒载体含有ompA或pelB前导序列、与c-Myc和6×His表位标签融合的Fc插入序列以及琥珀终止密码子，随后为M13外壳蛋白pIII。
产生在期望的修饰位置处含有“NNK”三密码子的引物，其中N是任一DNA碱基(即，A、C、G或T)并且K是G或T。或者，使用用于“软”随机化的引物，其中对于每一随机化位置使用对应于70％野生型碱基和10％其他三个碱基中的每一者的碱基混合物。通过对对应于随机化区的Fc区片段执行PCR扩增来产生库，并且接着使用含有SfiI限制位点的末端引物进行组装，接着用SfiI消化并且连接至噬粒载体中。或者，使用引物来进行Kunkel诱变。将连接的产物或Kunkel产物转化至菌株TG1(从
获得)的电感受态大肠杆菌细胞中。所述大肠杆菌细胞在回收后用M13K07辅助噬菌体感染并且生长过夜，随后用5％PEG/NaCl使库噬菌体沉淀，再悬浮于PBS中的15％甘油中并且冷冻直至使用。典型库大小是在约109至约1011个转化子范围内。Fc二聚体经由pIII融合的Fc与未附着于pIII的可溶性Fc(后者是由于pIII之前的琥珀终止密码子而产生)之间的配对展示于噬菌体上。
酵母展示库的产生
合成编码野生型人类Fc序列的DNA模板，并且将其并入至酵母展示载体中。对于CH2和CH3库，所述Fc多肽展示于Aga2p细胞壁蛋白上。两种载体均含有具有Kex2裂解序列的前原前导肽，和与Fc末端融合的c-Myc表位标签。
使用与针对噬菌体库所述的那些方法类似的方法组装酵母展示库，除了用含有载体的同源末端的引物执行片段的扩增。用线性化载体和组装的库插入序列对新鲜制备的电感受态酵母(即，菌株EBY100)进行电穿孔。电穿孔方法将为本领域技术人员所知。在选择性SD-CAA培养基中回收之后，使酵母生长至汇合并且将其分开两次，接着通过转移至SG-CAA培养基中来诱导蛋白质表达。典型库大小是在约107至约109个转化子范围内。通过对毗邻展示的Fc单体进行配对形成Fc二聚体。
用于噬菌体选择的一般方法
噬菌体方法是从Phage Display:A Laboratory Manual(Barbas,2001)修改的。其他方案细节可获自这一参考文献。
板式分选方法
在4℃下将人类TfR靶涂布于
微量滴定板(通常200μL，在PBS中1-10μg/mL)上过夜。除非另外指定，否则所有结合均是在室温下进行。将噬菌体库添加至每一孔中并且孵育过夜以供结合。用含有0.05％
20的PBS(PBST)充分洗涤微量滴定孔，并且通过使所述孔与酸(通常含有500mM KCl的50mM HCl，或100mM甘氨酸，pH 2.7)一起孵育持续30分钟来洗脱所结合的噬菌体。用1M Tris(pH 8)中和洗脱的噬菌体，并且使用TG1细胞和M13/KO7辅助噬菌体进行扩增并且在37℃下在含有50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的2YT培养基中生长过夜。将从含有靶的孔洗脱的噬菌体的效价与从不含靶的孔回收的噬菌体的效价进行比较以评价富集。通过随后减少结合期间的孵育时间并且增加洗涤时间和洗涤次数来增加选择严格性。
珠粒分选方法
使用NHS-PEG4-生物素(从PierceTM获得)通过游离胺使抗原生物素化。对于生物素化反应，在PBS中使用3倍至5倍摩尔过量的生物素试剂。用Tris使反应淬灭，随后在PBS中进行充分透析。使生物素化抗原固定于链霉抗生物素蛋白涂布的磁珠(即，从Thermo Fisher获得的M280-链霉抗生物素蛋白珠粒)上。所述噬菌体展示库与所述抗原涂布的珠粒一起在室温下孵育持续1小时。接着去除未结合的噬菌体，并且用PBST洗涤珠粒。通过与含有500mMKCl的50mM HCl(或0.1M甘氨酸，pH 2.7)一起孵育持续30分钟来洗脱结合的噬菌体，并且接着如上文针对板式分选所描述进行中和和繁殖。
在三至五轮淘选之后，通过在噬菌体上表达Fc或在大肠杆菌周质中可溶地表达Fc来筛选单克隆。此类表达方法将为本领域技术人员所知。使个别噬菌体上清液或周质提取物暴露于涂布有抗原或阴性对照的阻断的ELISA板，并且随后使用结合HRP的山羊抗Fc(从Jackson Immunoresearch获得)检测周质提取物或使用抗M13(GE Healthcare)检测噬菌体，并且接着用TMB试剂(从Thermo Fisher获得)显影。OD450值大于背景约5倍的孔被视为阳性克隆并且进行定序，随后使一些克隆以可溶性Fc片段或与Fab片段融合的形式表达。
用于酵母选择的一般方法
珠粒分选(磁辅助细胞分选(MACS))方法
类似于如Ackerman等人，2009Biotechnol.Prog.25(3),774中所述，执行MACS和FACS选择。用生物素化抗原标记链霉抗生物素蛋白磁珠(例如，M-280链霉抗生物素蛋白珠粒，来自Thermo Fisher)，并且与酵母(通常5-10×库多样性)一起孵育。去除未结合的酵母，洗涤珠粒，并且使结合的酵母在选择性培养基中生长并诱导以供后续轮次的选择。
荧光活化细胞分选(FACS)方法
用抗c-Myc抗体标记酵母以监测表达和生物素化抗原(浓度视分选轮次而变化)。在一些实验中，抗原与链霉抗生物素蛋白-Alexa
647预混合以便增强相互作用的亲合力。在其他实验中，在用链霉抗生物素蛋白-Alexa
647结合和洗涤之后检测到生物素化抗原。使用FACS Aria III细胞分选仪对具有结合的单线态酵母进行分选。使分选的酵母在选择性培养基中生长，接着诱导以用于后续选择轮次。
在实现富集的酵母群体后，将酵母接种于SD-CAA琼脂板上并且使单群落生长并诱导表达，接着如上文所述进行标记以测定其结合于靶的倾向。随后对结合抗原的阳性单克隆进行定序，随后使一些克隆以可溶性Fc片段或与Fab片段融合的形式表达。
用于筛选的一般方法
通过ELISA进行筛选
从淘选输出选择克隆并且使其在96孔深孔板的个别孔中生长。使用自身诱导培养基(从EMD Millipore获得)诱导所述克隆的周质表达或用辅助噬菌体感染所述克隆以供在噬菌体上噬菌体展示个别Fc变体。使培养物生长过夜并且短暂离心以使大肠杆菌集结成粒。对于噬菌体ELISA，直接使用含有噬菌体的上清液。对于周质表达，使集结粒再悬浮于20％蔗糖中，随后用水以4:1稀释，并且在4℃下振荡持续1小时。板短暂离心以使固体集结成粒，并且在ELISA中使用上清液。
通常用0.5mg/mL抗原涂布ELISA板过夜，接着用1％BSA阻断，随后添加噬菌体或周质提取物。在1小时孵育并且洗去未结合的蛋白质后，添加结合HRP的二级抗体(即，对于可溶性Fc或噬菌体展示的Fc分别为抗Fc或抗M13)并且孵育持续30分钟。再次洗涤所述板，并且接着用TMB试剂显影并用2N硫酸淬灭。使用读板仪
定量在450nm下的吸光度，并且在适用情况下使用Prism软件绘制结合曲线。将测试的克隆的吸光度信号与阴性对照(缺乏Fc的噬菌体或周质提取物)进行比较。在一些分析中，在结合步骤期间通常以显著摩尔过量(大于10倍过量)添加可溶性转铁蛋白或其他竞争剂。
通过流式细胞术进行筛选
将Fc变体多肽(在噬菌体上、在周质提取物中表达或作为与Fab片段的融合物可溶性地表达)添加至96孔V型底板中的细胞(约100,000个细胞/孔，于PBS+1％BSA(PBSA)中)，并且在4℃下孵育持续1小时。所述板随后短暂离心并且去除培养基，并且接着用PBSA洗涤细胞一次。使细胞再悬浮于含有二级抗体(通常山羊抗人类-IgG-Alexa
647(从Thermo Fisher获得))的PBSA中。30分钟后，所述板短暂离心并且去除培养基，用PBSA洗涤细胞1-2次，并且接着在流式细胞仪(即，FACSCantoTM II流式细胞仪)上对所述板读数。使用FlowJo软件计算针对每一条件的中值荧光值，并且用Prism软件绘制结合曲线。
实施例18.CH3C.18变体的建构
这一实施例描述CH3C.18变体的库的建构。
分离单克隆，并且在补充有0.2％葡萄糖的SG-CAA培养基中生长过夜以诱导CH3C.18变体的表面表达。对于每一克隆，两百万个细胞在PBS+0.5％BSA(pH 7.4)中洗涤三次。细胞在4℃和振荡下用生物素化靶250nM人类TfR、250nM食蟹猴TfR或250nM不相关的生物素化蛋白染色持续1小时，接着用相同缓冲液洗涤两次。细胞在4℃下用中性抗生物素蛋白-Alexafluor647(AF647)染色持续30分钟，接着再洗涤两次。使用抗c-myc抗体和抗鸡-Alexfluor488(AF488)二级抗体测量表达。使细胞再悬浮，并且在BD FACS CantoII上测量AF647和AF488的中值荧光强度(MFI)。计算每一群体的TfR结合群体的MFI，并且与人类TfR、食蟹猴TfR或对照结合一起作图。
表9显示CH3C.18变体的库。每一行代表在每一位置处含有指示的氨基酸取代的变体，并且其余位置处的氨基酸与CH3C.18中的那些氨基酸相同。表9中所示的位置是根据EU编号方案来编号。
