CN113195742A - 细菌应答 - Google Patents

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Abstract

提供了用于确定细菌的抗生素抗性的方法、样品器皿和器械。

Description

细菌应答
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月2日提交的美国申请序列号62/739,949的利益和优先权，所述美国申请整体引入本文作为参考。
背景技术
在美国、加拿大和西欧，传染病约占人类死亡率的大约7%，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的超过40%。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现中有发烧，肺炎，脑膜炎，腹泻和含血的腹泻。虽然身体表现提示一些病原体并且消除其它病原体(作为致病因子)，但是仍然存在各种潜在的致病物，并且明确的诊断通常需要执行各种测定。用于诊断病原体的传统微生物学技术可能需要数天或数周，经常延迟适当的治疗过程。
近年来，聚合酶链反应(PCR)已成为用于快速诊断传染因子的选择方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏和特异性的工具。使用PCR作为主要诊断手段的挑战是一些病理样本中存在的可能的致病生物的多样化和生物的低水平。运行对于每种可能的致病生物一个的PCR测定的大实验对象组经常是不切实际的，大多数所述PCR测定预计为阴性的。当病原体核酸处于低浓度并且需要大体积的样品以收集足够的反应模板时，该问题恶化。在一些情况下，不存在足够的样品以测定所有可能的致病因子。一种解决方案是运行“多重PCR”，其中样品在单一反应中针对多个靶同时进行测定。虽然多重PCR已在一些系统中证明为有价值的，但存在关于高水平多重反应的稳固性和难以明确分析多重产物的缺点。为了解决这些问题，随后可以将测定分成多重次级PCR。在初级产物内嵌套次级反应经常增加稳固性。然而，这种进一步处理可能是昂贵的，并且可以导致污染或其它问题。
集成样品制备、扩增、检测和分析的完全整合的多重PCR系统是用户友好的，并且特别良好地适于诊断市场和综合征方法。FilmArray® (BioFire Diagnostics，LLC，SaltLake City，UT)是此类系统，开发用于诊断市场的用户友好的高度多重化PCR系统。单个样品器械接受一次性使用的“小袋”，其整合了样品制备和嵌套多重PCR。集成的样品制备提供了易用性，而高度多重化PCR提供了PCR的灵敏度和同时测试高达30种不同生物的能力两者。该系统非常适合病原体鉴定，其中许多不同的病原体全都表现出相似的临床症状。目前可用的诊断实验对象组(diagnostic panel)包括用于上呼吸道感染的呼吸实验对象组，用于血流感染的血液培养实验对象组，用于GI感染的胃肠实验对象组和用于脑脊液感染的脑膜炎实验对象组。其它实验对象组正在开发中。
虽然FilmArray器械已用于从单个样品中鉴定各种病原体，但FilmArray以及其它定量和半定量系统可能适用于检测抗生素敏感性。可以通过检测敏感细菌和抗性细菌响应抗生素暴露的转录差异，在分子水平上测量抗生素敏感性。尽管可以使用RNA测序或cDNA微阵列分析来发现这些转录差异，但大型的多重化和逆转录功能系统例如FilmArray，可以促进对于多重细菌和抗生素的抗生素敏感性测量。
对抗生素的抗性是重大公共威胁，其中死亡率对于抗性生物体估计高达五倍。预料到2050年，抗生素抗性每年将导致1000万人死亡，伴随100万亿美元的费用。当前用于抗生素抗性的微生物学方法包括微量肉汤稀释法，包括铺平板，随后为针对各种浓度的抗生素接种肉汤。目视或经由显微镜检查，针对接种物的“浑浊”或比色变化来检查肉汤。可替代地，可以使用琼脂稀释法，其中将抗生素稀释物浸渍到琼脂内，将细菌接种到琼脂稀释系列上，使平板生长，然后目视检查生长的存在或不存在以及在哪个稀释度下。其它微生物学方法是已知的，包括自动化系统，但是所有方法都需要细菌生长，同时用各种浓度的不同抗生素攻击细菌。这些方法花费数小时到数天来完成。因此，需要抗生素抗性的快速和准确鉴定，使得可以以及时的方式适当地治疗患者。
在一个说明性实例中，可以靶向特异性和通用细菌-抗生素组合，其中可以提供具有抗生素混合物的样品装载器皿，导致广泛的敏感性结果。
在另一个说明性实例中，包括通用细菌-抗生素基因靶，并且可以提供具有单一抗生素的独特样品装载器皿，导致狭窄的敏感性结果。
发明内容
在本公开内容的一个方面，提供了用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法。
