CN113215103B - 一种生产杂合型n糖链修饰糖蛋白细胞株dfko及其制备方法 - Google Patents

一种生产杂合型n糖链修饰糖蛋白细胞株dfko及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO及其制备方法，其制备方法包括，将靶序列连接到CRISPR‑Cas9敲除系统的PX330‑EGFP质粒中，转染于HEK293野生型细胞中，转染后利用流式分选仪进行筛选富集和有限稀释，得到DFKO单克隆细胞。本发明在哺乳动物细胞HEK293中，利用CRISPR‑Cas9技术敲除N糖基化路径的MAN2A1、MAN2A2和FUT8基因，建立了三基因敲除细胞DFKO，该细胞可生产以杂合型且不含核心岩藻糖修饰为主要N糖链。该细胞株可应用于生产生物医药糖蛋白，能大大提高其稳定性和生物活性；特别地，由于DFKO细胞株丧失了核心岩藻糖修饰，利用该细胞株生产抗体，可以大大提高该抗体的ADCC效力。

Description

一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO及其制备方法
技术领域
本发明属于生物科技技术领域，具体涉及一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株 DFKO及其制备方法。
背景技术
蛋白质糖基化修饰是真核生物中高度保守的翻译后修饰(post-translationalmodification, PTM)方式之一，在细胞生命活动中发挥重要作用。目前，生物医药糖蛋白的生产与发展的 关键性问题就是在于蛋白质的糖基化修饰。与受中心法则严格调控的转率和翻译过程不同， 蛋白质的糖基化修饰乃至于翻译后修饰都是一个相对随机的过程，蛋白是否被修饰只取决于 是否与相应的酶接触充分，所以同一蛋白上发生的翻译后修饰可能会不一致。
糖蛋白是生物体维持正常生命活动的一类重要的功能性蛋白。从结构上来看，糖蛋白是 由分支的寡糖链与多肽链共价相连接的复合蛋白，其中寡糖链和多肽链的连接方式有以下几 种：N-糖苷键型、O-糖苷键型、GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚定型和蛋白聚糖型。N-糖苷键型 修饰是真核生物中最为广泛的的翻译后修饰之一，其通常发生于肽链中天冬酰胺-X-丝氨酸/ 苏氨酸(N-X-S/T，X可以是除了脯氨酸之外的任意氨基酸)这一保守氨基酸序列的天冬酰 胺的侧链酰胺基团上。N-糖苷键型糖链(也称为N糖链)具有五糖核心，主要包括三类寡 糖链：①高甘露糖型，由GlcNAC和甘露糖组成；②复合型糖型，除了GlcNAC和甘露糖外， 还有半乳糖和唾液酸等；③杂合型糖型，具有①和②的特征。
N糖链的合成是一系列由糖基转移酶和糖苷酶催化的酶促反应结果，这些反应之间存在 着协同或竞争的关系，所以最终导致细胞内可合成各种高度复杂的糖链结构，称为糖链微观 不均一性。这种微观不均一性直接影响生物制药糖蛋白的药效学和药代动力学性质，如抗体 依赖的细胞毒性(Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity，ADCC)，补体依赖的细胞毒作用 (Complement-Dependent Cytotoxicity，CDC)以及其在体内的半衰期等。为解决糖链微观不 均一性这一问题，改善生物制药蛋白的稳定性，生物活性和免疫原性，研究者们提出了许多 关于N糖基化路径改造的方法。Zong等人利用CRISPR/Cas9技术将CHO-S细胞的N-糖基 化路径中FUT8基因进行敲除，使得蛋白上糖链的核心岩藻糖修饰丧失，从而得到了生产高 ADCC活性抗体药物的细胞株。Jin和Ren等人在人胚胎肾细胞293(HEK293)细胞中敲除 了内质网和高尔基体的α1,2甘露糖苷酶，在敲除细胞中只检测到高甘露糖型N糖链，使糖 链结构得以均一化和简化，并且该作者在敲除细胞内过表达只携带高甘露糖型的重组溶酶体 酸性脂肪酶(LIPA)，这种酶可应用治疗溶酶体贮积疾病。本发明具体主要涉及在哺乳动物 细胞中构建用于生产以杂合型且不含核心岩藻糖修饰为主要N糖链的糖蛋白的敲除细胞株， 以往的文献或者专利都未曾报道过这样的细胞株。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本 部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书 摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种生产杂 合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋 白的细胞株DFKO的制备方法，其包括，利用CRISPR-Cas9敲除系统，敲除或破坏HEK293细胞的N糖基化路径的基因，获得敲除N糖基化路径基因的细胞株DFKO。
