CN113227843A - 低放大率暗场显微镜下的可扩增纳米颗粒增强的定量散射测定 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于产生暗场图像的低放大率暗场显微镜系统和方法。所述方法包含：将生物样本转移到样品板的表面；以及使用选自以下的一个或多个预处理步骤对所述生物样本进行预处理：(1)使用加热装置加热所述生物样本；(2)使用超声换能器和超声发生器施加超声能量；以及(3)用金属纳米颗粒掺杂所述生物样本。在预处理之后，所述方法包含使用暗场显微镜对所述样品板上的所关注区域所述生物样本进行成像，以生成所述生物样本的暗场图像。

Description

低放大率暗场显微镜下的可扩增纳米颗粒增强的定量散射 测定

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年12月31日提交的美国临时专利申请第62/787,003号的优先权，所述美国临时专利申请以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

纳米材料的纳米级提供了与生物分子相当的大小，从而改善了其之间的相互作用，因此在健康问题和生物研究方面具有巨大潜力。由于其物理化学特性，金纳米颗粒被完全开发为体外和体内两者的治疗剂和诊断剂。在开发用于无创和靶向肿瘤诊断和治疗的基于金纳米颗粒的生物传感器方面已经做出大量努力。然而，转化临床应用很少，并且受到在灵敏度与可用性之间进行权衡的影响。

基于暗场显微镜的纳米颗粒定量测定类似地受到影响。例如，基于暗场显微镜的纳米颗粒定量测定受到操作复杂性的影响，因为其不可避免地涉及密集的手动对焦调节和定位，这需要有经验的操作者并且费时。另外地，高放大率下的有限视图区域使得难以观察所有所关注区域(ROI)，并且通常手动选择ROI内的多个视图进行平均，这会引入人为偏差。在低放大率暗场测定中，使用低功率物镜也存在定量有关问题。例如，大视图区域会引起缺陷、凹痕和划痕，这会干扰合成图像并且降低信噪比(SNR)。

当前，需要改进现有的基于暗场显微镜的纳米颗粒定量测定系统，并且具体地，需要开发新技术来提高灵敏度和减少不均匀性偏差。

发明内容

本公开解决了常规的低放大率暗场测定(LMDFA)系统和方法的上文所提到的缺点。在一些实施例中，本公开包含一个或多个预处理步骤(如加热、超声)和/或信号扩增方案以改善成像期间生物样本在样品板上的均匀分布和灵敏度。

一些实施例提供了一种用于使用低放大率暗场显微镜系统来产生生物样本的暗场图像的过程。具体地，所述过程包含：将生物样本转移到样品板的表面；以及使用加热装置以足以增强所述生物样本对所述样品板的结合亲和力的量加热所述生物样本。另外地或可替代地，以足以增强所述生物样本对所述样品板的结合亲和力的量将超声能量施加到所述生物样本。使用通信耦接到超声发生器的超声换能器施加超声能量。所述方法还包含使用暗场显微镜对所述样品板上的所述生物样本的所关注区域进行成像，以生成所述生物样本的暗场图像。

本公开的一些实施例进一步包含对所述生物样本的所述暗场图像进行处理以确定所述所关注区域内的所述生物样本的量。

在另外的实施例中，将所述生物样本转移到所述样品板的所述表面进一步包含用一种或多种金属纳米颗粒掺杂所述生物样本以改善所述暗场图像生成期间的信号扩增。具体地，所述一种或多种金属纳米颗粒掺杂剂包括：第一蛋白质，所述第一蛋白质用第一金属纳米棒修饰；第二蛋白质，所述第二蛋白质用第二金属纳米棒修饰；以及接头，所述接头将所述第一蛋白质耦接到所述第二蛋白质。所述第一蛋白质和所述第二蛋白质可以包括链霉亲和素，并且所述第一金属纳米棒和所述第二金属纳米棒包括金纳米棒。所述接头可以包括通过官能化聚乙二醇耦接的双生物素。

当结合附图审阅本发明的优选实施例的以下详细描述时，本发明的这些和其它优点和特征将变得更加明显。

附图说明

当考虑对本公开的当前实施例和除上文所阐述的那些特征、方面和优点之外的特征、方面和优点进行以下详细描述时，将更好地理解本公开的当前实施例并且除上文所阐述的那些特征、方面和优点之外的特征、方面和优点将变得显而易见。此种详细描述参考以下附图，其中：

