CN113227779A - 用于基于磁性纳米颗粒的热稳定性进行分子检测的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了使用磁性纳米颗粒(MNP)来鉴定分子的检测设备、系统和方法。本公开的实施方案包括磁性传感器(例如，磁阻传感器)，这些磁性传感器可用于检测由MNP发射的温度依赖性磁场(或磁场变化)，并且具体地讲，用于区分在不同温度下由MNP发射或不是由这些MNP发射的磁场的存在和不存在，这些不同温度被选择以利用关于这些MNP的磁性能的知识。本文所公开的实施方案可用于核酸测序，诸如脱氧核糖核酸(DNA)测序。

Description

用于基于磁性纳米颗粒的热稳定性进行分子检测的设备和 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年4月12日提交的名称为“MAGNETORESISTIVE SENSOR ELEMENTSFOR NUCLEIC ACID SEQUENCING ARRAYS AND DETECTION SCHEMES FOR NUCLEIC ACIDSEQUENCING USING MAGNETIC NANOPARTICLES WITH DIFFERENT THERMAL STABILITY”的美国临时申请No.62/833,206和2019年12月26日提交的名称为“DEVICES AND METHODS FORMOLECULE DETECTION BASED ON THERMAL STABILITIES OF MAGNETIC NANOPARTICLES”的美国非临时申请No.16/727,064的权益，这两个申请据此以引用方式并入本文以用于所有目的。
背景技术
技术领域
本公开的实施方案整体涉及使用磁阻(MR)传感器阵列进行分子检测诸如核酸测序(例如，脱氧核糖核酸(DNA)测序)的设备和方法。
相关领域的描述
当前最先进的测序系统基于荧光信号检测，并且每次运行提供200亿个读段的吞吐量(https：//www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html)。然而，实现这种性能可能需要大面积流通池、高精度自由空间成像光学器件和昂贵的高功率激光器来产生足够的荧光信号以成功检测碱基。
用于DNA测序的一类核酸测序被称为“合成测序”(SBS)。SBS涉及引物杂交的模板DNA的结合、脱氧核苷三磷酸(dNTP)的掺入以及掺入的dNTP的检测。已经采用两种方法实现了SBS吞吐量的逐渐增加，第一种方法是向外缩放，其中测序器中的流通池的大小和数量增加。该方法提高了试剂的成本和测序系统的价格，因为必须采用更高功率的激光器和高精度的纳米定位器。第二种方法涉及向内缩放，其中增加DNA测试位点的密度，使得固定大小的流动池中测序的DNA链的总数更多。为了实现向内缩放，必须采用越来越高数值孔径(NA)的透镜以在相邻荧光团之间的间距减小时将信号与相邻荧光团区分开。然而，该方法不能无限地实施，因为瑞利标准将可分辨的光源之间的距离设定为0.61λ/NA，从而将两条测序DNA链之间的最小距离约束为不小于约400nm。类似的分辨率极限适用于直接在成像阵列的顶部上(类似于手机相机)进行测序，其中迄今为止实现的最小像素尺寸为大约1μm(https：//www.ephotozine.com/article/complete-guide-to-image-sensor-pixel-size-29652)。
瑞利准则目前表示光学SBS系统的向内缩放的基本限制，这只能通过应用超分辨率成像技术(参见A.M.Sydor、K.J.Czymmek、E.M.Puchner和V.Mannella，“Super-Resolution Microscopy：From Single Molecules to Supramolecular Assemblies”Quantitative Cell Biology特刊，第25卷，第730页，2015年)来克服，并且尚未在高度复用的系统中实现。因此，由于需要构建更大的流通池和实现更昂贵的光学扫描和成像系统，光学SBS测序器的吞吐量增加和成本降低一直进展缓慢。
因此，需要克服常规装置和方法的限制的用于检测分子诸如核酸的存在的新的和改进的装置和方法。
发明内容
本概述代表本发明的非限制性实施方案。
本文公开了使用磁性纳米颗粒(MNP)以允许用MNP标记的分子被检测到的检测设备、系统和方法。本公开的实施方案涉及使用能够提供指示磁性传感器附近MNP的存在或不存在的输出的磁性传感器的各种检测设备和系统实施方案，以及被设计成确定(例如，测量或获得)指示MNP的存在的磁性传感器输出(例如，电阻、电压、电流、频率、噪声或电阻、电压、电流、频率或噪声的变化)的检测方法实施方案。本公开的实施方案整体涉及使用磁阻(MR)传感器阵列来检测分子的设备和方法。本文所公开的实施方案可用于核酸测序，诸如脱氧核糖核酸(DNA)测序。
在一些实施方案中，提供了一种使用测序设备检测分子的方法，该测序设备包括至少一个流体通道和被配置为检测该流体通道内的MNP的多个磁性传感器，该方法包括：在一轮或多轮添加中，向该至少一个流体通道添加第一多个待检测分子和第二多个待检测分子。第一多个待检测分子中的至少一些已用第一类型的MNP进行标记，其中，在第一温度范围内，由第一类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第一阈值，并且在第二温度范围内，由第一类型的MNP产生的磁场的量值小于第一阈值，其中第一温度范围低于第二温度范围。第二多个待检测分子中的至少一些已用第二类型的MNP进行标记，其中，在第一温度范围和第二温度范围内，由第二类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第二阈值，第二阈值可与第一阈值相同或不同。该方法还包括将流体通道内的温度设置为在第一温度范围内，并且在流体通道的温度在第一温度范围内时，从该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器获得输出，该输出指示第一检测到的磁场的量值。该方法还包括将流体通道内的温度设置为在第二温度范围内，并且在流体通道的温度在第二温度范围内时，从该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器获得输出，该输出指示第二检测到的磁场的量值。该方法还包括：至少部分地基于第一检测到的磁场的量值和第二检测到的磁场的量值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器是已检测到第一类型的MNP还是第二类型的MNP。
在一些实施方案中，该输出包括电阻、电压、电流、频率、噪声或电阻、电压、电流、频率或噪声的变化中的一者或多者。
在一些实施方案中，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器是已检测到第一类型的MNP还是第二类型的MNP包括：(a)响应于第一检测到的磁场的量值大于或等于第一阈值以及第二检测到的磁场的量值小于第一阈值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器已检测到第一类型的MNP，或者(b)响应于第一检测到的磁场的量值大于或等于第二阈值以及第二检测到的磁场的量值大于或等于第二阈值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器已检测到第二类型的MNP。
在一些实施方案中，第一类型的MNP的居里温度不同于第二类型的MNP的居里温度。在一些此类实施方案中，第二类型的MNP的居里温度大于第一类型的MNP的居里温度，并且该方法还包括：在向流体通道添加第一多个待检测分子和第二多个待检测分子之前，将流体通道内的温度设置为高于第一类型的MNP的居里温度和第二类型的MNP的居里温度的温度值；以及向流体通道添加第一多个待检测分子和第二多个待检测分子发生在该流体通道内的温度处于高于第一类型的MNP的居里温度和第二类型的MNP的居里温度的温度值时。在第一类型的MNP的居里温度不同于第二类型的MNP的居里温度的一些实施方案中，该方法还包括：在向流体通道添加第一多个待检测分子和第二多个待检测分子之前，将第一多个待检测分子和第二多个待检测分子的混合物的温度设置为高于第一类型的MNP的居里温度和第二类型的MNP的居里温度的温度值。
在一些实施方案中，第一类型的MNP的阻断温度不同于第二类型的MNP的阻断温度。
在一些实施方案中，第一类型的MNP和第二类型的MNP中的每一种通过阻断温度表征，并且该方法还包括：在向流体通道添加第一多个待检测分子和第二多个待检测分子之前，将流体通道内的温度设置为高于第一类型的MNP的阻断温度和第二类型的MNP的阻断温度的温度值；以及向流体通道添加第一多个待检测分子和第二多个待检测分子发生在该流体通道内的温度处于高于第一类型的MNP的阻断温度和第二类型的MNP的阻断温度的温度值时。在一些实施方案中，第一类型的MNP和第二类型的MNP中的每一种通过阻断温度表征，并且该方法还包括：在向流体通道添加第一多个待检测分子和第二多个待检测分子之前，将第一多个待检测分子和第二多个待检测分子的混合物的温度设置为高于第一类型的MNP的阻断温度和第二类型的MNP的阻断温度两者的温度值。
在一些实施方案中，向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子和第三多个分子。在一些此类实施方案中，在第三温度范围内，由第一类型的MNP产生的磁场的量值小于第一阈值，第三温度范围高于第二温度范围，并且在第三温度范围内，由第二类型的MNP产生的磁场的量值小于第二阈值。在一些此类实施方案中，该方法还包括：向流体通道添加第三多个待检测分子，第三多个待检测分子中的至少一些用第三类型的MNP进行标记，其中，在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围内，由第三类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第三阈值；将流体通道内的温度设置为在第三温度范围内；在流体通道的温度在第三温度范围内时，获得该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器的输出，该输出指示第三检测到的磁场的量值；以及至少部分地基于第三检测到的磁场的量值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器是否已检测到第三类型的MNP。在一些此类实施方案中，至少部分地基于第三检测到的磁场的量值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器是否已检测到第三类型的MNP包括：响应于第一检测到的磁场的量值大于或等于第三阈值，以及第二检测到的磁场的量值大于或等于第三阈值，以及第三检测到的磁场的量值大于或等于第三阈值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器已检测到第三类型的MNP。在一些实施方案中，第一阈值、第二阈值和第三阈值中的至少两者不同。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子和第三多个分子的一些实施方案中，基本上同时向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子和第三多个分子。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子和第三多个分子的一些实施方案中，第三类型的MNP的居里温度高于第二类型的MNP的居里温度，第二类型的MNP的居里温度高于第一类型的MNP的居里温度。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子和第三多个分子的一些实施方案中，该方法还包括：在向流体通道添加第一多个待检测分子、第二多个待检测分子和第三多个待检测分子之前，将流体通道内的温度设置为高于第一类型的MNP的居里温度、第二类型的MNP的居里温度和第三类型的MNP的居里温度的温度值；以及向流体通道添加第一多个待检测分子、第二多个待检测分子和第三多个待检测分子发生在该流体通道内的温度处于高于第一类型的MNP的居里温度、第二类型的MNP的居里温度和第三类型的MNP的居里温度的温度值时。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子和第三多个分子的一些实施方案中，第三类型的MNP的阻断温度不同于第二类型的MNP的阻断温度，并且第二类型的MNP的阻断温度不同于第一类型的MNP的阻断温度。
在一些实施方案中，向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子。在一些此类实施方案中，在第四温度范围内，由第一类型的MNP产生的磁场的量值小于第一阈值，第四温度范围高于第三温度范围；在第四温度范围内，由第二类型的MNP产生的磁场的量值小于第二阈值；并且在第四温度范围内，由第三类型的MNP产生的磁场的量值小于第三阈值。在一些此类实施方案中，该方法还包括：向流体通道添加第四多个待检测分子，第四多个待检测分子中的至少一些用第四类型的MNP进行标记，其中，在第一温度范围、第二温度范围、第三温度范围和第四温度范围内，由第四类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第四阈值；将流体通道内的温度设置为在第四温度范围内；在流体通道的温度在第四温度范围内时，获得该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器的输出，该输出指示第四检测到的磁场的量值；以及至少部分地基于第四检测到的磁场的量值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器是否已检测到第四类型的MNP。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子的一些实施方案中，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器是否已检测到第四类型的MNP包括：响应于第一检测到的磁场的量值大于或等于第四阈值，以及第二检测到的磁场的量值大于或等于第四阈值，以及第三检测到的磁场的量值大于或等于第四阈值，以及第四检测到的磁场的量值大于或等于第四阈值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器已检测到第四类型的MNP。在一些此类实施方案中，第一阈值、第二阈值、第三阈值和第四阈值中的两者或更多者不同。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子的一些实施方案中，基本上同时向流体通道添加第一多个待检测分子、第二多个待检测分子、第三多个待检测分子和第四多个待检测分子。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子的一些实施方案中，第四类型的MNP的居里温度高于第三类型的MNP的居里温度，第三类型的MNP的居里温度高于第二类型的MNP的居里温度，第二类型的MNP的居里温度高于第一类型的MNP的居里温度。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子的一些实施方案中，该方法还包括：在向流体通道添加第一多个待检测分子、第二多个待检测分子、第三多个待检测分子和第四多个待检测分子之前，将流体通道内的温度设置为高于第一类型的MNP的居里温度、第二类型的MNP的居里温度、第三类型的MNP的居里温度和第四类型的MNP的居里温度的温度值；以及向流体通道添加第一多个待检测分子、第二多个待检测分子、第三多个待检测分子和第四多个待检测分子发生在该流体通道内的温度处于高于第一类型的MNP的居里温度、第二类型的MNP的居里温度、第三类型的MNP的居里温度的和第四类型的MNP的居里温度的温度值时。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子的一些实施方案中，第四类型的MNP的阻断温度不同于第三类型的MNP的阻断温度，第三类型的MNP的阻断温度不同于第二类型的MNP的阻断温度，并且第二类型的MNP的阻断温度不同于第一类型的MNP的阻断温度。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子的一些实施方案中，在第四温度范围内，由第一类型的MNP产生的磁场的量值小于第一阈值，第四温度范围高于第三温度范围；在第四温度范围内，由第二类型的MNP产生的磁场的量值小于第二阈值；并且在第四温度范围内，由第三类型的MNP产生的磁场的量值小于第三阈值。在一些此类实施方案中，该方法还包括：向流体通道添加第四未标记的多个待检测分子；将流体通道内的温度设置为在第四温度范围内；在流体通道的温度在第四温度范围内时，获得该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器的输出，该输出指示第四检测到的磁场的量值；以及响应于第四检测到的磁场的量值小于第一阈值、小于第二阈值以及小于第三阈值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器未检测到第一类型的MNP、第二类型的MNP或第三类型的MNP中的任一者。
