CN113278058A - 一种牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种牛乳β‑乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物及其制备方法和应用。该方法包括预测β‑乳球蛋白T细胞表位；采用不同种类的蛋白酶对β‑乳球蛋白进行酶解，并用质谱测定水解物肽段的氨基酸序列，将这些肽段的氨基酸序列与预测的β‑乳球蛋白T细胞表位序列进行比对，初步筛选出可能具有免疫耐受作用的水解物；以所筛选的可能具有免疫耐受作用的水解物为研究对象，用动物实验进一步筛选和确实具有免疫耐受作用的水解物。本发明成功地建立了胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶β‑乳球蛋白水解物诱导Balb/c小鼠口服耐受的模型，这三种水解物可以有效预防OVA诱导的小鼠过敏反应。根据本发明的β‑乳球蛋白水解物，可以开发出肽类药物或者功能性食品。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，尤其涉及一种牛乳β-乳球蛋白T细 胞免疫耐受水解物及其制备方法和应用。
背景技术
随着食品工业的不断发展，食物的安全性日渐收到人们的重视。近年来， 食物过敏现象逐年增多，大量研究表面，在食物过敏中，牛乳蛋白过敏是最 普遍的。牛乳不仅是婴幼儿膳食蛋白质的最佳来源，也是成人获取蛋白质所 必须,具有出色的功能特性，并为身体提供丰富的营养。但是，牛乳过敏严重 影响了过敏体质者的食用安全。牛奶总蛋白质中近20％是乳清蛋白，α-乳白 蛋白和β-乳球蛋白是两种主要的乳清蛋白，分别占20％和50％。其中β-乳 球蛋白(β-LG)是牛乳中乳清蛋白的主要过敏原之一。
在食品领域，β-LG被认为是一种有价值的蛋白质，因为它具有如乳化、 发泡和凝胶特性等功能特性，以及高含量的必须氨基酸。因此，开发降低β -LG过敏原性的新方法具有重要意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种牛乳β-乳球蛋白 T细胞免疫耐受水解物及其制备方法和应用，使制备的水解物具有免疫 耐受性，能更好的用于食品或药物中。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明实施例提供快速获得牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫 耐受水解物的方法，其特征在于，其包括：
S1、获得β-乳球蛋白的基因及氨基酸序列，利用在线网站工具IEDB 和NetMHC(Ⅱ)/pan4.0预测β-乳球蛋白T细胞表位，结合二者的预测结果， 得出牛乳β-乳球蛋白可能的T细胞表位区可能在五段氨基酸序列，分别 为AA13-29,AA32-46,AA55-69,AA83-108,AA110-128,AA154-175；
S2、采用不同种类的蛋白酶对β-乳球蛋白进行酶解，并用质谱测定 水解物肽段的氨基酸序列，将这些肽段的氨基酸序列与S1中预测的β- 乳球蛋白T细胞表位序列进行比对，初步筛选出可能具有免疫耐受作用 的水解物；
S3、以所筛选的可能具有免疫耐受作用的水解物为研究对象，用动 物实验进一步筛选和确实具有免疫耐受作用的水解物。
优选地，所述方法，S2中的酶解过程包括如下步骤：
将β-乳球蛋白配制成3-5％(w/v)的水溶液；按照2500-3500U/g蛋白的比 例在β-乳球蛋白的水溶液中加入蛋白酶，调节反应体系的pH值为7-8；在 温度为50-60℃的条件下水解反应3-5h；灭酶，冷却。
优选地，采用稀盐酸或氢氧化钠溶液调节反应体系的pH值。
优选地，水解反应在恒温水浴振荡器中进行。
优选地，在80-90℃灭酶5-20min。
优选地，S2中所述蛋白酶为复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 和胰蛋白酶中的至少一种。
优选地，所述蛋白酶为复合蛋白酶时，水解反应的酶切位点为丝氨 酸；
所述蛋白酶为中性蛋白酶时，水解反应的酶切位点为色氨酸、苯丙 氨酸、缬氨酸和亮氨酸；
所述蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解反应的酶切位点为亮氨酸、甘氨 酸、赖氨酸和精氨酸；
所述蛋白酶为胰蛋白酶时，水解反应的酶切位点为精氨酸、脯氨酸 和亮氨酸。
优选地，S2中使用不同蛋白酶的水解条件为：
复合蛋白酶水解条件为：底物浓度为3％(w/v)，水解pH值为7.0， 水解温度为60℃；