图1是根据本公开的暗场显微镜系统的框图。

图2是根据本公开的预处理装置的示意性图示。

图3是根据本公开的使用暗场显微镜系统获取的灵敏度和均匀性增强的暗场测定的示意性图示。

图4是在预处理步骤之前和之后使用10倍放大率、4倍放大率下的暗场显微镜系统和快速傅立叶变换(FFT)图像获取的暗场图像。

图5(a-h)展示了各种处理效果，包含：a)直接结合测定的示意性图表；b)超声处理引起的应答和方差和的变化；c)夹心结合测定的示意性图表；d、e)分别由超声和热量引起的应答变化；f)纳米颗粒定量测定的示意性图表；g、h)相较于未经处理的测定，对颗粒浓度的应答的线性度和批内CV。

图6(a-b)展示了处理对外泌体固定化的影响，包含：a)在未进行处理的情况下和b)在进行了处理的情况下的外泌体的AFM图像。在底部处的粒度分布图来自对AFM进行的颗粒分析。左角上的插图是外泌体的SEM图像。

图7(a-f)是建模数据和模拟，包含：a)用于信号扩增的模拟方案；b)颗粒在650nm处的散射强度对距离；c)颗粒的波长扫描对距离；d)颗粒的所有波长的散射强度之和对距离；e)用于纳米颗粒簇团的模拟方案；f)颗粒的散射强度对数量。

图8(a-g)提供了信号扩增方案和成像数据，包含：a)信号扩增方案；b)未连接的和已连接的颗粒溶液的UV-IR吸收光谱；c、d)650nm处的UV-IR吸收光谱和强度对接头浓度；e)未连接的和已连接的AuNR的SEM图像；f、g)经扩增的LMDFA方案和应答比较。

具体实施方式

在详细地解释本公开的任何实施例之前，应当理解，本公开在其应用方面不限于以下描述中阐述的或以下附图中展示的构造细节和组件布置。本公开能够具有其它实施例并且能够以各种方式实践或进行。而且，应当理解，本文所使用的措辞和术语是出于说明的目的，而不应当被视为是限制性的。本文中对“包含”、“包括”或“具有”及其在此变化的使用意在涵盖其后列出的项及其等同物以及另外的项。除非另有规定或限制，否则术语“安装”、“连接”、“支撑”和“耦接”及其变化被广泛使用并且涵盖直接和间接安装、连接、支撑和耦接。进一步地，“连接”和“耦接”不限于物理或机械连接或耦接。

提出以下讨论以使本领域技术人员能够作出并使用本公开的实施例。对于本领域技术人员而言，对所展示的实施例的各种修改将是显而易见的，并且在不脱离本公开的实施例的情况下，可以将本文中的一般性原理应用于其它实施例和应用。因此，本公开的实施例不旨在限于所示出的实施例，而是与复合本文中所公开的原理和特征的最广泛范围相一致。将参照附图来读取以下详细说明，在附图中，不同附图中的相似元件具有相似的附图标记。不一定按比例绘制的附图描绘了所选实施例并且不旨在限制本公开的实施例的范围。技术人员将认识到，本文中所提供的实例具有许多有用的替代方案并且落入本公开的实施例的范围内。

本公开解决了常规的低放大率暗场测定(LMDFA)系统和方法的上文所提到的缺点。在一些实施例中，本公开包含一个或多个预处理步骤和/或信号扩增方案以改善成像期间生物样本的均匀分布和灵敏度。

暗场显微镜系统：

参考图1，展示了根据本公开的实施例的可以产生暗场图像的暗场显微镜系统100的示例框图。通常，暗场显微镜系统100包含具有被配置成收纳生物样本(例如，蛋白质、抗体、纳米颗粒、外泌体、细胞等)的表面的样品板102、被配置成具有用于处理生物样本的一个或多个预处理装置或步骤的预处理站104以及被配置成产生生物样本的所关注区域的暗场图像的暗场显微镜106。

在一些方面，预处理站104包含被配置成将热量从热源传递到生物样本和样品板102的加热装置108。另外地或可替代地，预处理站104可以包含被配置成将超声能量施加到生物样本和样品板102的超声装置110。加热装置104和超声装置110可以分别以足以增强生物样本对样品板102的结合亲和力和所述生物样本在所述样品板上的均匀分布的量施加热和超声能量。