在向流体通道添加第一多个分子、第二多个分子、第三多个分子和第四多个分子的一些实施方案中，在第四温度范围内，由第一类型的MNP产生的磁场的量值小于第一阈值，第四温度范围高于第三温度范围；在第四温度范围内，由第二类型的MNP产生的磁场的量值小于第二阈值；并且在第四温度范围内，由第三类型的MNP产生的磁场的量值小于第三阈值。在一些此类实施方案中，该方法还包括：向流体通道添加第四未标记的多个待检测分子；将流体通道内的温度设置为在第四温度范围内；在流体通道的温度在第四温度范围内时，获得该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器的输出，该输出指示第四检测到的磁场的量值；以及响应于第四检测到的磁场的量值小于第一阈值、小于第二阈值以及小于第三阈值，确定该多个磁性传感器中的选定的磁性传感器已检测到第四未标记的多个分子中的一个分子。
在一些实施方案中，提供了一种用于对核酸进行测序的系统，该系统包括：(a)流体通道，该流体通道具有用于将待测序的多条核酸链附接到该流体通道的表面的多个位点；(b)温度控制设备，该温度控制设备耦接到该流体通道，以用于将该流体通道的内容物的温度设置为在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围中的任一者内，其中第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围不重叠；(c)多个磁性传感器，该多个磁性传感器被配置为在该多个位点中的每个位点处检测在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围中的每一者内由一个或多个磁性纳米颗粒(MNP)发射的磁场；和(d)至少一个处理器，该至少一个处理器耦接到这些磁性传感器和该温度控制设备并且被配置为执行至少一个机器可执行指令。在一些实施方案中，该多个磁性传感器中的至少一个磁性传感器包括磁阻(MR)传感器。在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令在被执行时使得该至少一个处理器：(i)引导温度控制设备将流体通道的内容物的温度设置为在第一温度范围内；(ii)从与该多个位点中的特定位点相关联的磁性传感器获得第一输出，第一输出指示第一检测到的磁场的量值；(iii)引导温度控制设备将流体通道的内容物的温度设置为在第二温度范围内；(iv)获得与该多个位点中的特定位点相关联的磁性传感器的第二输出，第二输出指示第二检测到的磁场的量值；(v)引导温度控制设备将流体通道的内容物的温度设置为在第三温度范围内；(vi)获得与该多个位点中的特定位点相关联的磁性传感器的第三输出，第三输出指示第三检测到的磁场的量值；以及(vii)至少部分地基于第一检测到的磁场的量值、第二检测到的磁场的量值和第三检测到的磁场的量值，确定磁性传感器是否已检测到特定类型的MNP。在一些实施方案中，第一输出、第二输出或第三输出中的至少一者包括电阻、电压、电流、频率、噪声或电阻、电压、电流、频率或噪声的变化中的一者或多者。在一些实施方案中，第一温度范围低于第二温度范围，并且第二温度范围低于第三温度范围。
在一些实施方案中，流体通道包括结构，该结构包括用于将该待测序的多条核酸链附接到流体通道的表面的该多个位点。在一些此类实施方案中，该结构包括腔或脊。
在一些实施方案中，该至少一个机器可执行指令在被执行时使得该至少一个处理器通过以下中的一者或多者来确定磁性传感器是否已检测到特定类型的MNP：(a)响应于第一检测到的磁场的量值满足或超过第一阈值，以及第二检测到的磁场的量值不满足第一阈值，以及第三检测到的磁场的量值不满足第一阈值，确定磁性传感器已检测到第一类型的MNP；(b)响应于第一检测到的磁场的量值满足或超过第二阈值，第二检测到的磁场的量值满足或超过第二阈值，以及第三检测到的磁场的量值不满足第二阈值，确定磁性传感器已检测到第二类型的MNP，或者(c)响应于第一检测到的磁场的量值满足或超过第三阈值，以及第二检测到的磁场的量值满足或超过第三阈值，以及第三检测到的磁场的量值满足或超过第三阈值，确定磁性传感器已检测到第三类型的MNP。
在一些实施方案中，在由该至少一个处理器执行时，该至少一个机器可执行指令还使得该至少一个处理器：(a)引导温度控制设备将流体通道的内容物的温度设置为在第四温度范围内，第四温度范围高于第三温度范围；(b)从与该多个位点中的特定位点相关联的磁性传感器获得第四输出，第四输出指示第四检测到的磁场的量值，以及(c)响应于第一检测到的磁场的量值满足或超过第四阈值，以及第二检测到的磁场的量值满足或超过第四阈值，以及第三检测到的磁场的量值满足或超过第四阈值，以及第四检测到的磁场满足或超过第四阈值，确定磁性传感器已检测到第四类型的MNP。
在包括温度控制设备的一些实施方案中，该温度控制设备包括热传感器或微处理器中的至少一者。在包括温度控制设备的一些实施方案中，该温度控制设备包括加热器。
在一些实施方案中，提供了一种用于检测耦合到分子的磁性纳米颗粒(MNP)的系统，这些MNP通过特性温度表征，在低于该特性温度的温度下，这些MNP发射具有高于阈值的量值的磁场，并且在高于该特性温度的温度下，这些MNP不发射具有高于阈值的量值的磁场，该系统包括：(a)流体通道；(b)温度控制设备，该温度控制设备耦接到该流体通道以用于设置该流体通道的内容物的温度；(c)控制电路，该控制电路耦接到该温度控制设备并且被配置为引导该温度控制设备将该流体通道的内容物的温度设置为第一温度和第二温度，第一温度高于MNP的特性温度，并且第二温度低于MNP的特性温度；(d)磁性传感器，该磁性传感器被配置为检测由该流体通道中的一种或多种MNP发射的磁场；以及(e)检测电路，该检测电路耦接到该磁性传感器并且被配置为从该磁性传感器获得指示该磁性传感器检测到的磁场量值的输出。
在一些实施方案中，特性温度为居里温度。在一些实施方案中，特性温度为阻断温度。
在一些实施方案中，控制电路被进一步配置为：至少部分地基于磁性传感器检测到的磁场量值，确定该磁性传感器是否已检测到MNP。
在一些实施方案中，流体通道的内容物的温度小于特性温度，并且该至少一个处理器被配置为通过以下方式确定磁性传感器是否已检测到MNP：(i)将该磁性传感器检测到的磁场量值与阈值进行比较，以及(ii)响应于该磁性传感器检测到的磁场量值大于阈值，确定该磁性传感器已检测到MNP。
在一些实施方案中，流体通道的内容物的温度大于特性温度，并且该至少一个处理器被配置为通过以下方式确定磁性传感器是否已检测到MNP：(i)将该磁性传感器检测到的磁场量值与阈值进行比较，以及(ii)响应于该磁性传感器检测到的磁场量值小于阈值，确定该磁性传感器已检测到MNP。
在一些实施方案中，流体通道包括结构，并且该结构包括用于将多个未鉴定分子附接到流体通道的表面以用于进行鉴定的多个位点。在一些此类实施方案中，该结构包括腔或脊。
在一些实施方案中，温度控制设备包括热传感器或微处理器中的至少一者。在一些实施方案中，温度控制设备包括加热器。
在一些实施方案中，磁性传感器包括磁阻(MR)传感器。在一些实施方案中，该输出包括电阻、电压、电流、频率、噪声或电阻、电压、电流、频率或噪声的变化中的一者或多者。
附图说明
为了可以详细理解本公开的上述特征，参考实施方案提供了对本公开的更具体的描述，所述实施方案中的一些在附图中示出。然而，应当注意，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为限制本公开的范围，因为本公开可允许其他同等有效的实施方案。通过结合附图对某些实施方案的以下描述，本公开的目的、特征和优点将变得显而易见，其中：
图1示出了根据一些实施方案适用的示例性MNP，其具有由于磁各向异性而例示性地沿z轴线固定的磁化。
图2A示出了根据一些实施方案的适用于DNA测序的示例性顺序二元方法。
图2B示出了根据一些实施方案的适用于DNA测序的示例性方法。
图3A至图3E示出了根据一些实施方案将不同MNP类型用于核酸测序的测序操作。
图4示出了根据一些实施方案的适用于DNA测序的示例性方法。
图5A、图5B和图5C示出了根据一些实施方案的磁阻(MR)设备的基本构造以及其可如何用作磁性传感器。
图6示出了根据一些实施方案的磁性传感器的一部分。
图7A和图7B示出了根据一些实施方案适用的MR传感器的电阻。
图8A、图8B和图8C示出了根据一些实施方案的MR传感器元件的交叉点阵列架构。
图9A、图9B和图9C示出了根据一些实施方案的示例性检测设备。
图9D是示出根据一些实施方案的用于分子检测的示例性检测系统的框图。
图10是根据一些实施方案的适用于结合到检测设备中或与该检测设备一起使用的示例性加热元件的分解图。
图11示出了根据一些实施方案的可耦接到例如检测设备的底表面的加热元件的阵列。
图12A、图12B、图12C和图12D示出了根据一些实施方案的示例性检测设备的部分。
图12E示出了根据一些实施方案的用于选择磁性传感器的示例性方法。
图12F示出了根据一些实施方案的另一个示例性磁性传感器选择方法。
图13A和图13B示出了根据一些实施方案的磁性传感器和使用该磁性传感器的检测。
图14示出了根据一些实施方案的制造检测设备的方法。
图15示出了根据一些实施方案的图14的制造工艺的每个步骤的结果。
为了有助于理解，在可能的情况下，使用相同的参考标号来表示附图中共有的相同元件。可以设想是，在一个实施方案中公开的元件可以有利地用于其他实施方案而无需具体叙述。
具体实施方式
本文公开了使用磁性纳米颗粒(MNP)来鉴定分子的改进的检测设备、系统和方法。本公开的实施方案涉及使用能够检测磁性传感器附近MNP的存在或不存在的磁性传感器的各种检测设备和系统实施方案，以及被设计成确定(例如，测量或获得)指示MNP的存在的输出(例如，电阻或电阻变化)的检测方法实施方案。本公开的实施方案整体涉及使用磁阻(MR)传感器阵列来检测分子的设备和方法。例如，本文所公开的实施方案可用于核酸测序，诸如脱氧核糖核酸(DNA)测序。
具体地讲，本公开的实施方案包括磁性传感器(例如，磁阻传感器)，这些磁性传感器可用于检测由MNP发射的温度依赖性磁场(或温度依赖性磁场变化)，并且具体地讲，用于区分在不同温度下由MNP发射或不是由MNP发射的磁场的存在和不存在，这些不同温度被选择以利用关于MNP的居里温度的知识。
在以下描述中，参考本公开的实施方案。然而，应当理解的是，本公开不限于具体描述的实施方案。相反，思考以下特征和元件的任何组合(无论是否与不同实施方案相关)以实现和实践本公开。此外，尽管本公开的实施方案可以实现优于其他可能解决方案和/或优于现有技术的优点，但是否通过给定实施方案来实现特定优点不是对本公开的限制。因此，以下方面、特征、实施方案和优点仅是示例性的。同样，提及“本公开”不应理解为对本文所公开的任何发明主题的概括。
如本文所用，术语“在...上方”、“在...下方”、“在...之间”、“在...上”和其他类似术语是指一层相对于其他层的相对位置。因此，例如，设置在另一层上方或下方的一层可直接与另一层接触，或者可具有一个或多个中间层。此外，设置在层之间的一层可直接与两层接触，或者可具有一个或多个中间层。相反，“在第二层上”的第一层与第二层接触。这些术语的相对位置并非将这些层限定或限制于这些层的某向量空间取向。
术语“耦接”在本文中用来指直接连接或通过一个或多个居间元件连接的元件。例如，如下所述，线(例如，用于选择或读取来自磁性传感器的输出)可直接连接到磁性传感器，或者其可经由居间元件连接到传感器。
术语“感测”和“检测”在本文中可互换使用，用于指从物理刺激获得信息。感测和检测包括测量。
虽然本文的公开内容中的一些是在核酸测序，并且具体地讲DNA测序的上下文中提供的，但应当理解，本文的实施方案通常可用于检测磁性颗粒(例如，磁性纳米颗粒)可附接的任何类型的分子。本公开假设所附接的颗粒为磁性纳米颗粒，但此假设为示例性的并且并非旨在进行限制。可使用本文所公开的方法和检测设备来检测可由磁性纳米颗粒标记的任何分子类型。此类分子类型可为生物分子类型，诸如蛋白质、抗体等。例如，本文的公开内容可用于检测核酸(例如，在DNA测序中)。本文的公开内容还可用于检测非生物(无机或非活性)分子，诸如污染物、矿物质、化合物等。本公开的部分在核酸测序的语境中的呈现仅仅是示例性的，并非意图限制本发明的范围。
此外，虽然本文的描述集中于DNA作为示例性核酸，但所述的各种实施方案一般可应用于核酸测序。类似地，尽管SBS用于以下描述中的示例性目的，但各种实施方案不限于SBS测序方案(例如，可替代地使用动态测序)。
常规的核酸测序，诸如用于DNA测序的核酸测序，通常依赖于荧光的检测。具体地讲，用于区分样品中的不同碱基的基于荧光的技术(例如，在基于荧光的核酸测序技术中)依赖于例如由与特定类型的核苷酸相关联的检测部分产生的信号的质量。例如，常规的荧光测序技术利用可鉴定地不同的荧光部分，这些荧光部分各自附接到测序反应中利用的四种核苷酸A、T、C和G中的一种。
一种常规的DNA测序方法涉及使单链DNA(ssDNA)适应于与测序装置的固相支撑物的附接，并使用诸如聚合酶链反应的技术来扩增ssDNA的量，以产生具有短前导序列的许多DNA分子。然后可添加与短前导序列互补的寡核苷酸，使得在前导序列处存在双链DNA(dsDNA)的短区段。结合分子的双链部分是在高温下有效的合适DNA聚合酶(诸如Taq聚合酶)的引物。
然后可采用若干方法中的一种来进行测序。例如，测序可使用四种荧光标记的3′-阻断dNTP(荧光标记的双脱氧核苷酸终止子)的混合物，其中荧光标记是3′-阻断基团的一部分。荧光标记用作聚合反应的“可逆终止子”。NTP中的每种NTP由不同的标记物标记(即，A、G、C和T核苷酸中的每种核苷酸具有不同的标记物)，并且不同的标记物可通过荧光光谱法或通过其他光学手段来区分。
四种荧光标记的核苷酸前体可用于对数百万簇平行的DNA链进行测序。DNA聚合酶催化在DNA合成的顺序循环期间将荧光标记的dNTP掺入DNA模板链中。在每个测序循环中，将结合的双链DNA分子暴露于DNA聚合酶和四种荧光标记的3′-阻断NTP的混合物。聚合酶将四种dNTP之一添加到生长中的寡核苷酸链(无论哪种dNTP与ssDNA中的下一个未配对碱基互补)。然后通过在防止游离dNTP与ssDNA结合但不会高到使dsDNA去杂交的温度下进行洗涤，将未掺入的dNTP和在反应期间留下未反应或产生的其他杂质从支撑物结合的DNA附近分离。
因为四种类型的dNTP中仅有一种将被添加到寡核苷酸，而且四种荧光标记是能够区分的，所以可通过激光激发和成像来鉴定掺入的dNTP的身份。具体地讲，四个滤光器中的每一个用于确定是否发射特定波长(例如，颜色)的光。然后可将荧光标记酶促裂解以允许下一轮掺入。因为每个碱基类型可与仅一个其他碱基类型配对，所以可从掺入的dNTP的身份(其从发射光的波长获知)来知道未知ssDNA序列中的刚好配对的碱基的身份。因此，在每个循环期间直接从荧光测量来鉴定碱基。
上述方法的一个缺点是，需要复杂的光学系统来滤除不同波长的光以检测所掺入的dNTP的荧光标记物并区分不同的发射颜色。已经开发出其他方法来简化光学系统，但它们的测序较慢并且在每个测序循环内需要中间化学步骤。因此，这些方法已被引入到较小、较便宜的入门级测序系统中，但未被引入到需要快速吞吐的较高级的系统中。
本文公开了使用磁性纳米颗粒(MNP)来鉴定分子的改进的检测设备、系统和方法。本公开的实施方案涉及使用能够获得指示磁性传感器附近MNP的存在或不存在的输出的磁性传感器的各种检测设备和系统实施方案，以及被设计成确定(例如，测量或获得)指示MNP的存在的输出(例如，电阻或电阻变化)的检测方法实施方案。
如前所述，本文的公开内容可用于检测磁性颗粒(例如，MNP)可附接的任何类型的分子(例如，生物分子、有机分子、无机分子或非活性分子)。本文所公开的装置和方法使用MNP和磁性传感器来执行分子的检测，诸如在核酸测序(例如，使用SBS化学方法的DNA测序)中。具体地讲，本公开的实施方案包括磁性传感器(例如，磁阻传感器)，这些磁性传感器可用于检测由MNP发射的温度依赖性磁场(或磁场变化)，并且具体地讲，用于区分在不同温度下由MNP发射或不是由MNP发射的磁场的存在和不存在，这些不同温度被选择以利用关于MNP的居里温度的知识。公开了针对所有待检测分子使用相同MNP类型的实施方案，以及使用多种MNP类型的实施方案，每种类型标记不同的分子类型并且具有不同的居里温度。本发明所公开的实施方案允许区分不同类型的检测分子。此外，通过适当选择MNP及其居里温度以及将MNP标记的分子添加到检测设备的流体通道的温度，可减少添加到检测设备的MNP标记的分子的聚集或聚簇。
本公开的某些实施方案还包括各种检测方法以获得或确定(例如，测量)由磁性传感器附近用作标记的MNP导致的磁性传感器的输出(例如，电阻、电压、电流、频率、噪声和/或电阻、电压、电流、频率和/或噪声的变化)。然后可使用关于特定MNP标记所附接的特定分子类型(例如，在DNA测序应用中，碱基的类型)的知识以及该分子的居里温度来鉴定特定分子类型(例如，在DNA测序应用中，ssDNA链的最后配对碱基)。