中性蛋白酶水解条件为：底物浓度为3％(w/v)，水解pH值为7.0， 水解温度为50℃；
木瓜蛋白酶水解条件为：底物浓度为3％(w/v)，水解pH值为7.0， 水解温度为60℃；
胰蛋白酶水解条件为：底物浓度为3％(w/v)，水解pH值为8.0， 水解温度为50℃；
碱性蛋白酶水解条件为：底物浓度为3％(w/v)，水解pH值为7.0， 水解温度为60℃；
蛋白酶M水解条件为：底物浓度为3％(w/v)，水解pH值为7.0， 水解温度为50℃；
优选地，在选用蛋白酶时，使用了已有的各种可水解蛋白质的蛋白 酶，每种蛋白酶水解β-乳球蛋白的水解产物分别测序，并经过S2比对 后，发现胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解产生的 肽段与预测的β-乳球蛋白T细胞表位重复部分较多，显示出较好的相关 性，初步筛选“胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解 产生的肽段”为可能具有免疫耐受作用的水解物。
优选地，S3中，用动物实验进一步筛选和确实具有免疫耐受作用的 水解物为胰蛋白酶水解物、复合蛋白酶水解物和木瓜蛋白酶的β-乳球蛋 白水解物。
另一方面，本发明提供一种牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物， 所述牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物是根据本发明记载的方法制 备而得。
另一方面，本发明提供预防OVA诱导的小鼠过敏反应的蛋白质水 解组合物，所述水解组合物是由胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶水 解β-乳球蛋白得到。
优选地，所述水解物所包含若干肽段，其中至少一条肽段与如SEQ ID NO:1-18中任一个或多个所示的氨基酸序列全部或部分重合。
LKALPMMHIR(SEQ ID NO:1)，ALPMHIR(SEQ ID NO:2)，
KTKIPAVFK(SEQ ID NO:3)，TKIPACFK(SEQ ID NO:4)，
IPAVFKIDALNENK(SEQ ID NO:5)，
VAGTWYSLAMAASDISSLLDAQSAPLR(SEQ ID NO:6)，
DTDYKK(SEQ ID NO:7)，
VYVEELKPTPE(SEQ ID NO:8)KFDKALKALPMHIRLS(SEQ ID NO:9)，IRIS(SEQ ID NO:10)，KVAGTWYS(SEQ ID NO:11)，
LIVTQTMKGLDIQ(SEQ ID NO:12)，PMMHIRLS(SEQ ID NO:13)，
LDAQSAPLR(SEQ ID NO:14)，DTDYKKYL(SEQ ID NO:15)，
LDAQSAPLR(SEQ ID NO:16)，LDTDYKKYL(SEQ ID NO:17)，
VLDTDYKKYL(SEQ ID NO:18)。
另一方面，本发明提供牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物作为 口服耐受物在制备食品或药物中的应用。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明通过生物信息学、质谱学与动物实验相结合的方法，从T细 胞表位预测，到水解物肽段序列分析，再到动物口服水解物实验，层层 深入的揭示了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶β-乳球蛋白水解物的 口服耐受机制。
通过质谱鉴定发现结果胰蛋白酶Trypsin、复合蛋白酶Protamex、木 瓜蛋白酶Papasin、中性蛋白酶Neutrase水解后，β-乳球蛋白水解物的部 分肽段与预测的T细胞表位全部或部分重合。
本发明成功地建立了胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶β-乳球蛋 白水解物诱导Balb/c小鼠口服耐受的模型，这三种水解物可以有效预防 OVA诱导的小鼠过敏反应。根据本发明的β-乳球蛋白水解物，可以开 发出肽类药物或者功能性食品。
附图说明
图1为本发明实施例的亮氨酸标准曲线图。
图2为本发明实施例和对比例的酶解β-乳球蛋白水解度图。
图3为胰蛋白酶肽段：TKIPAVFKIDALNENK的离子图。
图4为胰蛋白酶肽段：TKIPAVFKIDALNENK的一级质谱(母离子)图。
