CN113227397A - 用于执行实时比色核酸扩增测定的方法和装置 - Google Patents

用于执行实时比色核酸扩增测定的方法和装置 Download PDF

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E·吉则里
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Abstract

用于进行实时比色核酸扩增测定的方法和装置，其中包含在反应管中的液体样品的加热通过使管的底部与加热元件热接触来进行。反应管的内容物的实时监测通过管的侧壁目视进行，优选通过使用照相机进行。

Description

用于执行实时比色核酸扩增测定的方法和装置
技术领域
本发明涉及执行和监测实时比色核酸扩增测定。
背景技术
在其分子组成方面对生物体的了解已导致主要基于核酸扩增和定量的越来越快速和准确的诊断测试的设计。这也导致了分子诊断学的新趋势，即在采集样品或治疗患者的位置进行实际的诊断测定(“需求点”测试)。对于需求点测试，主要基于核酸扩增和定量的越来越快速和准确的诊断测定的设计目前是一个新兴领域，在医疗保健、农业/食品安全、研究等中具有众多应用。最广泛的测定之一是聚合酶链反应(PCR)，其采用在数个加热循环后会以指数方式扩增特定靶标的聚合酶。每个循环包括三个步骤。1.在92-98℃加热以进行双链DNA变性；2.特异性引物在50-65℃退火；和3.通过聚合酶在72℃进行链延伸。通过将反应容器(通常为Eppendorf管)浸入通常位于加热元件上的加热(金属)块中来实现高效加热，这是快速和正确的产品形成的前提。PCR虽然是基于实验室的核酸检测的黄金标准并且适用于终点和定量实时检测，但对于及时检验(point-of-care)或基于现场的应用而言并不理想。这是因为PCR需要昂贵的和/或难以随用户移动的用于高级温度控制和光学(荧光)监测的装备。一种替代的DNA扩增方法(环介导的等温扩增(LAMP))被认为对于及时检验(POC)应用是理想的，因为它仅需一个温度用于扩增(65℃)，并且可以通过颜色变化(比色)实现DNA的目视检测。在LAMP扩增比色设置中，将反应容器放置在与用于PCR的相似的加热块内。LAMP比色法的当前形式仅基于终点测量。然而，这带来了两个主要的缺点；首先，通常很难通过肉眼辨别颜色变化，其次，终点测量值可以用作定性测试(是或否)，这对于许多重要应用而言是不够的。目前，没有可用的解决方案来克服这些问题。
一旦被解决则将克服上述障碍并允许实时比色核酸扩增的关键特征涉及发明监测溶液的颜色变化而该过程同时与反应的有效加热相结合地发生的方式/方法。当前所有使用的形式均基于反应容器浸入加热块内，其允许在所需的高温下的有效扩增。这意味着只能通过容器的顶部实现目视监测，例如视查和检测。但是，由于在扩增反应过程中容器被加热，因此液体样品的一部分转化为蒸气，这干扰从反应容器顶部进行实时比色监测的任何可能性。因此，LAMP比色法的当前形式仅基于在允许样品冷却至室温后的终点测量。这意味着使用当前的形式不可能进行实时比色监测。
发明内容
本发明人已经开发了一种将原本定性的比色核酸扩增测定(例如LAMP测定)转换成定量的并且通常是实时的程序的方法。为此，开发了用于执行实时比色核酸扩增测定的方法和装置。本发明的一个重要方面是在不将样品浸入在加热块内的情况下加热液体样品。这是通过使包含样品的反应管的底部与加热元件热接触来实现的。由于该方法允许通过反应管的侧壁查看容器的内容物，因此该方法有利于目视监测。本发明还提供了一种通过使用上述加热方法并通过使用例如利用照相机的目视监测来监测比色核酸扩增测定的方法。
另外，本发明提供了用于进行实时比色核酸扩增测定的装置。
附图简要说明
图1显示了反应管的不同部分以及反应管的底部的足迹(footprint)。
图2显示了根据本发明的装置的示意图。
图3显示了根据本发明的装置的实施方案。
图4显示了在根据本发明的装置中反应管的定位。
图5显示了根据本发明并使用酚红和羟基萘酚蓝(HNB)作为指示剂着色物质进行的LAMP测定的实验数据。
图6显示了根据本发明的使用酚红作为指示剂着色物质在不同压力量下进行的LAMP测定的实验数据。
发明详述
在核酸扩增测定中，液体样品通常包含在通常被称为Eppendorf管的反应管中。通常，这样的管由诸如聚丙烯的聚合物材料制成，并且具有10μl至200μl的体积。可以使用其他光学透明/半透明材料和3D打印来制造类似于可商购获得的Eppendorf管的反应管。
