CN113249324A - 一种猪眼睛角膜的培养及保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种猪眼睛角膜的培养及保存方法，步骤如下：将离体的新鲜猪眼球迅速依次放入含有庆大霉素、青链霉素的磷酸盐缓冲液中进行消毒，集样瓶中低温0～4℃保存，在60～120min内通过双酶消化法或者揭膜贴壁法进行细胞培养；将步骤一得到的猪眼睛角膜内皮原代细胞于4℃保存于保存液中，保存6～12h。本发明方法使得具有活性的完整角膜保存时间为6～12h，本发明将丰富生物组织材料猪供体器官眼睛角膜细胞生物学基础研究数据，满足医用市场对动物供体器官的开发研究需求。本发明对于缓解供体缺乏严重，确立异种移植的候选材料及临床应用价值给予理论依据，为医学利用组织器官移植角膜可能性提供基础数据。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，尤其是一种猪眼睛角膜的培养及保存方法。
背景技术
角膜是眼睛前部的一种无血管、透明的重要组织，是眼睛主要的屈光部位。角膜将光线传输并聚焦到视网膜上以产生视觉。但由于各种机械或疾病的因素会导致角膜受损，而这些因素可能会导致严重的视力下降甚至失明。
据报道，全球有2.85亿人患有视力障碍。角膜疾病是全球第四大致盲原因(Pascolini et al.2012)。目前，中国约有123.3万名视力障碍患者。其中，有400万人因角膜失明而致残，其次是角膜功能障碍。然而，解决不可逆角膜损伤的唯一治疗方法是角膜移植。仅在美国，每年就有4万例角膜移植手术(Whitcher et al.2001)。目前，主要有两种途径来获取角膜供体材料：同种异体材料和合成材料。但角膜移植也存在着短板，全球范围内角膜供体数量和质量受到限制，阻碍了外科手术的发展。此外，可能出现感染、移植失败和免疫反应等并发症。
猪被认为是提供外源器官的合适动物，因为它们的生理结构与人类相似。猪的角膜在解剖学和生物力学特性上也与人类的角膜非常相似，角膜内皮细胞的性质也相似。一方面，非人类灵长类动物是最接近人类的物种，但存在可用性和伦理问题；另一方面，小动物的眼睛太小，无法有效地摘除角膜。作为屠宰场的副产品，它们很容易获得，最大程度上可缓解供体短缺的局面。猪的角膜除了最前部的几个角化细胞外，几乎没有引起超急性排斥反应的α-gal抗原决定簇，降低角膜移植手术后引起的排斥反应。
现代医疗可使用眼睛活组织进行人对人的角膜移植。全球普遍采用的储存方法是“湿室”，即1935年推出的保存于2～6℃的湿润容器中。角膜保存主要有三种储存方式：第一是短期保存，在4℃的温度下全眼保存48小时；第二是中期保存，在4℃的硫酸软骨素培养基中保存长达14天；第三是长期保存，在37℃的温度下组织培养4周以上。
在美国和一些国家，低温(2℃～8℃)保存角膜是首选，因为对比器官培养更便利些。在美国，最常用的保存溶液是Optisol-GS(Bausch和Lomb)，其次是Life 4℃(Numedis)(Price et al.2015)和Eusol(Alchimia)(Yüksel et al.2016)。这些溶液含有硫酸软骨素、非必需氨基酸、抗氧化剂和其他成分，在不同的储存溶液中含量不同，支持内皮细胞活性直到角膜移植(Pham et al.2013)。
人角膜在我国主要保存在湿室内，保存时间较短(约24～48小时)，因为角膜内皮细胞的细胞活力在48小时后下降了50％(Sun et al.2014)。因此，角膜移植手术在中国一直被认为是一种急诊手术。降低角膜保存成本，延长角膜保存时间，改进角膜保存方法，拓展不同动物供体角膜来源一直是攻关的课题研究。
由于内皮细胞对移植物的透明性和存活率至关重要，因此最大允许的保存时间主要由内皮细胞功能和完整性的维持决定。内皮细胞密度测定是根据美国眼科银行协会的医学标准对角膜组织进行评估的一种标准方法。一般来说，是通过显微镜对内皮细胞进行储存前的评估。由于内皮细胞的外观随温度、类型、保存时间和介质的不同而变化，因此应在室温下进行评价。当无法获得内皮细胞计数时，可根据具体情况放弃此要求。
用于移植的供体角膜在体外保存期间内皮细胞密度明显下降。在一个大的眼库中，大约30％的角膜没有用于移植，因为内皮细胞数量已经低于2200个细胞/mm2的可接受密度(Armitage et al.1997)。如果出现排斥反应，细胞密度就会进一步急剧下降。在某些情况下，这将使细胞密度降低到透明度丧失和角膜移植失败的程度。