表9.CH3C.18变体
应理解，本文所述的实施例和实施方案仅是出于说明性目的，并且基于其的各种修改或变化应为本领域技术人员所了解并且打算包括于本申请的精神和范围以及随附权利要求书的范畴内。本文所引用的序列登录号的序列由此以引用的方式并入。
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有本公开所属领域的一般技术者通常所理解的相同含义。
可以在不存在本文中未明确公开的任何要素、限制下适宜地实践以说明性方式描述于本文中的公开内容。因此，举例来说，术语“包含”、“包括”、“含有”等应以扩展方式并且无限制地加以理解。另外，本文中所用的术语和表述是作为描述性而非限制性术语来使用，并且并非意图通过使用此类术语和表述来排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等效形式，但应意识到在所要求的本公开的范畴内可能存在各种修改形式。
在不一致的情形下，表格(例如表6)中所述的每一克隆的氨基酸取代相较于在序列表中所陈述的序列中可见的氨基酸决定所述克隆在登记位置处的氨基酸取代。
本文中所提及的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献均是以全文引用的方式明确并入，其并入程度就如同每一者均个别地以引用方式并入一般。倘若出现冲突，将以本说明书(包括定义)为准。
表5.CH3C登记位置和突变
表6.其他CH3C登记位置和突变
非正式序列表
Claims (164)
1.一种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：
(a)能够结合人类表皮生长因子受体2(HER2)的抗体可变区或其抗原结合片段；和
(b)修饰的Fc多肽二聚体，其包含含有产生TfR结合位点的修饰的第一Fc多肽。
2.如权利要求1所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区形成Fab结构域的一部分。
3.如权利要求1或2所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区结合于人类HER2的子结构域IV、II或I。
4.如权利要求3所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区结合于人类HER2的子结构域IV。
5.如权利要求4所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的互补决定区(CDR)：
(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:72的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和
(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
6.如权利要求5所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列；
(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列；
(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列；和
(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
7.如权利要求4至6中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
8.如权利要求3所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区结合于人类HER2的子结构域II。
9.如权利要求8所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:78的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:78的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:79的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和
(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:80的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
10.如权利要求9所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列；
(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列；
(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列；和
(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。
11.如权利要求8至10中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
12.如权利要求3所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区结合于人类HER2的子结构域I。
13.如权利要求12所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(d)轻链CDR1，其与SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:253的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(e)轻链CDR2，其相对于SEQ ID NO:254的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和
(f)轻链CDR3，其相对于SEQ ID NO:255的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
14.如权利要求13所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列；
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列；
(d)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列；
(e)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列；和
(f)轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列。
15.如权利要求12至14中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
16.如权利要求1至15中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述TfR结合位点是在所述CH3结构域内。
17.如权利要求16所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述修饰的CH3结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3结构域。
18.如权利要求16或17所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述修饰的CH3结构域在包含380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421的一组氨基酸位置中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一个取代。