作为本发明所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO的制备方法，其中：所述N糖基化路径的基因包括MAN2A1、MAN2A2和FUT8中的一种或几种。
作为本发明所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO的制备方法，其中：所述敲除或破坏细胞的N糖基化路径的基因，其为先敲除MAN2A1和/或MAN2A2基因再 敲除FUT8基因。
作为本发明所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO的制备方法，其中：所述敲除或破坏，其为将靶序列连接到所述CRISPR-Cas9敲除系统的PX330-EGFP质粒中，再转染于HEK293细胞中，EGFP阳性细胞株经筛选富集、有限稀释，得到DFKO细胞株。
作为本发明所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO的制备方法，其中：所述靶序列包括序列SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:24中的一种或几种；所述PX330-EGFP质粒包括PX330-EGFP-MAN2A1-Target1、PX330-EGFP-MAN2A1-Target2、 PX330-EGFP-MAN2A2-Target1、PX330-EGFP-MAN2A2-Target2、PX330-EGFP-FUT8-Target1、 PX330-EGFP-FUT8-Target2中的一种或几种。
作为本发明所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO的制备方法，其中：所述转染，其使用的转染试剂包括PEI-MAX、OPTI中的一种或几种。
作为本发明所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO的制备方法，其中：所述转染，其包括以下步骤，将PEI-MAX与OPTI混合稀释，体积比为1：50，获得第一混 合液，静置5～10分钟；将PX330-EGFP质粒稀释于OPTI中，质粒使用量与OPTI比例为 4ng：250μl，获得第二混合液，静置5～10分钟；混匀所述第一混合液和所述第二混合液，静 置15～30分钟；均匀加到HEK293细胞中。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO， 其中：所述细胞株为MAN2A1/A2/FUT8基因三敲除细胞株DFKO，保藏号为CCTCC No.C2020123，保藏在中国典型培养物保藏中心。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO 的敲除质粒，其包括PX330-EGFP-MAN2A1-Target1；PX330-EGFP-MAN2A1-Target2；PX330-EGFP-MAN2A2-Target1；PX330-EGFP-MAN2A2-Target2；PX330-EGFP-FUT8-Target1；PX330-EGFP-FUT8-Target2中的一种或几种。
作为本发明的另一方面，本发明提供生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO的 敲除引物，其包括FUT8-Target1，FUT8-c1f1，FUT8-c1r1，FUT8-Target2，FUT8-c2f2，FUT8-c2f2 KO-CHECK-F3，KO-CHECK-R3，MAN2A1-Target1，MAN2A1-c1f1，MAN2A1-c1r1，MAN2A1-Target2，MAN2A1-c2f2，MAN2A1-c2r2，KO-CHECK-F1，KO-CHECK-R1， MAN2A2-Target1，MAN2A2-c1f1，MAN2A2-c1r1，MAN2A2-Target2，MAN2A2-c2f2， MAN2A2-c2f2，KO-CHECK-F2，KO-CHECK-R2中的一种或几种，其序列如SEQ ID NO:1 -SEQ ID NO:24所示。
本发明的有益效果：
(1)本发明在哺乳动物细胞HEK293中，利用CRISPR-Cas9技术敲除N糖基化路径的MAN2A1、MAN2A2和FUT8基因，建立了三基因敲除细胞DFKO，该细胞可生产以杂合型 且不含核心岩藻糖修饰为主要N糖链的糖蛋白。相比于野生型细胞，敲除细胞株DFKO可 产生的杂合型N糖链占所有N糖链的比例增加了60％，同时不含核心岩藻糖修饰的杂合型 N糖链比例大大提高，并且可使用该敲除细胞株表达携带杂合型且不含核心岩藻糖修饰N 糖链的重组蛋白。(2)三基因敲除细胞DFKO保证了其可以生产均一化的糖链，如果将这 一敲除细胞应用于生产生物医药糖蛋白，能大大提高其稳定性和生物活性。(3)特别地， 由于DFKO细胞株丧失了核心岩藻糖修饰，利用该细胞株生产抗体，可以大大提高该抗体 的ADCC效力。