图5为胰蛋白酶肽段：TKIPAVFKIDALNENK的二级质谱(子离子)图。
图6为复合蛋白酶DEALEKFDKALKALPMHIRLS的离子图。
图7为复合蛋白酶DEALEKFDKALKALPMHIRLS的一级质谱(母 离子)图。
图8为复合蛋白酶DEALEKFDKALKALPMHIRLS的二级质谱(子 离子)图。
图9中9a为各组小鼠血清中特异性抗体IgE水平图；9b各组小鼠血 清中特异性抗体IgG1水平图；9c为各组小鼠血清中特异性抗体IgG2a水 平图。
图10中a为各组小鼠IFN-γ因子含量图；b为各组小鼠IL-17因子 含量图；c为各组小鼠IL-4因子含量图；d为各组小鼠IL-5因子含量图； e为各组小鼠IL-13因子含量图。
图11为各组小鼠血清中组胺含量图。
图12为各组小鼠血清中几丁质酶-3样蛋白-1含量图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对 本发明作详细描述。
本发明中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径 得到。
本发明的实施例提出一种牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物的 制备：
牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物的制备方法，其特征在于， 包括如下步骤：
1)将β-乳球蛋白配制成3％(w/v)的水溶液；
2)按照3000U/g蛋白的比例在β-乳球蛋白的水溶液中加入蛋白酶， 调节反应体系的pH值；在温度为50-60℃的条件下水解反应3-5h；水解 反应在恒温水浴振荡器中进行；实施例所有
3)在水浴锅中85℃灭酶10min，冷却。
实施例1
生物信息学预测β-乳球蛋白T细胞表位：
1)材料与方法：
从GenBank中获取乳球蛋白的氨基酸序列，通过IEDB (http://www.iedb.org/)、NetMHC(Ⅱ)/pan4.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetMHCIIpan-4.0)在线网 站工具预测T细胞表位。在IEDB主页上首先选择T细胞表位预测板块， 输入β-LG氨基酸序列或者上传BLG序列的Fasta文件，选择预结合的 MHC分子，并设定多肽长度，就会得到该网站预测的可能的β-LG的T 细胞表位，最后输出结果。结果中调整等级越小，则说明越可能为β-乳 球蛋白T细胞表位。在NetMHC(Ⅱ)/pan4.0网页上，输入β-LG氨基酸序 列或者上传BLG序列的Fasta文件，选择预结合的MHC分子信息，并设 定多肽长度，最终输出结果。在结果中，分数越高则越可能为β-乳球蛋 白T细胞表位。从uniprot数据库中获取乳球蛋白的三维结构，使用 pymol软件对可能的T细胞表位进行建模标注。
2)乳球蛋白T细胞表位预测结果：
β-LG的可能的T细胞表位利用在线网站工具IEDB和 NetMHC(Ⅱ)/pan4.0预测，利用在线网站工具IEDB得出的T细胞表位在 表1中列出，由在线网站工具NetMHC(Ⅱ)/pan4.0预测的T细胞表位在 表2中列出。观察结果，如表1所示，从IEDB数据库得到的β-LG可能 的T细胞表位结果表明，T细胞表位主要集中在三段氨基酸序列上，即 AA26-46，AA110-128，AA154-173。如表2所示，利用在线工具 NetMHC(Ⅱ)/pan4.0预测的β-LG可能的T细胞表位结果表明T细胞表位 集中在五段氨基酸序列上，即AA13-29，AA33-56，AA55-69， AA83-108，AA160-174。结合二者的预测结果，可以得出牛乳β-乳球蛋 白可能的T细胞表位区可能在五段氨基酸序列，分别为AA13-29， AA33-56，AA55-69，AA83-108，AA110-128，AA154-175。
表1 IEDB在线预测网站预测的T细胞表位
表2 NetMHC(Ⅱ)/Pan在线预测网站预测的T细胞表位
从Uniprot数据库中检索得到β-乳球蛋白的三维结构，序号为1BEB。
综合IEDB、NetMHC(Ⅱ)/Pan4.0预测结果，可以得到有5段肽段分 别为AA13-29，AA32-46，AA55-69，AA83-108，AA110-128，AA160-175 可能为乳球蛋白的T细胞表位。将预测的表位在乳球蛋白的三维结构中 进行标注。
实施例2
牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物的制备方法，其特征在于， 包括如下步骤：