在一些实施例中，暗场显微镜系统100包含通信耦接到暗场显微镜108、加热装置108和/或超声装置110的一个或多个控制器112。控制器112包含一个或多个处理器、存储器和存储在其中的软件，以用于控制加热装置108、超声装置110和暗场显微镜106以执行和实施本文中所描述的处理任务和方法。

在一些实施例中，样品板102可以包含耦接到样品板102上的表面的结合培养基，所述结合培养基用于促进将生物样本粘附到样品板102的表面。例如，结合培养基可以与分散在样品板102的整个表面上的多个样品装载点结合，或与样品板102的整个表面结合。用于本公开中的适合的结合培养基包含促进将生物样本例如通过共价键、离子键、氢键、极性键和其组合粘附到样品板102的表面的那些结合培养基。

图2描绘了预处理站104的示例性布置。预处理站104包含加热装置108和超声装置110。在一些实施例中，预处理站104包含具有底表面114和从所述底表面纵向突出的一个或多个侧壁(例如，114a和114b)的壳体113。壳体113可以被配置成收纳促进将热量从加热装置108传递到生物样本和样品板102的流体介质116(例如，水)。在一些实施例中，预处理站104包含被配置成收纳样品板102的样品保持器118。样品保持器118可以耦接到壳体113，使得样品保持器118的至少一部分浸没在流体介质116内以促进热量传递到样品板102和生物样本。如本文中所使用的，术语“部分”以其普通意义使用，是指但不限于整体的至少一部分，并且涵盖事物的量、部分或件(例如，样品保持器118的量或部分)。

在一些实施例中，加热装置108包含被配置成将热量传递到流体介质116的一个或多个热源120。热源120可以如图2中所展示的耦接到壳体113的外表面，或者直接耦接到以下中一个或多个：样品保持器118和/或样品板102。适于在预处理站104使用的热源120的非限制性实例包含但不限于通信耦接到控制器112(例如，具有2通道128V继电器开关的Mega2560控制器板)的加热带。

温度传感器122(如热电偶)可以用于监测壳体113中的流体介质116的温度。在一些实施例中，控制器112通信耦接到热源120和温度传感器122。控制器112可以被编程成基于从温度传感器122获得的测量值来调节流体介质116的温度。例如，控制器112可以调节流体介质116的温度以维持期望的设定点温度或执行预先编程的温度斜坡函数(例如，在预处理步骤的持续时间内增加或降低流体介质116的温度)。

在一些非限制性实例中，控制器112可以调控流体介质116的温度以将温度维持介于25摄氏度到75摄氏度之间或者将温度维持介于30摄氏度到45摄氏度之间。在一些实施例中，控制器112被编程成在预先选择的持续时间(例如，30秒、或1分钟、或2分钟、或3分钟、或4分钟、或5分钟、或10分钟、或15分钟、或30分钟、或1小时、或1天以及其之间的时间)内加热生物样本。

返回参考图2，预处理站104进一步包含超声装置110，所述超声装置包含被配置成生成超声能量的超声发生器124和被配置成将超声能量引导到生物样本和样品板102处的超声换能器126。在一些实施例中，超声换能器126耦接到壳体113的外表面。超声装置110可以包含通信耦接到超声发生器124和超声换能器126的控制器112。控制器112包含存储在其中的编程以调节所施加的超声能量的量和/或调控施加到生物样本和样品板102的超声能量的持续时间。控制器112可以控制或调控超声换能器126以连续地或间歇地发射超声能量。在一些非限制性实例中，控制器112可以调控超声换能器126以在30秒、或1分钟、或2分钟、或3分钟、或4分钟、或5分钟、或10分钟、或15分钟、或30分钟、或1小时、或1天以及其之间的时间的持续时间内施加超声能量。在其它非限制性实例中，控制器112可以调控超声换能器126以在超声能量的每个相应脉冲之间实施用户指定暂停，如1秒、或5秒、或10秒、或20秒、或30秒、或更长的贯穿施加超声能量的持续时间始终的暂停。