低温保存法在世界各地都很普遍。低温存储溶液，即M-K培养基，存储时间最长为10天。已经被存储效果更好和时间更长的其他溶液所取代，如改良的M-K培养基、K-Sol、DexSol、Likorol、Optisol(Plus，GS)，具有更好的储存能力，最长储存时间为14-16天。由于在低温贮藏过程中会发生退行性变化，因此必须考虑内皮细胞的损失，甚至可能导致细胞完全死亡。随着角膜由低温向器官培养保存的转变，贮藏时间从最长的7～10天增加到23天。延长储存时间可以改进微生物和血清学筛选，以便进行组织相容性匹配和随后的分配。世界各地不同的眼库使用的存储方法有很大的不同(Ehlers et al.2002)。低温储存降低了成本，并且不需要复杂的技术设备。也有研究表明，短期储存对角膜肿胀和内皮细胞活力有积极影响(Szaflik et al.2000)。然而，一些研究清楚地表明，内皮细胞密度(ECD)和形态学在器官培养中保存良好，甚至可以保存35天(Probst et al.1997)；而且术后存活率和角膜厚度与短期保存相似(Ehlers et al.2002)。
低温保存技术很简单：用最少的处理将其存储在冰箱中，不需要复杂或昂贵的设备。保存介质由组织培养基组成，辅以抗生素、防止角膜肿胀的右旋糖酐、硫酸软骨素等消肿剂，以及能量、抗氧化剂、膜稳定剂、生长因子等添加剂，提高保存能力。
器官保存技术相对复杂，尽管目前的存储溶液在市场上可以买到。角膜保存在30～37摄氏度的培养箱中，置于组织培养基中，辅以胎儿或新生小牛血清、抗生素和抗真菌药物。角膜在存储介质中保存的最长时间在各眼库间也有所不同：从1天到7天不等(Maas etal.2006)。器官培养的允许贮存期较长，贮存期可能长达4～5周。根据所使用的存储介质，介质在存储10～14天后进行更换。
器官培养后在显微镜下不适合内皮的显示。有必要通过低渗溶液使细胞间隙膨胀来观察内皮细胞，进而对整个内皮表面进行检查。这种方法引起的肿胀是暂时的，几分钟后就消失了，这取决于细胞膜的完整性。在死亡细胞和坏死细胞中以及在它们的直接邻近区域不会发生肿胀。平衡盐溶液(BSS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、1.8％蔗糖-PBS混合物或低渗透BSS在保存前后均可引起肿胀，而对于含有脱水剂溶液中的组织，可能需要用1.8％蔗糖进行更强的刺激。肿胀的诱导和肿胀方式取决于储存时间和介质(Thuret et al.2004)。在细胞间隙进行人为膨胀之前使用诸如台盼蓝之类的重要染色剂可能有助于识别死亡或坏死的细胞或剥离的Descemet膜。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种猪眼睛角膜的培养及保存方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种猪眼睛角膜的培养及保存方法，步骤如下：
一、猪眼睛角膜内皮原代细胞培养
将离体的新鲜猪眼球迅速依次放入含有庆大霉素、青链霉素的磷酸盐缓冲液中进行消毒，集样瓶中低温0～4℃保存，在60～120min内通过双酶消化法或者揭膜贴壁法进行细胞培养；
双酶消化法：
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿猪眼球角膜缘1mm处环形剪下全层角膜；
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来；
(3)将剥离的Descemet's膜剪成1mm×1mm的组织块；
(4)加入胶原酶I，在37℃培养箱消化10min；
(5)再加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化10min；用培养液终止消化；
(6)1500r/min离心5min，弃上清，加入培养液，将沉淀吹打成悬液，移至培养皿；
(7)在37℃、5％CO2条件下培养；24h后加培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次，即得猪眼睛角膜内皮原代细胞；
揭膜贴壁法：
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿猪眼球角膜缘1mm处环形剪下全层角膜；
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来；
(3)内皮面贴于培养皿中，加入培养液，使培养液刚好覆盖组织，又不使其漂浮；
(4)在37℃、5％CO2条件下培养；24h后加培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次，即得猪眼睛角膜内皮原代细胞；
二、猪眼角膜保存和冻存