MNP
适用于生物分子检测应用的MNP具有宽范围的尺寸(例如，数十至数百纳米(nm))和形状(例如，球形、立方体、锥体等)。这些颗粒中的磁性归因于材料中的交换相互作用，这些交换相互作用使材料晶格中未配对的芯电子在相同方向上对准，从而导致材料中的角动量的净力矩，其也被称为纳米颗粒的磁矩或磁化。(术语“磁矩”和“磁化”在本文中可互换使用。)MNP的磁矩(原子内源自电子的角动量和自旋的偶极矩)至少在一些温度下产生磁场，如下文进一步所述，该磁场可用于检测MNP的存在。附加的磁各向异性能量(例如，磁晶、去磁)也有助于限定MNP的磁化的稳定取向，使得当颗粒的空间取向被明确限定时，颗粒的磁化方向也被明确限定。图1示出了具有磁化的示例性MNP，该磁化由于磁各向异性而例示性地沿z轴线固定。应当理解，如果颗粒是机械旋转的，则磁化方向也是机械旋转的。
MNP的磁化是温度依赖性的，并且对于足够小的MNP，存在它们的磁性能显著变化的两个温度。第一变化发生在被称为阻断温度(表示为TB)的温度处。当纳米颗粒足够小时，其磁化可在不存在外部磁场的情况下随机地翻转方向。此时，颗粒的热能(kT)足够大于各向异性能量，使得磁化不再沿单条轴线指向。相反，磁化可在两个或更多个取向之间随机地翻转或旋转，此时MNP从铁磁性转变为被认为是超顺磁性的。(当其滞后回线的回线面积在准静态条件下测量时为零时，磁性纳米颗粒被认为是“超顺磁性的”，这在纳米颗粒核足够小以每个核仅支持一个磁域时发生，在这种情况下，这些纳米颗粒核是单畴颗粒。)
MNP的磁性能也在居里温度下或大约居里温度下变化，该居里温度表示为Tc，其大于或等于阻断温度。居里温度(有时称为铁磁转变温度)是在高于该温度时铁磁性材料失去其永磁性能并变成顺磁性的温度。铁磁性材料和顺磁性材料具有不同的固有磁矩结构，并且这些性能在材料的居里温度下改变。换句话讲，铁磁性仅在低于居里温度时出现。在高于居里温度的温度下，热能足够大以克服芯电子之间的交换相互作用并消除MNP的净力矩。因此，有序磁矩改变并且变得无序(例如，随机地取向，从而导致零净磁化)。在低于居里温度时，MNP为铁磁性的(具有自发磁化的力矩)，并且因此产生磁场，但在高于居里温度时，颗粒处于顺磁性状态并且不产生其自身的自发磁场。
本公开的发明人认识到，可利用大约阻断温度和大约居里温度下MNP磁性能的差异进行分子检测，如下文进一步详细解释的。
如本领域的普通技术人员将理解的，存在可与下文所述的系统和方法一起使用的许多合适的MNP。例如，可通过改变化合物的组分将MNP的居里温度调节为在室温和100℃之间的小范围内。例如，通过改变MNP中的铝含量已合成了具有100nm的平均直径以及在7至140℃范围内变化的居里温度的Y3Fe5-xAlxO12颗粒(参见例如，Grasset等人，“Synthesis，magnetic properties，surface modification and cytotoxicity evaluation ofY3Fe5-xAlxO12garnet submicron particles for biomedical applications”，JMMM，第234卷(2001年)，第409-418页，该文献据此全文以引用方式并入以用于所有目的)。还已通过改变钛含量合成了具有在20和90℃之间的居里温度的La1-xSrxMn1-yTiyO3颗粒(参见例如，Phuc等人，“Tuning of the Curie Temperature in La1-xSrxMn1-yTiyO3”，Journal of theKorean Physical Society，第52卷，第5期，2008年5月，第1492-1495页，该文献全文以引用方式并入本文以用于所有目的)。最后，掺杂有元素诸如锗、铒和铑的GdSi合金已示出在大约室温的范围内的居里温度，较小(大约40nm直径)的尺寸以及更规则的球形形状(参见例如，Alnasir等人，“Magnetic and magnetothermal studies of pure and dopedgadolinium silicide nanoparticles for self-controlled hyperthermiaapplications”，JMMM，第449卷(2018年)，第137-144页，该文献全文以引用方式并入本文以用于所有目的)。这些实施方案仅表示用于产生适合与本发明所公开的实施方案一起使用的MNP的可能材料的小样品，并非旨在为限制性的。本领域的技术人员将理解，具有本公开所述性能的许多MNP是存在的或可被开发而无需大量实验。此外，本领域的技术人员将理解，也可通过掺杂(例如，通过改变材料的晶体结构)来调节阻断温度。
一旦选择了MNP，就存在将MNP附接到待检测分子上并(如果适用的话)在检测后裂解MNP的多种方法。例如，MNP可附接到待检测的碱基或分子，在这种情况下，MNP可被化学裂解。又如，MNP可附接到磷酸基，在这种情况下，MNP可被例如聚合酶裂解，或者如果经由接头附接，则可通过裂解该接头来裂解MNP。
在用于核酸测序的一些实施方案中，MNP连接到核苷酸前体的含氮碱基(例如，A、C、T、G或衍生物)。在掺入核苷酸前体并通过检测设备检测后(例如，如下所述)，可从所掺入的核苷酸裂解MNP。
在一些实施方案中，MNP通过可裂解的接头附接。可裂解的接头是本领域已知的，并且已例如在美国专利7,057,026、7,414,116以及这些专利的继续申请和改进中进行了描述。在一些实施方案中，MNP通过包括烯丙基或叠氮基团的接头附接到嘧啶中的5-位或嘌呤中的7-位。在一些实施方案中，接头包括二硫化物、吲哚、Sieber基团、叔丁基Sieber基团和/或二烷氧基苄基基团。接头还可包含选自烷基(诸如，C1-6)或烷氧基(诸如，C1-6)、硝基、氰基、氟基团或具有类似性能的基团的一个或多个取代基。简而言之，接头可被水溶性膦和/或基于膦的含过渡金属的催化剂裂解。其他接头和接头裂解机制是本领域已知的。例如，包括三苯甲基基团、对烷氧基苄酯基团、对烷氧基苄酰胺基团、叔丁氧羰基(Boc)基团和基于缩醛的基团的接头可在酸性条件下被质子释放裂解剂诸如酸裂解。可使用亲硫金属(诸如，镍、银和/或汞)裂解硫缩醛或其他含硫接头。裂解保护基团也可考虑用于制备合适的接头分子。含酯和二硫化物的接头可在还原条件下裂解。包含三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的接头可在存在F离子的情况下裂解。以不影响反应混合物的其他组分的波长裂解的可光裂解的接头包括包含邻硝基苄基基团的接头。包括苄氧羰基基团的接头可被钯系催化剂裂解。
在一些实施方案中，核苷酸前体包括附接到多磷酸盐部分的MNP标记，如例如美国专利7,405,281和8,058,031中所述。简而言之，核苷酸前体包括核苷部分和3个或更多个磷酸酯基团的链，其中氧原子中的一个或多个氧原子任选地用例如S取代。标记可直接或经由接头附接到α、β、γ或更高级的磷酸酯基团(如果存在的话)。在一些实施方案中，MNP标记经由非共价接头附接到磷酸酯基团，如例如美国专利8,252,910中所述。在一些实施方案中，接头为选自以下项的烃：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基以及取代或未取代的杂环烷基；参见例如美国专利8,367,813。接头还可包括核酸链；参见例如美国专利9,464,107。
在MNP连接到磷酸酯基团的实施方案中，核苷酸前体可通过核酸聚合酶掺入新生链中，该核酸聚合酶还裂解和释放可检测的MNP。在一些实施方案中，通过裂解接头来移除MNP，例如，如美国专利9,587,275中所述。
在一些实施方案中，核苷酸前体是不可延伸的“终止子”核苷酸，即具有被阻断“终止子”基团阻断下一个核苷酸添加的3′端的核苷酸。阻断基团为可逆终止子，其可被移除以继续如本文所述的链合成过程。将可移除的阻断基团附接到核苷酸前体是本领域已知的。参见例如美国专利7,541,444、8,071,739以及这些专利的继续申请和改进。简而言之，阻断基团可包括烯丙基基团，该烯丙基基团可通过在存在膦或氮-膦配体的情况下在水溶液中与金属烯丙基络合物反应而被断裂。
检测方法
本文的一些实施方案涉及使用检测设备并利用MNP的磁性能的温度依赖性来检测检测设备的流体通道内的分子的存在(在本文中也称为纳米通道，纳米流体通道和/或微流体通道)(其示例性实施方案在例如图8A至图15的讨论中有所描述)。
在一些实施方案中，MNP以任何合适的方式(例如，如上所述)耦合到待检测分子(例如，DNA测序应用中的dNTP)。使用磁性传感器(例如，下文进一步详细描述的磁性传感器105的各种实施方案中的任一个实施方案)，检测设备然后可感测一个或多个流体通道中MNP的存在和/或不存在。通过在低于和高于在本文中称为标记待检测分子的MNP的特性温度(例如，居里温度、阻断温度或MNP的磁性能在大约该温度下改变的任何其他温度)两者的温度下执行检测，当MNP检测到磁场在低于适用特性温度的特性温度下超过阈值但在高于适用特性温度(例如，居里温度或阻断温度)的特性温度下不超过阈值时，检测设备可确定MNP存在。
在本文档中的各个点处，为了方便和简化说明，假设MNP的磁性能在大约特性温度(例如，阻断温度、居里温度等)下突然改变。然而，应当理解，MNP的磁性能在特性温度下可能不会并且不需要突然改变。例如，在低于但接近居里温度的范围内的温度下，磁化通常可随温度升高(单调地或非单调地)而减小，最终在居里温度下达到约为零的最小值。因此，应当理解，在本文所公开的各种实施方案中，当在低于特性温度(例如，居里温度或阻断温度)的温度下执行检测时，可能期望的是在低于特性温度若干度的温度下执行检测。例如，可能期望的是，当在低于居里温度的温度下执行检测时，将温度设置为居里温度的某个百分比或分数(例如，Tm＝p×Tc，其中Tm是执行检测的温度，并且0＜p＜1)。又如，可能期望的是，将温度设置在低于居里温度的指定范围内，其中在指定范围的顶端和居里温度之间存在缓冲区(例如，T1≤Tm≤T2，其中Tm是执行检测的温度，T1＜＜Tc并且T2＜Tc，并且在Tc和T2之间存在缓冲区)。目的是，基于所感测的磁性能来检测MNP是否在磁性传感器附近，并且本领域的普通技术人员将理解如何基于关于特性温度的知识、选定的MNP类型在大约特性温度的温度下的磁性能和本文的公开内容来选择执行检测的适当温度。
作为将MNP用于分子检测的具体示例，在DNA测序应用中，四种类型的核苷酸前体(A、T、C和G)中的每一种的分子可用MNP进行标记。当各个dNTP掺入存在于磁性传感器附近的流体通道内的靶DNA链中时，在特定磁性传感器处，在低于特性温度(例如，其居里温度或阻断温度)的温度下存在与MNP相关联的感测磁场并且在高于该特性温度的温度下不存在感测磁场指示：由该MNP标记的核苷酸前体已被掺入DNA链中，该DNA链由该特定磁性传感器测序和感测。相反，当特定磁性传感器未能在低于特性温度(例如，居里温度或阻断温度)的温度下检测到与MNP相关的磁场时，可以推断出由该MNP标记的核苷酸前体尚未掺入特定传感器附近的DNA链中。
以DNA测序的示例继续，存在至少两种方式来执行DNA测序：(1)使用顺序二元方法，其中一种MNP类型用于标记所有四种核苷酸前体，以及(2)使用多种可区分的MNP类型，每种MNP类型标记核苷酸前体中的不同核苷酸前体。
在顺序二元方法中，将磁性标记的核苷酸前体(各自用相同类型的MNP标记)逐个添加到检测设备(例如，添加到这种检测设备的流体通道)。在引入每种核苷酸前体之后进行检测过程，以检测该核苷酸前体是否掺入一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器附近的DNA链中。在添加被测试的MNP标记的核苷酸前体之后，将温度设置在第一范围内，该第一范围低于或高于用作磁性标记的MNP的特性(例如，居里或阻断)温度，并且磁性传感器用于检测从其附近的MNP发出的磁场。磁性传感器可通过检测例如电阻、电压、电流、频率、噪声和/或电阻、电压、电流、频率和/或噪声的变化来检测磁场，并且每个磁性传感器的输出可指示检测到的场的量值。
图2A示出了根据一些实施方案的适用于DNA测序的示例性顺序二元方法500。图2A示出了示例性方法500，该示例性方法假设利用居里温度，但应当理解，可替代地使用其他特性温度，诸如阻断温度。在502处，该方法开始。在504处，四种核苷酸前体(A、T、C和G)中的每一者的分子均由相同类型的MNP标记。然后将各自用相同MNP类型标记的不同核苷酸前体一次一种地掺入例如检测设备的流体通道中。因此，在506处，选择待测试的第一核苷酸前体。在508处，将选定的(磁性标记的)核苷酸前体添加到检测设备的流体通道。在510处，将流体通道的内容物的温度设置为低于用作磁性标记的MNP的居里温度的值。可例如使用温度控制设备(例如，加热器)来设置温度以加热流体通道的内容物。另选地或除此之外，可在核苷酸前体被添加到流体通道之前对其进行加热(或冷却)。在512处，选定的磁性传感器检测其附近的第一磁场量值(例如，假设是由流体通道内的MNP导致的)。如上所述，磁性传感器可通过检测电阻、电压、电流、频率、噪声和/或电阻、电压、电流、频率和/或噪声的变化来感测由一种或多种MNP发射的磁场。感测可在足以减少或消除瞬态效应的指定时间段内进行(例如，以提供平均值)。可记录感测磁场量值。
在514处，将流体通道的内容物的温度设置为高于用作标记的MNP的居里温度的值。可例如使用温度控制设备(例如，加热器)来设置温度以加热流体通道的内容物。另选地或除此之外，可在核苷酸前体被添加到流体通道之前对其进行加热(或冷却)。在516处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第二磁场量值(例如，如果存在的话，则假设是由流体通道内的MNP导致的)。可记录感测磁场量值。在518处，可基于在两个温度下感测到的磁场做出关于被测试的磁性标记的核苷酸前体是否已掺入该一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器附近的DNA链中的二元(是/否、I/0等)确定。如图2A的示例性方法所示，如果第一磁场量值大于阈值(例如，从磁性传感器附近的MNP预期的磁场量值)并且第二磁场量值小于阈值，然后在520处，确定在506处选择的核苷酸前体掺入与磁性传感器相关联(例如，由该磁性传感器感测)的靶DNA链中。可记录核苷酸前体本身或靶DNA链的互补碱基的种类，并且该方法在524处结束。
然而，如果在518处确定第一磁场量值不大于阈值或第二磁场量值不小于阈值，则在522处确定在测序循环期间是否存在更多待测试的核苷酸前体。如果是这样，则可从DNA子链裂解MNP，并且可以类似的方式引入和检测下一种核苷酸前体。在图2A的示例性实施方案中，该方法返回至506，其中选择另一种核苷酸前体，并重复上述过程。在522处，如果确定在当前测序循环期间不存在更多待测试的核苷酸前体，则该方法在524处结束。
虽然图2A示出了首先将流体通道的内容物的温度设置为低于居里温度的值，感测磁场，然后将温度设置为高于居里温度的值并感测磁场，但应当理解，温度设置步骤的顺序可颠倒。例如，对于第一磁场量值感测步骤514，温度可首先被设置为高于居里温度的值，并且对于第二磁场量值感测步骤510，流体通道的内容物可被冷却为低于居里温度的值。换句话讲，如果第一温度在低于居里温度的范围内，则第二温度在高于居里温度的范围内，并且如果第一温度在高于居里温度的范围内，则第二温度在低于居里温度的范围内。
此外，虽然图2A假设每种核苷酸前体由相同类型的MNP标记，但并不需要对每种核苷酸前体使用相同类型的MNP。例如，对每种核苷酸前体使用相同类型的MNP可能是方便的，但作为另外一种选择，可用不同类型的MNP来标记不同的核苷酸前体。换句话讲，两种或更多种核苷酸前体可用相同类型的MNP进行标记，或者两种或更多种核苷酸前体可用不同类型的MNP进行标记。
方法500可使用一个或多个磁性传感器来执行。应当理解，当使用多于一个磁性传感器时，518处的决定可对于不同的磁性传感器而有所不同。例如，在一些类型的SBS中，长链DNA(或来自单个供体生物体的DNA的多个长链)在测序之前被分割成较小的随机长度片段。来自相同供体的所有这些较短链是待测序的完整链的随机化子链。例如，如果完整链包括序列ATGGCTTAGCCATACCGAT，则较短链可包括例如不同的子链(例如，TGGCTT和CCATACCGA)，以及如果将多个较长链分割成子链，则较短链可包括部分或完全与其他子链重叠的子链(例如，CTTAGCCAT和ATGGCTTAGCC)。所有较短的随机化子链可同时被测序，这可能是在扩增之后。在此类应用中，应当理解，因为子链不表示相同的子序列，所以可能期望的是每个磁性传感器检测由单种MNP导致的磁场和/或磁场变化，因为子链的测序将不在子链之间协调(或同步)。例如，在单个测序循环期间，第一子链可掺入胞嘧啶，第二子链可掺入胸腺嘧啶，并且第三子链可掺入腺嘌呤。为了对较大核酸链的多个随机片段进行测序，希望在每个测序循环中确定是否掺入了每种dNTP类型以及每种dNTP类型在哪个物理位置掺入。因此，当使用图2A所示的示例性方法500时，518处的决定对于一个磁性传感器可为“是”，对于另一个磁性传感器可为“否”。因此，当对核酸(诸如DNA)的随机化子链进行测序时，可能期望的是在每个测序循环期间测试所有四种核苷酸前体，即使对于磁性传感器中的一些，218处针对第一、第二或第三测试的核苷酸前体的决定为“是”。