在现有技术的系统中，为了将液相加热到所需温度，将管浸入加热块内。
本发明人现已出人意料地发现，将容器浸入加热块内对于有效扩增不是必需的，并且可以通过使包含液相的管的底部与加热元件热接触来加热液相。
根据本发明，“管的顶部”或“反应管的顶部”是开口，液体样品通过该开口被加载到管中。“管的底部”或“反应管的底部”是与管的顶部相对的管的部分。图1a显示了反应管的顶部(1)、底部(2)和侧壁(3)。
根据本发明，反应管可以直接放置在加热元件的表面上。此外，加热元件可以包括由导热材料制成的表面，在其上可以放置反应管。加热元件通常是电阻加热器或珀耳帖元件。
优选地，当放置在加热元件上时，管的纵轴与加热元件形成60至120度的角。更优选地，该角基本上是直角。
对于有效的核酸扩增测定，液相的有效加热是最重要的先决条件之一。现有技术教导，为了有效地加热液相，必须使大面积的反应管与加热体热接触。因此，反应管必须浸入金属块中，该金属块几乎包围整个管并与管的底部和侧壁热接触。这意味着现有技术教导了为了有效地加热，管的几乎整个表面必须与加热体热接触。现在出乎意料地发现，通过仅使管的底部(即管的很小的一部分)与加热元件热接触，就可以实现有效的加热。
优选地，与加热元件热接触的管的面积多至12mm2。更优选地，与加热元件热接触的管的面积多至6mm2。甚至更优选地，与加热元件热接触的管的面积多至3mm2。与加热元件热接触的管的面积可以通过确定管的底部的足迹来确定，如图1b所示。首先，例如用记号笔对管的底部进行着色，然后将管压在一张纸(4)上以获得管的底部的圆形足迹(5)。足迹的面积是与加热元件热接触的管的面积。
本发明人还出乎意料地发现，通过在管上朝向加热元件施加压力，可以提高本发明的加热方法的有效性和效率。例如，通过这样做，显著缩短了扩增反应开始之前所需的时间量。这方面非常重要，尤其是在及时检验应用中，其中必须在尽可能短的时间内进行测定。优选地，施加在反应管上的压力使得通过管施加在加热元件上的压力为0.4MPa至15MPa。更优选地，通过管施加在加热元件上的压力为1MPa至10MPa。甚至更优选地，通过管施加在加热元件上的压力为1MPa至3MPa。可以通过本领域技术人员众所周知的不同手段来调节压力。例如，可以通过在管上施加不同的重量，或者通过使用螺钉系统，或者通过使用磁体系统，来调节压力。压力可以通过本领域技术人员众所周知的方法来确定。例如，可以通过测量由管施加在加热元件上的垂直力，然后测量管的与加热元件接触的面积(如上所述)，和最后将垂直力的值除以面积来计算压力。
核酸扩增测定可以是例如等温扩增测定，例如转录介导的扩增，基于核酸序列的扩增，RNA技术的信号介导的扩增，链置换扩增，滚环扩增，LAMP，等温多重置换扩增，重组酶聚合酶扩增，解旋酶依赖性扩增，单引物等温扩增和环状解旋酶依赖性扩增。优选地，所述测定是LAMP测定。
本发明的加热方法的有效性与其中将管浸入加热块中的现有技术的方法相同。另一方面，本发明的加热方法在能量消耗方面提供了更高的效率，因为加热液相所需的能量较少。
本发明的加热方法的另一个优点是，当管由半透明或透明材料制成时，管的内容物不仅从管的顶部可见，而且更重要的是通过侧壁可见。这意味着在测定的运行期间中，测定的参数(例如比色LAMP测定中的颜色变化)的目视监测成为可能。这是因为在扩增反应期间样品的蒸发不会干扰监测。因此，本发明的加热方法使得能够实时监测测定。
因此，本发明的另一方面是一种用于进行实时比色核酸扩增测定的方法，其中该方法包括通过使包含液相的管的底部与加热元件热接触来加热液相，和利用测定的参数的实时目视监测。
目视监测包括通过用户的眼睛的监测以及通过照相机的监测。优选地，监测是通过照相机进行的。
根据一个优选的实施方案，本发明提供了一种方法，其中使用彩色数码相机监测由于有色物质的形成、反应或颜色变化而引起的液体样品的颜色的实时变化。
根据该优选实施方案，该方法包括使用彩色数码相机记录液体样品的一个或多个图像，对每个图像处理从图像获得的红色通道数据、绿色通道数据和蓝色通道数据中的一个或多个，从而获得测定的参数。
在终点测定中，该方法通常涉及单个图像的记录和处理。当该方法涉及记录和处理从多个图像获得的数据时，一系列图像可以形成视频。
测定的参数可以是例如分析物的存在或其量或核酸扩增反应(例如LAMP)的效率。
有色物质包括在测定过程中形成或消耗或改变其颜色的物质。颜色的变化可以例如响应于pH的变化或响应于化学反应而发生。颜色变化可能涉及从一种颜色到另一种颜色的变化，或者从一种颜色到透明的变化，反之亦然。