1)将β-乳球蛋白配制成3％(w/v)的水溶液；
2)按照3000U/g蛋白的比例在β-乳球蛋白的水溶液中加入蛋白酶， 调节反应体系的pH值，进行水解反应；水解反应在恒温水浴振荡器中进 行；实施例所有的蛋白酶水解反应条件如表3所示；
3)在水浴锅中85℃灭酶10min，冷却。
实施例3-5及对比例1-2
实施例3-5和对比例1-2的制备方法与实施例2相同，具体的β-乳球 蛋白水溶液的底物浓度、所用的蛋白酶及水解反应的条件如表1所示。
表3实施例2-5和对比例1-2蛋白酶水解β-乳球蛋白的的反应条件
实施例6
水解度的测定：
利用OPA法测定上述实施例2-5和对比例1-2的水解物的水解度， 主要原理为当硫醇基存在时氨基和邻苯二甲醛(OPA)可发生特异性反 应。将10mL 50mMOPA的甲醇溶液，10mL 50mM N-乙酰半胱氨酸的蒸 馏水溶液，5mL 20％(w/v)SDS和75mL硼酸盐缓冲液(0.1M，pH9.5)混合制备OPA试剂。OPA试剂避光保存，并在使用前避光持续搅拌60 分钟。取3.2mL新鲜配置的OPA试剂于试管中，加入400μL水解物即 样品或L-亮氨酸标准品，混合均匀，在室温下温育放置10分钟后，使用 紫外分光光度计在340nm下测量样品或标准品的吸光度。
以L-亮氨酸为标准品绘制标准曲线。用电子天平准确称量0.3279g L-亮氨酸于100mL容量瓶中用超纯水定容，再分别取0、0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0mL上述容量瓶中溶液至6支25mL棕色容量瓶中定容至 25mL，并按浓度高低分别编号0、1、2、3、4、5号。
计算水解度DH公式如(1-1)所示：
其中(NH2)Tx是酶解产物的游离氨基含量(μmol/mL)，(NH2) To是未水解β-乳球蛋白的游离氨基含量(μmol/mL)，(NH2)Total 是β-乳球蛋白样品中游离氨基的含量(μmol/mL)。
本实施例中采用OPA法测定各个水解物的水解度。以L-亮氨酸作为 标准品，建立L-亮氨酸标准曲线，结果如图1所示。
由图2可知，亮氨酸浓度与吸光度值呈较好的线性关系，线性方程 为y＝0.7553x+0.0041，相关性达到0.9992，结果可靠。
β-乳球蛋白游离氨基的总含量测定；盐酸水解β-乳球蛋白后用氨 基酸分析仪测定。参考食品安全国家标准即GB5009.124－2016中规定的 食品中氨基酸的测定方法进行测定。
用氨基酸分析仪测定β-乳球蛋白中20种氨基酸含量，结果见表4。 通过计算可得β-乳球蛋白中总氨基含量为191.403μmol/ml。以未水解 的β-乳球蛋白为样品，和OPA溶液反应后，测定其OD值，如表5所 示，通过L-亮氨酸的标准曲线得到β-乳球蛋白中游离NH2浓度为14.09 μmol/ml。相同的方法测定不同酶解液的OD值，计算水解液中游离NH2浓度。利用公式(1-1)计算水解度，结果见图3。
测定的实施例及对比例六种酶的水解度均低于50％，为β-乳球蛋白 部分水解。
表4β-乳球蛋白20种氨基酸的含量
表5β-乳球蛋白中游离氨基酸含量
实施例7
水解物质谱分析条件：
使用Q Exactive HF-X质谱仪，Nanospray Flex(ESI)离子源，设定离 子喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为320℃，质谱采用数据依赖型采 集模式，质谱全扫描范围为m/z＝300-1700，一级质谱分辨率设为 70000，C-trap最大容量为1×106，C-trap最大注入时间为50ms；选取 全扫描中离子强度TOP20的母离子使用高能碰撞裂解(HCD)方式破裂， 进行二级质谱检测，二级质谱分辨率定为17500，C-trap最大容量为2× 105，C-trap最大注入时间为50ms，肽段碎裂碰撞能量设为28％，阈强度 设为2.0×104，动态排阻范围设为30ms。
质谱分析时，所用蛋白酶水解位点，如表6所示。
表6实施例和对比例的各种蛋白酶水解位点
质谱分析水解物肽段氨基酸序列结果：
如表7所示，实施例和对比例的6种蛋白酶中，胰蛋白酶水解物肽 段与预测的T细胞表位部分或全部重叠9条，复合蛋白酶水解物肽段与 预测表位部分或全部重叠5条，中性蛋白酶水解物肽段与预测表位部分 重叠4条，木瓜蛋白酶水解物肽段与预测表位部分重叠1条，而碱性蛋 白酶和蛋白酶M水解物肽段与预测T细胞表位肽段几乎无重叠。
表7蛋白酶水解物肽段氨基酸序列