根据本发明的一个方面，用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法包括：(a)使样品与抗生素一起温育，(b)从样品中分离RNA，(c)针对各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因，将RNA逆转录，(d)扩增来自各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因的靶，以生成多个扩增靶，(e)定量来自多种基因的多个扩增靶中的每个，以提供多个定量的扩增靶，并且生成指示抗生素敏感性的值，并且(f)由指示抗生素敏感性的值确定抗生素抗性。
本公开内容的一个进一步方面涉及用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法，其包括：(a)使样品与抗生素一起温育，(b)从样品中分离RNA，(c)针对在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的基因，将RNA逆转录，(d)扩增来自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的基因的靶，以生成扩增靶，(e)定量扩增靶，以生成指示抗生素敏感性的值，并且(f)由指示抗生素敏感性的值确定抗生素抗性。
本公开内容的另一个方面涉及用于确定样品中细菌的抗生素抗性的容器，其包括：包括第一阶段反应泡罩的第一阶段反应区，所述第一阶段反应泡罩包含用于多种基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，以及流体连接到第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因，所述第二阶段反应区配置用于对所有多个第二阶段反应室进行热循环。
本发明的一个进一步方面涉及用于分析样品的装置，其包括：配置为接收容器的开口，所述容器包括第一阶段反应区，所述第一阶段反应区包含用于多种基因或参考基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，以及流体连接到第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因或参考基因，所述多个第二阶段反应室进一步包含产生指示扩增量的信号的可检测标记，用于控制第一阶段反应区的温度的第一加热器，用于对第二阶段反应区进行热循环的第二加热器，配置为检测第二阶段反应室各自中的信号的检测装置，以及CPU，其配置为确定多种基因中的每个和参考基因的Cp，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并配置为输出关于多种基因各自的值，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，其中所述值是关于多种基因各自的ΔCp或ΔCp的绝对值，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并且其中所述CPU配置为由多种基因各自的值确定抗生素抗性，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式。
本发明的一个另外方面涉及如本文所述的容器的用途，任选地所述容器在如本文所述的方法(例如，用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法)中的用途。在一些实施方案中，该容器包括：包括第一阶段反应泡罩的第一阶段反应区，所述第一阶段反应泡罩包含用于多种基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，以及流体连接到第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因，所述第二阶段反应区配置用于对所有多个第二阶段反应室进行热循环。
本发明的另一个方面涉及如本文所述的装置的用途，任选地所述装置在如本文所述的方法(例如，用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法)中的用途。在一些实施方案中，该装置包括：配置为接收容器的开口，所述容器包括第一阶段反应区，所述第一阶段反应区包含用于多种基因或参考基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，以及流体连接到第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因或参考基因，所述多个第二阶段反应室进一步包含产生指示扩增量的信号的可检测标记，用于控制第一阶段反应区的温度的第一加热器，用于对第二阶段反应区进行热循环的第二加热器，配置为检测第二阶段反应室各自中的信号的检测装置，以及CPU，其配置为确定多种基因中的每个和参考基因的Cp，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并配置为输出关于多种基因各自的值，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，其中所述值是关于多种基因各自的ΔCp或ΔCp的绝对值，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并且其中所述CPU配置为由多种基因各自的值确定抗生素抗性，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式。