用于核酸扩增测定的有色物质的示例包括羟萘酚蓝(HNB)、酚红、钙黄绿素、结晶紫、SYBR绿I、甲酚红、中性红、间甲酚紫、金纳米颗粒、聚二乙炔(PDA)脂质体和其他本领域技术人员公知的物质。
图像的记录和/或从图像获得的数据的处理可以包括一个或多个图像处理步骤，例如颜色模式转换、图像校正和伽马校正中的一个或多个。
通常，图像包括像素，并且处理步骤包括从图像的像素中提取红色、绿色和蓝色中的一种或多种的光的水平，例如其强度，从而分别获得红色、绿色和蓝色通道数据中的一种或多种。所记录的光的水平(例如强度)可以用图像的像素表示。该水平可以是强度，例如由照相机的通道记录的强度。该水平可以是RGB颜色值，例如8位、16位、24位或32位。
通常，由数码相机记录的图像的像素包括各自代表图像的不同颜色分量的元素。颜色分量通常是红色、绿色和蓝色，分别对应于红色、绿色和蓝色通道，尽管照相机可以记录根据不同的颜色模型(例如使用亮度、色度和色相作为维度的CIECAM02)的数据和/或可以使用根据不同的颜色模型(例如使用亮度、色度和色相作为维度的CIECAM02)的数据存储图像。
图像可以是液相的区域的多像素图像。图像可以是液相的区域的单像素图像，其可以例如使用光纤或每个颜色通道的光纤来获得。图像可以例如显示在计算机屏幕上，或者以显示图像的领域的技术人员已知的任何其他方式显示。
本发明的处理步骤可以包括例如通过执行数学运算从红色通道数据、绿色通道数据和蓝色通道数据中的一个或多个中计算值。
优选地，处理步骤包括计算红色通道数据、绿色通道数据和蓝色通道数据中的三个中的两个之间的差异。更优选地，处理步骤包括计算红色通道数据和绿色通道数据之间，或蓝色通道数据和绿色通道数据之间的差异。
可以使用数码相机进行液相的视频图像记录。然后可以使用例如硬件处理器将这样的视频图像记录分解成其组成图像。视频图像可以使得能够实时监测液相测定。
本发明的另一方面是一种用于执行本发明的方法的装置。因此，本发明提供了用于进行实时比色核酸扩增测定的装置，其中所述装置包括
加热元件
由半透明或透明材料制成的反应管，其被布置为使得管的底部与加热元件热接触，
彩色数码相机，其被布置为使得其可以通过反应管的侧壁记录图像，和
处理单元，其被配置为处理由彩色数码相机获得的图像并处理图像的红色、绿色和蓝色通道数据中的一个或多个由此获得所述测定的参数。
优选地，该装置还包括用于在反应管上朝向加热元件施加压力的装置。
在图2中显示了根据本发明的装置的示意图。在反应管(18)中进行核酸扩增，反应管位于加热元件(10)上，使得仅管的底部与加热元件热接触。照相机(13)被布置为使得其可以通过反应管的侧壁记录图像。照相机(13)的输出被传递到诸如计算机的处理单元(22)，其具有处理器(23)和用于存储图像数据和由处理器执行的计算机程序的存储器(24)。如图2所示，处理单元(22)可以是单独的单元，或者可以是照相机或包括照相机的其他设备的组成部分。
图3显示了根据本发明的装置的实施方案，其可以用于执行和监测核酸扩增测定，例如比色LAMP测定。
该装置包括主壳体单元(6)，该主壳体单元(6)包括主开关(8)和电源插座(9)。它还包括加热元件(10)，加热元件(10)通过加热元件支架(11)连接到主壳体单元(6)。主壳体单元(6)还包括用于接收照相机模块(13)的照相机支架(12)和用于照亮反应管的内容物的LED灯(14)。主壳体(6)还包括用于处理由照相机记录的图像的微处理器和电子板(未显示)。
该装置还包括盖(7)，该盖(7)包括四个大磁体(15)，它们与主壳体单元(6)的相应大磁体(16)接合，并在将盖(7)放置在主壳体单元(6)上时将盖(7)固定在其预期位置。
该装置还包括反应管支架(17)，其包括用于接收反应管(18)的插槽。反应管(18)由半透明材料制成。反应管支架(17)还包括背景壁(19)，该背景壁在其面向管(18)的一侧上具有白色，这有助于监测测定期间的颜色变化。
为了执行测定，将液体样品加入放置在相应插槽中的反应管(18)。将反应管支架(17)放置在加热元件(10)上(图4a)，使得反应管(18)的底部与加热元件(10)热接触。这允许照相机通过管的侧壁查看液相(图4b)。通过使盖的大磁体(15)与主壳体单元(6)的大磁体(16)接合，将盖(7)固定在其位置上。由此，反应管支架(17)通过与盖(7)的相应的小磁体(21)接合的小磁体(20)固定在其位置上。可以通过改变盖(7)和主壳体单元(6)上的大磁体(15)和(16)的尺寸和/或数量来调节由管(18)的底部施加在加热元件(10)上的压力。