各种其他实施方案涉及使用多种MNP类型(例如，MNP1、2、3和4)，每种MNP类型在一定温度范围内具有例如不同的TB或Tc，该温度范围为从例如室温到高达用于不同DNA测序化学的温度(其可为大约80-100摄氏度)。关注DNA示例来举例说明，每个单独的碱基(A、T、C、G)可用不同类型的MNP进行标记(例如，用MNP 1标记碱基A，用MNP 2标记碱基C，用MNP 3标记碱基G，用MNP的4标记碱基T)，具体方法是分别标记每个碱基，然后将它们混合在一起，或以不同方式官能化每种类型的MNP，使得其对特定(例如，其指定的)碱基具有亲和力。在单次化学运行中，可将所有带标签的(磁性标记的)碱基引入微流体池(例如，下文更详细描述的检测设备的流体通道)中，其中待测序的DNA链(例如，片段)已附接在微流体池内(例如，如下文关于检测设备的讨论所述)。
因此，在一些实施方案中，不是如上所述针对每个碱基读段(测序循环)使用具有四个化学步骤的二元方法，而是可将各自具有例如不同居里温度的三种或四种不同的MNP用作磁性标记，并且它们全部可在单个化学步骤中被检测到。例如，可用不同的MNP类型标记每种类型的分子(例如，在DNA测序应用中，每种dNTP类型)，其中每种MNP类型具有不同的居里温度和/或为大约居里温度的不同温度依赖性，从而使其能够与用作磁性标记的所有其他MNP区分开。例如，在DNA测序应用中，A可用MNP1进行标记，T可用MNP2进行标记，C可用MNP3进行标记，并且G可用MNP4进行标记或保留未标记，其中MNP1、MNP2、MNP3和MNP4(如果使用的话)的居里温度全部足够不同，使得三种或四种类型的MNP可通过检测在特定温度下磁性传感器附近是否发射超过阈值的磁场(例如，其可以是MNP依赖性或温度依赖性的)来区分开。然后可同时将所有三种或四种磁性标记的核苷酸前体引入流体通道中，并且可使用检测设备的磁性传感器附近的磁场变化来鉴定哪种MNP(如果有的话)(以及因此哪种类型的碱基)已掺入在每个磁性传感器附近。已用聚合酶将待测序的靶DNA链附接到检测设备，该聚合酶用于掺入与靶链中的那些核苷酸前体互补的核苷酸前体。
由于耦合到不同核苷酸前体的不同MNP类型具有不同的居里温度，因此在不同可区分的温度下从铁磁性切换为顺磁性(或反之亦然)，因此可在单个化学步骤期间检测到所有四种碱基。例如，在一些实施方案中，第一分子类型(例如，DNA测序应用中的腺嘌呤(A))用具有第一居里温度Tc，1的第一MNP类型作为标签，第二分子类型(例如，DNA测序应用中的胞嘧啶(C))用具有第二居里温度Tc，2的第二MNP类型作为标签，第三分子类型(例如，DNA测序应用中的鸟嘌呤(G))用具有第三居里温度Tc，3的第三MNP类型作为标签；并且第四分子类型(例如，DNA测序应用中的胸腺嘧啶(T))用具有第四居里温度Tc，4的第四MNP类型作为标签。然后可通过改变流体通道的内容物的温度并使用磁性传感器在每个选定的温度下检测传感器中的每个传感器附近的磁场量值来区分四种分子类型。通过比较各种温度下的磁场量值，可确定四种MNP类型中的哪一种(如果有的话)在传感器中的每个传感器附近。
例如，假设居里温度的关系为Tc，1＜Tc，2＜Tc，3＜Tc，4。为了解释起见，进一步假设MNP的磁化与其居里温度的关系呈阶梯状，使得第一MNP类型(“MNP1”)在低于Tc，1的温度下发射量值高于第一阈值(“Th1”)的磁场并且在高于Tc，1的温度下发射量值低于第一阈值的磁场；第二MNP类型(“MNP2”)在低于Tc，2的温度下发射量值高于第二阈值(“Th2”)的磁场，并且在高于Tc，2的温度下发射量值低于第二阈值的磁场；第三MNP类型(“MNP3”)在低于Tc，3的温度下发射量值高于第三阈值(“Th3”)的磁场，并且在高于Tc，3的温度下发射量值低于第三阈值的磁场；第四MNP类型(“MNP4”)在低于Tc，4的温度下发射量值高于第四阈值(“Th4”)的磁场，并且在高于Tc，4的温度下发射量值低于第四阈值的磁场。(如上所述，与此处假设的阶梯状行为相比，磁化在约居里温度的温度下的变化可没有那么突然，在这种情况下，“在低于[居里温度]的温度下”可解释为“在低于[居里温度减去合适的缓冲区]的温度下”。类似地，“在高于[居里温度]的温度下”可解释为“在高于[居里温度加上合适的缓冲区]的温度下”。阈值可呈某种关系(例如，阈值中的两个或更多个阈值可为相同的，或者所有阈值可为相同的)，或者阈值之间可不存在关系(例如，阈值中的一些或全部可为不同的)。在DNA测序应用中，例如，可使用下表A确定MNP的种类，并因此确定用该MNP标记的所掺入的核苷酸前体(掺入靶ssDNA中的碱基)的种类：
表A
Figure BDA0003126820860000251
因此，如果在温度范围1和2内，例如由特定磁性传感器检测到的磁场的量值高于指定阈值Th2，但在范围3和4内，该量值低于该阈值，则可确定已检测到MNP类型2。因此，在示例性DNA测序应用中，所掺入的核苷酸前体是胞嘧啶(C)，并且被测序的DNA链中的最后配对碱基的种类是胞嘧啶的互补碱基，为鸟嘌呤(G)。
在每种核苷酸前体用不同MNP类型进行标记的实施方案中，每种不同MNP类型具有不同居里温度，可跳过在低于MNP的最低居里温度(上表中的范围1)的温度范围内的检测，因为如上表所示，所有MNP都发射量值超过其适用阈值的磁场。另选地，可能期望的是在范围1内执行检测，以区分已检测到在铁磁性和顺磁性之间转变的MNP的传感器和不在任何被检测分子附近(或在其附近不具有任何待检测分子)的传感器。例如，在DNA测序应用中，在范围1内获得的结果可用于确定特定磁性传感器是否在被测序的DNA链附近。因为所有的MNP都发射范围1内的磁场，所以如果特定传感器未检测到量值超过范围1内的阈值中的一个阈值的磁场，则可以推断出在可由特定传感器检测到的区域中不存在被测序的DNA链。
在一些或所有磁性传感器已在温度范围中的每个温度范围内被读取之后，可使用例如酶促或化学裂解从所掺入的磁性标记的核苷酸前体裂解MNP，如本领域中所公知的。然后可对被测序的链中的下一个未配对碱基重复该过程。对于至少DNA测序应用，该实施方案允许每个碱基读段使用单个化学步骤。
因此，适用于DNA测序应用的本文的一些实施方案涉及将各自用不同MNP类型标记的所有四种核苷酸前体同时或大致同时引入检测设备流体通道(例如，磁性传感器的流通池阵列，下文将更详细地描述)中以实现单个模板DNA碱基读段的方法。适用于此类实施方案的MNP类型在用于使核苷酸前体官能化的化学品的温度(通常为80-100摄氏度)下变为顺磁性的，并且具有不同的热稳定性，使得它们可彼此区分开。如上所述，此类MNP类型的使用允许每个碱基读段使用单个化学循环，这可显著增加测序数据收集吞吐量并减少对基因组进行测序所需的时间量。
在一些实施方案中，在超过用作磁性标记的MNP类型的最高阻断温度或居里温度的温度下，将四种核苷酸前体基本上同时引入流体通道中。在此类条件下，标记核苷酸前体的所有MNP是超顺磁性的或顺磁性的。该方法可减轻(并且理想地，消除)MNP之间的磁相互作用，该磁相互作用原本可能导致标记不同核苷酸前体的MNP的聚集或聚簇。换句话讲，只要在高于最高阻断温度或居里温度的温度下将磁性标记的核苷酸前体添加到流体通道，那么当MNP被添加到流体通道时，MNP之间将几乎不存在或不存在磁相互作用，这避免了多种MNP的聚集或聚簇，该聚集或聚簇原本可能使各种碱基的检测复杂化和/或妨碍所引入的核苷酸前体与靶DNA链的掺入。获得时间将核苷酸前体掺入靶DNA链中(例如，聚合酶掺入与DNA链的下一种未配对碱基匹配的核苷酸前体中的任一种核苷酸前体)。然后可将系统冷却到在该温度下所有所引入的MNP都是铁磁性的较低温度(例如，室温)，以开始测量(测序)循环，这可涉及任何数量的磁性检测方案，包括上文所提及的那些磁性检测方案。
在一些实施方案中，从流体通道裂解和冲洗MNP的化学步骤也在高于阻断温度或居里温度的温度下进行，也用于防止被洗掉的MNP聚集和这些MNP之间的磁相互作用。
由于MNP在选定的起始温度(例如，室温)下是铁磁性的，因此被配置为检测掺入核苷酸前体的位点处的磁场的任何磁性传感器应检测MNP，但MNP的种类可能无法确定。然而，通过将系统的温度升高至高于MNP类型中的一种的居里温度，可将该MNP类型变成顺磁性的。一旦是顺磁性的，该MNP类型将不会产生磁场，并且将不再被磁性传感器检测到。因此，在首先将系统温度升高至高于MNP1的居里温度，然后升高至MNP1和2的居里温度，最后升高至MNP1、2和3的居里温度之后进行的后续测量将看到越来越多的MNP“退出(drop out)”，并且允许测序系统区分哪种MNP以及因此哪种碱基被掺入阵列中的特定位点处。然后可进行化学步骤以裂解和冲洗MNP，并且可对靶DNA链中的下一种未配对碱基重复该过程。这里，减少了所需的化学步骤的数量以加速读取过程，这主要仅受流体通道中的局部加热/冷却时间的限制。
应当理解，如前所述，检测到磁场的温度不需要单调地升高。例如，一旦已在高于所使用的所有MNP的最高居里温度的温度下将磁性标记的核苷酸前体添加到流体通道，该温度就可被冷却至仅低于最高居里温度。一般来讲，温度可以任何选定的方式变化，以确定哪种MNP(如果有的话)正在由特定传感器进行检测。
图2B示出了根据一些实施方案的适用于DNA测序的示例性方法550，其中所有四种磁性标记的核苷酸前体在同时(或基本上同时)被添加到检测设备的流体通道。图2B示出了示例性方法550，该示例性方法假设利用居里温度，但应当理解，可替代地使用在该温度下MNP磁性性能改变的其他特性温度，诸如阻断温度。在552处，该方法开始。在554处，每种核苷酸前体用不同的MNP类型进行标记(例如，A由MNP1标记，C用MNP2进行标记，G用MNP3进行标记，并且T用MNP4进行标记，其中MNP1、MNP2、MNP3和MNP4具有可区分的温度依赖性热稳定性)。出于示例性目的，假设第一MNP类型(“MNP1”)在低于Tc，1的温度下发射量值高于第一阈值(“Th1”)的磁场，并且在高于Tc，1的温度下发射量值低于第一阈值的磁场；第二MNP类型(“MNP2”)在低于Tc，2的温度下发射量值高于第二阈值(“Th2”)的磁场，并且在高于Tc，2的温度下发射量值低于第二阈值的磁场；第三MNP类型(“MNP3”)在低于Tc，3的温度下发射量值高于第三阈值(“Th3”)的磁场，并且在高于Tc，3的温度下发射量值低于第三阈值的磁场；第四MNP类型(“MNP4”)在低于Tc，4的温度下发射量值高于第四阈值(“Th4”)的磁场，并且在高于Tc，4的温度下发射量值低于第四阈值的磁场。(同样，如上所述，与此处假设的阶梯状行为相比，磁化在约居里温度的温度下的变化可没有那么突然，在这种情况下，“在低于[居里温度]的温度下”可解释为“在低于[居里温度减去合适的缓冲区]的温度下”。类似地，“在高于[居里温度]的温度下”可解释为“在高于[居里温度加上合适的缓冲区]的温度下”。
在556处，将磁性标记的核苷酸前体的混合物的温度(或检测设备的流体通道的温度)设置为高于四种MNP类型的最高居里温度的值。可例如使用温度控制设备(例如，加热器)来设置温度以加热流体通道的内容物。另选地或除此之外，可在核苷酸前体被添加到流体通道之前对其进行加热(或冷却)。根据上文所述的假设，最高居里温度为Tc，4。在该温度下，标记核苷酸前体的所有MNP都是顺磁性的，并且不太可能发生磁性相互作用并导致聚集或聚簇。在558处，将所有核苷酸前体添加到检测设备的流体通道(例如，同时、基本上同时或在步骤560开始之前顺序地)。在获得时间将核苷酸前体掺入靶DNA链中的一段时间之后，在560处，将流体通道的温度设置为低于最低居里温度Tc，1的值。(同样，如上所述，首先在低于最低居里温度的温度下进行检测的选择是任意的，并不是必需的。)在562处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第一磁场量值(例如，是由流体通道内的MNP导致的)。如上所述，磁性传感器可通过检测电阻、电压、电流、频率、噪声和/或电阻、电压、电流、频率和/或噪声的变化来感测由一种或多种MNP发射的磁场。可记录感测的第一磁场量值。
在564处，将流体通道的内容物的温度设置为最低居里温度Tc，1和第二最低居里温度Tc，2之间的值。可例如使用温度控制设备(例如，加热器)来设置温度以加热流体通道的内容物。在566处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第二磁场量值(例如，是由流体通道内的MNP导致的)。可记录感测的第二磁场量值。
在568处，将流体通道的温度设置为第二最低居里温度Tc，2和第二最高居里温度Tc，3之间的值。可例如使用温度控制设备(例如，加热器)来设置温度以加热流体通道的内容物。在570处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第三磁场量值(例如，是由流体通道内的MNP导致的)。可记录感测的第三磁场量值。
在572处，将流体通道的温度设置为第二最高居里温度Tc，3和最高居里温度Tc，4之间的值。可例如使用温度控制设备(例如，加热器)来设置温度以加热流体通道的内容物。在574处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第四磁场量值(例如，是由流体通道内的MNP导致的)。可记录感测的第四磁场量值。
在576处，基于对第一磁场量值、第二磁场量值、第三磁场量值和第四磁场量值的分析来确定所掺入的核苷酸前体的种类。可使用类似于上文所示的表A的逻辑表来进行分析。一旦确定了所掺入的核苷酸前体的种类，就可记录它或互补碱基的种类。
如上所述，应当理解，可修改图2B所示的某些步骤的顺序。例如，虽然图2B示出了检测到磁场的低于最低居里温度的第一温度，但应当理解，第一温度可在由MNP的居里温度限定的任何范围内。具体地讲，可方便地将第一温度设置为Tc，3和Tc，4之间的值，使得步骤556和560之间的温度变化小于在第一温度低于Tc，1的情况下将达到的温度变化。一般来讲，温度范围可以任何顺序测试。因此，应当理解，步骤560和562、步骤564和566、步骤568和570以及步骤572和574相对于彼此的位置可被修改(例如，步骤560和562可在步骤564和566、步骤568和570以及步骤572和574中的任一者或全部之前或之后)。
此外，应当理解，在步骤556处，可将磁性标记的核苷酸前体的混合物的温度(或检测设备的流体通道的温度)设置为高于四种MNP类型的最高阻断温度(其可小于四种MNP类型的最高居里温度)的值。在该温度下，标记核苷酸前体的所有MNP都是超顺磁性的，并且不太可能发生磁性相互作用并导致聚集或聚簇。
在一些或所有磁性传感器已在温度范围中的每个温度范围内被读取之后，可使用例如酶促或化学裂解从所掺入的磁性标记的核苷酸前体裂解MNP，如本领域中所公知的。如上所述，从流体通道裂解和冲洗MNP的化学步骤可在高于最高阻断温度或居里温度的温度下进行，也用于防止被洗掉的MNP聚集和这些MNP之间的磁相互作用。温度控制设备(例如，加热器)可用于在洗涤步骤之前或期间调节流体通道的内容物的温度。然后可对被测序的链中的下一种未配对碱基重复方法550的步骤。对于至少DNA测序应用，该实施方案允许每个碱基读段使用单个化学步骤。
作为方法550的示例，图3A至图3E示出了根据一些实施方案将不同MNP类型用于核酸测序的测序操作。图3A是两条靶DNA链(模板)的简化图示，其中聚合酶在掺入如上所述的MNP标记的核苷酸前体之后结合到测序设备的流体通道。将与靶DNA链中的下一种未配对碱基互补的标记核苷酸掺入DNA链中。在图3A中，用MNP1标记的腺嘌呤(A)核苷酸前体已在图3A左手侧的流体通道内的位点处掺入DNA链(片段)中，并且用MNP2标记的胞嘧啶(C)核苷酸前体已在图3A右手侧的位点处掺入DNA链(片段)中。
然后将系统冷却至第一温度(例如，室温)以开始测序循环。如图3B所示，假设第一温度(被示出为27摄氏度)低于所有MNP类型的最低居里温度，则标记所掺入的核苷酸前体的MNP发射具有可被附近的磁性传感器检测到的量值的磁场(由向左指向箭头标记)。
在第一温度下的检测完成之后，将系统加热至高于四个居里温度中的最低居里温度但低于其余三个居里温度的第二温度。如图3C所示，附图的左手侧标记核苷酸前体的MNP(MNP1)变成顺磁性的，并且不再产生高于第一阈值的磁场。假设MNP标记腺嘌呤(A)，可确定在第一温度下检测到高于第一阈值的磁场量值但在第二温度下未检测到该磁场量值的磁性传感器检测到A。因此，模板DNA链的最后配对碱基为互补碱基T。
在第二温度下的检测完成之后，将系统加热至高于四个居里温度中的第二最低居里温度但低于四个居里温度中的第二最高居里温度的第三温度。如图3D所示，附图的右手侧标记掺入DNA链中的核苷酸前体的MNP(MNP2)也变成顺磁性的，并且不再产生高于第二阈值(其可与用于标记其他核苷酸前体的MNP类型的第一阈值相同或不同)的磁场。假设MNP标记胞嘧啶(C)，则可确定在第二温度下检测到高于第二阈值的磁场量值但在第三温度下未检测到该磁场量值的磁性传感器检测到C。因此，可以推断出模板DNA链的最后配对碱基是互补碱基G。
在第三温度下的检测完成之后，将系统加热至除了四个居里温度中的最高居里温度之外的所有居里温度的第四温度。在该温度下，MNP3也变为顺磁性的并且不再产生高于第三阈值(其可与用于MNP1的第一阈值和/或用于MNP2的第二阈值相同或不同)的磁场。假设MNP3标记鸟嘌呤(G)，可确定在第二温度下检测到高于第二阈值的磁场量值但在第三温度下未检测到该磁场量值的磁性传感器检测到G。因此，可以推断出模板DNA链的最后配对碱基为互补碱基C。