附图说明
图1为哺乳动物细胞中N糖基化途径；
图2为MAN2A1和MAN2A2基因敲除验证，其中，A为MAN2A1敲除验证核酸电泳图， B为MAN2A1敲除序列测序分析图，C为MAN2A2敲除验证核酸电泳图，D为MAN2A2敲 除序列测序分析图；
图3为敲除细胞表面N糖链凝集素染色流式分析，其中，A为敲除细胞株凝集素PHA-L4 染色流式图，B为敲除细胞株凝集素PHA-L4染色定量分析图，C为敲除细胞株凝集素ConA 染色流式图，D为敲除细胞株凝集素Con A染色定量分析图，E为敲除细胞株凝集素LCA 染色流式图，F为敲除细胞株凝集素LCA染色定量分析图；
图4为HEK293野生型和敲除细胞M2DKO表面N糖链质谱分析，其中，A为HEK293 野生型表面N糖链质谱分析，B为M2DKO表面N糖链质谱分析，图中的图形图例与图1 相同；
图5为FUT8基因敲除验证与敲除细胞DFKO表面N糖链质谱分析，其中，A为FUT8 敲除验证核酸电泳图，B为FUT8敲除序列测序分析图，C为DFKO凝集素LCA染色流式 图，D为DFKO凝集素LCA染色定量分析图，E为DFKO表面N糖链质谱分析；
图6为敲除细胞株所表达的重组溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)上N糖链质谱分析；
图7为敲除细胞株所表达的人源IgG1恒定片段(Fc)上N糖链质谱分析。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明 的具体实施方式做详细的说明。
本发明的方案主要过程如下：
1.利用CRISPR/Cas9敲除技术敲除HEK293野生型细胞中的高尔基体甘露糖苷酶II和 α1,6岩藻糖基转移酶以去除野生型细胞中的复杂型糖链和核心岩藻糖修饰。
2.三基因敲除细胞株DFKO能够通过凝集素染色和质谱分析技术来鉴定细胞表面糖蛋 白上的N糖链的变化，从而验证敲除细胞株的正确构建。
3.使用已获得的DFKO敲除细胞株分别表达重组溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和人源IgG1恒定片段(Fc)，同时鉴定两种重组蛋白上的N糖链。
本发明中的细胞株DFKO为人胚肾细胞293-MAN2A1&A2&FUT8-DFKO，于2020年07 月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C2020123。
实施例1
下面是根据(附图1)的N糖基化路径图，通过CRISPR/Cas9敲除技术敲除HEK293 野生型细胞中高尔基体甘露糖苷酶II和α1,6岩藻糖转移酶以及利用凝集素染色和质谱分析技术来鉴定细胞表面N糖链变化。
1.编码高尔基体甘露糖苷酶II两个基因MAN2A1和MAN2A2的敲除
1.1MAN2A1和MAN2A2的敲除质粒构建
利用CRISPR-Cas9技术敲除基因往往需要设计一个20bp长度的序列片段，且该序列片 段后要有一个PAM位点(NGG/NAG)。在本实验中，需要敲除的两个基因MAN2A1和MAN2A2的基因序列可从NCBI中下载。同时guide-RNA的设计，在Michael Boutros lab'sTarget Finder(http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)上可找到敲除基因所需的 guide-RNA的DNA序列。
MAN2A1的两条靶序列和使用的敲除验证引物序列如下：
MAN2A1-Target1：GATCAGGTCCACAAGTGTGA NGG
MAN2A1-c1f1：CACCGATCAGGTCCACAAGTGTGA
MAN2A1-c1r1：AAACTCACACTTGTGGACCTGATC
MAN2A1-Target2：GATTTTAAACGTCTTCCTGG NGG
MAN2A1-c2f2：CACCGATTTTAAACGTCTTCCTGG
MAN2A1-c2r2：AAACCCAGGAAGACGTTTAAAATC
KO-CHECK-F1：AGATTTTATAAATGCAGGTTTGTGTGTTGGC
KO-CHECK-R1：TGGCTAATAAAGCCCATTTGTTCAACC
MAN2A2的两条靶序列和使用的敲除验证引物序列如下：
MAN2A2-Target1：GGATGAGGAGCACGAGCAGC NGG
MAN2A2-c1f1：CACCGGATGAGGAGCACGAGCAGC
MAN2A2-c1r1：AAACGCTGCTCGTGCTCCTCATCC
MAN2A2-Target2：GCCTACCTCTTCCTGCCCGA NGG
MAN2A2-c2f2：CACCGCCTACCTCTTCCTGCCCGA
MAN2A2-c2f2：AAACTCGGGCAGGAAGAGGTAGGC
KO-CHECK-F2：TGGGGAAGCTATTCCGTGTCC
KO-CHECK-R2：GCCAGGTTGTTCAAGGCATCTTT