数码相机记录测定期间的图像，其被传送到处理单元。处理单元被配置为计算红色和绿色或蓝色和绿色通道之间的差异。处理这些值随时间的变化以计算液相的颜色的变化。
实施例
实施例1
将重悬于PBS缓冲液中的细菌细胞在95℃裂解1分钟。沙门氏菌入侵基因invA被一组六种引物靶向，其中两种外部引物(F3和B3)、两种内部引物(FIP和BIP)和两种环状引物(Loop-F和Loop-B)。
FIP:GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG
BIP:CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG
F3:GGCGATATTGGTGTTTATGGGG
B3:AACGATAAACTGGACCACGG
Loop F:GACGAAAGAGCGTGGTAATTAAC
Loop B:GGGCAATTCGTTATTGGCGATAG
总体积为25μl的LAMP试剂混合物，其包含12.5μl标准品或比色WarmStart 2×Master Mix(New England BioLabs)(其使用酚红作为有色物质)、1.8μM FIP和BIP、0.1μMF3和B3、0.4μMLoop-F和Loop-B以及PBS中的1μl裂解细胞。反应在放置在如图3-4所示的装置中的反应管中进行。通过装置的数码相机记录管的内容物的图像来进行测定的监测。
实施例2
从实施例1得到的图像如下处理。
首先，如上文所述，获得液相的图像序列。来自照相机的原始红色(R)、绿色(G)和蓝色(B)通道可以经受图像处理，包括例如伽玛校正、颜色调整等。其次，从每个图像的一个或多个像素中提取红色、绿色和蓝色通道数据。
在第三步中，对于每个红色、绿色和蓝色通道，对于每个时间点，减去红色、绿色和蓝色通道的初始值，以给出从零开始的数据。被减去的值可以分别是在第一时间点的红色、绿色或蓝色的值，尽管通常可以将来自多个初始时间点的值进行平均，或者可以绘制曲线并计算和减去时间零轴截距。
接下来，计算两个通道之间的差异。在以下使用酚红的示例方案中，计算绿色和蓝色值之间的差(即从绿色值中减去从上一步获得的蓝色值)。这发生在每个时间点。通过使用HNB，计算绿色和红色值之间的差。
接下来，可选地绘制差异，然后进行分析，以确定测定的一个或多个参数。计算出的差值增加到阈值以上的时间可用于确定分析物的存在或量，例如相对于对照(它可以是使用已知浓度的分析物和/或预先存储的数据的一个或多个反应的平行测量值)。还可以分析差值随时间的变化，以建立扩增反应的效率，以及例如通过外推回到起始时间来改善对分析物的量的估计。
图5显示了使用两种不同的有色物质(酚红(其是pH指示剂)和HNB(其是金属结合指示剂))对2个阳性(感染的/存在10种细菌)样品的LAMP扩增的实时监测的比较结果。随着测定的进行，根据时间自动记录和分析液相的图像。在每种情况下计算绿色和蓝色通道或绿色和红色通道之间的差异。在测定过程中，由反应管施加在加热元件上的压力为2MPa。
图5显示了使用酚红或HNB颜色指示剂对10种细菌的LAMP扩增期间的实时曲线。对于酚红色指示剂计算了绿色和蓝色通道之间的差异，而绿色和红色像素之间的差异用于HNB。该图表明，在两种情况下，在反应的第15分钟之前可以观察到阳性信号。因此，可以确定是否存在分析物(在这样的情况下为沙门氏菌细胞)，并且在给定时间处的差异大小可用于确定分析物的量，例如与一种或多种对照相比。
实施例3
本实施例举例说明来自通过使用实施例2的图像处理将阳性(感染的/存在沙门氏菌)样品与阴性(未感染的/不存在沙门氏菌)样品进行比较的第二组结果。在这样的情况下使用的有色物质是酚红。随着测定的进行，根据时间记录了液相的图像。计算绿色和蓝色通道之间的差异。
图6a显示了在如图3-4所示的装置中放置的反应管中进行沙门氏菌细胞(阳性样品相对阴性样品)的实时比色LAMP检测。由管施加在加热元件上的压力为0.4MPa。阳性曲线的颜色的变化在第23分钟开始。在第30分钟测得的最大颜色变化(颜色指数单位)为17个单位。
图6b显示了以与上一段所解释的相同的方式进行沙门氏菌细胞(阳性样品相对阴性样品)的实时比色LAMP检测的示例。但是，在这样的情况下，由管施加在加热元件上的压力为2MPa。阳性曲线颜色的变化在第17分钟开始。在第30分钟测得的最大颜色变化(颜色指数单位)为28个单位。在指数扩增测定的情况下提前6分钟的检测可导致1-2个数量级的改善的灵敏度。