本发明的一个进一步方面涉及用于确定抗生素针对样品中的细菌的最小抑菌浓度(MIC)的方法，其包括：使样品的等分试样与已知标准浓度的抗生素一起温育，从样品的等分试样中分离RNA，所述RNA包含相对于所述抗生素的MIC显示数量上不同的表达水平的基因，针对所述基因将RNA逆转录，扩增所述基因的靶，以生成扩增靶，定量扩增靶，以提供定量的扩增靶并生成指示MIC的值，并且将MIC报告为基因的定量输出结果。
本发明的实施方案的另外特征和优点将在下述描述中阐述，或者可以通过此类实施方案的实践来学习。借助于所附权利要求中特别指出的器械和组合，可以实现且获得此类实施方案的特征和优点。这些和其它特征根据下述描述和所附权利要求将变得更加明显，或者可以通过如下文阐述的此类实施方案的实践来学习。
附图说明
为了描述其中可以获得本发明的上述和其它优点和特征的方式，将通过参考在附图中示出的其特定实施方案来呈现上文简要描述的本发明的更具体的描述。应理解这些附图仅描绘了本发明的典型实施方案，并且因此不应视为对其范围的限制，本发明将通过使用附图用另外的具体性和细节进行描述和解释，在所述附图中：
图1显示了根据本发明的一个实施方案的柔性小袋。
图2显示了根据本发明的示例性实施方案，用于与图1的小袋一起使用的器械的分解透视图，包括图1的小袋。
图3显示了根据本发明的示例性实施方案，图2的器械的局部横截面视图，包括图2的囊状物部件，其中图1的小袋以虚线显示。
图4显示了在图2的器械的一个说明性实施方案中使用的电动机。
图5A显示了关于通用抗生素抗性基因lasI的扩增曲线，其中敏感菌株的Cp早于抗性菌株的Cp，无论菌株是否与抗生素一起温育。显示了四种条件：敏感–ABX (̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ )、敏感+ABX (‒ ‒ ‒)、抗性–ABX (‒ ●‒ ●●‒)、抗性+ABX (- - - - )，其中–ABX指示未用抗生素处理，而+ABX指示用抗生素处理。
图5B显示了关于特异性抗生素抗性基因LexA的扩增曲线，其中仅当菌株与抗生素一起温育时，敏感菌株的Cp才早于抗性菌株的Cp。显示了四种条件：敏感–ABX (̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ ̶ )、敏感+ABX (‒ ‒ ‒)、抗性–ABX (‒ ●‒ ●●‒)、抗性+ABX (- - - - )，其中–ABX指示未用抗生素处理，而+ABX指示用抗生素处理。
图6显示了当在以下四种条件各自下进行扩增时，高拷贝靶PA14_RS28865的Cp：-dsDNA酶-RT、-dsDNA酶+RT、+dsDNA酶-RT和+dsDNA酶+RT。
图7A-J显示了在以下四种条件各自下，实施例2的小袋中的许多不同测定法的Cp：-dsDNA酶-RT(左)、+dsDNA酶-RT(中)和+dsDNA酶+RT(右)，其中图7A是lexA，图7B是atpA，图7C是孔蛋白，图7D是oprD，图7E是RS25625，图7F是OmpA，图7G是yhbY，图7H是RS02955，图7I是rnpB，而图7J是PA14_RS28865。
图8显示了在与图1类似的说明性小袋中的lasI转录物的Cp值。
图9A和9B呈现了当在时间10、30和60分钟下，暴露于零、7.5或15 µg/mL环丙沙星时，抗性菌株(图9A)和敏感菌株(图9B)两者中的说明性测定法靶lexA的相对表达水平。
图10示出了根据本公开内容各方面的热循环系统的示例性实施例的方框图。
具体实施方式
下文参考附图描述了示例性实施方案。许多不同的形式和实施方案是可能的，而不脱离本公开内容的精神和教导，并且因此公开内容不应被解释为限于本文阐述的示例性实施方案。相反，提供这些示例性实施方案使得本公开内容将是彻底和完整的，并且将本公开内容的范围传达给本领域技术人员。在附图中，为了清楚起见，可放大各层和各区域的尺寸和相对尺寸。在说明书自始至终，相同的参考编号指的是相同的元件。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。将进一步理解，术语例如在通常使用的词典中定义的那些，应当被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想化或过度形式化的意义来解释，除非在本文中明确如此定义。本文的本发明描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不预期限制本发明。虽然本文仅描述了某些示例性材料和方法，但与本文描述的那些类似或等价的许多方法和材料可以用于本公开内容的实践中。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利或其它参考文献都整体引入作为参考。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
