CN113234120A - 一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于作物种子成分提取鉴定技术领域，具体涉及一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：S1、将大豆干燥成熟种子与30‑60％体积浓度的异丙醇按照100‑120mg：1ml的比例混合后振荡提取1‑1.5h，得蛋白提取液；S2、将蛋白提取液离心8‑10min，后取上清液与预冷丙酮以15:10的体积比混合，充分涡旋，随后将此混合溶液于‑20℃‑‑15℃放置；S3、10‑12h后，将混合溶液在4℃、以6000‑8,000r/min的速度离心18‑20min，将离心沉淀物自然干燥30min，获得所述大豆种子低丰度蛋白。本发明的提取方法能够优先富集低丰度蛋白质，有效消除大豆种子高丰度蛋白对低丰度蛋白的干扰，为大豆蛋白质组学、代谢组学研究提供杂质少、电泳谱带清晰、分辨率高、具有生物活性的高质量蛋白样品。
Description
技术领域
本发明属于作物种子成分提取鉴定技术领域，具体涉及一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法。
背景技术
随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅依靠基因组序列阐明生命活动的现象及本质是远远不够的。许多研究者将作物科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度、具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键步骤。
高质量蛋白质样品的制备是蛋白质组学分析过程中至关重要一步。蛋白质样品的质量直接影响蛋白质分离及质谱分析的效果。一直以来，三氯乙酸/丙酮沉淀法是蛋白质组学中制备蛋白样品的标准提取方法。由于大豆种子中含有大量的贮藏蛋白，约占种子总蛋白的70-80％，受常规提取方法的限制及检测时高丰度蛋白的遮蔽作用，现有常用蛋白提取方法很难优先富集低丰度蛋白质。
综上，如何去除掉干扰检测的高丰度蛋白，尽可能富集更多低丰度蛋白，成为大豆蛋白质组学研究的关键因素之一。
发明内容
有鉴于上述技术问题，本发明提供了一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法，包括以下步骤：
S1、将大豆成熟种子干燥，干燥的成熟种子与30-60％体积浓度的异丙醇按照100-120mg：1ml的比例混合后振荡提取1-1.5h，得蛋白提取液；
S2、将蛋白提取液在4℃、以12000-13,000r/min的速度离心8-10min，后取上清液与预冷丙酮以15:10的体积比混合，随后将此混合溶液于-20℃--15℃放置10-12h；
S3、将混合溶液在4℃、以6000-8,000r/min的速度离心18-20min，将离心沉淀物自然干燥，获得所述大豆种子低丰度蛋白。
进一步的，S1中，将干燥的成熟种子在液氮中研磨成粉后与异丙醇混合。
进一步的，S1中，提取在轨道式振荡器上提取，转速为18,500r/min。
进一步的，S3中，将所述大豆种子低丰度蛋白重悬于裂解缓冲液，充分混合直至沉淀完全溶解，于-80℃保存。
更进一步的，所述裂解缓冲液含有9mol/L的尿素，体积百分含量1％的CHAPS，体积百分含量0.5％的IPG缓冲液和质量百分含量1％的二硫苏糖醇。
更进一步的，所述IPG缓冲液pH4-7。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
高质量蛋白质样品的制备是蛋白质组学分析过程中至关重要一步。蛋白质样品的质量直接影响蛋白质分离及质谱分析的效果。一直以来，三氯乙酸/丙酮沉淀法是蛋白质组学中制备蛋白样品的标准提取方法。由于大豆种子中含有大量的贮藏蛋白，约占种子总蛋白的70-80％，且受常规提取方法的限制及检测时高丰度蛋白的遮蔽作用，因此如何去除掉干扰检测的高丰度蛋白，尽可能富集更多低丰度蛋白，成为大豆蛋白质组学研究的关键因素之一。此外，含量较低的蛋白质和低分子量的蛋白酶抑制剂通常在分析前通过硫酸铵沉淀、凝胶过滤、柱层析或高效液相色谱进行纯化，这些方法通常很耗时，并且导致提纯蛋白样品的数量有限。