将步骤一得到的猪眼睛角膜内皮原代细胞于4℃保存于保存液中，保存6～12h；
其中，所述保存液的组成为：DMEM/F12+右旋糖酐+硫酸软骨素+双抗即青霉素、链霉素+胎牛血清。
进一步地，所述步骤一中含有庆大霉素的磷酸盐缓冲液为：将庆大霉素：PBS缓冲液按体积比为0.1：100混合而成的磷酸盐缓冲液，含有青链霉素的磷酸盐缓冲液为：将青链霉素：PBS缓冲液按体积比为1：100混合而成的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述步骤一(4)中每一颗离体的新鲜猪眼球的胶原酶I的添加量为1mL，所述步骤一(5)中每一颗离体的新鲜猪眼球的0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA的添加量为1mL。
进一步地，所述培养液为DMEM/F12培养基。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明方法使得具有活性的完整角膜保存时间为6～12h，本发明将丰富生物组织材料猪供体器官眼睛角膜细胞生物学基础研究数据。探索不同动物来源的眼角膜生物特性和潜在的医学价值，满足医用市场对动物供体器官的开发研究需求。本发明对于缓解供体缺乏严重，确立异种移植的候选材料及临床应用价值给予理论依据，为医学利用组织器官移植角膜可能性提供基础数据。
2、本发明方法中使用揭膜贴壁法，获得的猪眼角膜内皮细胞培养，细胞生长缓慢，贴壁时间长，12d以后细胞铺满培养皿底部，形成单层的鹅卵石状形态。双酶消化法，在消化后可获得轮廓清晰的圆形内皮细胞，9～10d细胞生长缓慢，形态变化不明显，出现少量梭形基质细胞。
3、本发明方法中使用使用4℃保存液保存的角膜片，染色后，在不同的保存时间段：4h、6h、8h、12h，均可见细胞轮廓清晰，连接紧密，呈六边形或多边形，未发现细胞核蓝染的细胞。-20℃冻存液保存的角膜片，染色后，在4h、6h、8h、12h时间，均发现不同程度蓝染的细胞核，其中6h时，程度明显，CECs轮廓不清晰；4h、8h次之；12h有少量核蓝染。-196℃冻存液保存的角膜片，染色后，在4h、6h、8h、12h时间，未发现核蓝染的细胞，细胞呈六边形或多边形，但CECs轮廓不清晰。有活性的完整角膜保存时间为6～12h。
附图说明
图1为本发明中揭膜贴壁法原代培养得到的猪角膜内皮细胞的形态图；其中，A：培养3d时，有圆形细胞游出(×200)；B：7d后细胞开始贴壁(×200)；C：10d时贴壁细胞呈不规则形状(×200)；D：12d后细胞铺满皿底，形成单层的鹅卵石形状(×200)；
图2为本发明中双酶消化法原代培养得到的猪角膜内皮细胞的形态图；其中，A：消化后的细胞呈圆形，悬浮于培养液(×200)；B：24h后有少量细胞出现贴壁，形态上改变不明显(×200)；C：8d时细胞全部贴壁，细胞形态呈不规则(×200)；D：10d时细胞生长缓慢，形态变化不明显，出现少量梭形基质细胞(×200)；
图3为本发明中双酶消化法存在的问题图；其中，A：双酶法消化时间过短导致消化不完全(×200)；B：双酶法消化时间过长导致消化过度(×200)；C、D：双酶法消化后会出现数量不等的杂质(×200)；
图4为本发明中角膜片分组图；
图5为本发明中保存后角膜内皮细胞染色(×200)图；其中，A、E、I分别是4℃保存液组、-20℃冻存液组、-196℃冻存液组保存4h后染色图片；B、F、G分别是4℃保存液组、-20℃冻存液组、-196℃冻存液组保存6h后染色图片；C、G、K分别是4℃保存液组、-20℃冻存液组、-196℃冻存液组保存8h后染色图片；D、H、L分别是4℃保存液组、-20℃冻存液组、-196℃冻存液组保存12h后染色图片；
图6为本发明中一种猪眼睛活性角膜实景图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种猪眼睛角膜的培养及保存方法，步骤如下：
一、猪眼睛角膜内皮原代细胞培养
将离体的新鲜猪眼球迅速依次放入含有庆大霉素、青链霉素的磷酸盐缓冲液中进行消毒，集样瓶中低温0～4℃保存，在60～120min内通过双酶消化法或者揭膜贴壁法进行细胞培养；
双酶消化法：
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿猪眼球角膜缘1mm处环形剪下全层角膜；
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来；
(3)将剥离的Descemet's膜剪成1mm×1mm的组织块；
(4)加入胶原酶I，在37℃培养箱消化10min；