本公开内容的各个方面，包括装置、系统、方法等可以参考一个或多个示例性实现方式来说明。如本文使用的，术语“示例性”和“说明性”意指“充当示例、实例或说明”，并且不一定应该解释为比本文公开的其它实现方式优选或有利。另外，对本公开内容或本发明的“实现方式”或“实施方案”的提及包括对其一个或多个实施方案的具体提及，且反之亦然，并且预期提供说明性示例而不限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求而不是下述描述指示。
应注意，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，对“分块(tile)”的提及包括一个、两个或更多个分块。类似地，除非内容和/或上下文另有明确说明，否则对多个指示物的提及应该被解释为包括单个指示物和/或多个指示物。因此，对“分块”的提及不一定需要多个此类分块。相反，应理解，不依赖于缀合；本文考虑了一个或多个分块。
如在本申请自始至终使用的，词语“可以”和“可能”以允许性意义(即，意味着具有潜力)，而不是强制性意义(即，意味着必须)使用。另外，术语“包括(including)”、“具有(having)”、“涉及(involving)”、“含有(containing)”、“特征在于”、其变体(例如，“包括”(includes)、“具有(has)”、“涉及(involves)”、“含有(contains)”等)、以及如本文包括权利要求使用的类似术语，应为包容性和/或开放性的，应具有与词语“包含(comprising)”及其变体(例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)相同的含义，并且不排除另外的未叙述的说明性元件或方法步骤。
如本文使用的，方向和/或任意术语，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内”、“外”、“内部”、“外部”、“内在”、“外在”、“近端”、“远端”、“前面”、“背面”等等可以仅用于指示相对方向和/或取向，并且可以不在其它方面预期限制本公开内容，包括说明书、发明和/或权利要求的范围。
应理解，当元件被称为“联接”、“连接”或“响应”另一个元件或“在另一个元件上”时，它可以直接联接、连接、或响应另一个元件或在另一个元件上，或者也可以存在插入元件。相反，当元件被称为“直接联接”、“直接连接”或“直接响应”另一个元件或“直接在另一个元件上”时，不存在插入元件。
本发明构思的示例性实施方案在本文中参考横截面图示进行描述，所述横截面图示是示例性实施方案的理想化实施方案(和中间结构)的示意图。像这样，预期由于例如制造技术和/或公差与图示形状的变化。因此，本发明构思的示例性实施方案不应被解释为限于本文示出的区域的特定形状，而是包括例如起因于制造的形状偏差。相应地，附图中示出的区域本质上是示意性的，并且它们的形状并不预期示出装置的区域的实际形状，并且不预期限制示例性实施方案的范围。
应理解，尽管术语“第一”、“第二”等在本文中可以用于描述各种元件，但这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件与另一个元件。因此，“第一”元件可以被称为“第二”元件，而不脱离本实施方案的教导。
术语“约”在本文中用于意指大约、在大致或周围的区域。当术语“约”与数目范围结合使用时，它通过扩展在所述数目的之上和之下的边界来修改该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将所述值之上和之下的数值修改5%的变化。当表达此类范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个实施方案。应进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点并且独立于另一个端点均为有意义的。
如本文使用的，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