本发明专利能够优先富集低丰度蛋白质，有效消除大豆种子高丰度蛋白对低丰度蛋白的干扰，为大豆蛋白质组学、代谢组学研究提供杂质少、电泳谱带清晰、分辨率高、具有生物活性的高质量蛋白样品，还可为深入认识大豆低丰度蛋白的结构与功能提供重要线索，加速优质食用大豆的生物育种及加工应用进程。
附图说明
图1本发明实施例2中不同体积浓度异丙醇提取蛋白的单向凝胶电泳图。
图2本发明实施例3中不同体积浓度异丙醇提取蛋白的双向凝胶电泳图。
图3本发明实施例3中40％体积浓度异丙醇提取蛋白的双向凝胶电泳图以及用于质谱分析的蛋白点。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
大豆种子低丰度蛋白的提取
以大豆干燥成熟种子为原料，采用异丙醇提取蛋白质，制备总蛋白提取物：使用预先冷却的研钵和研杵在液氮中研磨种子，称量500mg大豆种子粉末，并将其置于含有5mL、40％体积浓度异丙醇的离心管中。蛋白质提取在轨道式振荡器上以18,500r/min的速度进行1h。蛋白提取液在4℃、以13,000r/min的速度离心10min，取上清液置于干净的15mL玻璃管中。在上清液中加入10mL预冷丙酮，并充分涡旋，随后将此蛋白提取液放置于-20℃过夜(12h)。第二天，将样品在4℃、以8,000r/min的速度离心20min，将离心沉淀物置于室温干燥30min。将沉淀物重悬于0.5mL裂解缓冲液[所述裂解缓冲液含有9mol/L的尿素，体积百分含量1％的CHAPS，体积百分含量0.5％的IPG缓冲液和质量百分含量1％的二硫苏糖醇]，充分涡旋直至沉淀完全溶解，最后分装成小份存于-80℃备用。
实施例2
不同浓度异丙醇优先溶解低丰度大豆种子蛋白的能力
本实施例的提取方法同实施例1，区别在于，设置异丙醇体积浓度分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的八组。
为比较不同浓度异丙醇溶液优先溶解低丰度大豆种子蛋白的能力，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，凝胶浓度为15％，以恒流20mA条件开始电泳，直至电泳结束，考马斯蓝G-250染色过夜后观察蛋白质。10％和20％浓度异丙醇的蛋白提取物中含有丰富的蛋白质，包括β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白等高丰度大豆种子贮藏蛋白(图1，泳道1和泳道2)。当异丙醇浓度为30％、40％、50％和60％时，高丰度贮藏蛋白的提取量减少，低丰度蛋白的提取量显著增加(图1，泳道3、泳道4、泳道5和泳道6)。70％和80％浓度异丙醇几乎无法提取到蛋白质(图1，泳道7和泳道8)。因此，选择浓度在30％-60％之间的异丙醇，作为双向凝胶电泳对低丰度蛋白鉴定的最佳浓度。
实施例3
双向凝胶电泳及低分子量蛋白质点的胶内酶解与质谱鉴定
1、双向凝胶电泳
为了进一步用双向凝胶电泳分析和鉴定低丰度大豆种子蛋白，再次用四种不同体积浓度的异丙醇(30％、40％、50％和60％)提取大豆种子蛋白，将离心沉淀物置于室温干燥30min。将沉淀物重悬于0.5mL裂解缓冲液[所述裂解缓冲液含有9mol/L的尿素，体积百分含量1％的CHAPS，体积百分含量0.5％的IPG缓冲液和质量百分含量1％的二硫苏糖醇]，充分涡旋直至沉淀完全溶解，得到蛋白溶液。
第一向根据蛋白质等电点不同进行蛋白的分离，使用GE Healthcare公司13cm、pH4-7的线性IPG胶条进行等电聚焦电泳。使用brandford法测量蛋白样品的相对浓度，计算上样量。将蛋白溶液用水化液(含8mol/L尿素、体积百分含量2％的CHAPS、15mmol/L二硫苏糖醇、体积百分含量0.5％的等电聚焦缓冲液、体积百分含量0.002％的溴酚蓝)补充至250μL，吸取此含有蛋白样品的水化液放入标准型胶条槽中，以确保蛋白样品充分进入胶条之中。等电聚焦的电压设置为500V，1h；1,000V，1h；8,000V直至14.5KV，约6h。聚焦结束的胶条，立即进行平衡，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者夹在两层塑料薄膜间于-20℃保存，电泳前10min时取出。