(5)再加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化10min；用培养液终止消化；
(6)1500r/min离心5min，弃上清，加入培养液，将沉淀吹打成悬液，移至培养皿；
(7)在37℃、5％CO2条件下培养；24h后加培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次，即得猪眼睛角膜内皮原代细胞；
揭膜贴壁法：
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿猪眼球角膜缘1mm处环形剪下全层角膜；
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来；
(3)内皮面贴于培养皿中，加入培养液，使培养液刚好覆盖组织，又不使其漂浮；
(4)在37℃、5％CO2条件下培养；24h后加培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次，即得猪眼睛角膜内皮原代细胞；
二、猪眼角膜保存和冻存
将步骤一得到的猪眼睛角膜内皮原代细胞于4℃保存于保存液中，保存6～12h；
其中，所述保存液的组成为：DMEM/F12+右旋糖酐+硫酸软骨素+双抗即青霉素、链霉素+胎牛血清。
较优地，所述步骤一中含有庆大霉素的磷酸盐缓冲液为：将庆大霉素：PBS缓冲液按体积比为0.1：100混合而成的磷酸盐缓冲液，含有青链霉素的磷酸盐缓冲液为：将青链霉素：PBS缓冲液按体积比为1：100混合而成的磷酸盐缓冲液。
较优地，所述步骤一(4)中每一颗离体的新鲜猪眼球的胶原酶I的添加量为1mL，所述步骤一(5)中每一颗离体的新鲜猪眼球的0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA的添加量为1mL。
较优地，所述培养液为DMEM/F12培养基。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
一、猪眼睛角膜内皮原代细胞培养试验
本试验通过比较揭膜贴壁法、双酶消化法，建立一种方便、实用、可靠的猪角膜内皮细胞的原代培养方法，并提供猪角膜细胞生物学参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
主要试剂及药品:
主要仪器及设备:
1.2试验方法
实验动物：天津市生猪屠宰肉食品加工股份有限公司基地，经过屠宰前严格检疫合格健康上市体重为110～140kg，生猪品种为大约克夏猪。取自屠宰场机械化工艺流水线刚屠宰放血猪的眼睛。每头猪仅取左侧的眼球，即每头猪取1只眼睛。可以如图6所示。为完成试验研究内容前后取试验猪眼睛样品共计80头屠宰线上生猪。
采样过程：取出的新鲜猪眼球迅速依次放入含有庆大霉素、青链霉素的磷酸盐缓冲液中进行消毒，集样瓶中低温0～4℃保存，在60～120min内进行细胞培养试验程序。
试验地点：天津农学院动物营养试验中心实验室。
1.2.1双酶消化法
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿角膜缘1mm处环形剪下全层角膜。
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来。
(3)将剥离的Descemet's膜剪成1mm×1mm的组织块。
(4)加入胶原酶I，在37℃培养箱消化10min。
(5)再加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化10min。用培养液终止消化。
(6)1500r/min离心5min，弃上清，加入培养液，将沉淀吹打成悬液，移至培养皿。
(7)在37℃、5％CO2条件下培养。24h后加少许培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次。
1.2.2揭膜贴壁法
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿角膜缘1mm处环形剪下全层角膜。
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来。
(3)内皮面贴于培养皿中，加入适量培养液，使培养液刚好覆盖组织，又不使其漂浮。
(4)在37℃、5％CO2条件下培养。24h后加少许培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次。
2结果
2.1揭膜贴壁法