返回参考图1，预处理站104可以任选地进一步包含用一种或多种金属纳米颗粒掺杂样品板102上的生物样本以在暗场成像期间增强信号。在一个非限制性实例中，所述一种或多种金属纳米颗粒包含：第一蛋白质，所述第一蛋白质用第一金属纳米棒修饰；第二蛋白质，所述第二蛋白质用第二金属纳米棒修饰；以及接头，所述接头将所述第一蛋白质耦接到所述第二蛋白质。在一个非限制性实例中，第一和第二蛋白质包括用金纳米棒修饰的链霉亲和素，并且接头包括双生物素官能化聚乙二醇。

在预处理之后，样品板102可以被转移到暗场显微镜106以进行成像。暗场显微镜106可以包含配备有物镜(例如，10倍放大率、4倍放大率或更少)和暗场聚光镜(例如，1.2<NA<1.43)的倒置显微镜(例如，TiS Eclipse；尼康公司(Nikon))。样品板102可以被收纳在可在X-Y-Z方向上移动的机动化平台上。光源(如来自100W卤素灯的白光)可以用于将光照射在生物样本上。可以用数码相机(如尼康公司的DS-Ri2)获取散射光以生成暗场彩色图像的数据。

在一些实施例中，可以使用机动化载物台和可以存储在控制器112中的图像拼接函数对样品板102上的所有样品点进行成像。适合的图像拼接函数可以包含例如尼康公司的NIS-Elements。可以使用DarkScatterMaster(DSM)算法对所关注区域内的生物样本的量进行图像处理和定量。在一个非限制性实例中，DSM算法可以配置有可以存储在控制器112中的以下软件输入参数：轮廓阈值(Ct)＝253.020，中心标度(S)＝0.8，类型＝红色，低(Lt)/高(Ht)定量极限：0/62。在另一个非限制性实例中，检测极限(LOD)和定量极限(LOQ)分别被定义为测定空白的标准偏差的3倍和10倍。根据所指示样品的六个复制品评估测定内和测定间变异系数(CV)。用GraphPad Prism、Origin 2017和Microsoft Excel生成图表。

实例

以下实例详细阐述了暗场显微镜系统100可以用于生成生物样本的暗场图像并且定量标识暗场图像中的所关注区域内的生物样本的量的方式。以下实例将使本领域技术人员能够更容易地理解其原理。以下实例以说明的方式呈现，并且不意指以任何方式进行限制。

对金纳米棒(AuNR)进行的抗体修饰。

链霉亲和素官能化纳米棒AuNR-AV购自Nanopartz(CZ12-25-650-NEUT-50，5.1×10¹²/mL)。抗体和AuNR的耦接遵循以下程序：将40μLAuNR与20μL PBS缓冲液和20μL生物素化抗体溶液(0.5mg/ml)混合，并在室温下摇动3小时(h)以完成耦接过程。然后，将混合溶液洗涤3次：以6000rpm离心10分钟(min)；去除上清液；用200μL PBS缓冲液溶解沉降物。最后，将抗体耦接的AuNR重新悬浮于200μL PBS缓冲液中，并在使用前在4℃下储存。

测定过程

蛋白A/G和通过专有疏水掩膜图案化的胺基官能化载玻片购自Arrayit公司(Arrayit Inc.)(美国森尼韦尔市)，其具有192个样品装载点。将蛋白A/G以1.1×10¹⁰个蛋白质/mm²的恒定密度(其是过量的)固定化为靶蛋白。表面被设计成结合人免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和所有类型的总IgG。通过每个点装载1μL抗体溶液(0.05mg/mL)并在4℃下温育过夜来进行表面抗体的固定。每个点添加1μL无蛋白质Pierce阻断缓冲液(美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))以在室温下阻断表面游离位点1小时。然后，每个点装载1μL靶溶液样品(血清或抗体)，并在4℃下温育过夜。最后，装载抗体耦接的纳米颗粒以在室温下标记靶标2小时。每次将溶液添加到载玻片上，都会进行清洁过程：真空排出先前溶液的剩余物；通过将1μL PBS装载到每个点来洗涤点；抽吸PBS。然后，将载玻片在含0.01％Tween-20的PBS(PBST，pH 7.0)中冲洗10分钟，并且然后在DI水中冲洗10分钟。在DFM下观察之前，将载玻片空气干燥。除非另有说明，否则对所有样品重复6次。

