CN113209373A

CN113209373A - 一种皮肤组织修复支架及其制备方法与应用

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Publication number: CN113209373A
Application number: CN202110409417.3A
Authority: CN
Inventors: 王林格; 宋舒航; 于倩倩; 陈磊; 贾毅凡
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-04-16
Filing date: 2021-04-16
Publication date: 2021-08-06

Abstract

本发明公开了一种皮肤组织修复支架及其制备方法，属于生物医药领域。该皮肤组织修复支架是通过静电纺丝和静电喷雾技术制备的一种糖胺聚糖化的微纳结构复合材料，该材料有适合皮肤组织细胞黏附、生长和迁移的物理结构和可吸附伤口部位炎症趋化因子的化学成分；作为皮肤组织修复支架应用于伤口敷料，可达到促进伤口愈合的效果。该皮肤组织修复支架可以很好的模拟体内环境，为在物理结构和化学成分上指导皮肤组织修复和缓解炎症等研究提供了更好的研究平台。本发明制作简单，生产成本低，可实现大规模制备，便于推广应用。

Description

一种皮肤组织修复支架及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药复合高分子材料领域，具体涉及一种皮肤组织修复支架及其制备方法与应用。改支架可以缓解炎症且能促进细胞黏附、生长和迁移。

背景技术

对于皮肤组织的创伤研究在医药领域一直都受到了广泛的关注，目前人体皮肤组织的损失大多依靠自体或异体皮肤移植的方法来治疗，但这样的方法不仅材料来源受限，还可能对患者产生免疫排斥反应造成二次伤害。随着医疗的发展，皮肤组织支架为细胞的生长提供合适的平台，为皮肤损伤的患者带来希望。

皮肤组织支架利用工程学和生物学原理，在体外研发一种“皮肤替代品”，作为细胞的黏附、生长、迁移、增殖和分化的载体，来修复损伤的皮肤组织。但目前的皮肤组织支架仍含有许多缺陷，例如：生物相容性较差，支架没有合适细胞黏附、增殖和迁移的结构，忽略了创伤皮肤炎症的问题。

静电纺丝/静电喷雾技术是一种获得超细纤维/微粒的便捷有效的方法，静电纺丝制备的纳米/微米纤维材料由于具有高孔隙率、良好的吸收性、高比表面积等特点，可以满足不同类型伤口的需求，被作为皮肤组织支架的理想材料。然而目前开发的纤维支架结构简单，功能单一，无法满足伤口多功能的需求。

本发明制备负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜，微纳结构能为皮肤组织细胞黏附、生长和迁移提供物理指导，糖胺聚糖通过吸附炎症趋化因子使其隔离开发炎的伤口，以抑制慢性伤口中持续的促炎趋化因子梯度来缓解炎症，避免了目前皮肤组织支架为了消炎引入过量药物造成的毒性问题。将其作为皮肤组织修复支架应用于皮肤创伤，可达到促进伤口愈合的效果。

发明内容

为了满足伤口对于伤口敷料的需求，本发明的主要目的在于提供了一种皮肤组织修复支架的制备方法；本发明制备负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜，微纳结构为皮肤组织细胞黏附、生长和迁移提供物理指导，糖胺聚糖通过吸附炎症趋化因子来缓解炎症。

本发明通过糖胺聚糖中携带负电荷的硫酸基团与带正电的趋化因子的相互作用来吸附炎症趋化因子使其隔离开发炎的伤口，以抑制慢性伤口中持续的促炎趋化因子梯度来缓解炎症。

本发明通过控制电喷雾参数，形成不同粗糙度的微纳结构复合纤维膜进而影响细胞的黏附与迁移行为，合适的微纳结构为皮肤组织细胞黏附、生长和迁移提供物理指导从而促进细胞的黏附、生长和迁移行为，微纳结构的粗糙度由静电喷雾的沉积时间所控制，并找到最合适的微纳结构复合材料。