第二向根据亚基分子量大小进行蛋白的分离，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将等电聚焦好的胶条分别放入平衡缓冲液I(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，6mol/L尿素，体积百分含量30％的甘油，质量百分含量2％的SDS，体积百分含量0.002％的溴酚蓝，质量百分含量1％的二硫苏糖醇)和平衡缓冲液II(50mmol/LTris-HCl，pH 8.8，6mol/L尿素，体积百分含量30％的甘油，质量百分含量2％的SDS，体积百分含量0.002％的溴酚蓝，质量百分含量2.5％的碘乙酰胺)，各在轨道式振荡器上缓慢摇晃15min。彻底倒掉或吸掉平衡缓冲液，将胶条竖在滤纸上，用滤纸吸取多余的平衡液，以免蛋白损失或损坏凝胶表面。用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在电泳缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，192mmol/L甘氨酸，质量百分含量0.1％的SDS)中，然后将胶条胶面朝向玻璃板放在12％浓度SDS-聚丙烯酰胺凝胶(18cm×16cm)上，在凝胶上方加入低熔点琼脂糖封胶液。用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与SDS-聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。放置5min，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。在电泳槽中加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用恒流5mA，待样品完全泳动出胶条，浓缩成一条线后，再加大电流至25mA，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶。将凝胶置于固定液(含体积百分含量50％的乙醇和体积百分含量10％的乙酸)中，在轨道式振荡器上缓慢摇晃过夜。第二天，先用去离子水冲洗3次，然后将凝胶置于预染色液(含体积百分含量34％的甲醇、质量百分含量17％的硫酸铵和体积百分含量3％的磷酸)中1h，之后在染色液(含体积百分含量34％的甲醇、质量百分含量17％的硫酸铵、体积百分含量3％的磷酸、质量百分含量0.066％的考马斯蓝G-250)中染色2天。利用双向电泳光密度扫描仪对凝胶进行扫描，图像用Image Master2D-Elite软件分析。
结果如图2所示：与30％(406个低丰度蛋白质点)、50％(318低丰度蛋白质点)和60％(212个低丰度蛋白质点)浓度的异丙醇相比，40％浓度的异丙醇能够提取获得出更多的低丰度蛋白质点(530个低丰度蛋白质点)。30％、50％和60％异丙醇提取的蛋白质，在一些凝胶区域内的电泳分辨率很低，并且在高分子量和低分子量区域，部分蛋白质点均呈弥散型分布。
为了确定哪种异丙醇浓度最适合蛋白质点的质谱分析，又比较了特定凝胶区域内(图2，标记为A、B、C和D)的蛋白质点分辨率。从图2的A区域可见，不同浓度异丙醇(30％、40％、50％和60％)提取的蛋白质点均具有较高的分辨率。然而，在图2的B、C和D区域内，40％异丙醇能够比其他浓度的异丙醇(30％、50％和60％)分辨出更多的蛋白质点。因此，选择40％异丙醇提取的蛋白质进行蛋白质点的质谱鉴定。
2、低分子量蛋白质点的胶内酶解与质谱鉴定