外泌体定量测定

通过专有疏水掩膜图案化的蛋白A/G官能化载玻片购自Arrayit公司(美国森尼韦尔市)，其具有192个样品装载点。将蛋白A/G以1.1×10¹⁰个蛋白质/mm²的恒定密度(其是过量的)固定化为靶蛋白。表面被设计成结合人免疫球蛋白IgGl、IgG2、IgG3、IgG4和所有类型的总IgG。通过每个点装载1μL抗体溶液(0.05mg/mL)来进行表面抗体的固定，并如上文所提到的进行加速。每个点添加1μL超级块Pierce阻断缓冲液(美国赛默飞世尔科技公司)以在室温下阻断表面游离位点1小时。然后，每个点装载1μL靶外泌体溶液样品，并在4℃下温育过夜。然后，在抽吸样品后，在室温下装载抗体耦接的纳米颗粒以标记靶标2小时。对于信号扩增，将每个点1μL的5mg/mL生物素官能化聚乙二醇(生物素-PEG-生物素，Mw：400和1000g/mol)装载到载玻片上，并在室温下温育1小时。然后每个点装载1uL的40X稀释的AuNR-AV以在冲洗载玻片之前温育1小时。每次将溶液添加到载玻片上，都会进行清洁过程：真空排出先前溶液的剩余物；通过将1μL PBS装载到每个点来洗涤点；抽吸PBS。然后，将载玻片在含0.01％Tween-20的PBS(PBST，pH 7.0)中冲洗10分钟，并且然后在DI水中冲洗10分钟。在DFM下观察之前，将载玻片空气干燥。除非另有说明，否则对所有样品重复6次。

AFM和SEM成像

在环境条件下以轻敲模式使用多模式AFM纳秒示波器IV系统(美国加利福尼亚州圣巴巴拉市的布鲁克仪器公司(Bruker Instruments))进行AFM成像。使用RTESPA-300探针(美国加利福尼亚州布鲁克纳米公司(Bruker Nano Inc.))以1.5Hz的扫描速率记录图像，谐振频率为～320kHz并且弹簧常数为～40N/m。使用在20keV下操作的扫描电子显微镜(FEINova NanoSEM 230)进行形态学研究。

模拟

用于进行计算的纳米棒靶标的直径为25nm并且高度为60nm(纵横比～2.5)。FDTD模拟通过计算散射横截面来确认邻近颗粒的增强由Lumerical FDTD Solutions来执行。由SMARTIES(可免费访问的T矩阵MATLAB代码库)进行Mie近似。使用贝克曼公司(Beckman)的DU730分光光度计测量用于进行实验拟合的UV可见吸收光谱。使用带有RF模块的有限元分析软件COMSOL Multiphysics来建模各种几何结构和条件。可以使用散射场公式在频域中对AuNR的近场和远场光学特性进行数值求解。3D模拟空间由三个球形体积组成：纳米棒、嵌入介质和完美匹配层(PML)。嵌入介质是空气。将用于进行激发的平面波插入在嵌入介质周围的PML的内部上。

LMDFA的超声和加热预处理步骤的示例性结果：

为了分析超声和加热预处理步骤的影响，使用暗场显微镜系统100获取示出颗粒分布的纳米颗粒暗场图像，并在不同放大率下在经处理的载玻片和未经处理的载玻片之间进行比较，如图3-4中所示出的。超声和加热处理后的图像示出增强的均匀性。快速傅立叶变换(FFT)是评价微观结构的均匀特性的数值技术。FFT图像映射每个空间频率处有多少能量。FFT图像的中心是频率轴的原点。FFT图像中的白色区域指示存在能量。处理后白色区域的边界越清晰，在低频率下的随机性图案越多。仅在未经处理的FFT图像中示出的对角线表明纳米颗粒的分布式区域与非分布式区域之间的间隙更尖锐。处理后更收敛的FFT图像验证了超声和热量具有解决LMDFA的低均匀性问题的潜力。