本发明另一目的在于提供上述方法制备得到的一种皮肤组织修复支架。其一可以通过控制内源性的促炎趋化因子达到缓解炎症的目的，其二可以很好的模拟细胞外基质的微环境，对细胞，特别是内皮细胞和成纤维细胞的黏附和迁移等提供了很好的平台。

本发明再一目的在于提供上述的一种皮肤组织修复支架在制备促进伤口愈合材料中的应用。

本发明通过以下技术方案实现。

一种皮肤组织修复支架的制备方法，包括如下步骤：

1)配置静电纺丝溶液：将将高分子材料溶解在溶剂中，搅拌至完全溶解得到高分子溶液，与糖胺聚糖水溶液混合，充分超声搅拌和混合均匀，形成均一的纺丝溶液；

2)配置静电喷雾溶液：将高分子材料溶解在溶剂中，充分搅拌溶解，形成均一的喷雾溶液；

3)制备负载糖胺聚糖的纤维底膜：将步骤1)中的纺丝溶液装入带有喷丝针头的注射装置中，进行静电纺丝，将喷丝针头连接在直流正电高压上，由注射泵控制高分子纺丝溶液的流速，并利用收丝装置收集纤维，待溶剂挥发干燥即可得到负载糖胺聚糖的纤维底膜；

4)制备负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜：将2)中的喷雾高分子溶液装入带有喷丝针头的注射装置中，喷丝针头连接在直流正电高压上，由注射泵控制喷雾高分子溶液的注入速度，利用步骤3)所得的纤维底膜作为收集装置，静电喷雾将高分子微球喷至纤维膜表面，形成负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜。

进一步的，步骤1)和步骤2)所述的高分子材料均为胶原、明胶、聚乙二醇、聚己内酯、聚羟基乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚乳酸和聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物中的至少一种。所述的有机溶剂均为六氟异丙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的至少一种。所述的高分子溶液浓度均为5wt％～50wt％。

步骤1)所述的糖胺聚糖为携带负电荷硫酸基团的多糖，包括肝素、肝素钠、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素中的至少一种。所述糖胺聚糖水溶液的浓度为10mg/mL～1g/mL。所述的高分子溶液与糖胺聚糖的水溶液混合比例为糖胺聚糖的质量相对于高分子质量的1％～30％。

进一步的，步骤3)所述的静电纺丝得到的负载糖胺聚糖的纤维直径为100～800nm；

进一步的，步骤4)静电喷雾的参数为喷丝头处接15～30kV电压，喷丝头与收集板/收集滚筒距离5～30厘米，纺丝溶液供给速度为0.1～30mL/h，纺丝环境温度5～60℃，相对湿度25％～95％；所述静电喷雾的沉积时间为0～20min。

进一步的，步骤4)静电喷雾得到的高分子微球直径为1～10μm。

优选的，步骤4)所述的负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜是通过携带负电荷的硫酸基团与带正电的趋化因子的相互作用来吸附炎症趋化因子缓解炎症，故所述的糖胺聚糖为携带负电荷硫酸基团的多糖，包括肝素、肝素钠、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。

优选的，步骤4)所述的负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜，其中合适的微纳结构为皮肤组织细胞黏附、生长和迁移提供物理指导，微纳结构的粗糙度由静电喷雾的沉积时间所控制，通过皮肤组织细胞的黏附和迁移实验得到最合适的微纳结构复合材料。

一种缓解炎症且能促进细胞黏附、生长和迁移的皮肤组织修复支架通过上述方法制备得到。进一步的，所述的细胞为在皮肤组织修复过程中起关键作用的细胞，包括内皮细胞，成纤维细胞，但不限于此。