在第四温度下的检测之后，可在化学步骤中将MNP从所掺入的核苷酸中裂解并从流体通道中冲洗出来，该化学步骤可以但并不需要在高于最高阻断温度或居里温度的温度下进行，以防止被洗掉的MNP的聚集和这些MNP之间的磁相互作用。然后可重复该过程，以鉴定靶DNA链中的下一种未配对碱基。可将系统温度升高至大于四种MNP的最高居里温度或阻断温度的温度，可引入标记的核苷酸前体的新样品，并且可开始下一个测序循环。在实施方案诸如图3A至图3E所示的实施方案中，减少了所使用的化学步骤的数量以加速读取过程。每个测序循环所需的时间取决于流体通道的内容物的加热/冷却时间。
虽然图3A至图3E示出了示例性DNA测序实施方案，其中单个化学步骤使得能够在单个步骤中检测所有四种碱基，如先前所述，但在其他实施方案中，可使用一种类型的MNP(或少于四种MNP类型)并且每次引入并检测少于所有碱基来执行类似的过程。例如，当使用单种MNP类型时，可顺序地引入并检测每个单独的碱基(核苷酸前体)，一次一种。在此类实施方案中，检测可以二元方式完成，其中磁性传感器检测是否存在指示磁性传感器附近存在MNP类型的磁场量值。然后可对剩余的碱基重复该方法，之后裂解/洗掉MNP，并对下一种未配对碱基重复该过程。
应当理解，不需要使用四种MNP来使用单个化学步骤执行检测。例如，在一些DNA测序实施方案中，碱基中的一种碱基可保留未标记。使用上述示例，并且假设胸腺嘧啶(T)保留未标记，表变为下表B：
表B
Figure BDA0003126820860000311
Figure BDA0003126820860000321
虽然相对于上述示例，如先前所述进行A、C和G的掺入的检测，但是通过在四个温度范围内的每个温度范围内检测磁性传感器附近不存在磁场来检测T的掺入。任选地，可使用公差来创建未标记碱基的检测范围，以考虑不接近任何MNP的磁性传感器附近的杂散磁场的变化。因此，如果在任何温度范围内都未检测到大于阈值中的每个阈值的磁场量值，则不存在可检测的磁场(或仅检测到低于预期将在该温度范围内由MNP发射的磁场量值的最小磁场量值)可被解释为最后掺入的核苷酸前体为胸腺嘧啶(并且因此，被测序的DNA链中的最后配对碱基是胸腺嘧啶的互补碱基，为腺嘌呤(A))的指示。
在三种核苷酸前体由不同MNP类型标记，每种不同MNP类型具有不同居里温度，以及第四核苷酸前体保留未标记的实施方案中，可跳过高于MNP的最高居里温度(上表中的范围4)的温度范围内的检测，因为如上表所示，所有三种MNP类型都无法发射量值超过其适用阈值的磁场，未标记的核苷酸前体也无法发射磁场。如果跳过范围4，则可通过比较多个测序循环的结果来区分在特定测序循环期间不在任何被检测的分子附近的磁性传感器和已检测到未标记的核苷酸前体(例如，本示例中的胸腺嘧啶)的传感器。例如，在DNA测序应用中，如果在一定数量的测序循环(例如，超过被测序的DNA样品的一行中相同碱基的最大预期数量的数量)之后并且在所有温度范围内，特定传感器从未检测到量值超过阈值中的一个阈值的磁场，则可以推断出在可由特定传感器检测到的区域/区中不存在被测序的DNA链。但是如果特定传感器有时检测到量值超过温度范围中的一个或多个温度范围(例如，范围1、2和3)内的阈值中的一个阈值的磁场，则可以推断出在传感器未检测到量值超过任何温度范围内的任何阈值的磁场的测序循环中，胸腺嘧啶(T)在对应的测序循环期间被掺入。
在一些或所有磁性传感器已在温度范围中的每个温度范围内被读取之后，可使用例如酶促或化学裂解从所掺入的磁性标记的核苷酸前体裂解MNP，如本领域中所公知的。然后可对被测序的链中的下一个未配对碱基重复该过程。对于至少DNA测序应用，该实施方案允许每个碱基读段使用单个化学步骤。
图4示出了根据一些实施方案的适用于DNA测序的示例性方法600，其中四种核苷酸前体中的三种被磁性标记并且与第四未标记核苷酸前体同时(或基本上同时)添加到检测设备的流体通道。在602处，该方法开始。在604处，四种核苷酸前体中的三种中的每一种用不同的MNP类型进行标记(例如，A用MNP1进行标记，C用MNP2进行标记，并且G用MNP3进行标记，其中MNP1、MNP2和MNP3具有可区分的热稳定性)。第四核苷酸前体(例如，T)保留未标记。出于示例性目的，假设第一MNP类型(“MNP1”)在低于Tc，1的温度下发射量值高于第一阈值(“Th1”)的磁场，并且在高于Tc，1的温度下发射量值低于第一阈值的磁场；第二MNP类型(“MNP2”)在低于Tc，2的温度下发射量值高于第二阈值(“Th2”)的磁场，并且在高于Tc，2的温度下发射量值低于第二阈值的磁场；第三MNP类型(“MNP3”)在低于Tc，3的温度下发射量值高于第三阈值(“Th3”)的磁场，并且在高于Tc，3的温度下发射量值低于第三阈值的磁场。
在606处，将核苷酸前体的混合物的温度(或检测设备的流体通道的温度)设置为高于最高居里温度(或高于最高阻断温度)的值。根据上文所述的假设，最高居里温度为Tc，3。在该温度下，标记核苷酸前体的所有MNP都是顺磁性的(或超顺磁性的)，并且不太可能发生磁性相互作用并导致聚集或聚簇。在608处，将所有核苷酸前体添加到检测设备的流体通道(例如，同时、基本上同时或在步骤410开始之前顺序地)。在610处，将流体通道的温度设置为低于最低居里温度Tc，1的值。在612处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第一磁场量值(例如，是由流体通道内的MNP导致的)。如上所述，磁性传感器可通过检测电阻、电压、电流、频率、噪声和/或电阻、电压、电流、频率和/或噪声的变化来感测由一种或多种MNP发射的磁场。可记录感测的第一磁场量值。
在614处，将流体通道的温度设置为最低居里温度Tc，1和中等居里温度Tc，2之间的值。在616处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第二磁场量值(例如，是由流体通道内的MNP导致的)。可记录感测的第二磁场量值。
在618处，将流体通道的温度设置为中等居里温度Tc，2和最高居里温度Tc，3之间的值。在620处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第三磁场量值(例如，是由流体通道内的MNP导致的)。可记录感测的第三磁场量值。
任选地，在622处，将流体通道的温度设置为高于最高居里温度Tc，3的值。任选地，在624处，选定的一个或多个磁性传感器中的每个磁性传感器检测其附近的第四磁场量值，该第四磁场量值应接近零，因为在高于最高居里温度的温度下添加到流体通道的所有MNP应为顺磁性的。如果执行步骤622和624，则可记录感测的第四磁场量值。
在626处，基于对第一磁场量值、第二磁场量值、第三磁场量值和第四磁场量值(如果检测到的话)的分析来确定所掺入的核苷酸前体的种类。可使用类似于上文所示的表B的逻辑表来进行分析。一旦确定了所掺入的核苷酸前体的种类，就可记录它或互补碱基的种类。
应当理解，可修改图4所示的某些步骤的顺序。例如，虽然图4示出了检测到磁场的低于最低居里温度的第一温度，但应当理解，第一温度可在由MNP的居里温度限定的任何范围内。具体地讲，可方便地将第一温度设置为Tc，2和Tc，3之间的值，使得步骤606和610之间的温度变化小于在第一温度低于Tc，1的情况下将达到的温度变化。一般来讲，温度范围可以任何顺序测试。因此，应当理解，步骤610和612、步骤614和616、步骤618和620以及步骤622和624(如果执行了的话)相对于彼此的位置可被修改(例如，步骤610和612可在步骤614和616、步骤618和620以及步骤622和624(如果执行了的话)中的任一者或全部之前或之后)。
在一些或所有磁性传感器已在温度范围中的每个温度范围内被读取之后，可使用例如酶促或化学裂解从所掺入的磁性标记的核苷酸前体裂解MNP，如本领域中所公知的。然后可对被测序的链中的下一种未配对碱基重复方法600的步骤。对于至少DNA测序应用，该实施方案允许每个碱基读段使用单个化学步骤。
磁性传感器
在本文所述的实施方案中使用的磁性传感器可以是或包括例如利用MR原理的磁阻(MR)传感器。为了理解MR设备如何工作，考虑电流中的电子如何与薄膜铁磁(FM)层相互作用。量子力学表明，与FM层相互作用的电子将使得电子自旋被取向成优先地平行于或反平行于磁矩的方向，以分别获得透射和反射的电子，如图5A所示。具有平行于FM层204的力矩的自旋的电子优先穿过FM层204(自旋210)，而具有反平行的自旋的那些电子优先被反射回来(自旋208)。由于该现象，非磁性(NM)层202(出于该解释的目的，假设它是金属层)和FM层204之间的界面充当可用于自旋极化(即，使一个自旋方向更优先)传入电流的自旋滤波器。
对于具有由非磁性金属层226(隔层)分开的两个FM层224和228的设备，如图5B和5C所示，由第一FM层(FM1)224极化的传入电流自旋与第二FM层(FM2)228不同地相互作用，具体取决于该层的磁矩的取向。如果FM层224和228两者的矩彼此平行(图5B)，则许多电子将穿过该设备，因为电流中的许多电子将随着第二FM 228(自旋234)的力矩而自旋取向。很少的电子会被反射回去(自旋232)。
在相反的情况下，其中两个FM层224和228的矩以反平行方式取向时(图5C)，许多电子将被阻挡穿过第二FM层228(自旋236)，并且少得多的电子将横穿该设备(自旋238)。这意味着经过设备的电流量取决于两个FM层224和228相对于彼此的取向。由于设备的电阻与电流成比例，因此该设备的电阻取决于力矩的取向(即，在力矩平行时的电阻小于在这些力矩反平行时的电阻)。
尽管上述说明假设使用将两个FM层224和228分开的非磁性金属隔层226(也称为自旋阀(SV)或巨磁阻(GMR)设备的构型)，但被称为隧穿阻隔层的绝缘层可另选地用作将FM层分开的隔层。在此类实施方式中，隔层可由基于氮化物和氧化物的材料制成。这些类型的设备被称为磁隧道结(MTJ)，并且由于自旋极化隧穿而不是自旋滤波，它们表现出类似的电阻响应(称为隧道磁阻或TMR)。
MR设备已用于许多应用中，包括磁记录、磁场感测和磁记忆。在这些情况下，通常优选的是，将MR设备设计成使得一个FM层被有效地“钉扎(pinned)”，使得其力矩点所在的方向保持固定并且不易由于磁场的施加而被改变。这通常通过将反铁磁(AFM)层邻近钉扎层放置并使用称为交换耦接的效应来实现，该交换耦接为FM层的力矩提供强大的单向各向异性。第二FM层保持“自由”以在磁场的脉冲下旋转，使得其力矩相对于钉扎FM层的固定取向旋转，使得设备的电阻通过有效地充当磁场-电压换能器而成为磁场方向或振幅的检测器。
磁阻可被定义为
Figure BDA0003126820860000361
其中R0是在力矩以平行构型取向时设备的电阻，AR是电阻为平行取向时和为反平行取向时的差值，并且θ是两个力矩之间的角度。对于磁场感测应用，期望传感器对磁场作出线性响应。考虑到上述等式，理想的是，传感器应被设计和制造成使得两个FM层相对于彼此成大约90°取向。这可通过用反铁磁体交换偏置钉扎层并使用“硬偏置”涂层将自由层旋转大约90°远离钉扎层来实现。下文将给出关于该设计的更多细节，如应用于与测序应用相关的实施方案的。
图6示出了根据一些实施方案的磁性传感器105的一部分。图6的示例性磁性传感器105具有底部108和顶部109，并且包括三个层，例如由非磁性隔层107分开的两个铁磁层106A、106B。非磁性隔层107可为例如金属材料或金属材料的组合，诸如例如铜或银，在这种情况下该结构被称为自旋阀(SV)，或者该非磁性隔层可为绝缘体，诸如例如氧化铝或氧化镁，在这种情况下该结构被称为磁性隧道结(MTJ)。用于铁磁层106A、106B的合适材料包括例如Co、Ni和Fe的合金(有时与其他元素混合)。上述示例性材料仅仅是示例性的，并非旨在进行限制。适用于MTJ的材料是本领域普通技术人员已知的。
在一些实施方案中，磁性传感器105是薄膜设备，铁磁层106A、106B被设计成使它们的磁矩被取向成基本上在该膜的平面内或基本上垂直于该膜的平面。附加材料可沉积在图6所示的三个层106A、106B和107下方和/或上方，以用于诸如界面平滑、界面纹理化和界面保护(使其免受用于图案化检测设备的处理的影响(如下所述))，但是磁性传感器105的有源区位于图6所示的三层结构中。因此，与磁性传感器105接触的部件可与三个所示层106A、106B或107中的一者接触，或者可与磁性传感器105的图6所示的另一个部分接触。
图7A和7B示出了MR传感器的电阻，该电阻与1-cos(θ)成比例，其中θ是图6所示的两个铁磁层106A、106B的力矩之间的角度。为了使由磁场产生的信号最大化并且提供磁性传感器105对所施加的磁场的线性响应，磁性传感器105可被设计成使得两个铁磁层106A、106B的力矩在不存在磁场的情况下相对于彼此取向成π/2或90度。该取向可通过本领域已知的任何数量的方法来实现。如上所述，一种解决方案是使用反铁磁体通过称为交换偏置的效应“钉扎”铁磁层中的一个铁磁层(106A或106B，命名为“FM1”)的磁化方向，然后用具有绝缘层和永磁体的双层涂覆传感器。绝缘层避免了磁性传感器105的电短路，并且永磁体提供了垂直于FM1的钉扎方向的“硬偏置”磁场，该“硬偏置”磁场然后将使第二铁磁体(106B或106A，命名为“FM2”)旋转并产生期望构型。平行于FM1的磁场然后使FM2围绕该90度构型旋转，并且电阻的变化产生可被校准以测量作用于磁性传感器105的场的电压信号。这样，磁性传感器105充当磁场-电压换能器。
需注意，虽然上面刚刚讨论的示例描述了铁磁体的使用，该铁磁体的力矩在膜的平面内相对于彼此成90度取向，但是另选地，可通过使铁磁层106A、106B中的一个铁磁层的力矩基本上在膜的平面外取向来实现垂直构型，这可使用称为垂直磁各向异性(PMA)的性质来实现。
因此，磁性传感器可具有多种构型中的任一种。例如，在本文的实施方案中使用的磁性传感器中的每个磁性传感器可以是使用MR效应(例如，其可以是MR传感器)来检测检测设备(例如，DNA测序装置)的流体通道中的MNP的薄膜设备。每个磁性传感器可作为电位差计进行操作，该电位差计具有随着感测磁场的强度和/或方向的变化而变化的电阻。每个磁性传感器可具有小于约30nm的尺寸以检测大约几毫特斯拉(mT)的磁场。
应当理解，虽然本公开的大部分集中于使用磁性传感器的电阻作为磁场量值的代表，但是由磁性传感器提供的输出可以是任何合适的输出，包括例如电阻、电压、电流、频率、噪声和/或电阻、电压、电流、频率和/或噪声的变化。
MR传感器阵列
图8A至图8C示出了根据一些实施方案的可包括在检测设备100中的交叉点阵列架构300的实施方案。为了举例说明，图8A至图8C所示的磁性传感器105包括MTJ元件308，但应当理解，可使用其他类型的传感器(例如，自旋阀设备)。应当理解，虽然上面描述了各种特定MR传感器类型，但是该描述并非旨在排除其他MR传感器类型。
参见图8A，交叉点阵列架构300包括顶部导线318和底部导线320。如图8A的示例性实施方案所示，顶部导线318与底部导线320成基本上90°角取向，如图所示。示例性MTJ元件308位于阵列的交叉点之间。示例性MTJ元件308包括由一个或多个非磁性层316(例如，MgO)分开的两个或更多个FM层。如图所示，FM层中的一个FM层是将在存在磁场的情况下旋转的自由层310，并且FM层中的另一个FM层是钉扎(或固定)层314，其可以是耦接到AFM层312的单个FM。另选地，可使用被称为合成反铁磁体(SAF)的复合物结构。SAF包括由磁耦合层(例如，钌)分开的两个FM层，其中这两个FM层中的一个耦接到AFM层。应当理解，虽然MTJ元件308的示例性层布置示出了在其他层上方或下方具有层的一般结构，但可插入未示出的居间层。
为了示出交叉点阵列架构300的一些特征，图8B示出了交叉点阵列架构300沿顶部导线318方向(由图8A中标记为“8B”的虚线指示)的剖面，并且图8C示出了交叉点阵列架构300沿底部导线320方向(由图8A中标记为“8C”的虚线指示)的剖面。如图所示，MTJ元件308(其可为磁性传感器105)的侧面由绝缘材料336封装。任选地，如图8B所示，也可将硬偏置磁性材料338沉积在MTJ元件308之间。如果存在的话，硬偏置磁性材料338可被磁化以指向平行于顶部导线318的方向的方向。在包括硬偏置磁性材料338的实施方案中，还将绝缘体340的薄层沉积在硬偏置磁性材料338的顶部上以使其与顶部导线318电绝缘。
在一些实施方案中，自由层310力矩的取向与钉扎层314力矩成大约90°的角度(如图13A的左侧面板所示，下文将进一步讨论)，这可使用一种或多种策略来实现。第一种方式是通过使用硬偏置场，其中沿顶部磁体的方向磁化的硬偏置也在顶部导线318的方向上跨MTJ元件308施加磁场。由于钉扎层314使用AFM层312固定，因此其力矩可被选择为垂直于硬偏置场，但自由层310将旋转成大致平行于该硬偏置场。
实现该取向构型的第二种方式是将MTJ元件308图案化为矩形或椭圆形，其中MTJ元件308的长轴线沿顶部导线318的方向。通过这些形状的纵横比，可调谐形状各向异性能量，这沿顶部导线318的长度产生轴线，在不存在外部磁场的情况下，自由层310磁化将优先沿该轴线指向。