“样品”意指动物；来自动物的组织或器官；细胞(在受试者体内、直接取自受试者、或维持在培养物中或来自培养细胞系的细胞)；细胞裂解产物(或裂解产物级分)或细胞提取物；含有衍生自细胞、细胞材料或病毒材料(例如多肽或核酸)的一种或多种分子的溶液；或含有非天然存在的核酸示例性地cDNA或下一代测序文库的溶液，其如本文所述进行测定。样品也可以是任何体液或排泄物(例如，但不限于血液、尿、粪便、唾液、泪、胆汁或脑脊髓液)，其可能含有或不含有宿主或病原体细胞、细胞组分或核酸。样品可以说明性地用抗生素进行处理，或者可以未处理而使用。
如本文使用的，短语“核酸”指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA还是RNA或DNA-RNA杂交体、单链或双链、有义或反义，其能够通过沃森-克里克碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物(例如BrdU)、经修饰或处理的碱基和非磷酸二酯核苷间键合(例如肽核酸(PNA)或硫代二酯键合)。特别地，核酸可以包括但不限于DNA、cDNA、gDNA、ssD NA、dsDNA、RNA包括所有RNA类型例如miRNA、mtRNA、rRNA、包括编码区或非编码区、或其任何组合。
“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指具有限定序列的单链核酸分子，其可以与含有互补序列的第二核酸分子(“靶”)碱基配对。所得到的杂交体的稳定性取决于长度、GC含量和碱基配对发生的程度。碱基配对的程度受参数例如探针和靶分子之间的互补程度以及杂交条件的严格程度影响。杂交严格程度受参数例如温度、盐浓度和有机分子如甲酰胺的浓度影响，并且通过本领域技术人员已知的方法测定。探针、引物和寡核苷酸可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行可检测地标记，或放射性地标记、荧光标记和/或非放射性地标记。dsDNA结合染料可以用于检测dsDNA。应理解，“引物”特别配置为通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以如此配置或不如此配置。作为探针，寡核苷酸可以用作本领域已知的许多基于荧光PCR引物和探针的化学物质的部分，包括共享荧光猝灭和/或荧光共振能量转移(FRET)配置的使用的那些，例如5'核酸酶探针(TaqMan®探针)、双杂交探针(HybProbes®)、或Eclipse®探针或分子信标、或Amplifluor®测定例如Scorpions®、LUX®或QZyme®PCR引物，包括具有天然或经修饰的碱基的那些。
“dsDNA结合染料”意指当与双链DNA结合时比与单链DNA结合或在溶液中游离时差异发荧光的染料，通常通过更强烈地发荧光。虽然提及了dsDNA结合染料，但应理解本文可以使用任何合适的染料，其中一些非限制性说明性染料描述于美国专利号7,387,887中，其引入本文作为参考。其它产生信号的物质可以用于检测核酸扩增和解链，示例性地酶、抗体等，如本领域已知的。
“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高严格条件下识别基本上互补的核酸(例如，样品核酸)并与其物理相互作用(即，碱基配对)，并且基本上不与其它核酸碱基配对。
“高严格条件”意指在约解链温度(Tm)减5℃下(即，比核酸的Tm低5°)。在功能上，高严格条件用于鉴定具有至少80%序列同一性的核酸序列。
虽然PCR是本文实例中使用的扩增方法，但应理解使用引物随后为解链曲线的任何扩增方法都可以是合适的。此类合适的程序包括任何类型(单步、两步或其它)的聚合酶链反应(PCR)；链置换扩增(SDA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；级联滚环扩增(CRCA)、DNA环介导的等温扩增(LAMP)；等温和嵌合引物引发的核酸扩增(ICAN)；基于靶的解旋酶依赖性扩增(HDA)；转录介导的扩增(TMA)、下一代测序技术等等。因此，当使用术语PCR时，它应理解为包括其它替代扩增方法，包括氨基酸定量方法。还应理解，本文包括的方法可以用于涉及扩增的其它生物和化学过程，所述扩增随后可以为解离曲线分析。对于不含不连续循环的扩增方法，可以使用反应时间代替以循环或Cp进行的测量，并且可以添加其中在本文描述的实施方案中添加另外的PCR循环的另外反应时间。应理解可能需要相应地调整方案。
当使用PCR以及涉及热循环的其它生物和化学过程时，应理解每个循环至少包括退火温度和变性温度，其中所述变性阶段涉及加热至变性温度，而退火阶段涉及冷却至退火温度。
如本文使用的，“最小抑菌浓度”(“MIC”)是抑制生物体生长所需的最低抗生素浓度。
如本文使用的，“断点”是限定细菌物种对抗生素是敏感还是抗性的抗生素浓度(经常表示为mg/L)。如果MIC小于或等于敏感性断点，则细菌被视为对抗生素敏感。如果MIC大于该值，则细菌被视为对抗生素抗性。也可以报告中间组，其中生物体的MIC接近或超过正常抗微生物给药的阈值，但用更高的剂量或抗微生物剂集中于感染部位处，则临床应答是可能的。