将含有CRISPR-Cas9敲除系统的质粒PX330-EGFP用Bpi I切开，将设计好的MAN2A1和MAN2A2 guide-RNA的DNA靶序列连接到PX330-EGFP质粒中，命名为：
PX330-EGFP-MAN2A1-Target1/PX330-EGFP-MAN2A1-Target2
PX330-EGFP-MAN2A2-Target1/PX330-EGFP-MAN2A2-Target2
1.2转染敲除质粒于HEK293野生型细胞
HEK293细胞是人类胚胎肾脏细胞，最初是由荷兰生物学家Alex Van der Eb在上世纪 70年代初分离并生长的，其高转染效率用于研究外源蛋白和病毒的表达生产。将HEK293 野生型细胞接种于6孔板中，使用10％FBS过夜培养之后，待细胞密度长到大概90％-95％左 右时，可进行转染。本发明使用的转染试剂为PEI-MAX(2mg/ml pH 7.5),转染前需要先将 PEI-MAX与OPTI混合稀释，两者的大概比例为1μl PEI-MAX：50μl OPTI；然后将准备敲 除的目的基因的一对敲除质粒稀释于OPTI中，质粒使用总量与OPTI比例为4ng：250μl； 两者静置5分钟后，混匀；室温再次静置20分钟后，均匀加到之前所准备的细胞中。转染后12小时，更换培养基，3天后，利用GFP对转染后的细胞进行分选。
1.3利用有限稀释得到单克隆敲除细胞
分选后所得到的细胞加入双抗培养基，培养5天，对细胞进行消化，使用有限稀释将细 胞接种于96孔板中，得到单克隆细胞。
1.4MAN2A1和MAN2A2基因敲除验证
当细胞数量增加后将单克隆细胞转移至12孔板培养。当其生长为100％状态时，提取细 胞基因组。移去培养基，使用1ml PBS冲洗一次，加入100ul的Trypsin/EDTA消化细胞，加入1ml培养基收获细胞。所得细胞液进行3000rpm 2min的离心，并再次使用1ml PBS冲 洗得到细胞。在细胞中加入50ul 50mM NaOH并于金属浴中95摄氏度反应20分钟，反应结 束后加入8.3ul 1M Tris(pH 7.5)于15000rpm 3min进行离心，取上清(即为细胞基因组) 待用。
使用KODFxNEO酶进行基因敲除结果验证的反应体系如下(50ul)：25ul KODbuffer、 10ul dNTP、2ul引物F、2ul引物R、0.5ul模板、0.5ul KOD酶和10ul超纯水。PCR反应如下 进行：在95℃预变性4min，然后优化循环，在98℃变性10s，在60℃退火30s，在68℃延伸 40s，循环35次，然后在68℃下延伸2min，冷却至4℃。
验证的琼脂糖凝胶电泳的结果(附图2A)，如图所示(附图2B)，可以看到MAN2A1CHECK PCR中，对比HEK293野生型细胞，MAN2A1-KO3单敲和M2DKO-KO3双敲细胞 的条带大小从326bp变成了272bp；如图所示(附图2CD)，可以看到MAN2A2 CHECK PCR 中，MAN2A2-KO2单敲细胞的条带有两条，对比HEK293野生型细胞，且根据基因测序结 果，小的条带减少76bp，大的条带减少了76bp后，又插入了71bp；M2DKO-KO3双敲细胞 有三条条带，最上面的条带减少76bp，又插入了890bp，中间的条带减少了76bp，又插入了 438bp，最底下的条带间减少了76bp，未插入其他片段。综上所述，以上敲除型细胞在翻译 MAN2A1和MAN2A2所编码的糖苷酶时，会发生移码突变，最终使得该基因敲除。
2.利用流式分析仪对细胞表面糖蛋白的N糖链进行检测分析
在使用CRISPR-Cas9技术敲除MAN2A1和MAN2A2后，双敲细胞表面糖蛋白的N糖链会发生一定的变化(附图3)。在本发明中我们使用凝集素对细胞染色，再用荧光基团标记，最后利用流式分析仪对其N糖链进行检测。在这里我们使用三种生物素标记的凝集素，分别是PHA-L4(附图3AB),ConA(附图3CD)和LCA(附图3EF)。PHA-L4可以识别 复合型糖型；ConA可以识别高甘露糖型和杂合型糖型；LCA可以识别带有核心岩藻糖修饰 的糖型。通过用不同凝集素对敲除细胞进行染色，可以鉴定出基因敲除前后的细胞表面糖型 的变化。具体的实验方法如下：
⑴将细胞接种于12孔板中，待其细胞密度达到到95％-100％；
⑵加入300ul FACS solution，收获细胞，3000rpm 3min离心并去上清；
⑶凝集素PHA-L4，ConA和LCA用FACS solution稀释100倍，每个细胞加入50ul；
⑷染色15min后，加入100ul FACS solution终止反应，3000rpm 3min离心并去上清；
⑸再加入100ul FACS solution终止反应，3000rpm 3min离心并去上清；
⑹将带有荧光基团的二抗链霉亲和素-藻红蛋白同样用FACS solution稀释100倍，每个 细胞加入50ul；
⑺染色15min后，加入100ul FACS solution终止反应，3000rpm 3min离心并去上清；