实现该取向构型的第三种方式是通过沿轴线蚀刻FM层310、314以引起纹理化(参见例如美国专利7,382,586)，这也可产生单轴各向异性，使得自由层310力矩将沿顶部导线318的长度指向。
实现该取向构型的第四种方式是使用垂直磁各向异性来将自由层310拉出平面外，同时将钉扎层314保持在膜的平面内，或反之亦然。自由层310的各向异性保持足够小，使得小的平面内场可使自由层310在平面内旋转，这在本质上类似于上述其他方法。除了这里提到的那些之外，还存在实现自由层力矩和钉扎层力矩之间成90°取向的其他方法，并且实现该取向不限于这些选项。
参见图8C，该剖面示出了流体通道115(例如，纳米流体通道或微米流体通道)，其可以是例如在绝缘体中蚀刻的沟槽。如图所示，少量绝缘体322留在磁性传感器105(示出为MTJ元件308)的侧壁上，使得MNP不与磁性传感器105电相互作用。绝缘体的暴露于(并形成)流体通道115的部分可形成壁117，聚合酶分子或待检测分子(例如，核酸样品)可附接到该壁以用于测序。
检测设备
图9A、图9B和图9C示出了根据一些实施方案的示例性检测设备100。适于与上述方法一起使用的示例性检测设备100包括被布置成邻近流体通道115设置的阵列110的多个磁性传感器105。图9A是装置的顶视图，图9B是由图9A中标记为“9B”的虚线指示的位置处的剖视图，并且图9C是由图9A中标记为“9C”的虚线指示的位置处的另一个剖视图。上文描述了磁性传感器105的示例性实施方案。
如图9A、图9B和图9C所示，示例性检测设备100包括磁性传感器阵列110，该磁性传感器阵列包括多个磁性传感器105，图9A示出了四个磁性传感器即105A、105B、105C和105D。(为简单起见，本文档通常通过参考标号105指代磁性传感器。各个磁性传感器以参考标号105后接字母来给出。)应当理解，检测设备100可包括多于或少于四个磁性传感器105。图9A的示例性实施方案所示的磁性传感器阵列110是线性阵列。
在一些实施方案中，多个磁性传感器105中的每个磁性传感器耦接到至少一条线120，以用于读取来自磁性传感器105中的一个或多个磁性传感器的输出。(为简单起见，本文档通常通过参考标号120指代流通道。各个流通道以参考标号120后接字母来给出。)该输出提供对磁场量值或磁场量值的变化的指示，并且可包括例如磁性传感器105的电阻、电压、电流、频率、噪声和/或电阻、电压、电流、频率和/或噪声的变化。在图9A所示的示例性实施方案中，磁性传感器阵列110中的每个磁性传感器105耦接到两条线120。具体地讲，磁性传感器105A耦接到线120A和120E，磁性传感器105B耦接到线120B和120E，磁性传感器105C耦接到线120C和120E，并且磁性传感器105D耦接到线120D和120E。在示例性实施方案中，线120A、120B、120C和120D分别位于磁性传感器105A、105B、105C和105D下方，并且线120E位于磁性传感器105上方。图9B示出了磁性传感器105D与线120D和120E的关系。
检测设备100还包括与磁性传感器阵列110相邻的流体通道115。顾名思义，流体通道115被配置为当检测设备100在使用中时保持流体(例如，液体、气体、等离子体)。流体通道115可为开放的(例如，如果其形状为矩形，则其可具有三个侧面；如果其形状为弯曲的，则其可具有为圆柱体的一部分的形状；等)或闭合的(例如，如果其形状为立方体，则其可具有六个侧面；如果其形状为弯曲的，则其可为圆柱形的；等)。流体通道115可包括至少一个可移动件(例如，塞子、挡板等)以允许流体进入和/或离开流体通道115。流体通道115的形状可为规则或不规则的。流体通道115可包括或可耦接到泵，该泵迫使流体进入和/或离开流体通道115(例如，通过膜、开口等)。另选地，流体通道115可为被动接收器(例如，其仅接收流体但不耦接到注入或移除流体的设备)。
如图9B所示，流体通道115具有与磁性传感器阵列110相邻的壁117。壁117可为基本上竖直的，如图9B所示。另选地，壁117可至少部分地倾斜(例如，流体通道115的内部的一些或全部可为弯曲的(例如，呈圆柱体的一部分或全部的形状)或部分或整体为非竖直的)。一般来讲，流体通道115和壁117可具有允许磁性传感器105检测流体通道115内壁117附近或附接到该壁的MNP的存在的任何形状。
如上所述，当检测设备100在使用中时，磁性传感器105能够检测由流体通道115中的MNP导致的磁场和/或磁场变化。在一些实施方案中，磁性传感器105能够检测由磁性传感器105附近的MNP导致的磁场量值。
因此，壁117具有保护传感器105免受流体通道115中的任何流体的影响，同时仍然允许磁性传感器105检测其附近的由流体通道115内的MNP导致的磁场和/或磁场变化的性能和特性。例如，壁117的材料(以及可能的流体通道115的其余部分的材料)可以是绝缘体或包括绝缘体。例如，在一些实施方案中，壁117的表面包括聚丙烯、金、玻璃和/或硅。此外，可选择壁117的厚度，使得磁性传感器105可检测由流体通道115内的MNP导致的磁场。在一些实施方案中，壁117的厚度在约2nm和约20nm之间。期望耦合到正被检测的分子的MNP靠近传感器105，但通过足够的绝缘体与它们分开以电钝化磁性传感器105。可选择壁117的厚度以满足该目的。本领域的普通技术人员将能够选择壁117的合适的材料和合适的厚度。
图9C是检测设备100沿图9A中标记为“9C”的虚线的剖视图。因为剖面在流体通道115内的一点处截取，所以磁性传感器105和线120将不可见，因此使用虚线示出，以示出它们在检测设备100内的位置。如图9C所示，在一些实施方案中，壁117具有一个支撑结构114(或多个支撑结构114)，该支撑结构被配置为将待感测的另一个分子(例如，核酸或核酸聚合酶的分子)锚定到磁性传感器105附近的壁117。图9C示出了四个单独的支撑结构114A、114B、114C和114D，每个支撑结构对应于磁性传感器105(例如，支撑结构114A对应于磁性传感器105A，支撑结构114B对应于磁性传感器105B等)。壁117的一个支撑结构114(或多个支撑结构114)可包括分子可附接或锚定到其上的腔或脊。虽然图9C示出了对应于磁性传感器105中的每个磁性传感器的单独的支撑结构114，但检测设备100可具有比所示更少或更多的支撑结构114。例如，可存在比磁性传感器105更多的支撑结构114，使得每个磁性传感器105在多个支撑结构114附近。又如，多个磁性传感器105可共享单个支撑结构114。又如，磁性传感器105可共享多个支撑结构114。在检测设备100包括多个支撑结构114的实施方案中，那些支撑结构114可彼此相同或类似，或者可彼此不同。
在一些实施方案中，可能有利的是，每个磁性传感器105检测耦接到单个相应支撑结构114的MNP。例如，在一些类型的SBS中，长链DNA(或来自单个供体生物体的DNA的多个长链)在测序之前被分割成较小的随机长度片段。来自相同供体的所有这些较短链是待测序的完整链的随机化子链。例如，如果完整链包括序列ATGGCTTAGCCATACCGAT，则较短链可包括例如不同的子链(例如，TGGCTT和CCATACCGA)，以及如果将多个较长链分割成子链，则较短链可包括部分或完全与其他子链重叠的子链(例如，CTTAGCCAT和ATGGCTTAGCC)。所有较短的随机化子链可同时被测序，这可能是在扩增之后。在此类应用中，应当理解，因为子链不表示相同的子序列，所以可能期望的是每个磁性传感器105检测由单种MNP导致的磁场和/或磁场变化，因为子链的测序将不在子链之间协调(或同步)。例如，在单个测序循环期间，第一子链可掺入胞嘧啶，第二子链可掺入胸腺嘧啶，并且第三子链可掺入腺嘌呤。为了对较大核酸链的多个随机片段进行测序，希望在每个测序循环中确定是否掺入了每种dNTP类型以及每种dNTP类型在哪个物理位置掺入。
为了简化说明，图9A、图9B和图9C示出了具有单个流体通道115和在磁性传感器阵列110中仅具有四个磁性传感器即105A、105B、105C、105D的示例性检测设备100。应当理解，检测设备100可在磁性传感器阵列110中具有更多的磁性传感器105，并且其可具有额外的流体通道115或更复杂的单个流体通道115(例如，具有不同的形状或具有互连的通道)。一般来讲，可使用磁性传感器105与允许磁性传感器105检测由可使用的流体通道115中的MNP导致的温度变化的流体通道115的任何构型。
图9D是示出根据一些实施方案的用于分子检测的示例性检测系统300的框图。如图9D所示，系统300包括检测设备100。如图9D的示例性实施方案所示，检测设备可包括经由线120耦接到磁性传感器阵列110的控制电路130。控制电路130可包括任何合适的部件，通常包括合适的检测电路。此类控制电路130可包括硬件和/或软件。控制电路130可包括例如以下中的一者或多者：能够执行机器可执行指令的处理器、专用集成电路(ASIC)、控制器、可编程电路(例如，FPGA)等。
同样如图9D所示，检测系统300还可包括一个或多个温度控制设备140(例如，一个或多个加热器)以及任选地一个或多个磁性部件150。磁性部件150可包括例如电磁体、分布式线圈、螺线管、永磁体或超导磁体。如果存在的话，磁性部件150可提供静态(例如，在时间上恒定或DC)磁场以使流体通道115中的MNP的磁矩在基本上相同的方向上对准。虽然图9D将温度控制设备140和磁性部件150示出为与检测设备100分开，但温度控制设备140和磁性部件150(如果存在的话)中的一者或多者可包括在检测设备100中，或者温度控制设备140和磁性部件150中的一者或两者可与检测设备100分开。
在一些实施方案中，系统300包括一个或多个温度控制设备140，其可包括例如一个或多个加热元件。例如，系统300可包括散热器，该散热器可耦接到检测设备100。在一些实施方案中，检测设备100本身包括耦接到例如其底表面119的一个或多个加热元件142。图10是根据一些实施方案的适于结合到检测设备100中或与该检测设备一起使用的示例性加热元件142的分解图。图10所示的检测设备100包括或耦接到表面加热器142A，该表面加热器在检测设备100的整个底表面119上提供基本上均匀的加热。图10所示的检测设备100还包括在底表面119(参见图12A)的边缘处或附近的线性加热器142B，该线性加热器可用于消除由处于不同(例如，更冷)温度的周围环境导致的温度梯度。
另选地或除此之外，检测设备100可包括加热元件142的阵列，这在需要精细温度控制的情况下可能是有用的。图11示出了根据一些实施方案的可耦接到例如检测设备100的底表面119的加热元件142的阵列144。为了避免模糊附图，仅用参考标号示出了加热元件142中的几个加热元件。
作为在磁性传感器阵列110中具有较大数量的磁性传感器105的检测设备100的示例，图12A、图12B、图12C和图12D示出了包括若干流体通道115的示例性检测设备100的部分，这些流体通道中的一个或多个流体通道可为根据一些实施方案的单独的流体通道115，或者这些流体通道的集合可被视为单个流体通道115。在图12A、图12B、图12C和图12D所示的检测设备100的实施方案中，磁性传感器阵列110中的多个磁性传感器105被布置成矩形网格图案。线120中的每条线识别磁性传感器阵列110的一行或一列。应当理解，图12A、图12B、图12C和图12D示出了检测设备100的仅一部分以避免模糊所讨论的检测设备100的部件。应当理解，各种所示部件(例如，线120、磁性传感器105、流体通道115等)在检测设备100的物理实例化中可能不可见(例如，其中的一些或全部可被保护材料诸如绝缘体覆盖)。此外，如本文所述，检测设备100可包括图12A、图12B、图12C和图12D未示出的其他部件。
图12A是根据一些实施方案的示例性检测设备100的立体图。示例性检测设备100包括九条线120，分别标记为120A、120B、120C、120D、120E、120F、120G、120H和120I。它还包括五个流体通道，分别标记为115A、115B、115C、115D和115E。如上所述，流体通道115A、115B、115C、115D和115E可被认为是单独的流体通道115或单个流体通道115。检测设备100还具有底部表面119。
图12B是图12A所示的示例性检测设备100的顶视图。在该顶视图中不可见的流通道120G、120H和120I用虚线示出以指示它们的位置。线120A-120F以实线示出，但如上所述，线120A-120F在该顶视图中也可能不可见(例如，它们可被保护材料诸如绝缘体覆盖)。
图12C是检测设备100沿图12A中标记为“12C”的线的剖视图。如图所示，线120A、120B、120C、120D、120E和120F中的每一条线沿该剖面与磁性传感器105中的一个磁性传感器的顶部接触(即，线120A与磁性传感器105A接触，线120B与磁性传感器105B接触，线120C与磁性传感器105C接触，线120D与磁性传感器105D接触，线120E与磁性传感器105E接触，并且线120F与磁性传感器105F接触)。线120H与磁性传感器105A、105B、105C、105D、105E和105F中的每个磁性传感器的底部接触。应当理解，虽然图12A至图12D示出了与磁性传感器105接触的线120，但线120一般可耦接到磁性传感器105(即，它们可直接连接，或者可存在设置在线120和磁性传感器105之间的居间部件)。
再次参见图12C，磁性传感器105A和105B由流体通道115A(在图12C中未标记但在图12A中示出)分开。类似地，磁性传感器105B和105C由流体通道115B分开，磁性传感器105C和105D由流体通道115C分开，磁性传感器105D和105E由流体通道115D分开，并且磁性传感器105E和105F由流体通道115E分开。如下面进一步讨论的，每个流体通道115的竖直壁中的任一个或两个可以是壁117。
在一些实施方案中，每个磁性传感器105被分配给单个流体通道115。例如，在图12A至图12D所示的示例性设备中，耦接到线120A的磁性传感器105可被配置为感测流体通道115A中MNP的存在或不存在，耦接到线120B的磁性传感器105可被配置为感测流体通道115B中的MNP，耦接到线120C的磁性传感器105可被配置为感测流体通道115C中的MNP，耦接到线120D的磁性传感器105可被配置为感测流体通道115D中的MNP，并且耦接到线120E的磁性传感器105可被配置为感测流体通道115E中的MNP。
在图12A至图12D所示的示例性实施方案中，存在比流体通道115更多列的磁性传感器105(即，在所示的示例性实施方案中，存在对应于线120A-120F的六个列和仅五个流体通道115A-115E)。在此类实施方案中，一个流体通道115的每个壁可为壁117。换句话讲，单个流体通道115可由数量为每个其他流体通道115的两倍的磁性传感器105感测。例如，在图12A至图12D的示例性实施方案中，流体通道115中的任一个流体通道可由两列磁性传感器105感测。例如，流体通道115B可由耦接到线120B和120C两者的磁性传感器105感测。在该示例中，耦接到线120A的磁性传感器105将被分配用于感测流体通道120A的内容物，耦接到线120D的磁性传感器105将被分配用于感测流体通道120C的内容物，耦接到线120E的磁性传感器105将被分配用于感测流体通道120D的内容物，并且耦接到线120F的磁性传感器105将被分配用于感测流体通道120E的内容物。
图12D是检测设备100沿图12A中标记为“12D”的线的剖视图。如图所示，流通道120E沿着该剖面与传感器105G、105E和105H中的每一者的顶部接触。线120G、120H和120I中的每一条线沿该剖面与磁性传感器105中的一个磁性传感器的底部接触(即，线120G与磁性传感器105G接触，线120H与磁性传感器105E接触，并且线120I与磁性传感器105H接触)。
如上所述，图12D所示的线120不需要与磁性传感器105直接接触；相反，它们可通过居间部件连接。例如，在一些实施方案中(诸如，图12E和图12F所示)，检测设备100包括多个选择器元件111，每个选择器元件耦接到磁性传感器105中的相应磁性传感器，其中选择器元件111中的每个选择器元件表现出阈值行为，使得对于高于特定值(Vth)的电压，选择器元件111具有高电导率，并且在该电压以下，选择器元件111的电导率实际上为零。选择器元件111可包括例如晶体管、二极管等。如本领域的普通技术人员将会理解的，可以使用不同的寻址(选择)磁性传感器105的方案(单独地或成组地)，以确保只有预期的磁性传感器105两端的电压降高于Vth。因此，可使用选择器元件111来减少可传输通过相邻元件的“潜行”电流并且降低检测设备100的性能的可能性。
图12E示出了根据一些实施方案的用于选择磁性传感器105的示例性方法。在图12E所示的示例性实施方案中，相应的选择器元件111(例如，在示例性实施方案中示出为CMOS晶体管)与磁性传感器105串联耦接。在该示例性实施方案中，三条线120A、120B和120C允许来自磁性传感器105的输出被获得或感测到。在概念上，流通道120A可被视为读出流通道，流通道120C可被视为控制流通道，并且流通道120B可被视为读出流通道和控制流通道中的任一者或两者。阵列110中的每个磁性传感器105可串联耦接到相应的选择器元件111。关于诸如图12E所示的示例性构型的构型的更多细节，参见B.N.Engel、J.