胰蛋白酶肽段：TKIPAVFKIDALNENK的离子图 (MH+1801.01992，m/z 451.01044)，一级质谱(母离子)图和二级质谱 (子离子)图如图4-6所示。
复合蛋白酶DEALEKFDKALKALPMHIRLS的离子图 (MH+2425.32718，m/z 607.08789)一级质谱(母离子)图和二级质谱(子 离子)图如图7-9所示。
胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解产生的肽段 与预测的β-乳球蛋白T细胞表位重复部分较多，显示出较好的相关性。 而碱性蛋白酶和蛋白酶M几乎无重叠部分。所以初步筛选出胰蛋白酶、 复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶四种酶水解物可能具有免疫耐受 性。
实施例7
1、动物实验方案及结果
实施例5和实施例6初步筛选出胰蛋白酶Typsin、木瓜蛋白酶 Papasin、复合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase四种蛋白酶的水解 物可能具有免疫耐受性。本实施例则进一步使用体内动物实验验证这四 种蛋白水解物的是否具有免疫耐受活性。
在致敏BalB/c小鼠前，分别用4种水解物连续灌胃小鼠7天，旨在 预防β-乳球蛋白免疫小鼠时发生过敏反应。以β-乳球蛋白致敏组和生 理盐水组分别为阳性对照组和阴性对照组。结果分别测定了小鼠血清中 特异性抗体IgE、IgG1、IgG2a的吸光度值，Th1和Th2细胞相关因子水 平、几丁质酶-3样蛋白-1及血浆中组胺的含量来验证四种水解物是否具 有免疫耐受活性。
BalB/c小鼠在SPF标准的动物房内适应性喂养3-4天，期间允许小 鼠自由进食和饮水(食物中不包含过敏原)，小鼠生存环境温度保持在 23±3℃，生活湿度维持在40％～70％，白天黑夜各12小时。小鼠按体 重随机分成6组，每组10只，小鼠分组设置了阴性对照组(NC组)： 灌胃生理盐水；阳性对照组(PC组)：灌胃β-乳球蛋白。在第0、7、 14、21，28天灌胃致敏剂量为0.3mL的混合液(含有5mg BLG的生 理盐水)1次，第35天用5～10倍剂量β-乳球蛋白灌胃。
4组预防组：适应性喂养3-4天后，致敏前7天(从第-7天开始)每 天分别灌胃4种蛋白水解物，每次灌胃20mg/只/天(溶于生理盐水)。 第0、7、14、21、28天这五天每天灌胃β-乳球蛋白0.3mL1次(溶于 生理盐水)，第35天小鼠禁食过夜后用5～10倍剂量的β-乳球蛋白灌胃。4组预防组分别为胰蛋白酶组(Trypsin)即TH组、木瓜蛋白酶组 (Papain)即PH组、复合蛋白酶组(Protamex)即PM组和中性蛋白酶组 (Neutrase)即NPH组。
实验过程中，每周观察小鼠的生长状况(包括小鼠的体貌特征、饮 食以及精神状态等)。每周测量小鼠体温变化。大剂量刺激后，观察各 组动物的状态，连续观察45分钟左右并进行致敏症状评分。评分标准 为：0分：没有异常过敏症状；1分：小鼠抓鼻子或挠头；2分：眼睛或 嘴巴周围肿起，毛发竖起，活动频率降低或呼吸频率增加；3分：哮 喘，呼吸困难；4分：大刺激后小鼠抽搐或静止；5分：死亡；
实验最后一天，各组小鼠眼部内眦静脉采血，加入含有或不含有 EDTAK2的离心管中，轻轻混匀。4℃静置过夜，次日在4℃以5000r/min 离心10min，分离出血清或血浆，分装存于-20℃，血清用于特异性抗 体、细胞因子、几丁质酶3样蛋白-1(CHI3L1)的测定。血浆用于组胺 的测定。
第35天激发各组小鼠后记录临床症状情况如表8所示。阴性对照组 10只都没有症状，β-乳球蛋白阳性对照组6只小鼠有哮喘，呼吸困难症 状，3只小鼠刺激后静止不活动，产生颤抖和肌肉收缩的症状，1只小鼠 死亡；胰蛋白酶水解物组即TH组，9只小鼠无症状，1只小鼠抓鼻子或 挠头，产生较轻微过敏现象；复合蛋白酶水解物组即PM组，8只小鼠无 症状，2只小鼠抓鼻子或挠头，产生较轻微过敏现象。木瓜蛋白酶组即 PH组，8只小鼠无症状，2只小鼠抓鼻子或挠头，产生较轻微过敏现象； 中性蛋白酶组即NPH组，2只小鼠眼睛或嘴巴周围浮肿，毛发竖立，活 动减少或呼吸频率增加；6只小鼠产生哮喘，呼吸困难等现象，2只小鼠 在刺激后小鼠静止不活动，或产生颤抖和肌肉收缩的症状。
表8各组小鼠临床症状
2、特异性抗体IgE、IgG1、IgG2a的测定：采用Elisa方法测定。
通过β-乳球蛋白特异性IgE、IgG1、IgG2a抗体吸光度值(OD)的 测定结果可知：