Claims (25)

1.一种用于在包含在由半透明或透明材料制成的反应管(18)中的液体样品中进行实时比色核酸扩增测定的方法，其中所述方法包括：
通过使反应管(18)的底部(2)与加热元件(10)热接触来加热所述液体样品，和
通过反应管(18)的侧壁(3)目视监测所述测定的参数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在反应管(18)上朝向加热元件(10)施加压力。
3.根据权利要求2所述的方法，其中由反应管(18)施加在加热元件(10)上的压力为0.4MPa至15MPa。
4.根据权利要求3所述的方法，其中由反应管(18)施加在加热元件(10)上的压力为1MPa至10MPa。
5.根据权利要求4所述的方法，其中由反应管(18)施加在加热元件(10)上的压力为1MPa至3MPa。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中反应管(18)的纵轴与加热元件(10)形成60度至120度的角。
7.根据权利要求6所述的方法，其中反应管(18)的纵轴与加热元件(10)形成90度的角。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中反应管(18)与加热元件(10)热接触的面积多至12mm2。
9.根据权利要求8所述的方法，其中反应管(18)与加热元件(10)热接触的面积多至6mm2。
10.根据权利要求9所述的方法，其中反应管(18)与加热元件(10)热接触的面积多至3mm2。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中反应管(18)由透明材料制成。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述监测是由数码相机执行的。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增测定是等温核酸扩增测定。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸扩增测定是环介导的等温扩增测定。
15.一种用于执行根据权利要求1至14中任一项所述的实时比色核酸扩增测定的装置，其中所述装置包括：
加热元件(10)，
由半透明或透明材料制成的反应管(18)，其被布置为使得管(18)的底部(2)与加热元件(10)热接触，
彩色数码相机，其被布置为使得其可以通过反应管(18)的侧壁(3)记录图像，和
处理单元，其被配置为处理由彩色数码相机获得的图像并处理图像的红色、绿色和蓝色通道数据中的一个或多个由此获得所述测定的参数。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述装置还包括用于在反应管(18)上朝向加热元件(10)施加压力的工具(15、16)。
17.根据权利要求15或16所述的装置，其中由反应管(18)施加在加热元件(10)上的压力为0.4MPa至15MPa。
18.根据权利要求17所述的装置，其中由反应管(18)施加在加热元件(10)上的压力为1MPa至10MPa。
19.根据权利要求18所述的装置，其中由反应管(18)施加在加热元件(10)上的压力为1MPa至3MPa。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的装置，其中反应管(18)由透明材料制成。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的装置，其中反应管(18)与加热元件(10)热接触的面积多至12mm2。
22.根据权利要求21所述的装置，其中反应管(18)与加热元件(10)热接触的面积多至6mm2。
23.根据权利要求22所述的装置，其中反应管(18)与加热元件(10)热接触的面积多至3mm2。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的装置，其中反应管(18)的纵轴与加热元件(10)形成60度至120度的角。
25.根据权利要求24所述的装置，其中反应管(18)的纵轴与加热元件(10)形成90度的角。
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