Figure BDA0003126820860000461
B.Butcher、R.W.Dave、M.DeHerrera、M.Durlam、G.Grynkewich、J.Janesky、S.V.Pietambaram、N.D.Rizzo、J.M.Slaughter、K.Smith、J.J.Sun和S.Tehrani，“A 4-MbToggle MRAM Based on a Novel Bit and Switching Method”，IEEE Transactions onMagnetics，第41卷，第132页(2005年)。
图12F示出了根据一些实施方案的另一个示例性磁性传感器105选择方法。在图12F所示的示例性实施方案中，选择器元件111(例如，如本领域中所公知的二极管或类似的阈值元件，诸如半导体二极管、运算跨导放大器(OTA)、氧化钒层、电容阈值逻辑门等)与磁性传感器105中的每个磁性传感器一起“堆叠内”沉积，这些温度传感器被置于交叉点架构中。虽然图12F示出了磁性传感器105下方的叠堆内选择器元件111，但应当理解，叠堆内选择器元件111和磁性传感器105的叠堆可颠倒(即，叠堆内选择器元件111可在磁性传感器105上方)。相应的选择器设备(例如，CMOS晶体管)可用于接通各条线120A、120B以寻址/访问检测设备100中的各个磁性传感器105。CMOS选择晶体管的使用可能是简单的，这是由于可用于制造前端的器件厂(例如，用于构建CMOS晶体管和底层电路的纳米加工)的普及，但是用于操作的电流类型可使用交叉点设计来最终达到期望的密度。关于适用于选择磁性传感器105(例如，采用交叉点阵列)的构型的附加细节可见于C.Chappert、A.Fert和F.N.VanDaul，“The emergence of spin electronics in data storage”，Nature Materials，第6卷，第813页(2007年)和J.Woo等人，“Selector-less RRAM with non-linearity ofdevice for cross-point array applications”.Microelectronic Engineering 109(2013年)第360-363页。
在磁性传感器105被布置成交叉点阵列的实施方案中，可同时读取整列或整行以提高检测的准确性。
如本文所述，本文(例如，参考图8A至图12F)示出和描述的示例性检测设备100可与使用SBS方案的方法一起使用，该SBS方案使用磁性标记的核苷酸前体。SBS涉及引物杂交的模板DNA的结合、脱氧核苷三磷酸(dNTP)的掺入以及掺入的dNTP的检测。检测设备100可用于将磁性传感器105暴露于流体通道115中的测序试剂，同时使用例如电绝缘材料保护磁性传感器105。如本文所述，DNA合成可使用放置在磁性传感器105附近的聚合酶分子来执行，该磁性传感器检测MNP的存在。
具体地讲，如本文所述，聚合酶的分子或单链核酸的片段可附接到在磁性传感器105中的一个或多个磁性传感器附近的流体通道115的侧壁117。然后可通过以下方式来执行测序：向流体通道115添加核酸模板(具有引物结合位点和可延伸引物)和磁性标记的核苷酸前体(由可区分的MNP标记的至少一些类型的核苷酸前体)，以及通过使用线120检测来自磁性传感器105的输出来对核酸模板进行测序。该输出可指示磁性标记的核苷酸前体中的哪一种已掺入可延伸引物中(例如，在各自用不同MNP类型标记的多种核苷酸前体基本上同时添加到流体通道115中的情况下)，或者可指示特定磁性标记的核苷酸前体是否已掺入可延伸引物中(例如，在用MNP(对于每种类型的核苷酸前体，其可以是相同类型的MNP)标记的不同核苷酸前体被顺序地添加到流体通道115中的情况下)。具体地讲，对于DNA测序，由于腺嘌呤(A)仅与胸腺嘧啶(T)配对，并且胞嘧啶(C)仅与鸟嘌呤(G)配对，因此对MNP的检测使得能够确定磁性标记的核苷酸前体中的哪一种已被掺入。具体地讲，如果检测到MNP标记A，则所记录的碱基为T(反之亦然)，如果检测到MNP标记C，则所记录的碱基为G(反之亦然)。
在一些实施方案中，待检测的靶分子(例如，待测序的核酸链)附接到流体通道115的壁117，如图13A的左面板所示，并且此时可引入聚合酶410。然后可将具有附接的MNP的各种碱基引入流体通道115中。然后，将掺入并且可检测到适当的(互补)碱基对(即，对于DNA测序，胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)，或腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T))。假设该过程一次处理一个碱基对，图13A的子面板402(左)示出了根据实施方案的检测方法，在该实施方案中，可使用例如图8A至图12F的各种设备实施方案来确定MNP的存在或不存在以及因此确定碱基。如子面板402所示，聚合酶410结合到壁117并用于捕获诱导的DNA碱基以用于检测。
可通过跨MTJ元件308(磁性传感器105的示例)施加磁场(Happ)来进行测序。可使用电磁体(例如，通过将磁极片放置在检测设备的任一侧上)、分布式线圈、垂直于流体通道115取向的螺线管等施加磁场，以产生在钉扎层的力矩406的方向上的磁场。用于产生磁场的装置可安装在例如检测设备100的底部表面119上。又如，用于产生磁场的设备可包括在包括检测设备100的系统中。应当理解，诸如例如通过使用永磁体或超导磁体来产生磁场的其他合适的装置是可能的，这些装置在本文中具体设想并且不排除在外。
所施加的磁场可实现至少两个目的：(1)该所施加的磁场使所有MNP的力矩在共同方向上对准，使得由于MNP的存在而测得的信号相似，以及(2)该所施加的磁场使自由层的力矩408朝向(或远离，这取决于场取向)钉扎层的力矩406旋转，并且因此使磁性传感器105的电阻从其平衡电阻改变。
图13A的右手边部分示出了钉扎层314(标记为“固定”)和自由层310，就好像从上方观看子面板402一样。钉扎层314和自由层310被绘制成彼此偏离以示出它们的力矩。在自由层310中示出的虚线424是自由层310的力矩的平衡方向。在MTJ元件308(或更一般地，磁性传感器105)附近不存在MNP的情况下，如图13A的右手侧上的情况418(顶部)所示，磁场可将自由层310的磁矩408旋转到钉扎层314的磁矩406的方向上(这取决于MTJ元件308/磁性传感器105设计的细节)。在MTJ元件308(或更一般地，磁性传感器105)附近存在MNP的情况下，如图13A的右手侧上的情况420(底部)所示，将产生边缘场(Hparticle)。这些边缘场将在与所施加的场相同的方向上，并且因此可显著地增加局部靠近磁性传感器105(示出为MTJ元件308)的所施加的场。然后，自由层310的磁矩408将更显著地从其平衡位置(虚线424)旋转，如情况420所示。因此，通过将磁性传感器105连接到测量磁性传感器105的电阻(或电阻的代表，诸如例如，给定电流的磁性传感器105两端的电压)的检测电子器件，可检测到MNP的存在或不存在。可通过测量每个磁性传感器105(例如，每个MTJ元件308)的绝对电阻或通过将电阻与参考单元或位(例如，被完全封装使得其不暴露于来自MNP的场或不受来自MNP的场的影响的磁性传感器105)进行比较来实现该检测。
图13B示出了另一个实施方案，其中自由层310和钉扎层314的相应磁矩408和406分别地相对于图13A颠倒布置。在自由层310中示出的虚线434是自由层310的力矩的平衡方向。如图13B所示，如果所施加的场Happ在沿流体通道115的方向上，则边缘场Hparticle将在与所施加的场Happ相反的方向上。因此，在MTJ元件308(或更一般地，磁性传感器105)附近不存在MNP的情况下，如图13B的右手侧上的情况440(顶部)所示，磁场可将自由层310的磁矩408旋转到钉扎层314的磁矩406的方向上(这取决于MTJ元件308/磁性传感器105设计的细节)。然而，在存在MNP的情况下，磁矩408和406将更接近90度对准，如图13B的右手侧的底部部分所示(情况450)。
制造检测设备的方法
在一些实施方案中，使用光刻工艺和薄膜沉积来制造检测设备100。图14示出了制造检测设备100的方法850，并且图15示出了根据一些实施方案的制造工艺850的每个步骤的结果，其中最终面板示出了结合到接近磁性传感器105的壁117的聚合酶(例如，当检测设备100用于核酸测序时)。在852处，该方法开始。在854处，在基底上制造至少一条流通道120，具体方法是例如通过沉积一个或多个金属层，使用例如光刻法将施加在金属层顶部上的聚合物层中的流通道和空间的阵列图案化，使用该聚合物层作为掩模以用于将金属层蚀刻成流通道的阵列，沉积绝缘电介质材料，剥离流通道上方的聚合物层和电介质材料，以及执行化学机械抛光以使表面平面化。在856处，在至少一条线120上制造磁性传感器阵列110。磁性传感器阵列110中的每个磁性传感器105具有底部部分108和顶部部分109。(参见图6。)底部部分108耦接到至少一条流通道120。在一些实施方案中，每个磁性传感器105的底部部分108与至少一条线120接触。
在858处，将电介质材料沉积在磁性传感器阵列110中的磁性传感器105之间。在860处，制造附加的流通道120。这些附加的线120中的每条线耦接到磁性传感器阵列110中的至少一个磁性传感器105的顶部部分109。在一些实施方案中，每个磁性传感器105的顶部部分109与线120接触。在一些实施方案中，磁性传感器105的底部部分108与第一线120A接触，并且磁性传感器105的顶部部分109与第二线120B接触。在862处，移除与磁性传感器105相邻的电介质材料的一部分(例如，通过铣削、蚀刻或任何其他合适的移除工艺)以形成流体通道115。在864处，工艺850结束。
本文所公开的实施方案提供了若干优点。例如，如前所述，一些实施方案的优点在于，这些实施方案通过迫使用作标签的磁性纳米颗粒在添加到检测设备的流体通道时变为顺磁性的而使得它们不通过磁力彼此相互作用，来简化将碱基引入和掺入微流体池中的操作。
一些实施方案的另一个优点在于，这些实施方案允许以允许所有四种核苷酸前体被区分开的方式同时标记所有四种核苷酸前体。这意味着可将单个化学步骤用于读取靶DNA链中的单种碱基，其中分别在被选择以利用MNP(例如，它们在高于居里温度时是顺磁性的，而在低于居里温度时是铁磁性的)的温度依赖性的三个或四个不同温度下进行三次或四次后续测量。由于各个化学步骤花费大约数分钟的时间，因此所公开的实施方案可显著加快分子检测(诸如DNA测序)，而不影响读取错误率。
如前所述，虽然本文的描述集中于DNA，但所述的各种实施方案一般可应用于核酸测序。类似地，虽然SBS用于描述中的示例性目的，但各种实施方案不限于SBS测序方案(例如，可替代地使用动态测序)。所得的磁性传感器105的阵列(例如，如图6所示)可与使用涉及用MNP标记的DNA碱基(核苷酸前体)的SBS方案的方法一起使用。与蚀刻的纳米通道阵列耦接的磁性传感器阵列(例如，如图9和图12A所示)可有利地用于将各个磁性传感器105暴露于测序试剂，同时用电绝缘材料保护磁性传感器105。可通过放置在密集压紧的磁场感测元件(例如，磁性传感器105)附近的聚合酶分子来执行DNA合成。SBS涉及引物杂交的模板DNA的结合、脱氧核苷三磷酸(dNTP)的插入和掺入。
具体地讲，聚合酶可附接到检测设备100的在阵列内的一个或多个磁性传感器元件附近的纳米通道侧壁。例如，可通过将具有DNA碱基的磁性纳米颗粒(四种类型的纳米颗粒，每组纳米颗粒仅包含一种拴系的碱基)添加到纳米流体或微流体通道中(一次一种类型的纳米颗粒)来进行测序。由于MNP将仅在掺入了适当的碱基对(即，胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)，或腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T))时才结合到聚合酶以及引物杂交的模板DNA，因此磁性颗粒的检测将允许确定模板DNA的未终止端处的碱基。
在前面的描述和附图中，阐述了特定术语来提供对本发明所公开的实施方案的透彻理解。在一些情况下，术语或附图可暗示实践本发明所不需要的具体细节。
为了避免不必要地模糊本公开，熟知的部件以框图形式示出和/或并未详细讨论，或在一些情况下完全不讨论。
除非本文另有具体定义，否则所有术语应被赋予其最广泛的可能解释，包括本说明书和附图所暗示的含义以及本领域技术人员理解的和/或如字典、图书等中所定义的含义。如本文明确阐述的，一些术语可能不符合其普通或惯常含义。
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”不排除复数指代，除非另外指明。除非另有明确说明，否则诸如“一个”或“一种”之类的冠词通常应解释为包括一个或多个所述项目。因此，短语诸如“被配置为...的设备”旨在包括一个或多个所述设备。此类一个或多个所述设备还可以被共同配置为执行所述叙述。例如，“被配置为执行叙述A、B和C的处理器”可以包括被配置为执行叙述A的第一处理器，其与被配置为执行叙述B和C的第二处理器结合工作。
除非另外指明，否则词语“或”应被解释为包括性的。因此，短语“A或B”应解释为以下所有含义：“A和B都”、“A但不是B”和“B但不是A”。本文中对“和/或”的任何使用并不意味着词语“或”单独表示排他性。
如本说明书和所附权利要求书中所用，形式“A、B和C中的至少一者”、“A、B或C中的至少一者”、“A、B或C中的一者或多者”以及“A、B和C中的一者或多者”的短语是可互换的，并且各自涵盖以下所有含义：“仅为A”、“仅B”、“仅C”、“A和B但不是C”、“A和C但不是B”、“B和C但不是A”以及“A、B和C中的全部”。
就在具体实施方式或权利要求书中使用术语“包括”、“具有”及其变体的程度而言，此类术语旨在以类似于术语“包含”的方式包括在内，即，意味着“包括但不限于”。术语“示例性”和“实施方案”用于表示示例，而不是偏好或要求。
如本文所用，术语“在...上方”、“在...下方”、“在...之间”和“在...上”是指一个特征相对于其他个特征的相对位置。例如，设置在另一个特征“上方”或“下方”的一个特征可直接与另一个特征接触，或者可具有居间材料。此外，设置在两个特征“之间”的一个特征可直接与两个特征接触，或者可具有一个或多个居间特征或材料。相反，“在第二特征上”的第一特征与该第二特征接触。
除非另外特别说明或在所使用的上下文内以其他方式理解，否则本文所用的条件语言诸如“可以”、“可”、“可能”、“可能会”、“例如”等通常旨在传达某些实施方案包括某些特征、元件和/或步骤，而其他实施方案不包括该某些特征、元件和/或步骤。因此，此类条件语言通常不旨在暗示特征、元件和/或步骤以任何方式是一个或多个实施方案所需要的，或者一个或多个实施方案必须包括用于在具有或不具有其他输入或提示的情况下决定这些特征、元件和/或步骤是否包括在任何具体实施方案或将在任何具体实施方案中执行的逻辑。
虽然上述详细描述已经示出、描述并指出了应用于各种实施方案的新颖特征，但应当理解，在不脱离本公开的实质的情况下，可对所例示的设备或算法的形式和细节进行各种省略、替换和改变。可以认识到，本文所述的某些实施方案可体现为不提供本文所述的所有特征和有益效果的形式，因为一些特征可与其他特征分开使用或实践。
附图未必按比例绘制，并且特征的维度、形状和尺寸可显著不同于它们在附图中的描绘方式。
尽管已公开了具体实施方案，但将显而易见的是，在不脱离本公开的更广泛的实质和范围的情况下，可对其进行各种修改和改变。例如，至少在可行的情况下，实施方案中任一实施方案的特征或方面可与实施方案中任何其他实施方案组合来应用，或代替其对应的特征或方面来应用。因此，本说明书和附图被认为是示例性意义的而不是限制性意义的。

Claims (48)

1.一种使用测序设备检测分子的方法，所述测序设备包括至少一个流体通道和被配置为检测所述流体通道内的磁性纳米颗粒(MNP)的多个磁性传感器，所述方法包括：
向所述至少一个流体通道添加：
(i)第一多个待检测分子，所述第一多个待检测分子中的至少一些用第一类型的MNP进行标记，其中，在第一温度范围内，由所述第一类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第一阈值，并且在第二温度范围内，由所述第一类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第一阈值，其中所述第一温度范围低于所述第二温度范围，并且
(ii)第二多个待检测分子，所述第二多个待检测分子中的至少一些用第二类型的MNP进行标记，其中，在所述第一温度范围和所述第二温度范围内，由所述第二类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第二阈值；
将所述流体通道内的温度设置为在所述第一温度范围内；
在所述流体通道的所述温度在所述第一温度范围内时，从所述多个磁性传感器中的选定的磁性传感器获得输出，所述输出指示第一检测到的磁场的量值；
将所述流体通道内的所述温度设置为在所述第二温度范围内；
在所述流体通道的所述温度在所述第二温度范围内时，从所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器获得所述输出，所述输出指示第二检测到的磁场的量值；以及
至少部分地基于所述第一检测到的磁场的所述量值和所述第二检测到的磁场的所述量值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器是已检测到所述第一类型的MNP还是所述第二类型的MNP，以检测所述第一多个分子或所述第二多个分子的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述输出包括电阻、电压、电流、频率、噪声或电阻、电压、电流、频率或噪声的变化中的一者或多者。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一阈值和所述第二阈值不同。
4.根据权利要求1所述的方法，其中至少部分地基于所述第一检测到的磁场的所述量值和所述第二检测到的磁场的所述量值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器是已检测到所述第一类型的MNP还是所述第二类型的MNP包括：
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第一阈值以及所述第二检测到的磁场的所述量值小于所述第一阈值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器已检测到所述第一类型的MNP，或者
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第二阈值以及所述第二检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第二阈值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器已检测到所述第二类型的MNP。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的MNP的居里温度不同于所述第二类型的MNP的居里温度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第二类型的MNP的所述居里温度大于所述第一类型的MNP的所述居里温度，并且所述方法还包括：
在向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子之前，将所述流体通道内的所述温度设置为高于所述第一类型的MNP的所述居里温度和所述第二类型的MNP的所述居里温度的温度值，
并且其中向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子发生在所述流体通道内的所述温度处于高于所述第一类型的MNP的所述居里温度和所述第二类型的MNP的所述居里温度的所述温度值时。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述温度值是第一温度值，并且所述方法还包括：