如图10a所示，阳性对照组、中性蛋白酶组小鼠血清中特异性抗体 IgE的OD值显著高于阴性对照(p﹤0.05)，而胰蛋白酶组、复合蛋白酶 组、木瓜蛋白酶组与阴性对照组无显著差异(p﹥0.05)。说明胰蛋白酶、 复合蛋白酶、木瓜蛋白酶水解的β-乳球蛋白水解物显著的预防了小鼠的 致敏反应，连续灌胃7天使小鼠产生了口服耐受性，而中性蛋白酶水解 物没有显著的预防小鼠的致敏反应。
如图10b所示，阳性对照组、中性蛋白酶组小鼠血清中特异性抗体 IgG1的OD值显著高于阴性对照组(p﹤0.05)，而胰蛋白酶组、复合蛋 白酶组、木瓜蛋白酶组与阴性对照组无显著差异(p﹥0.05)。这说明由 胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶水解的β-乳球蛋白水解物显著地预 防了小鼠的致敏反应，连续灌胃7天使小鼠产生了口服耐受性，而中性 蛋白酶水解物没有显著地预防小鼠的过敏。
如图10c所示，阳性对照组、中性蛋白酶组小鼠血清中特异性抗体 IgG2a的OD值显著高于阴性对照组(p﹤0.05)，而胰蛋白酶组、复合蛋 白酶组、木瓜蛋白酶组与阴性对照组无显著差异(p﹥0.05)。这说明由 胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶水解的β-乳球蛋白水解物显著地预 防了小鼠的致敏反应，通过灌胃7天使小鼠产生了口服耐受性，而中性 蛋白酶水解物没有显著地预防小鼠的致敏反应。
3、Th1和Th2细胞因子的测定：IL-4、IL-5、IL-13、IL17和IFNγ 分别使用ELISA试剂盒测定，按照说明书操作。
通过Th1细胞因子的测定，Th2细胞因子的测定可知：
如图10a所示，蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组IFN-γ水 平显著高于阳性对照组(P﹤0.05)，说明蛋白酶组、复合蛋白酶组、木 瓜蛋白酶组主动抑制了小鼠过敏的发生，进行了免疫耐受。中性蛋白酶 组与阴性对照组、阳性对照组无显著性差异(P﹥0.05)，则说明中性蛋 白酶未发生免疫耐受机制。如图10b所示，胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、 木瓜蛋白酶组IL-17水平显著高与阳性对照组，且与阳性对照组有显著性 差异(P﹤0.05)，说明胰蛋白酶组酶解物、复合蛋白酶组酶解物、木瓜 蛋白酶组酶解物主动抑制了小鼠过敏的发生，进行了免疫耐受。中性蛋 白酶组与阴性对照组、阳性对照组无显著性差异(P﹥0.05)，则说明中 性蛋白酶未发生免疫耐受机制。耐受性的形成会涉及到一些免疫变化， 如Th2反应减弱，Th1细胞反应增强。过敏反应则正好相反。如图10c所示，胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组酶解物IL-4水平与阴 性对照组无显著差异(P﹥0.05)，而显著低于阳性对照组(P﹤0.05)。 中性蛋白酶组显著高于阴性对照组(P﹤0.05)，与阳性对照组无显著差 异(P﹥0.05)。说明胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组酶解物 使小鼠没有发生过敏反应，中性蛋白酶组酶解物使小鼠发生了过敏反应。
如图10d所示，胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组三组酶 解物小鼠产生的IL-5水平与阴性对照组无显著差异(P﹥0.05)，但是显 著低于阳性对照组(P﹤0.05)。中性蛋白酶组小鼠IL-5水平显著高于阴 性对照组(P﹤0.05)，与阳性对照组无显著差异(P﹥0.05)。说明胰蛋 白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组小鼠没有发生过敏反应，中性蛋 白酶组小鼠发生了过敏反应。
如图10e所示，胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组IL-4水 平与阴性对照组无显著差异(P﹥0.05)，而显著低于阳性对照组(P﹤ 0.05)。中性蛋白酶组显著高于阴性对照组(P﹤0.05)，与阳性对照组 无显著差异(P﹥0.05)。说明胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶 组小鼠没有发生过敏反应，中性蛋白酶组小鼠发生了过敏反应。
4、血浆中组胺的测定：使用组胺ELISA试剂盒测定,按照说明书操 作。
组氨酸是在脱羧酶的反应下会产生组胺。组胺存在于身体的许多组 织中的肥大细胞。当身体发生过敏反应时，这些组织会释放大量组胺。