⑻再加入100ul FACS solution终止反应，3000rpm 3min离心并去上清；
⑼最后加入100ul FACS solution重悬细胞，进行流式检测。
结果如图所示(附图3)，在M2DKO细胞中复合型糖链已经减少，相反带有核心岩藻糖修饰的杂合型糖链明显增加了；而单敲除细胞株MAN2A1-KO3和MAN2A2-KO2则相较 于野生型变化较小。HEK293野生型和M2DKO细胞表面糖链MALDI TOF质谱原始数据和 糖链结构解析以及每种糖链的相对强度(每种糖链intens占所有糖链总intens的比例)如表 1和2所示：
Figure BDA0002980635850000061
/>
Figure BDA0002980635850000071
/>
Figure BDA0002980635850000081
Figure BDA0002980635850000082
Figure BDA0002980635850000091
/>
注：NeuAc:N-乙酰神经氨酸；Hex:已糖；HexNAc:N-乙酰已糖胺；dHex:脱氧已糖
3.利用MALDI-TOF检测细胞表面糖蛋白的N糖链
在细胞糖链类型得到进一步确认后有必要对其糖链进行结构解析，我们使用质谱分析仪 MALDI-TOF来对细胞表面糖蛋白的N糖链进行测定。
3.1细胞表面糖肽的获取
将待检测细胞接种于10cm平板，等待细胞密度增长到90％-95％时，去掉培养基；沿着 平板壁缓慢加入5ml冰PBS洗涤细胞，重复此操作5次；最后加入5ml冰PBS收获细胞，3000rpm 3min离心并去上清；用1ml冰PBS重悬细胞，吹吸洗涤，3000rpm 3min离心并去 上清，重复此操作3次；最后加入500ul PBS，加入测序级Trypsin，使得Trysin的终浓度为15ug/ml。将样品置于37℃，150rpm的振荡培养箱孵育30min；孵育完，15000rpm 15min 离心收集上清(即细胞表面糖肽)。
3.2细胞表面糖链的获取
得到的糖肽溶液放置于95℃，5min使得Trysin变性失活，再冷却至室温；使用1MNH4HCO3调节pH至8.5左右，加入1ul PNGase F，过夜培养12h后，冻干，即得到糖链。
3.3去除糖链中的肽段
该操作使用C18柱除去糖链中的多肽，具体方法如下：
⑴5ml无水甲醇活化柱子；
⑵10ml5％乙酸水溶液平衡柱子；
⑶将冻干后的样品溶解于1ml5％乙酸水溶液；
⑷上样，收集流出液，重复上样，收集流出液；
⑸再加入5ml5％乙酸水溶液洗脱柱子中剩余的糖链，收集流出液；
⑹合并两次的流出液，冻干。
3.4糖链的全甲基化修饰
得到冻干的糖链是未加修饰的糖链，带有唾液酸基团。这样的糖链如果直接用MALDI-TOF检测可能会使得各种糖链的电离程度不一致，同时对于带有负电荷的唾液酸来讲，其在质谱检测中很容易丢失。这会非常影响我们对于糖链检测的结果，所以在检测前，要对糖链进行化学衍生修饰，这里我们使用全甲基化对糖链进行衍生。对于全甲基化，其可以增强糖链的疏水性和质谱检测的电离程度，另外对于唾液酸化糖链甲基化的修饰，可以使 得其与中性糖链同时在阳离子模式下被检测；与此同时，糖链疏水性的增加可以在糖链脱盐 的实验环节使用氯仿萃取糖链，超纯水多次洗涤，以除去盐类这样便利的操作。以下是糖链 全甲基化的操作：
⑴称取0.1g的NaOH固体于研磨器皿中，加入500ul DMSO，快速研磨NaOH，使其与DMSO充分混匀，形成灰白色浆状物；
⑵剪掉枪头的尖端部分，吸取500ul NaOH固体和DMSO形成的浆状物，加入含有冻干 糖链的玻璃管中，使用涡流振荡器混合均匀；
⑶加入300ul ICH3，使用锡箔纸将玻璃管包裹均匀，避光，防止ICH3分解。将玻璃管 于室温振荡反应25min；
⑷反应完毕，将玻璃管放置于冰盒上，再使用胶头吸管向玻璃管缓慢滴加1ml超纯水终 止反应，边加边振荡；
⑸往玻璃管加入2ml氯仿萃取全甲基化修饰了的糖链，此时玻璃管中液体分为两相，上 层为水相，下层为有机相，使用胶头吸管除去上层水相；
⑹再加入2ml超纯水，充分振荡，静置分层，去除上层水相；
⑺重复步骤6操作10次，直至上层水相清澈，不见浑浊；
⑻将下层的有机相放置于氮吹条件下，以除去氯仿；
⑼检测前，使用15ul 50％甲醇水溶液溶解糖链。
检测结果(附图4)，如图所示，在HEK293野生型细胞中(附图4A)，其细胞表面 的糖链种类十分复杂，有高甘露糖型，杂合糖型，以及种类繁多的复合糖型。这也就是我们 所说的糖链的微观不均一性；相反，在MAN2A1和MAN2A2基因双敲细胞M2DKO中(附 图4B)，其细胞表面最主要的糖型是带有核心岩藻糖修饰的杂合糖型，几乎所有的复合糖 型已经除去了，即使还存在一些高甘露糖型，但是其含量远远低于杂合糖型。
4.核心岩藻糖修饰的敲除