在向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子之前，将所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子的混合物的温度设置为高于所述第一类型的MNP的所述居里温度和所述第二类型的MNP的所述居里温度的第二温度值，所述第二温度值与所述第一温度值相同或不同。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的MNP的阻断温度不同于所述第二类型的MNP的阻断温度。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的MNP和所述第二类型的MNP中的每一种均通过阻断温度来表征，并且所述方法还包括：
在向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子之前，将所述流体通道内的所述温度设置为高于所述第一类型的MNP的所述阻断温度和所述第二类型的MNP的所述阻断温度两者的温度值，
并且其中向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子发生在所述流体通道内的所述温度处于高于所述第一类型的MNP的所述阻断温度和所述第二类型的MNP的所述阻断温度的所述温度值时。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一类型的MNP和所述第二类型的MNP中的每一种均通过阻断温度来表征，并且所述方法还包括：
在向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子之前，将所述第一多个待检测分子和所述第二多个待检测分子的混合物的温度设置为高于所述第一类型的MNP的所述阻断温度和所述第二类型的MNP的所述阻断温度两者的温度值。
11.根据权利要求1所述的方法，其中：
在第三温度范围内，由所述第一类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第一阈值，所述第三温度范围高于所述第二温度范围，并且
在所述第三温度范围内，由所述第二类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第二阈值，
并且所述方法还包括：
向所述流体通道添加第三多个待检测分子，所述第三多个待检测分子中的至少一些用第三类型的MNP进行标记，其中，在所述第一温度范围、所述第二温度范围和所述第三温度范围内，由所述第三类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第三阈值；
将所述流体通道内的所述温度设置为在所述第三温度范围内；
在所述流体通道的所述温度在所述第三温度范围内时，从所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器获得所述输出，所述输出指示第三检测到的磁场的量值；以及
至少部分地基于所述第三检测到的磁场的所述量值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器是否已检测到所述第三类型的MNP。
12.根据权利要求11所述的方法，其中至少部分地基于所述第三检测到的磁场的所述量值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器是否已检测到所述第三类型的MNP包括：
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第三阈值，以及所述第二检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第三阈值，以及所述第三检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第三阈值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器已检测到所述第三类型的MNP。
13.根据权利要求11所述的方法，其中基本上同时向所述流体通道添加所述第一多个分子、所述第二多个分子和所述第三多个分子。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一阈值、所述第二阈值和所述第三阈值中的至少两者不同。
15.根据权利要求11所述的方法，其中：
所述第三类型的MNP的居里温度高于所述第二类型的MNP的居里温度，并且
所述第二类型的MNP的所述居里温度高于所述第一类型的MNP的居里温度。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括：
在向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子、所述第二多个待检测分子和所述第三多个待检测分子之前，将所述流体通道内的所述温度设置为高于所述第一类型的MNP的所述居里温度、所述第二类型的MNP的所述居里温度和所述第三类型的MNP的所述居里温度的温度值，
并且其中向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子、所述第二多个待检测分子和所述第三多个待检测分子发生在所述流体通道内的所述温度处于高于所述第一类型的MNP的所述居里温度、所述第二类型的MNP的所述居里温度和所述第三类型的MNP的所述居里温度的所述温度值时。
17.根据权利要求11所述的方法，其中：
所述第三类型的MNP的阻断温度不同于所述第二类型的MNP的阻断温度，并且
所述第二类型的MNP的所述阻断温度不同于所述第一类型的MNP的阻断温度。
18.根据权利要求11所述的方法，其中：
在第四温度范围内，由所述第一类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第一阈值，所述第四温度范围高于所述第三温度范围，
在所述第四温度范围内，由所述第二类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第二阈值，并且
在所述第四温度范围内，由所述第三类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第三阈值，
并且所述方法还包括：
向所述流体通道添加第四多个待检测分子，所述第四多个待检测分子中的至少一些用第四类型的MNP进行标记，其中，在所述第一温度范围、所述第二温度范围、所述第三温度范围和所述第四温度范围内，由所述第四类型的MNP产生的磁场的量值大于或等于第四阈值；
将所述流体通道内的所述温度设置为在所述第四温度范围内；
在所述流体通道的所述温度在所述第四温度范围内时，从所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器获得所述输出，所述输出指示第四检测到的磁场的量值；以及
至少部分地基于所述第四检测到的磁场的所述量值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器是否已检测到所述第四类型的MNP。
19.根据权利要求18所述的方法，其中至少部分地基于所述第四检测到的磁场的所述量值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器是否已检测到所述第四类型的MNP包括：
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第四阈值，以及所述第二检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第四阈值，以及所述第三检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第四阈值，以及所述第四检测到的磁场的所述量值大于或等于所述第四阈值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器已检测到所述第四类型的MNP。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一阈值、所述第二阈值、所述第三阈值和所述第四阈值中的两者或更多者不同。
21.根据权利要求18所述的方法，其中基本上同时向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子、所述第二多个待检测分子、所述第三多个待检测分子和所述第四多个待检测分子。
22.根据权利要求18所述的方法，其中：
所述第四类型的MNP的居里温度高于所述第三类型的MNP的居里温度，
所述第三类型的MNP的所述居里温度高于所述第二类型的MNP的居里温度，并且
所述第二类型的MNP的所述居里温度高于所述第一类型的MNP的居里温度。
23.根据权利要求22所述的方法，所述方法还包括：
在向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子、所述第二多个待检测分子、所述第三多个待检测分子和所述第四多个待检测分子之前，将所述流体通道内的所述温度设置为高于所述第一类型的MNP的所述居里温度、所述第二类型的MNP的所述居里温度、所述第三类型的MNP的所述居里温度和所述第四类型的MNP的所述居里温度的温度值，
并且其中向所述流体通道添加所述第一多个待检测分子、所述第二多个待检测分子、所述第三多个待检测分子和所述第四多个待检测分子发生在所述流体通道内的所述温度处于高于所述第一类型的MNP的所述居里温度、所述第二类型的MNP的所述居里温度、所述第三类型的MNP的所述居里温度和所述第四类型的MNP的所述居里温度的所述温度值时。
24.根据权利要求18所述的方法，其中：
所述第四类型的MNP的阻断温度不同于所述第三类型的MNP的阻断温度，
所述第三类型的MNP的所述阻断温度不同于所述第二类型的MNP的阻断温度，并且
所述第二类型的MNP的所述阻断温度不同于所述第一类型的MNP的阻断温度。
25.根据权利要求11所述的方法，其中：
在第四温度范围内，由所述第一类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第一阈值，所述第四温度范围高于所述第三温度范围，
在所述第四温度范围内，由所述第二类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第二阈值，并且
在所述第四温度范围内，由所述第三类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第三阈值，
并且所述方法还包括：
向所述流体通道添加第四未标记的多个待检测分子；
将所述流体通道内的所述温度设置为在所述第四温度范围内；
在所述流体通道的所述温度在所述第四温度范围内时，从所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器获得所述输出，所述输出指示第四检测到的磁场的量值；以及
响应于所述第四检测到的磁场的所述量值小于所述第一阈值、小于所述第二阈值以及小于所述第三阈值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器未检测到所述第一类型的MNP、所述第二类型的MNP或所述第三类型的MNP中的任一者。
26.根据权利要求11所述的方法，其中：
在第四温度范围内，由所述第一类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第一阈值，所述第四温度范围高于所述第三温度范围，
在所述第四温度范围内，由所述第二类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第二阈值，并且
在所述第四温度范围内，由所述第三类型的MNP产生的所述磁场的所述量值小于所述第三阈值，
并且所述方法还包括：
向所述流体通道添加第四未标记的多个待检测分子；
将所述流体通道内的所述温度设置为在所述第四温度范围内；
在所述流体通道的所述温度在所述第四温度范围内时，从所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器获得所述输出，所述输出指示第四检测到的磁场的量值：以及
响应于所述第四检测到的磁场的所述量值小于所述第一阈值、小于所述第二阈值以及小于所述第三阈值，确定所述多个磁性传感器中的所述选定的磁性传感器已检测到所述第四未标记的多个分子中的至少一个分子。
27.一种用于对核酸进行测序的系统，所述系统包括：
流体通道，所述流体通道具有用于将待测序的多条核酸链附接到所述流体通道的表面的多个位点；
温度控制设备，所述温度控制设备耦接到所述流体通道，以用于将所述流体通道的内容物的温度设置为在第一温度范围、第二温度范围和第三温度范围中的任一者内，其中所述第一温度范围、所述第二温度范围和所述第三温度范围不重叠；
多个磁性传感器，所述多个磁性传感器被配置为在所述多个位点处检测由一个或多个磁性纳米颗粒(MNP)发射的磁场；和
至少一个处理器，所述至少一个处理器耦接到所述磁性传感器和所述温度控制设备并且被配置为执行机器可执行指令，所述机器可执行指令在被执行时使得所述至少一个处理器：
引导所述温度控制设备将所述流体通道的所述内容物的所述温度设置为在所述第一温度范围内，
从与所述多个位点中的特定位点相关联的磁性传感器获得第一输出，所述第一输出指示第一检测到的磁场的量值，
引导所述温度控制设备将所述流体通道的所述内容物的所述温度设置为在所述第二温度范围内，
从与所述多个位点中的所述特定位点相关联的所述磁性传感器获得第二输出，所述第二输出指示第二检测到的磁场的量值，
引导所述温度控制设备将所述流体通道的所述内容物的所述温度设置为在所述第三温度范围内，
从与所述多个位点中的所述特定位点相关联的所述磁性传感器获得第三输出，所述第三输出指示第三检测到的磁场的量值，以及
至少部分地基于所述第一检测到的磁场的所述量值、所述第二检测到的磁场的所述量值和所述第三检测到的磁场的所述量值，确定所述磁性传感器是否已检测到特定类型的MNP。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述第一输出、所述第二输出或所述第三输出中的至少一者包括电阻、电压、电流、频率、噪声或电阻、电压、电流、频率或噪声的变化中的一者或多者。
29.根据权利要求27所述的系统，其中：
所述第一温度范围低于所述第二温度范围，并且
所述第二温度范围低于所述第三温度范围。
30.根据权利要求27所述的系统，其中所述流体通道包括结构，其中所述结构包括用于将所述待测序的多条核酸链附接到所述流体通道的所述表面的所述多个位点。
31.根据权利要求30所述的系统，其中所述结构包括腔或脊。
32.根据权利要求27所述的系统，其中所述机器可执行指令在被执行时使得所述至少一个处理器：至少部分地基于所述第一检测到的磁场的所述量值、所述第二检测到的磁场的所述量值和所述第三检测到的磁场的所述量值，确定所述磁性传感器是否检测到特定类型的MNP，所述机器可执行指令包括在被执行时使得所述至少一个处理器执行以下中的一者或多者的机器可执行指令：
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值满足或超过第一阈值，以及所述第二检测到的磁场的所述量值不满足所述第一阈值，以及所述第三检测到的磁场的所述量值不满足所述第一阈值，确定所述磁性传感器已检测到第一类型的MNP，
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值满足或超过第二阈值，所述第二检测到的磁场的所述量值满足或超过所述第二阈值，以及所述第三检测到的磁场的所述量值不满足所述第二阈值，确定所述磁性传感器已检测到第二类型的MNP，或者
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值满足或超过第三阈值，以及所述第二检测到的磁场的所述量值满足或超过所述第三阈值，以及所述第三检测到的磁场的所述量值满足或超过所述第三阈值，确定所述磁性传感器已检测到第三类型的MNP。
33.根据权利要求32所述的系统，其中在由所述至少一个处理器执行时，所述机器可执行指令还使得所述至少一个处理器：
引导所述温度控制设备将所述流体通道的所述内容物的所述温度设置为在第四温度范围内，所述第四温度范围高于所述第三温度范围，
从与所述多个位点中的所述特定位点相关联的所述磁性传感器获得第四输出，所述第四输出指示第四检测到的磁场的量值，以及
响应于所述第一检测到的磁场的所述量值满足或超过第四阈值，以及所述第二检测到的磁场的所述量值满足或超过所述第四阈值，以及所述第三检测到的磁场的所述量值满足或超过所述第四阈值，以及所述第四检测到的磁场满足或超过所述第四阈值，确定所述磁性传感器已检测到第四类型的MNP。
34.根据权利要求27所述的系统，其中所述温度控制设备包括热传感器或微处理器中的至少一者。
35.根据权利要求27所述的系统，其中所述温度控制设备包括加热器。
36.根据权利要求27所述的系统，其中所述多个磁性传感器中的至少一个磁性传感器包括磁阻(MR)传感器。
37.一种用于检测耦合到分子的磁性纳米颗粒(MNP)的系统，所述MNP通过特性温度表征，在低于所述特性温度的温度下，所述MNP发射具有高于阈值的量值的磁场，并且在高于所述特性温度的温度下，所述MNP不发射具有高于所述阈值的所述量值的所述磁场，所述系统包括：
流体通道；
温度控制设备，所述温度控制设备耦接到所述流体通道以用于设置所述流体通道的内容物的温度；
控制电路，所述控制电路耦接到所述温度控制设备并且被配置为引导所述温度控制设备将所述流体通道的所述内容物的所述温度设置为第一温度和第二温度，所述第一温度高于所述MNP的所述特性温度，并且所述第二温度低于所述MNP的所述特性温度；
磁性传感器，所述磁性传感器被配置为检测由所述流体通道中的一种或多种MNP发射的磁场；和
检测电路，所述检测电路耦接到所述磁性传感器并且被配置为从所述磁性传感器获得指示所述磁性传感器检测到的磁场量值的输出。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述特性温度为居里温度。
39.根据权利要求37所述的系统，其中所述特性温度为阻断温度。
40.根据权利要求37所述的系统，其中所述控制电路被进一步配置为：
至少部分地基于所述磁性传感器检测到的所述磁场量值，确定所述磁性传感器是否已检测到MNP。
41.根据权利要求40所述的系统，其中所述流体通道的所述内容物的所述温度小于所述特性温度，并且其中至少部分地基于所述磁性传感器检测到的所述磁场量值，确定所述磁性传感器是否已检测到所述MNP包括以下中的一者或多者：
将所述磁性传感器检测到的所述磁场量值与所述阈值进行比较，或者
响应于所述磁性传感器检测到的所述磁场量值大于所述阈值，确定所述磁性传感器已检测到所述MNP。
42.根据权利要求40所述的系统，其中所述流体通道的所述内容物的所述温度大于所述特性温度，并且其中至少部分地基于所述磁性传感器检测到的所述磁场量值，确定所述磁性传感器是否已检测到所述MNP包括：
将所述磁性传感器检测到的所述磁场量值与所述阈值进行比较，以及
响应于所述磁性传感器检测到的所述磁场量值小于所述阈值，确定所述磁性传感器已检测到所述MNP。
43.根据权利要求37所述的系统，其中所述流体通道包括结构，其中所述结构包括用于将多个未鉴定分子附接到所述流体通道的表面以用于进行鉴定的多个位点。
44.根据权利要求43所述的系统，其中所述结构包括腔或脊。
45.根据权利要求37所述的系统，其中所述温度控制设备包括热传感器或微处理器中的至少一者。
46.根据权利要求37所述的系统，其中所述温度控制设备包括加热器。
47.根据权利要求37所述的系统，其中所述磁性传感器包括磁阻(MR)传感器。
48.根据权利要求47所述的系统，其中所述输出包括电阻、电压、电流、频率、噪声或电阻、电压、电流、频率或噪声的变化中的一者或多者。
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