上述一种皮肤组织修复支架在制备促进伤口愈合材料中的应用。

本发明所提供的技术方案原理在于，其一，通过在纳米纤维膜表面进行静电喷雾沉积微球，制备一种具有表面拓扑结构的材料，细胞具有感知外界物理特性(包括粗糙度和刚性等)的能力，为皮肤组织细胞提供一种合适的物理指导，可以促进细胞的黏附、生长和迁移，将其作为皮肤组织支架可以有效地促进伤口组织的修复。其二，在此基础上，在支架中负载糖胺聚糖，糖胺聚糖中带负电荷的硫酸基团可以与带正电的趋化因子的相互作用来吸附炎症趋化因子使其隔离开发炎的伤口，以抑制慢性伤口中持续的促炎趋化因子梯度来缓解炎症。以此来达到皮肤组织支架缓解炎症和促进组织修复的双重功能。

与现有技术相比，本发明具有如下优点与技术效果：

1、通过静电纺丝/静电喷雾技术，制备的微纳结构复合材料与现有的纯纳米纤维材料相比更有利于促进细胞的黏附、生长和迁移，作为一种皮肤组织修复支架能更有效地促进伤口愈合。

2、制备的表面微纳结构复合材料可同时作为载体，加入功能性辅料糖胺聚糖而不改变纳米纤维的基本形貌，为促进伤口愈合提供消炎等多重保障。

3、加入的糖胺聚糖是一种人体内常见的物质，本身没有细胞毒性，仅通过与炎症因子的相互作用来缓解炎症，与现有支架通过加入药物来达到消炎目的相比更友好。

4、本发明采用的静电纺丝与静电喷雾技术，设备工艺简单、制作简单，生产成本低，可实现大规模制备。

附图说明

图1为实施例1中得到负载肝素的纳米纤维膜的扫描电镜图像；

图2为实施例1中静电喷雾沉积不同时间得到负载肝素的微纳结构复合纤维膜的扫描电镜图像；

图3为实施例2中静电喷雾沉积不同时间得到负载肝素的微纳结构复合纤维膜对内皮细胞粘附形态影响的激光共聚焦图像；

图4为实施例2中静电喷雾沉积不同时间得到负载肝素的微纳结构复合纤维膜对内皮细胞迁移影响的光学显微镜图像；

图5实施例4中炎症化的3T3细胞接种在空白对照组、FS和HFS纤维膜上培养1天和3天后在450nm处的吸光度；

图6实施例4中炎症化的3T3细胞接种在FS和HFS纤维膜上培养24小时后细胞黏附形态的激光共聚焦图像；

具体实施方式

以下将结合附图和若干实例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：制备负载肝素的微纳结构复合纤维膜

I.静电纺丝制备负载肝素的纳米纤维膜

将聚己内酯和明胶(质量比为7:3)共混加入到六氟异丙醇溶剂中配制成质量分数为18wt％的共混溶液，将肝素溶于去离子水配置成0.1g/mL的溶液。将肝素的水溶液以肝素占聚己内酯和明胶总质量的5wt％的相应体积加入共混溶液中，超声并搅拌24h后得到均一的混合溶液。采用静电纺丝装置，进行静电纺丝，相对湿度为99％、环境温度为60℃，纺丝正电压为20kV，采用平板收丝装置，另外在收丝板后2cm处设置一个接地针头(点电极)，出丝针头与收丝板之间的距离为15cm，纺丝溶液进样流速是6mL/h，待溶剂挥发后得负载肝素的纳米纤维膜(图1所示)。

II.静电喷雾制备负载肝素的微纳结构复合纤维膜

将聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物(嵌段比为1:4)加入到二氯甲烷中配制成质量分数为7％的共混溶液，300r/min转速下机械搅拌24h，混合均匀形成喷雾溶液。采用静电纺丝装置，进行静电喷雾，相对湿度为50％、环境温度为25℃，纺丝正电压为20kV，采用上述所收集到的负载肝素的纳米纤维膜接地为收丝装置，针头与收丝板之间的距离为30cm，进样流速为3mL/h，在相同的流速和正电压的情况下，分别控制静电喷雾的沉积时间为0min、1min、3min、5min、10min、15min得到不同表面粗糙度的微纳结构复合纤维膜。通过扫描电子显微镜进行观察并对其粗糙度用3D轮廓仪进行测量统计，参阅图2和表1。