19.如权利要求16至18中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述修饰的CH3结构域包含在位置380处的Glu、Leu、Ser、Val、Trp、Tyr或Gln；在位置384处的Leu、Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val；在位置386处的Leu、Thr、His、Pro、Asn、Val或Phe；在位置387处的Val、Pro、Ile或酸性氨基酸；在位置388处的Trp；在位置389处的脂肪族氨基酸、Gly、Ser、Thr或Asn；在位置390处的Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala、Asp、Glu、Asn、Arg或Thr；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr、Pro、Ile或His；在位置415处的Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在位置416处的Thr、Arg、Asn或酸性氨基酸；和/或在位置421处的芳香族氨基酸、His或Lys。
20.如权利要求1至19中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白结合于TfR的顶端结构域。
21.如权利要求1至20中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽包括在结合于TfR时降低FcγR结合的氨基酸修饰。
22.如权利要求21所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述氨基酸修饰包含在位置234处和在位置235处的Ala。
23.如权利要求1至22中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽和/或存在于所述Fc多肽二聚体中的第二Fc多肽包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。
24.如权利要求23所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，增加血清半衰期的所述氨基酸修饰包含(i)在位置428处的Leu和在位置434处的Ser，或(ii)在位置434处的Ser或Ala。
25.如权利要求1至24中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含杵突变T366W，并且存在于所述Fc多肽二聚体中的第二Fc多肽包含臼突变T366S、L368A和Y407V。
26.如权利要求25所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
27.如权利要求25或26所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:67和68中任一者的氨基酸序列。
28.一种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：
(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；
(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W，和
(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点。
29.如权利要求28所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
30.如权利要求28所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
31.如权利要求28所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
32.如权利要求28或29所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列的第一重链。
33.如权利要求28或29所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
34.如权利要求33所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列的第一重链。
35.如权利要求28、29或32至34中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。
36.如权利要求28、29或32至35中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
37.如权利要求28或30所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列的第一重链。
38.如权利要求28或30所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
39.如权利要求38所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列的第一重链。
40.如权利要求28、30或37至39中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。
41.如权利要求28、30或37至40中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
42.如权利要求28或31所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列的第一重链。
43.如权利要求28或31所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
44.如权利要求43所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列的第一重链。
45.如权利要求28、31和42至44中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。
46.如权利要求28、31和42至45中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
47.一种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：
(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；
(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和
(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V，并且不含TfR结合位点。
48.如权利要求47所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
49.如权利要求47所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
50.如权利要求47所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
51.如权利要求47或48所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列的第一重链。
52.如权利要求47或48所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
53.如权利要求52所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列的第一重链。
54.如权利要求47、48和51至53中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的第二重链。
55.如权利要求47、48和51至54中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
56.如权利要求47或49所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列的第一重链。
57.如权利要求47或49所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
58.如权利要求57所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列的第一重链。
59.如权利要求47、49或56至58中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的第二重链。