培养3～5d，内皮细胞从角膜片的边缘游出，以圆形居多，形态大小维持较好，边缘清晰可见。7～10d大部分细胞开始贴壁，呈不规则多边形，单层为主，细胞体积增大。12d以后细胞铺满培养皿底部，形成单层的鹅卵石形态结构。如图1所示。
2.2双酶消化法
消化后的细胞呈圆形，悬浮于培养液中，轮廓清楚可见。24～48h有少量细胞出现贴壁，形态上改变不明显。6～8d细胞全部贴壁。出现伪足，细胞形态呈不规则，以多角形居多。9～10d细胞生长缓慢，形态变化不明显，出现少量梭形基质细胞。如图2所示。
2.3讨论
根据2016年美国眼库协会的报告，美国眼库捐赠的角膜中，近60％用于治疗角膜内皮功能障碍。通常，人CECs的平均储备足以维持一个人一生的临界屏障和泵的功能。在加速或急性内皮细胞丢失的情况下，当内皮细胞密度低于500至1000个细胞/平方毫米的阈值范围时，角膜内皮细胞失代偿和不能有效地将液体从基质中泵出，将导致基质水肿，表现为角膜混浊和视力丧失。事实上，内皮细胞的临床试验目前正在进行中，这表明培养的角膜内皮细胞是未来一种很有前途的替代方法(Fuest et al.2016)。
本试验采用揭膜贴壁法(图1)、双酶消化法(图2)对比原代细胞的获取。揭膜贴壁法在分离后弹力层时，会发生卷曲，不利于内皮细胞的游出。试验中发现，将后弹力层平铺在培养皿中，需要器械辅助，操作要迅速熟练，不当的操作及操作时间过长都可能造成角膜内皮细胞的损伤，不利于贴壁培养，因此操作者要具备熟练的取材技巧；还存在细胞生长缓慢，贴壁时间长等不足之处。优点是由于分离面介于后基膜及角膜实质最后层胶原小板的后界面之间，而成纤维细胞仅位于其前界面，可以完全避免其它细胞的污染。这与前试验者(王爱莲等2007)研究观点相似。
双酶消化法采用I型胶原酶和胰蛋白酶-EDTA进行消化。试验发现，在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA消化10～15min，可获得轮廓清晰，呈圆形的内皮细胞。操作相对简单，缩短了细胞培养周期。但本试验中也发现，9～10d细胞生长缓慢，形态变化不明显，出现少量梭形基质细胞。胰蛋白酶主要作用是使细胞间蛋白质水解，作用较强，消化过程中时间过长对细胞有损伤，时间过短不利于后弹力层附着的内皮细胞脱落。此外，出现数量不等的杂质(图3)。通常，接触抑制的破坏是通过胰蛋白酶-EDTA破坏细胞-细胞连接来解除CECs的有丝分裂阻滞(Patel et al.2009)。而研究发现，在人角膜内皮细胞(HCECs)的体外培养中，如果细胞与细胞间连接被破坏，会发生内皮-间质转化(EMT)。Zhu等(2012)研究发现，利用胰蛋白酶-EDTA破坏细胞间连接来分离HCECs的传统方法可能导致EMT，并将HCECs表型改变为成纤维样。
本试验在DMEM/F12中除添加胎牛血清外，还加入右旋糖酐、硫酸软骨素及生长因子如：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)。EGF可以促进角膜内皮细胞进入细胞周期；bFGF能加快细胞的增殖和组织损伤的修复。培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Lee et al.2006)或表皮生长因子(EGF)，这种常规方法已被证实可用于促进CEC增殖(Liu et al.2015)。试验中也发现在培养基中加入bFGF、EGF，能加快细胞的增殖，有一定的促进作用。出现的问题，与其他研究发现相似。这种常规方法会导致病理性内皮-间质转化(EMT)(Lee et al.2004)。Zhu等(2004)发现OptiMEM-I加8％胎牛血清(FBS)、20ng/mL神经生长因子(NGF)、5ng/mL表皮生长因子(EGF)、0.08％硫酸软骨素效果明显。已有研究表明，白血病抑制因子(LIF)(Zhu et al.2014)可以延迟接触抑制，在不含血清、不改变表型的情况下，用bFGF更有效地促进内皮细胞CECs生长。与本试验出现的问题相似。
体外培养角膜内皮细胞的适应和增殖能力与供体年龄呈负相关，即年龄越小其适应性和增殖能力愈好。本实验生物材料器官采样，从成年猪上获得角膜内皮细胞，其增殖能力较弱，凋亡较明显，即使加入调控的营养物质，培养的猪原代角膜内皮细胞试验效果，分化的细胞群出现的典型六边形外观形态不够鲜明。这可能与显微镜检摄像捕捉的细胞活力时间和视野偏差有关。猪角膜细胞培养的周期需要的时间7～10天。总之，培养的眼睛角膜原代内皮细胞，对于研究眼睛结构及角膜的功能，为开发利用减少人医眼科疾病患者带来光明和希望。
2.4小结
1.比较两种角膜内皮细胞培养方法，揭膜贴壁法与双酶消化法。揭膜贴壁法更适用于猪角膜原代内皮细胞的体外培养。