从质谱分析图谱我们可以看出，在M2DKO细胞中，其主要的糖型是带有核心岩藻糖修 饰的杂合糖型，而往往当我们建立好这样的细胞系之后，需要其生产酶或抗体。对于抗体而 言，修饰其的N糖如果丧失了核心岩藻糖可提高抗体的ADCC应答功能。所以对于我们所 建立的双敲除细胞株，需要进一步敲除杂合糖型上的核心岩藻糖修饰。核心岩藻糖修饰发生 于高尔基体，由α1,6岩藻糖转移酶来完成。目前已发现FUT8基因编码α1,6岩藻糖转移酶， 接下来继续在M2DKO细胞中敲除FUT8基因。基因敲除方法如实施例1，以下是FUT8的 两条靶序列和使用的敲除验证引物序列：
FUT8-Target1：GAGACACCCACCACACTGCA NGG
FUT8-c1f1：CACCGAGACACCCACCACACTGCA
FUT8-c1r1：AAACTGCAGTGTGGTGGGTGTCTC
FUT8-Target2：GTCAGACGCACAGACAAAGT NGG
FUT8-c2f2：CACCGTCAGACGCACAGACAAAGT
FUT8-c2f2：AAACACTTTGTCTGTGCGTCTGAC
KO-CHECK-F3：CCCCGTCCTCCATATTTACCCTTGGC
KO-CHECK-R3：CTTTAATAAAGAAGGGTCATCTGTGGCC
所构建好的敲除质粒命名为：
PX330-EGFP-FUT8-Target1/PX330-EGFP-FUT8-Target2
最终转染于M2DKO细胞中，得到MAN2A1、MAN2A2和FUT8三基因敲除细胞DFKO。 根据FUT8基因敲除验证结果(附图5AB)，相比于野生型细胞，DFKO的条带减小了2260bp， 可得出FUT8已经敲除。同样也对DFKO细胞表面的N糖链使用LCA凝集素染色检测，在 DFKO细胞中(附图5CD)，LCA染色已经减少且接近于空白对照组，可见该细胞中N糖 链的核心岩藻糖修饰已经丧失。最后使用质谱分析技术检测，如图所示(附图5E),DFKO 中的主要糖链是丧失核心岩藻糖修饰的杂合糖型，同时根据质谱数据统计结果，相比于野生 型细胞，敲除细胞株DFKO可产生的杂合型N糖链占所有N糖链的比例增加了60％，同时 不含核心岩藻糖修饰的杂合型N糖链比例大大提高。综上所述，在DFKO三敲细胞中，核 心岩藻糖修饰已完全丧失。DFKO细胞表面糖链MALDI TOF质谱原始数据和糖链结构解析 以及每种糖链的相对强度(每种糖链intens占所有糖链总intens的比例)如表3所示：
Figure BDA0002980635850000111
Figure BDA0002980635850000121
5.重组溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和人源IgG1恒定片段(Fc)表达
在野生型细胞，敲除细胞株M2DKO和DFKO分别表达溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和 人源IgG1恒定片段(Fc)，同时也验证蛋白上N糖链修饰与敲除细胞株表面N糖链是否一 致。溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)的表达为瞬时转染，而人源IgG1恒定片段(Fc)为稳定转 染。并且两种蛋白均为分泌蛋白模式表达，即表达于培养基中。以下为重组蛋白表达的操作：
(1)溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)的瞬时表达
将HEK293野生型细胞和敲除细胞株接种于10cm板中，使用10％FBS过夜培养之后，待 细胞密度长到大概90％-95％左右时，可进行转染。本发明使用的转染试剂为PEI-MAX(2mg/ml pH 7.5),转染前需要先将PEI-MAX与OPTI混合稀释，两者的大概比例为1μl PEI-MAX：50μl OPTI；然后将用于表达溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)质粒稀释于OPTI中， 质粒使用总量与OPTI比例为16ng:1ml；两者静置5分钟后，混匀；室温再次静置20分 钟后，均匀加到之前所准备的细胞中。转染后12小时，转接于15cm板中，当细胞数量 为培养皿大小的一半时，将培养基替换为25ml含1％FBS的新培养基。将细胞进一步培 养48小时，最后收集培养基。
(2)人源IgG1恒定片段(Fc)的稳定表达
将HEK293野生型细胞和敲除细胞株接种于6孔板中，使用10％FBS过夜培养之后，待细 胞密度长到大概90％-95％左右时，可进行转染。本发明使用的转染试剂为PEI-MAX(2mg/ml pH 7.5),转染前需要先将PEI-MAX与OPTI混合稀释，两者的大概比例为1μl PEI-MAX：50μl OPTI；然后将用于表达人源IgG1恒定片段(Fc)质粒稀释于OPTI中， 质粒使用总量与OPTI比例为4ng：250μl；两者静置5分钟后，混匀；室温再次静置20 分钟后，均匀加到之前所准备的细胞中。转染后12小时，更换培养基，3天后，利用抗 生素潮霉素对转染后的细胞进行筛选。两周后，得到稳定表达人源IgG1恒定片段(Fc) 的细胞株，再将细胞扩大到15cm板培养，收集培养基。