使用图2中所描述的预处理装置104进行直接结合和夹心免疫测定以单独地阐明超声和热量的影响。为了定量均匀性，采用被定义为

(其中P是以i,j作为定位符的图像中的像素强度)的方差和(σ)作为反向指示符。较低的σ指示更均匀的分布。无论测定类型如何，两种测定在超声处理后均示出较高的应答和较低的σ值(图5B和5D)，这成为超声可以增强LMDFA的灵敏度和均匀性的数值证据。热量示出类似的通过促进结合来提高灵敏度的效果(图5E)。作为副产品，LMDFA中涉及超声和热量的处理显著加快了测定。与未经处理的LMDFA和常规ELISA相比，可以实现缩短多于14倍的测定持续时间，如表1中所示出的。

表1：测定时间消耗比较

*任选用于基于接头的扩增信号扩增

另外，设计了定量纳米颗粒的直接结合测定(图5F)，旨在评价处理后的线性度和变异系数(CV)(图5G和5H)。在加速处理的情况下的优异的线性度(R²＝0.98)、可重复性(平均11％)和灵敏度(斜率)相较于未经处理的测定提倡使用LMDFA的稳定敏感的纳米颗粒定量测定。

暗场显微镜系统100可以用于定量血清和细胞培养基中的外泌体。超声是广泛接受的用于裂解细胞膜的方法。由于外泌体被与细胞相同的膜覆盖，因此在使用针对外泌体定量的处理时出现问题。超声可能会危及使用LMDFA的外泌体定量。为了评价处理前后的外泌体状态，对AFM图像和SEM图像进行了标记(图6A和6B)。来自SEM图像的计数结果示出90％的外泌体在处理后仍然存在(62对69)。因此，使用暗场显微镜系统100对外泌体进行处理和成像是可持久的。此外，来自AFM图像的颗粒分析证实了超声对外泌体的大小滤波作用。处理后对大小较小的外泌体进行滤波。其可能有益于基于外泌体的研究，因为较大的膜区域将潜在地承载更多的表面标志物。

信号扩增方案的理论建模和模拟：

本文中还公开了基于邻近纳米颗粒的信号扩增方案。为了提供理论依据，进行了数值模拟。时域有限差分(FDTD)、米氏近似(T-矩阵)和有限元方法(FEM)是计算由金属纳米颗粒进行的电磁辐射的散射的最常用方法。FDTD计算给定时刻中的场向量分量，并且傅立叶将近场解转移到频域中并通过表面或体积积分传播到远场。FDTD模拟证实了邻近纳米颗粒的散射增强，但是由于计算复杂性而难以进行大范围模拟。

米氏近似(T-矩阵)通过考虑来自球形物体的光的散射显著简化了麦克斯韦计算(Maxwell computing)。近似椭圆物体的散射是可能的，但是通常不适于具有复杂空间配置的纳米棒。FEM方法通过离散化亥姆霍兹方程来解决散射问题，这平衡了计算复杂性并且适于大范围纳米棒模拟。如图7a中所示出的，在波长为650nm的入射光下模拟了两个邻近AuNR(直径和高度：25nm和60nm)之间的不同距离。当距离达到30nm时，两个颗粒的中心处的散射强度最大化(图7b)。还模拟了波长扫描对不同距离(图7c)。所有波长的整合散射强度在距离为40nm处示出最大值。那些结果表明，为了最大化散射信号，扩增方案应接近第一和第二AuNR接近或小于30-40nm。

其成为使用如上文所描述的MW为1000(总距离～20nm)的PEG接头的依据。如(图7e)中所示出的，设计了具有模拟载玻片上的AuNR的条件的纳米颗粒簇团的扩大模拟。入射光覆盖从载玻片底部发射的全光谱，并且检测器垂直于载玻片设置以收集与暗场显微镜下类似设置的散射光。随着玻璃上纳米颗粒数量增加，散射强度增加，这揭示了使用LMDFA作为定量生物测定的理论依据。