如图11所示，胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组三组小鼠 的组胺水平与阴性对照组小鼠无显著差异(p﹥0.05)，与阳性对照组小 鼠有显著差异(p﹤0.05)。这说明胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋 白酶组三组β-乳球蛋白水解物对过敏小鼠组胺的释放有抑制作用，成功 诱导了小鼠免疫耐受。但中性蛋白酶组与阳性对照组并无显著差异(p﹥0.05)，与阴性对照组差异显著(p﹤0.05)，说明中性蛋白酶组的β-乳 球蛋白水解物没有成功诱导免疫耐受，小鼠发生了过敏反应。
5、血清中几丁质酶-3样蛋白-1(Chitinase 3-like 1)含量测定：使用几 丁质酶3样蛋白-1ELISA试剂盒测定。
在过敏反应中，几丁质酶可以通过调节TGF-β的表达和调节 Foxp3+调节性T细胞的数量发挥作用。可以减轻过敏炎症。
如图12所示，胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、木瓜蛋白酶组三组小鼠 释放的几丁质酶-3样蛋白-1水平与阴性对照组无显著差异(p﹥0.05)， 但却显著低于阳性对照组(p﹤0.05)，这说明胰蛋白酶组、复合蛋白酶 组、木瓜蛋白酶组三组的β-乳球蛋白水解物对过敏小鼠几丁质酶-3样蛋 白-1的释放有抑制作用，成功诱导了小鼠免疫耐受。但中性蛋白酶组与 阳性对照组并无显著差异(p﹥0.05)，显著高于阴性对照组(p﹤0.05)， 说明中性蛋白酶组的β-乳球蛋白水解物没有成功诱导免疫耐受。
本发明成功地建立了胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶β-乳球蛋 白水解物诱导Balb/c小鼠口服耐受的模型，这三种水解物可以有效预防 OVA诱导的小鼠过敏反应，复合蛋白酶、木瓜蛋白酶水解物是之前未见 报道的。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而 非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领 域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术 方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这 些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围。
序列表
<110> 北京工商大学
<120> 一种牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物及其制备方法和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Lys Ala Leu Pro Met Met His Ile Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Leu Pro Met His Ile Arg
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Thr Lys Ile Pro Ala Val Phe Lys
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Thr Lys Ile Pro Ala Cys Phe Lys
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Pro Ala Val Phe Lys Ile Asp Ala Leu Asn Glu Asn Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser
1 5 10 15
Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg
20 25
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Thr Asp Tyr Lys Lys
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Tyr Val Glu Glu Leu Lys Pro Thr Pro Glu
1 5 10