6.重组溶酶体酸性脂肪酶(LIPA)和人源IgG1恒定片段(Fc)上N糖链质谱分析 得到的两种重组蛋白使用N糖链质谱分析技术分析其N糖链修饰，具体操作如下：
6.1N糖链的释放
⑴蛋白样品加入Sample buffer，100℃，5min变性
⑵10％10孔蛋白胶上样20ul，跑胶，转PVDF膜
⑶得到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，DB71染色15min，无水甲醇脱色，并且剪下蛋 白条带，大小为2mm x 2mm，转到1.5ml EP管中，离心9000rmp，1min，4℃，去 除甲醇
⑷100ul 0.1％聚乙烯醇(PVA)洗涤振荡膜3次，离心9000rmp，1min，4℃
⑸重新加入150ul 0.1％PVA室温振荡1小时，离心9000rmp，1min，4℃
⑹加入100ul 50mM NH4HCO3洗涤振荡膜3次，离心9000rmp，1min，4℃
⑺重新加入100ul 50mM NH4HCO3，1ul PNGase F处理48h
⑻PNGase F处理后，加入200ul去离子水，摏捣PVDF膜至膜透明，收集上清；再 加入200ul 5％冰醋酸水溶液，再继续摏捣PVDF膜，收集上清，合并两次的上清
⑼冻干
6.2去除糖链中的肽段(见3.3)
6.3糖链的全甲基化修饰(见3.4)
检测结果(附图6和7)，如图所示，HEK293野生型细胞所表达的LIPA和Fc均 含有复杂型N糖链，M2DKO敲除细胞株所表达的LIPA和Fc未检测到复杂型N糖链，并 且主要的糖链是带有核心岩藻糖修饰的杂合型N糖链，对于DFKO细胞株，其主要修饰 的糖链是未带核心岩藻糖修饰的杂合型N糖链。所以，由此可见，敲除细胞株所表达的 LIPA和Fc上的N糖链与之前我们所检测的敲除细胞株表面N糖链修饰一致，表明我们构 建的敲除细胞DFKO可用于生产以杂合型且不含核心岩藻糖修饰为主要N糖链的糖蛋白。
7.三基因敲除细胞株DFKO在生产糖蛋白方面的应用
为了改善生物制药糖蛋白的稳定性，生物活性和免疫原性，保证糖蛋白上面糖链的均一 性是尤为重要的，从而构建一株能生产均一化糖链的细胞株可以极大程度地生物医药糖蛋白 的生产与发展。本发明中所构建的DFKO细胞株可生产以杂合型且不含核心岩藻糖修饰为 主要N糖链，如果将这一敲除细胞应用于生产糖蛋白或者抗体，能大大提高其稳定性和生 物活性。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例 对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行 修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要 求范围当中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO及其制备方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagacaccca ccacactgca ngg 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccgagaca cccaccacac tgca 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaactgcagt gtggtgggtg tctc 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcagacgca cagacaaagt ngg 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgtcaga cgcacagaca aagt 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacactttg tctgtgcgtc tgac 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccccgtcctc catatttacc cttggc 26
<210> 8
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctttaataaa gaagggtcat ctgtggcc 28
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatcaggtcc acaagtgtga ngg 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caccgatcag gtccacaagt gtga 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaactcacac ttgtggacct gatc 24