虽然本文的各种实例提及人靶和人病原体，但这些实例仅是说明性的。本文描述的方法、试剂盒和装置可以用于检测来自广泛多种样品，包括人、兽医、工业和环境的广泛多种核酸序列。
还应理解，本文描述的各种实现方式可以与所描述或公开的任何其它实现方式组合使用，而不脱离本公开内容的范围。因此，根据本公开内容的某些实现方式的产品、构件、元件、装置、仪器、系统、方法、过程、组合物和/或试剂盒可以包括、掺入或以其它方式包含本文公开的其它实现方式(包括系统、方法、仪器和/或类似物)中描述的性质、特征、部件、构件、元件、步骤和/或类似物，而不脱离本公开内容的范围。因此，对与一个实现方式有关的特定特征的提及不应被解释为仅限于在所述实现方式内的应用。
本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用于限制说明书或权利要求的范围。为了便于理解，在可能时，相同的参考编号已用于指定附图共有的相同元件。此外，在可能时，在各个图中已使用了元件的相同编号。此外，特定元件的替代配置可以各自包括附加到元件编号的分开字母。
本文公开的各种实施方案使用独立的核酸分析小袋来测定样品中各种生物物质的存在，说明性地抗原和核酸序列，说明性地在单个封闭系统中。此类系统，包括小袋和用于与小袋一起使用的器械更详细地公开于美国专利号8,394,608；和8,895,295；以及美国专利申请号2014-0283945中，所述专利引入本文作为参考。然而，应理解，此类器械和小袋仅是说明性的，并且本文讨论的核酸制备和扩增反应可以在如本领域已知的各种开放或封闭系统样品器皿中的任一种中执行，包括96孔板、其它配置的平板、阵列、转盘(carousel)等等，使用各种核酸纯化和扩增系统，如本领域已知的。
虽然本文使用术语“样品孔”、“扩增孔”、“扩增容器”等等，但这些术语意欲涵盖如这些扩增系统中使用的孔、管和各种其它反应容器。此类扩增系统可以包括扩增容器中的单个多重步骤，并且可以任选地在多个个别反应孔中包括多个第二阶段个别或更低级的多重反应。在一个实施方案中，小袋用于测定多种病原体。小袋可以包括用作样品孔的一个或多个泡罩，说明性地在封闭系统中。说明性地，可以在任选的一次性使用的小袋中执行各种步骤，包括核酸制备、初级大体积多重PCR、初级扩增产物的稀释和次级PCR，最后为任选的实时检测或扩增后分析例如解链曲线分析。此外，应理解，虽然可以在本发明的小袋中执行各个步骤，但对于某些用途可以省略一个或多个步骤，并且小袋配置可以相应地改变。
图1显示了可以在各种实施方案中使用，或者可以对于各种实施方案重新配置的说明性小袋510。小袋510类似于美国专利号8,895,295的图15，其中相同的项目编号相同。配件590提供有入口通道515a到515l，其也充当试剂贮存器或废物贮存器。说明性地，试剂可以在配件590中冷冻干燥并且在使用前再水合。泡罩522、544、546、548、564和566以及它们各自的通道514、538、543、552、553、562和565类似于美国专利号8,895,295的图15的相同编号的泡罩。图1的第二阶段反应区580类似于美国专利申请号8,895,295的那种，但高密度阵列581的第二阶段反应区582以稍微不同的图案排列。图1的高密度阵列581的更圆形图案消除了拐角处的孔，并且可以导致第二阶段孔582的更均匀填充。如所示，高密度阵列581提供有102个第二阶段孔582。小袋510适用于FilmArray®器械(BioFire Diagnostics，LLC，Salt Lake City，UT)。然而，应理解，小袋实施方案仅是说明性的。
虽然可以使用其它容器，但说明性地，小袋510由两层柔性塑料薄膜或其它柔性材料形成，所述其它柔性材料例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及其混合物，其可以通过本领域已知的任何方法制备，所述方法包括挤出、等离子体沉积和层压。也可以使用具有铝层压结构的金属箔或塑料。其它阻隔材料是本领域已知的，其可以密封在一起以形成泡罩和通道。如果使用塑料薄膜，则可以说明性地通过热封将这些层粘合在一起。说明性地，该材料具有低核酸结合能力。
对于采用荧光监测的实施方案，优选吸光度足够低且在操作波长下自发荧光的塑料薄膜。可以通过测试不同的塑料、不同的增塑剂和复合比率以及不同厚度的薄膜来鉴定此类材料。对于具有铝或其它箔层压结构的塑料，待通过荧光检测装置读取的小袋的部分可以保持不含箔。例如，如果在小袋510的第二阶段反应区580的第二阶段孔582中监测荧光，则在孔582处的一个或两个层将保持不含箔。在PCR的例子中，由约0.0048英寸(0.1219mm)厚的聚酯(Mylar，DuPont，Wilmington DE)和0.001-0.003英寸(0.025-0.076 mm)厚的聚丙烯薄膜组成的薄膜层压结构表现良好。说明性地，小袋510由能够透射大约80%-90%的入射光的透明材料制成。