60.如权利要求47、49或56至59中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
61.如权利要求47或50所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列的第一重链。
62.如权利要求47或50所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
63.如权利要求62所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列的第一重链。
64.如权利要求47、50或61至63中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:290的氨基酸序列的第二重链。
65.如权利要求47、50或61至64中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
66.一种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：
(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；
(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W，和
(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
67.如权利要求66所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
68.如权利要求66所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
69.如权利要求66所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
70.如权利要求66或67所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列的第一重链。
71.如权利要求66或67所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
72.如权利要求71所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列的第一重链。
73.如权利要求66、67或70至72中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。
74.如权利要求66、67或70至73中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
75.如权利要求66或68所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列的第一重链。
76.如权利要求66或68所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
77.如权利要求76所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列的第一重链。
78.如权利要求66、68或75至77中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。
79.如权利要求66、68或75至78中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
80.如权利要求66或69所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列的第一重链。
81.如权利要求66或69所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
82.如权利要求80所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列的第一重链。
83.如权利要求66、69或80至82中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。
84.如权利要求66、69或80至83中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
85.一种Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其包含：
(a)能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段；
(b)第一Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，和
(c)第二Fc多肽，根据EU编号，其包含臼突变T366S、L368A和Y407V以及具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S，并且不含TfR结合位点。
86.如权利要求85所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区。
87.如权利要求85所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
88.如权利要求85所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述抗体可变区包含两个含有SEQ ID NO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
89.如权利要求85或86所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列的第一重链。
90.如权利要求85或86所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
91.如权利要求90所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列的第一重链。
92.如权利要求85、86或89至91中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二重链。
93.如权利要求85、86或89至92中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链。
94.如权利要求85或87所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列的第一重链。
95.如权利要求85或87所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
96.如权利要求95所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列的第一重链。
97.如权利要求85、87或94至96中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的第二重链。
98.如权利要求85、87或94至97中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链。
99.如权利要求85或88所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列的第一重链。
100.如权利要求85或88所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中根据EU编号，所述第一Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
101.如权利要求100所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列的第一重链。
102.如权利要求85、88和99至101中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含含有SEQ ID NO:291的氨基酸序列的第二重链。
103.如权利要求85、88和99至101中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白包含两条含有SEQ ID NO:293的氨基酸序列的轻链。