(1)蛋白质点的胶内酶解：从染色的凝胶上切下蛋白点，首先用蒸馏水洗涤以除去硫酸铵，然后用50％乙腈(含25mmol/L碳酸氢铵)洗涤以使凝胶脱色。凝胶块用100％乙腈脱水，真空干燥，然后用20μL的10μg/mL胰蛋白酶(含25mmol/L碳酸氢铵)对蛋白点进行再溶解。37℃消化过夜，产生的蛋白片段用50％乙腈和5％三氟乙酸超声提取。将提取物真空干燥，然后用50％乙腈和0.1％三氟乙酸溶解。
(2)蛋白鉴定：借助MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)技术，对双向电泳后的蛋白质胶点样本进行定性分析。利用AB SCIEX公司的4800Plus MALDL-TOF/TOF质谱仪，测定获得酶解蛋白质点的PMF(多肽质量指纹谱)，然后在数据库查询识别鉴定蛋白质。应用842.51和2211.10m/z(质荷比)条件下的胰蛋白酶自分解峰值进行质谱仪的校准。
进一步借助LC-MS/MS(液相色谱串联质谱)技术，对MALDI-TOF-MS无法识别的蛋白质胶点样本进行定性和定量分析。利用Thermo LCQ DECAXP PLUS离子阱质谱仪，对MALDI-TOF-MS后无法从数据库中搜索获得的酶解蛋白质点进行鉴定。采用反相色谱法分离蛋白，色谱柱为100mm×0.18mm BioBasic-18色谱柱，乙腈(含体积百分含量0.1％的甲酸)为流动相，乙腈含量梯度为30分钟内自5％升至40％，流量为3μL/min。Thermo LCQ DECAXP PLUS离子阱质谱仪在数据依赖模式下工作，占空比在400-1,600m/z(质荷比)范围内，通过测量扫描获得并记录三种最丰富离子的质谱，采用动态排除法以防止对相同离子的连续分析。
蛋白质鉴定是通过Mascot(http://www.matrixscience.com)搜索NCBI非冗余数据库来执行，该搜索引擎使用基于概率的评分系统。利用MALDI-TOF-MS多肽质量指纹图谱数据进行数据库检索时，使用以下参数：物种类型选择绿色植物；25ppm质量承受值；胰蛋白酶作为消化酶；允许错过1个缺口；半胱氨酸的氨基甲酸乙酯化作为固定化修饰；允许用非化学计量或不可预测的化学修饰搜索(主要是甲硫氨酸氧化，天冬氨酸和谷氨酸甲基酯酰化，N-端焦谷氨酰甲基化)。对于使用LC-MS/MS的串联质谱数据库检索，使用以下参数：物种类型选择绿色植物；1Da肽段容差；多肽带电荷为1+、2+、3+；允许最大未被酶切位点数为1；半胱氨酸碘乙酰胺化作为固定修饰；甲硫氨酸氧化及N-乙酰化作为可变修饰。
结果如图3所示，低分子量蛋白质点是从考马斯亮蓝染色的凝胶中人工挑选出来的，胰蛋白酶消化后使用MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS鉴定大部分可见的蛋白质。所有切下的蛋白质点在MALDI-TOF-MS和LC-MS/MS中均获得了高质量的谱图，说明40％异丙醇的蛋白提取方法可用于质谱分析。数据库检索后，获得了107个蛋白质点的一系列特征值，包括等电点、分子量、同源蛋白质名称、相匹配多肽数、序列匹配率、MOWSE评分、期望值和NCBI数据库注册号。
β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白是大豆种子中两个最高丰度的蛋白，然而40％异丙醇提取的蛋白质中仅含有少量的大豆球蛋白异构体(图3，蛋白质点1-14)，几乎未获得任何β-伴大豆球蛋白。凝集素是大豆中存在的抗营养蛋白，仅占蛋白质总量的5％左右，在40％异丙醇提取的蛋白质中发现了大豆凝集素(图3，蛋白质点15-24)。脱水素蛋白在大豆种子成熟和干燥过程中表达，并且仅在低温或脱水相关的环境胁迫下诱导表达，在40％异丙醇提取的蛋白质中发现了大豆脱水素蛋白(图3，蛋白质点25-33)。种子成熟蛋白仅在种子发育的后期合成，在40％异丙醇提取的蛋白质中发现了大豆种子成熟蛋白(图3，蛋白质点34-47)。应激诱导蛋白22又被称为过敏原Gly m4，是大豆种子中一种主要的过敏原，在40％异丙醇提取的蛋白质中发现了大豆种子应激诱导蛋白22(图3，蛋白质点48-53)。