2.猪角膜细胞7～10d细胞贴壁，呈现鹅卵石或多边形形态。
二、猪眼角膜保存液和冻存液的研究
本试验旨在研究猪器官眼睛角膜的保存液和冻存液，在不同温度(4℃、-20℃、-196℃)及不同时间(4h、6h、8h、12h)条件下对猪角膜内皮细胞活性的影响。丰富动物器官生物材料。
1材料与方法
1.1试验材料
主要试剂及药品:
主要仪器及设备:
1.2试验方法
实验动物及采样过程同步骤一中1.2。
1.2.1猪角膜片制备及分组
取自屠宰场的新鲜猪眼用生理盐水冲洗，用青链霉素溶液和硫酸庆大霉素溶液分别浸泡5～10min。在无菌条件下，用眼科剪刀沿角膜缘1mm处环形剪下全层角膜。12只猪角膜片用于角膜内皮细胞活性检测，6只猪角膜片用于电镜观察。
将12只猪角膜片随机分为3组，每组4只猪角膜片，即：4℃保存液组、-20℃冻存液组、-196℃冻存液组。自放入保存介质开始计时，分别在保存4h，6h，8h，12h后取1只猪角膜片检测内皮细胞活性(图4)。
1.2.2猪角膜片的复温
保存到期后，-20℃冻存液组、-196℃冻存液组需进行复温。取出-20℃冻存液组、-196℃冻存液组样品放入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
1.2.3台盼蓝—茜素红联合染色检测内皮细胞活性
(1)每组取1只角膜片，用生理盐水冲洗，以内皮面向上放于载玻片上，用滤纸吸干水分。
(2)将0.4％台盼蓝染液滴于角膜内皮面上，染色1min后弃去染液，用生理盐水冲洗，滤纸吸去水分。
(2)再滴入0.2％茜素红染液，染色1.5min后弃去染液，用生理盐水冲洗，滤纸吸去水分。
(3)置于倒置显微镜下观察拍照。
1.2.4保存液及冻存液的制备
(1)保存液：DMEM/F12+右旋糖酐+硫酸软骨素+双抗(青链霉素)+胎牛血清。
(2)冻存液：DMEM/F12+胎牛血清+DMSO(过滤)。
2结果
保存液及冻存液对保存的角膜内皮细胞经过染色后，角膜的细胞形态影响见图5。
(1)4℃保存液组角膜片经台盼蓝-茜素红联合染色后，在不同的保存时间段：4h(图A)、6h(图B)、8h(图C)、12h(图D)，均可见细胞轮廓清晰，连接紧密，呈六边形或多边形，未发现核蓝染的细胞。
(2)-20℃冻存液组角膜片染色后，在4h(图E)、6h(图F)、8h(图G)、12h(图H)时间段均发现不同程度蓝染的细胞核(白色箭头)，其中6h(图F)时，程度明显，CECs轮廓不清晰；4h(图E)、8h(图G)次之；12h(图H)有少量核蓝染。
(3)-196℃冻存液组角膜片染色后，在4h(图I)、6h(图J)、8h(图K)、12h(图L)时间段未发现核蓝染的细胞，细胞呈六边形或多边形，但CECs轮廓不清晰。
3讨论
在英美国家，低温保存是最受欢迎的角膜保存方法。相比之下，在欧洲大陆，大多数供体角膜在培养基(含胎牛血清和抗生素)中保存长达34天，直到移植。
在20世纪60年代，硫酸软骨素(CS)最初是用来保存眼角膜。硫酸软骨素(CS)属于硫酸糖胺聚糖(GAG)，是角膜内皮细胞基质的主要成分之一(Schwend et al.2012)。CS是一种分子量较小的弥漫性粘弹性剂，可以均匀地覆盖在角膜内皮上。
本试验结果显示，4℃保存液组保存后CECs在不同时间段内，细胞结构完整，轮廓清晰，呈六边形或多边形，无核蓝染。已证实含CS的角膜保存液对角膜内皮细胞具有明显的保护作用(Soni et al.2015)，与本试验结果相似。CS是一种穿透性介质，具有大量负电荷，可在角膜内皮层表面积聚一层硫酸软骨素膜。抵抗组织和细胞中的自由基(Sandri etal.2016)，保护细胞免受细胞毒素的侵害。CS作为一种膜稳定剂，具有机械减阻作用，还可以对抗运输过程中机械振动引起的物理损伤(Belda et al.2005)。长期维持角膜内皮细胞的活性，减少内皮细胞的组织溶解。这与本试验结果是一致的，本试验研究细节也充分证实了该科学论点。
右旋糖酐是一种β-1,6-葡聚糖，葡萄糖侧链主要通过1,3-氧桥连接到主链。它被细菌和酵母用作能量储存物质。它是水溶性的，6％右旋糖酐水溶液的胶体渗透压相当于人体血液的胶体渗透压。此外，经常被用作血浆扩张剂，有不良反应但很少发生。
随着保存时间的延长，角膜在低渗培养基中虽然有足够的内皮细胞，但仍有肿胀的趋势。本试验中-20℃冻存液组、-196℃冻存液组保存后CECs轮廓不清晰，4℃保存液组保存后CECs，细胞结构完整，轮廓清晰。可能的原因是在冻存液中未加入右旋糖酐，引起肿胀，导致细胞边界模糊。右旋糖酐通过增加角膜储存介质中的胶体渗透压，保持高渗透压来限制水分进入基质(Jablonski et al.1998)。Hashimoto等(2010)使用右旋糖酐来防止洗涤步骤中的肿胀，以避免在没有右旋糖酐的洗涤过程中观察到的肿胀。这与本试验研究结果相似。但也有研究发现，右旋糖酐对内皮细胞具有明显的毒性作用，具有强烈的个体变异性。右旋糖酐导致内皮细胞平均每天2.06％的损失(Filip et al.2017)。