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gattttaaac gtcttcctgg ngg 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caccgatttt aaacgtcttc ctgg 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacccagga agacgtttaa aatc 24
<210> 15
<211> 31
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agattttata aatgcaggtt tgtgtgttgg c 31
<210> 16
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggctaataa agcccatttg ttcaacc 27
<210> 17
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggatgaggag cacgagcagc ngg 23
<210> 18
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caccggatga ggagcacgag cagc 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaacgctgct cgtgctcctc atcc 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcctacctct tcctgcccga ngg 23
<210> 23
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caccgcctac ctcttcctgc ccga 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaactcgggc aggaagaggt aggc 24
<210> 24
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggggaagct attccgtgtc c 21
<210> 24
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gccaggttgt tcaaggcatc ttt 23

Claims (6)

1.一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：利用CRISPR-Cas9敲除系统，敲除或破坏HEK293细胞的N糖基化路径的基因，获得敲除N糖基化路径基因的细胞株DFKO；
其中，所述N糖基化路径的基因为MAN2A1、MAN2A2和FUT8；
所述敲除或破坏细胞的N糖基化路径的基因，其为先敲除MAN2A1和MAN2A2基因再敲除FUT8基因。
2.如权利要求1所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述敲除或破坏，其为将guide-RNA的DNA序列连接到所述CRISPR-Cas9敲除系统的PX330-EGFP质粒中，再转染于HEK293细胞中，EGFP阳性细胞株经筛选富集、有限稀释，得到DFKO细胞株。
3.如权利要求2所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述guide-RNA的DNA序列包括序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:20。
4.如权利要求2所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述转染，其使用的转染试剂包括PEI-MAX、OPTI中的一种或几种。
5.如权利要求4所述的生产杂合型N糖链修饰糖蛋白细胞株DFKO的制备方法，其特征在于：所述转染，其包括以下步骤，
将PEI-MAX与OPTI混合稀释，体积比为1：50，获得第一混合液，静置5~10分钟；
将PX330-EGFP质粒稀释于OPTI中，质粒使用量与OPTI比例为4ng：250μl，获得第二混合液，静置5~10分钟；
混匀所述第一混合液和所述第二混合液，静置15~30分钟；
均匀加到HEK293细胞中。
6.一种生产杂合型N糖链修饰糖蛋白的细胞株DFKO，其特征在于：所述细胞株为MAN2A1/A2/FUT8基因三敲除细胞株人胚肾细胞293-MAN2A1&A2&FUT8-DFKO，于2020年7月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC No.C2020123。
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