蛋白酶抑制剂也是大豆中的主要过敏原，一般分子量都较小，40％异丙醇导致蛋白酶抑制剂增加了数倍，共发现8个亚型A胰蛋白酶抑制剂的蛋白质点(图3，蛋白质点54-61)、9个Kunitz胰蛋白酶抑制剂的蛋白质点(图3，蛋白质点62-70)、1个Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(图3，蛋白质点71)。乙醇脱氢酶和苹果酸脱氢酶是低氧条件下成功萌发所必需的蛋白酶，仅占大豆种子总蛋白的1％左右，在40％异丙醇提取的蛋白质中发现了2个乙醇脱氢酶点(图3，蛋白质点72和73)、5个苹果酸脱氢酶点(图3，蛋白质点74-78)。超氧化物歧化酶是一种催化清除过氧化氢和分子氧的超氧化物自由基的蛋白酶，在40％异丙醇提取的蛋白质中发现了铜锌超氧化物歧化酶(图3，蛋白质点79-82)和铁超氧化物歧化酶(图3，蛋白质点83)。40％异丙醇提取蛋白凝胶上的蛋白点还包括napin型2S清蛋白前体(图3，蛋白质点84-86)、2S清蛋白(图3，蛋白质点87和88)、蛋白酶亚基(图3，蛋白质点89和90)、IIIa型膜蛋白(图3，蛋白质点91-93)、III类酸性几丁质酶(图3，蛋白质点94-97)、核苷二磷酸激酶(图3，蛋白质点98)、磷酸三糖异构酶(图3，蛋白质点99)、二氢化脱氢酶(图3，蛋白质点100)、过氧化物酶A链(图3，蛋白质点101)、乙二醛酶(图3，蛋白质点102)、二烯内酯水解酶(图3，蛋白质点103)、抗病基因编码蛋白(图3，蛋白质点104)、未定名的功能蛋白(图3，蛋白质点105-107)。此外，一些蛋白质点(图3，蛋白质点24、32、33、52、86、95、97和105)MOWSE评分较低，这可能是由于样品中存在杂质或双向凝胶上的蛋白质含量较低所致。
综上，本发明的提取方法能够优先富集低丰度蛋白质，有效消除大豆种子高丰度蛋白对低丰度蛋白的干扰，为大豆蛋白质组学、代谢组学研究提供杂质少、电泳谱带清晰、分辨率高、具有生物活性的高质量蛋白样品。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (6)
1.一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将大豆成熟种子干燥，干燥的成熟种子与30-60％体积浓度的异丙醇按照100-120mg：1ml的比例混合后振荡提取1-1.5h，得蛋白提取液；
S2、将蛋白提取液在4℃、以12000-13,000r/min的速度离心8-10min，后取上清液与预冷丙酮以15:10的体积比混合，随后将此混合溶液于-20℃--15℃放置10-12h；
S3、将混合溶液在4℃、以6000-8,000r/min的速度离心18-20min，将离心沉淀物自然干燥，获得所述大豆种子低丰度蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法，其特征在于，S1中，将干燥的成熟种子在液氮中研磨成粉后与异丙醇混合。
3.根据权利要求1所述的一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法，其特征在于，S1中，提取在轨道式振荡器上提取，转速为18,500r/min。
4.根据权利要求1所述的一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法，其特征在于，S3中，将所述大豆种子低丰度蛋白重悬于裂解缓冲液，充分混合直至沉淀完全溶解，于-80℃保存。
5.根据权利要求4所述的一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液含有9mol/L的尿素，体积百分含量1％的CHAPS，体积百分含量0.5％的IPG缓冲液和质量百分含量1％的二硫苏糖醇。
6.根据权利要求5所述的一种高效提取大豆种子低丰度蛋白的方法，其特征在于，所述IPG缓冲液pH4-7。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210810 |
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