二甲基亚砜(DMSO)不仅在工业上用作有机和无机化合物的溶剂，而且在分子生物学领域中用于细胞的冷冻保存和疏水性药物的溶解。作为一种在细胞培养中用于冷冻保存的化合物，具有多重的冷冻保护作用。在液体状态下，DMSO起缓冲作用，类似于PBS。DMSO与PBS的区别在于溶液的冻结。通常在含血清的培养基中使用含有10％二甲基亚砜(DMSO)的冷冻溶液来保存角膜内皮细胞(Vianna et al.2016)。尽管DMSO常被用作低温保护剂，但它对细胞功能、细胞周期以及某些细胞类型的凋亡也有多种影响，是一种已知的细胞分化剂。
本试验中，-196℃冻存液组染色后细胞虽出现轮廓不清晰，边界模糊的现象，但未发现细胞核蓝染。DMSO增加了细胞溶胶的黏度，从而导致没有或至少更小的冰晶形成，并减少了细胞在冷冻过程中的脱水，这一切都减少了对细胞的伤害，从而使细胞得以存活并保护细胞外基质(Wood et al.2014)。Egli等(2003)研究表明，在DMSO存在下冷冻时，新生小鼠股骨中的细胞仍保持活力。10％DMSO在Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM)中对肌腱细胞活力也有类似的积极作用(Sass et al.2009)，这与本试验结果相似。Hochstrat等(2019)研究报道，在-20℃条件下，DMSO冷冻保存小鼠肌腱组织具有保存细胞活力和维持生物力学特性的优点。而本试验中，-20℃冻存液组保存的角膜染色后，出现不同程度的细胞损伤，核蓝染，细胞轮廓不清晰的现象。这与本试验结果不一致。可能的原因是细胞类型特异性和物种特异性对低温保存诱导损伤的敏感性存在差异以及细胞对不同浓度的冷冻保护剂有不同的反应。
台盼蓝突出了受损细胞的细胞核，在未染色计数中这些细胞核通常无受损现象。茜素红S通过染色Descemet的细胞膜，明显增强了细胞边缘和受损细胞的可见性，有利于内皮细胞密度的评估和角膜内皮形态学特征的分析。虽然染色增强了细胞边缘的可见性，但未染色计数与染色计数相比，内皮细胞密度的结果并无明显差异(Wenzel et al.2019)。未染色计数的明显好处是，在整个实验过程中可进行多次随访检查，而染色物质通常是细胞毒性物质，并终止观察期。然而，染色计数仍是评价内皮细胞形态特征的重要方法。
综上所述，硫酸软骨素、右旋糖酐作为保护剂和消肿剂用于眼角膜的保存，但右旋糖酐对内皮细胞有副作用，应根据实际情况使用。二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂，其效果受细胞类型及浓度影响。4℃保存液效果优于-20℃和-196℃两组冻存液，适合用于猪供体眼睛角膜的保存与医用试验。
4小结
1)硫酸软骨素作为保护剂，可用于猪供体眼睛角膜的保存；右旋糖酐对内皮细胞有副作用，应根据实际情况使用；DMSO的保护效果受细胞类型及浓度的影响。
2)试验结果4℃保存液环境温度适合用于猪眼睛角膜活性的保存。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (4)
1.一种猪眼睛角膜的培养及保存方法，其特征在于：步骤如下：
一、猪眼睛角膜内皮原代细胞培养
将离体的新鲜猪眼球迅速依次放入含有庆大霉素、青链霉素的磷酸盐缓冲液中进行消毒，集样瓶中低温0～4℃保存，在60～120min内通过双酶消化法或者揭膜贴壁法进行细胞培养；
双酶消化法：
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿猪眼球角膜缘1mm处环形剪下全层角膜；
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来；
(3)将剥离的Descemet's膜剪成1mm×1mm的组织块；
(4)加入胶原酶I，在37℃培养箱消化10min；
(5)再加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化10min；用培养液终止消化；
(6)1500r/min离心5min，弃上清，加入培养液，将沉淀吹打成悬液，移至培养皿；
(7)在37℃、5％CO2条件下培养；24h后加培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次，即得猪眼睛角膜内皮原代细胞；