104.如权利要求1至103中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述修饰的Fc多肽二聚体不会大体上消耗网状细胞。
105.如权利要求104所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中在施用所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白后所消耗网状细胞的量少于在施用对照后所消耗网状细胞的量。
106.如权利要求105所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，其中所述对照是具有完全效应子功能和/或不含降低FcγR结合的突变的相应TfR结合多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白。
107.一种抗体重链，其包含：
(a)抗人类HER2抗体重链可变区或其片段；和
(b)修饰的Fc多肽，其含有产生TfR结合位点的修饰。
108.如权利要求107所述的抗体重链，其中所述修饰的Fc多肽包括在结合于TfR时降低FcγR结合的一个或多个氨基酸修饰。
109.如权利要求107或108所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:69的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:70的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和
(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:71的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
110.如权利要求107或108所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列；和
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
111.如权利要求107至110中任一项所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
112.如权利要求107或108所述的抗体重链，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:75的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:76的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和
(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:77的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQID NO:77的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
113.如权利要求107或108所述的抗体重链，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列；和
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列。
114.如权利要求107、108、112或113所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
115.如权利要求107或108所述的抗体重链，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其与SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:250的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；
(b)重链CDR2，其与SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:251的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代；和
(c)重链CDR3，其与SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有至少90％序列同一性或相对于SEQ ID NO:252的氨基酸序列具有最多两个氨基酸取代。
116.如权利要求107或108所述的抗体重链，其中所述抗体可变区包含一个或多个选自由以下组成的组的CDR：
(a)重链CDR1，其包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列；
(b)重链CDR2，其包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列；和
(c)重链CDR3，其包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列。
117.如权利要求107、108、115或116所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。
118.如权利要求107至117中任一项所述的抗体重链，其中所述TfR结合位点包含修饰的CH3结构域。
119.如权利要求118所述的抗体重链，其中所述修饰的CH3结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3结构域。
120.如权利要求118或119所述的抗体重链，其中根据EU编号，所述修饰的CH3结构域在包含380、384、386、387、388、389、390、413、415、416和421的一组氨基酸位置中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一个取代。
121.如权利要求118至120中任一项所述的抗体重链，其中根据EU编号，所述修饰的CH3结构域包含在位置380处的Glu、Leu、Ser、Val、Trp、Tyr或Gln；在位置384处的Leu、Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val；在位置386处的Leu、Thr、His、Pro、Asn、Val或Phe；在位置387处的Val、Pro、Ile或酸性氨基酸；在位置388处的Trp；在位置389处的脂肪族氨基酸、Gly、Ser、Thr或Asn；在位置390处的Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala、Asp、Glu、Asn、Arg或Thr；在位置413处的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr、Pro、Ile或His；在位置415处的Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在位置416处的Thr、Arg、Asn或酸性氨基酸；和/或在位置421处的芳香族氨基酸、His或Lys。
122.如权利要求108至121中任一项所述的抗体重链，其中根据EU编号，在结合于TfR时降低FcγR结合的所述氨基酸修饰包含在位置234处和在位置235处的Ala。
123.如权利要求107至122中任一项所述的抗体重链，其中所述修饰的Fc多肽还包含增加血清半衰期的氨基酸修饰。
124.如权利要求123所述的抗体重链，其中根据EU编号，增加血清半衰期的所述氨基酸修饰包含(i)在位置428处的Leu和在位置434处的Ser，或(ii)在位置434处的Ser或Ala。
125.如权利要求107至124中任一项所述的抗体重链，其中根据EU编号，所述修饰的Fc多肽还包含杵突变T366W。
126.如权利要求125所述的抗体重链，其中所述修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
127.一种抗体重链，其包含：
(a)抗人类HER2抗体重链可变区或其片段；和
(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰和杵突变T366W。
128.如权利要求127所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