表1

沉积时间

0min

1min

3min

5min

10min

15min

粗糙度/μm

0.70±0.03

0.87±0.04

1.10±0.08

1.47±0.18

5.40±0.18

6.10±0.4

实施例2：以实施例1制备得到的一系列微纳结构复合纤维膜作为载体进行内皮细胞培养

I.负载肝素的微纳结构复合纤维膜的样品准备

参照实施例1得到负载肝素的微纳结构复合纤维膜；对复合纤维膜进行紫外照射灭菌处理过夜，然后用完全培养基浸泡2h。

II.负载肝素的微纳结构复合纤维膜进行细胞培养

将事先培养好的人脐静脉内皮细胞消化吹打后，参照实施例1，将内皮细胞接种至纤维膜上，接种密度为5×10⁴～1×10⁵，细胞分别于37℃、5％CO₂条件下静置培养。

III.微纳结构复合纤维膜上的细胞黏附情况

对细胞在纤维膜上培育5天后进行固定染色处理：将样品取出置于新的培养板中，加入2.5％的戊二醛进行细胞固定。固定1小时后，样品采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次；0.1％的Triton X-100孵育10min，PBS清洗3次；用Actin-Tracker Green的稀释液对细胞骨架进行染色处理，室温避光孵化40min；PBS清洗3次，用DAPI对细胞核进行染色，室温避光孵化5min，PBS清洗3次，通过激光共聚焦显微镜对细胞黏附情况进行观察，查阅图3。

IV.微纳结构复合纤维膜的细胞迁移情况

将细胞接种在24孔板中，种植密度为5×10⁵cell/cm²。培育1天后，内皮细胞在孔板底部表面形成融合的单层。借助无菌标尺，利用塑料枪头(200μL)尖端轻轻地划过融合的内皮细胞层，形成宽度为750±30μm的划痕(无细胞)。然后将微纳结构复合纤维膜有微球的一面翻盖在融合的内皮细胞层上,在光学显微镜下观察1天、2天、3天、5天细胞向划痕处迁移的情况，并统计划痕之间的距离，计算细胞的迁移率，查阅图4。

参阅图3和4可以观察到细胞在不同表面粗糙度的微纳结构复合纤维膜上的黏附以及迁移行为表现出明显的差异性，并且可以得出电喷雾3min的表面粗糙度更适合内皮细胞的黏附且能促进内皮细胞的迁移。

实施例3：制备负载硫酸乙酰肝素的微纳结构复合纤维膜

I.静电纺丝制备负载硫酸乙酰肝素的纳米纤维膜

将聚乳酸和聚乙二醇(质量比为8:2)共混加入到二氯甲烷溶剂中配制成质量分数为35wt％的共混溶液，将硫酸乙酰肝素溶于去离子水配置成10μg/mL的水溶液。将硫酸乙酰肝素的水溶液以硫酸乙酰肝素占聚乳酸和聚乙二醇总质量的15wt％的相应体积加入共混溶液中,超声并搅拌24h后得到均一的混合溶液。采用静电纺丝装置，进行静电纺丝，相对湿度为60％、环境温度为30℃，纺丝正电压为25kV，采用平板收丝装置，另外在收丝板后2cm处设置一个接地针头(点电极)，出丝针头与收丝板之间的距离为20cm，纺丝溶液进样流速是5mL/h，待溶剂挥发后得到负载硫酸乙酰肝素的纳米纤维膜。