信号扩增：

贵金属纳米颗粒能够通过表面等离子体共振增强散射。一对紧密间隔的金属纳米颗粒支持可以增强散射的“二聚体”等离子体。为了试图扩增LMDF A的信号，首先实验涉及经链霉亲和素修饰的AuNR和经生物素修饰以形成“二聚体”的连接策略。观察到二聚体结合后吸收较少，这意味着更多的散射。然而，其信号扩增有限并且涉及纳米颗粒异质修饰，这增加了翻译难度。因此，将同双功能生物素化PEG衍生物、双生物素官能化聚乙二醇(生物素-PEG-生物素)作为二聚体接头引入(图8a)。将分子量(MW)为1000Da的接头添加到链霉亲和素修饰的AuNR溶液中，吸收峰的显著强度下降(图8b)表明散射得到有效增强。通过控制接头浓度，吸收峰强度可以是可调谐的，散射也是如此(图8C和8D)。作为替代方案，对MW为400Da的相同接头进行了评价，但是线性度(0.94对0.84)和绝对斜率(0.36对0.11)均低于1000Da的接头。将基于接头的方案以逐层模式应用于LMDFA，获得了6.41倍的信号扩增(图8F和8G)。结果支持LMDFA用于更多应用，其中定量需要更高的灵敏度。

本公开已经描述了一个或多个优选实施例，并且应当了解，除了明确陈述的那些之外，许多等效、替代、变化和修改都是可能的并且在本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种使用低放大率暗场显微镜系统用于产生暗场图像的方法，所述方法包括：

将生物样本转移到样品板的表面；

使用加热装置以足以增强所述生物样本对所述样品板的结合亲和力的量加热所述样品板上的所述生物样本；

以足以增强所述生物样本对所述样品板的结合亲和力的量将超声能量施加到所述样品板上的所述生物样本的至少一部分，其中所述超声能量使用通信耦接到超声发生器的超声换能器施加到所述生物样本；以及

使用暗场显微镜对所述样品板上的所关注区域所述生物样本进行成像，以生成所述生物样本的暗场图像。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述暗场显微镜系统进一步包括处理器，所述处理器在其中存储有软件并且被编程成：

对所述暗场图像进行处理以确定所述所关注区域内的所述生物样本的量。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品板包含耦接到所述板的所述表面的结合培养基，其中所述结合培养基促进将所述生物样本粘附到所述样品板的所述表面。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述暗场显微镜系统进一步包括：

壳体，所述壳体被配置成收纳流体介质；以及

样品保持器，所述样品保持器耦接到所述壳体并且具有被配置成收纳所述样品板的表面，所述样品保持器被定位成至少部分地浸没在所述流体介质内。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述暗场显微镜系统进一步包括：

热源，所述热源被配置成将热量传递到所述流体介质；

温度传感器，所述温度传感器被配置成监测所述壳体中的所述流体介质的温度；

控制器，所述控制器通信耦接到所述热源和所述温度传感器，其中所述控制器包含存储在其中的软件并且被编程成：

接收指示所述流体介质的温度的温度信号；并且使用所述热源调节所述流体介质的温度以获得期望的设定点温度。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述控制器被编程成将所述期望的设定点温度调控为介于25摄氏度到75摄氏度之间。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述控制器被编程成将所述期望的设定点温度调控为介于30摄氏度到45摄氏度之间。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述热源耦接到所述壳体的外表面的至少一部分。

9.根据权利要求4所述的方法，其中所述流体介质包括水。

10.根据权利要求4所述的方法，其中所述暗场显微镜系统进一步包括：

控制器，所述控制器通信耦接到所述超声发生器和所述超声换能器，其中所述控制器包含存储在其中的软件并且被编程成：使用所述超声换能器和所述超声发生器将超声能量施加到所述生物样本持续一定的持续时间。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述控制器被编程成将超声能量施加到所述生物样本持续至少2分钟。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述控制器被编程成将超声能量施加到所述生物样本持续至少10分钟。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述控制器被编程成将超声能量施加到所述生物样本持续至少15分钟。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述控制器被进一步编程成：在每个相应的超声能量脉冲之间以用户指定暂停间歇地将超声能量施加到所述生物样本。

15.根据权利要求4所述的方法，其中所述超声换能器耦接到所述壳体的外表面。

16.根据权利要求1所述的方法，其中将生物样本转移到所述样品板的所述表面进一步包括用金属纳米颗粒掺杂所述生物样本。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述金属纳米颗粒包括：

第一蛋白质，所述第一蛋白质用第一金属纳米棒修饰；

第二蛋白质，所述第二蛋白质用第二金属纳米棒修饰；以及

接头，所述接头将所述第一蛋白质耦接到所述第二蛋白质。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质包括链霉亲和素。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一金属棒和所述第二金属棒包括金纳米棒。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述接头包括通过官能化聚乙二醇耦接的双生物素。

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