129.如权利要求127所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
130.如权利要求127所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。
131.如权利要求128所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:1、9、17和81中任一者的氨基酸序列。
132.如权利要求129所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:29、37、45和89中任一者的氨基酸序列。
133.如权利要求130所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:258、266、274和282中任一者的氨基酸序列。
134.如权利要求127至133中任一项所述的抗体重链，其中根据EU编号，所述修饰的Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
135.如权利要求134所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:2、10、18和82中任一者的氨基酸序列。
136.如权利要求134所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:30、38、46和90中任一者的氨基酸序列。
137.如权利要求134所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:259、267、275和283中任一者的氨基酸序列。
138.一种抗体重链，其包含：
(a)抗人类HER2抗体重链可变区或其片段；和
(b)修饰的Fc多肽，根据EU编号，其含有产生TfR结合位点的修饰、杵突变T366W和具有或不具有M428L的氨基酸修饰N434S。
139.如权利要求138所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列。
140.如权利要求138所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
141.如权利要求138所述的抗体重链，其中所述抗体重链可变区包含SEQ ID NO:256的氨基酸序列。
142.如权利要求139所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:3、11、19和83中任一者的氨基酸序列。
143.如权利要求140所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:31、39、47和91中任一者的氨基酸序列。
144.如权利要求140所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:260、268、276和284中任一者的氨基酸序列。
145.如权利要求138至144中任一项所述的抗体重链，其中根据EU编号，所述修饰的Fc多肽还包含氨基酸修饰L234A和L235A。
146.如权利要求145所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:4、12、20和84中任一者的氨基酸序列。
147.如权利要求145所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:32、40、48和92中任一者的氨基酸序列。
148.如权利要求145所述的抗体重链，其中所述抗体重链包含SEQ ID NO:261、269、277和285中任一者的氨基酸序列。
149.一种药物组合物，其包含如权利要求1至106中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和药学上可接受的载体。
150.一种跨内皮胞转能够结合人类HER2的抗体可变区或其抗原结合片段的方法，所述方法包括使所述内皮与包含如权利要求1至106中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合物接触。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述内皮是BBB。
152.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如权利要求1至106中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合物。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述癌症是HER2阳性癌症。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述HER2阳性癌症是HER2阳性乳腺癌。
155.如权利要求153所述的方法，其中所述HER2阳性癌症是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌。
156.如权利要求153至155中任一项所述的方法，其中所述HER2阳性癌症是转移癌。
157.一种用于治疗受试者的HER2阳性癌症的脑转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含如权利要求1至106中任一项所述的Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的组合物。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述HER2阳性癌症是HER2阳性乳腺癌。
159.如权利要求157所述的方法，其中所述HER2阳性癌症是HER2阳性胃腺癌和/或HER2阳性胃食管结合部腺癌。
160.如权利要求152至159中任一项所述的方法，其中包含所述Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的所述组合物拮抗HER2活性。
161.如权利要求152至160中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，
其中所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ IDNO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区，并且
其中所述第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ IDNO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区。
162.如权利要求152至160中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，
其中所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ IDNO:59的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区，并且
其中所述第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ IDNO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
163.如权利要求152至160中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白和第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白，
其中所述第一Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ IDNO:61的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区，并且
其中所述第二Fc多肽二聚体-抗体可变区融合蛋白的抗体可变区包含两个含有SEQ IDNO:256的氨基酸序列的抗体重链可变区和两个含有SEQ ID NO:257的氨基酸序列的轻链可变区。
164.如权利要求152至163中任一项所述的方法，其中所述受试者先前未用抗HER2疗法和/或针对转移性疾病的化学疗法治疗。
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