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Lys Phe Asp Lys Ala Leu Lys Ala Leu Pro Met His Ile Arg Leu Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ile Arg Ile Ser
1
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Pro Met Met His Ile Arg Leu Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Thr Asp Tyr Lys Lys Tyr Leu
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Leu Asp Thr Asp Tyr Lys Lys Tyr Leu
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Val Leu Asp Thr Asp Tyr Lys Lys Tyr Leu
1 5 10
Claims (10)
1.一种快速获得牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物的方法，其特征在于，其包括：
S1、获得β-乳球蛋白的基因及氨基酸序列，利用在线网站工具IEDB和NetMHC(Ⅱ)/pan4.0预测β-乳球蛋白T细胞表位，结合二者的预测结果，得出牛乳β-乳球蛋白可能的T细胞表位区可能在五段氨基酸序列，分别为AA13-29,AA32-46,AA55-69,AA83-108,AA110-128,AA154-175；
S2、采用不同种类的蛋白酶对β-乳球蛋白进行酶解，并用质谱测定水解物肽段的氨基酸序列，将这些肽段的氨基酸序列与S1中预测的β-乳球蛋白T细胞表位序列进行比对，初步筛选出可能具有免疫耐受作用的水解物；
S3、以所筛选的可能具有免疫耐受作用的水解物为研究对象，用动物实验进一步筛选和确实具有免疫耐受作用的水解物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S2酶解的过程包括如下步骤：
将β-乳球蛋白配制成3-5％(w/v)的水溶液；按照2500-3500U/g蛋白的比例在β-乳球蛋白的水溶液中加入蛋白酶，调节反应体系的pH值为7-8；在温度为50-60℃的条件下水解反应3-5h；灭酶，冷却。
3.如权利要求2所述的方法：其特征在于，采用稀盐酸或氢氧化钠溶液调节反应体系的pH值。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：水解反应在恒温水浴振荡器中进行。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在80-90℃灭酶5-20min。
6.如权利要求1所述的，其特征在于：S2中所述蛋白酶为复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶中的至少一种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述蛋白酶为复合蛋白酶时，水解反应的酶切位点为丝氨酸；
所述蛋白酶为中性蛋白酶时，水解反应的酶切位点为色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸；
所述蛋白酶为木瓜蛋白酶时，水解反应的酶切位点为亮氨酸、甘氨酸、赖氨酸和精氨酸；
所述蛋白酶为胰蛋白酶时，水解反应的酶切位点为精氨酸、脯氨酸和亮氨酸。
8.一种牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物，其特征在于：所述牛乳β-乳球蛋白T细胞免疫耐受水解物是根据权利要求1-7任一项所述方法制备得到。
9.一种预防OVA诱导的小鼠过敏反应的蛋白质水解组合物，其特征在于，所述水解组合物是由胰蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶水解β-乳球蛋白得到。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于：所述水解物所包含若干肽段，其中至少一条肽段与如SEQ ID NO:1-18中任一个或多个所示的氨基酸序列全部或部分重合。
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