揭膜贴壁法：
(1)在无菌条件下，用眼科剪沿猪眼球角膜缘1mm处环形剪下全层角膜；
(2)使用镊子将角膜内皮连同Descemet's膜一起剥离下来；
(3)内皮面贴于培养皿中，加入培养液，使培养液刚好覆盖组织，又不使其漂浮；
(4)在37℃、5％CO2条件下培养；24h后加培养液，72h后第一次换液，以后隔日换液1次，即得猪眼睛角膜内皮原代细胞；
二、猪眼角膜保存和冻存
将步骤一得到的猪眼睛角膜内皮原代细胞于4℃保存于保存液中，保存6～12h；
其中，所述保存液的组成为：DMEM/F12+右旋糖酐+硫酸软骨素+双抗即青霉素、链霉素+胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的猪眼睛角膜的培养及保存方法，其特征在于：所述步骤一中含有庆大霉素的磷酸盐缓冲液为：将庆大霉素：PBS缓冲液按体积比为0.1：100混合而成的磷酸盐缓冲液，含有青链霉素的磷酸盐缓冲液为：将青链霉素：PBS缓冲液按体积比为1：100混合而成的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的猪眼睛角膜的培养及保存方法，其特征在于：所述步骤一(4)中每一颗离体的新鲜猪眼球的胶原酶I的添加量为1mL，所述步骤一(5)中每一颗离体的新鲜猪眼球的0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA的添加量为1mL。
4.根据权利要求1至3任一项所述的猪眼睛角膜的培养及保存方法，其特征在于：所述培养液为DMEM/F12培养基。
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|---|---|---|---|---|
| US20130023050A1 (en) * | 2010-02-05 | 2013-01-24 | Foundation For Biomedical Research And Innovation | Method for culture of corneal endothelial cells, process for production of corneal endothelial cell sheet for transplantation purposes, and culture kit for corneal endothelial cells |
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| CN106938059A (zh) * | 2017-04-12 | 2017-07-11 | 山东省眼科研究所 | 一种体外构建组织工程角膜内皮的方法 |
-
2021
- 2021-04-12 CN CN202110388076.6A patent/CN113249324A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US20130023050A1 (en) * | 2010-02-05 | 2013-01-24 | Foundation For Biomedical Research And Innovation | Method for culture of corneal endothelial cells, process for production of corneal endothelial cell sheet for transplantation purposes, and culture kit for corneal endothelial cells |
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| Title |
|---|
| 孙喆: "中长期保存方法对角膜内皮细胞活性的影响", 《航空航天医药》 * |
| 林宁等: "角膜器官培养中角膜厚度的变化――硫酸软骨素的作用", 《眼科研究》 * |
| 苗雨润: "树鼩角膜内皮细胞体外原代培养方法的建立", 《实验动物科学》 * |
| 贺美宁: "角膜内皮细胞体外培养模型的建立", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》 * |
| 郑邦和: "《眼科临床理论与实践》", 31 October 1998, 北京出版社 * |
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