II.静电喷雾制备负载硫酸乙酰肝素的微纳结构复合纤维膜

将聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(嵌段比为1:4)加入到二氯甲烷中配制成质量分数为10％的共混溶液，800r/min转速下机械搅拌24h，混合均匀形成喷雾溶液。采用静电纺丝装置，进行静电喷雾，相对湿度为60％、环境温度为25℃，纺丝正电压为18kV，用所收集到的纳米纤维膜为收丝装置，针头与收丝板之间的距离为30cm，进样流速为6mL/h，静电喷雾1.5min得到负载硫酸乙酰肝素的微纳结构复合纤维膜。

实施例4：微纳结构复合材料吸附内源性炎症趋化因子CCL2/MCP-1可缓解细胞炎症

I.细胞与炎症因子预孵育：将3T3细胞与炎症因子MCP-1预孵育来模拟体内细胞的炎症环境，具体操作如下：往处于对数生长期的3T3细胞培养瓶中加入100ng/mL的MCP-1，共孵育过夜(12h)后，用PBS溶液清洗培养瓶三遍，加入胰蛋白酶消化液消化2min后，吸出所有胰蛋白酶消化液，加入新鲜的培养基2mL吹打至细胞悬浮；将细胞悬浮液移入离心管中，在900rpm的转速下离心处理5min后移除上清液，然后加入3mL的培养基将细胞重悬；

II.细胞增殖测试：在96孔板中加入20μL的3T3细胞悬浮液，并加入200μL的完全培养基；将超净台内紫外照射灭菌过的纤维膜样品裁剪成96孔板可放入的相同大小，并放入加了3T3细胞悬浮液的96孔板中，与细胞在37℃，5％CO2培养箱中进行共培养，以一天和三天为节点，用CCK-8方法评价细胞的存活率；使用酶标仪测定450nm处溶液的OD值，对照组为不加任何物质的空白细胞，图5所示为细胞吸光值。

III.细胞粘附形态：将重悬的3T3细胞以每孔120μL的细胞密度分别接种在紫外照射灭菌过的纤维膜样品上。培养24h后，对细胞进行染色处理后用共聚焦显微镜观察3T3细胞在各纤维支架上的形态结构，如图6所示。

参考图5和图6可以看出炎症化的3T3细胞在纯复合纤维膜上的增殖和黏附生长受到了抑制，而负载了硫酸乙酰肝素的复合纤维膜可以明显缓解由炎症带来的抑制作用。

综上可以看到，本发明采用静电纺丝和静电喷雾技术制备了负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜，相对于纯纤维结构，带有一定微纳结构的复合纤维膜更能促进细胞的黏附、生长和迁移行为，同时负载糖胺聚糖对炎症环境有很好的缓解作用，将负载糖胺聚糖的微纳结构复合纤维膜作为皮肤组织修复支架将其应用伤口敷料，可以达到促进伤口愈合的效果。

Claims

1.一种皮肤组织修复支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤1)所述的糖胺聚糖水溶液的浓度为10mg/mL～1g/mL；

步骤1)和步骤2)所述的高分子溶液浓度均为5wt％～50wt％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤1)所述的高分子溶液与糖胺聚糖的水溶液混合比例为糖胺聚糖的质量相对于高分子质量的1％～30％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤1)所述的糖胺聚糖为肝素、肝素钠、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素中的至少一种；

步骤1)和步骤2)所述的高分子材料均为胶原、明胶、聚乙二醇、聚己内酯、聚羟基乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚乳酸和聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物中的至少一种；所述的有机溶剂均为六氟异丙醇、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤3)所述的静电纺丝得到的负载糖胺聚糖的纤维直径为100～800nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)所述静电喷雾的沉积时间为0～20min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)静电喷雾的参数为喷丝头处接15～30kV电压，喷丝头与收集板/收集滚筒距离5～30厘米，纺丝溶液供给速度为0.1～30mL/h，纺丝环境温度5～60℃，相对湿度25％～95％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)静电喷雾得到的高分子微球直径为1～10μm。

9.一种皮肤组织修复支架的，通过权利要求1～8任一项所述方法制备得到。

10.根据权利要求9所述皮肤组织修复支架在制备促进伤口愈合材料中的应用。