在说明性实施方案中，通过在泡罩和通道上施加压力，说明性地气动压力，使材料在泡罩之间移动。相应地，在采用压力的实施方案中，小袋材料说明性地足够柔性，以允许压力具有所需效应。术语“柔性”在本文中用于描述小袋的材料的物理特征。术语“柔性”在本文中定义为易于通过本文使用的压力水平变形，而不破裂、破坏、开裂等等。例如，薄的塑料片，例如Saran™包装和Ziploc®袋，以及薄金属箔，例如铝箔，是柔性的。然而，即使在采用气动压力的实施方案中，仅泡罩和通道的某些区域需要是柔性的。此外，泡罩和通道的仅一侧需要是柔性的，只要泡罩和通道易于变形。小袋510的其它区域可以由刚性材料制成，或者可以用刚性材料强化。
说明性地，塑料薄膜用于小袋510。可以研磨或以其它方式切割金属片，示例性地铝或其它合适材料，以产生具有凸起表面图案的模具。当安装到气动压力机(说明性地A-5302-PDS，Janesville Tool Inc.，Milton WI)时，说明性地在195℃的操作温度下调节，气动压力机像印刷机一样工作，仅在其中模具接触薄膜处使塑料薄膜的密封表面熔化。随着小袋510形成，各种组分，例如PCR引物(说明性地点在薄膜上并干燥)、抗原结合基底、磁珠和硅酸锆珠可以密封在各种泡罩内。用于样品处理的试剂可以在密封之前共同地或分开地点在薄膜上。在一个实施方案中，将核苷酸三磷酸(NTP)与聚合酶和引物分开点在薄膜上，基本上消除了聚合酶的活性，直到反应被含水样品水合。如果含水样品在水合之前已加热，则这为真正的热启动PCR创造了条件，并且减少或消除了对于昂贵的化学热启动组分的需求。
小袋510可以以与美国专利号8,895,295中描述的那种类似的方式使用。在一个说明性实施方案中，将包含待测试样品(100 μl)和裂解缓冲液(200 μl)的300 μl混合物注入入口通道515a附近的配件590中的注入口(未示出)，并且将样品混合物抽取到入口通道515a内。水也被注入到与入口通道515l相邻的配件590的第二注入口(未示出)内，并且经由配件590中提供的通道(未示出)分配，从而水合高达11种不同的试剂，所述试剂各自先前在入口通道515b到515l处以干燥形式提供。这些试剂说明性地可以包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA提取试剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其它化学实体。说明性地，所述试剂用于核酸提取、第一阶段多重PCR、多重反应的稀释、和第二阶段PCR试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施方案中，所有需要注入的是一个注入口中的样品溶液和另一个注入口中的水。注入后，可以密封两个注入口。关于小袋510和配件590的各种配置的更多信息，参见已经引入作为参考的美国专利号8,895,295。
在注入后，样品经由通道514从注入通道515a移动到裂解泡罩522。裂解泡罩522提供有珠或颗粒534，例如陶瓷珠，并且配置为用于使用在FilmArray®器械中提供的旋转叶片或桨叶，经由撞击而涡旋。通过在裂解颗粒如硅酸锆(ZS)珠534的存在下摇动或涡旋样品的珠磨，是形成裂解产物的有效方法。应理解，如本文使用的，术语例如“裂解(lyse)”、“裂解(lysing)”和“裂解产物”并不限于破裂细胞，而是此类术语包括非细胞颗粒例如病毒的破坏。
图4显示了珠击打电动机819，其包括叶片821，所述叶片821可以安装在图2中所示的器械800的支撑构件802的第一侧811上。叶片可以延伸穿过槽804以接触小袋510。然而，应理解，电动机819可以安装在器械800的其它结构上。在一个说明性实施方案中，电动机819是安装在支撑构件802上的Mabuchi RC-280SA-2865 DC Motor (Chiba，日本)。在一个说明性实施方案中，电动机以5,000至25,000 rpm，更说明性地10,000至20,000 rpm，且再更说明性地大约15,000至18,000 rpm转动。对于Mabuchi电动机，已发现7.2V提供足够的rpm用于裂解。然而，应理解，当叶片821撞击小袋510时，实际速度可能稍微慢一些。取决于所使用的电动机和桨叶，其它电压和速度可以用于裂解。任选地，可以将受控的小体积空气提供到与裂解泡罩522相邻的囊状物822内。已发现，在一些实施方案中，用一个或多个小体积空气部分填充相邻囊状物帮助在裂解过程期间定位和支撑裂解泡罩。可替代地，其它结构，说明性地裂解泡罩522周围的刚性或顺应性垫圈或其它保持结构，可以用于在裂解期间约束小袋510。还应理解，电动机819仅是说明性的，并且其它装置可以用于研磨、摇动或涡旋样品。
一旦细胞已被充分裂解，样品就通过通道538、泡罩544和通道543移动到泡罩546，在其中样品与核酸结合物质，例如二氧化硅涂布的磁珠533混合。允许混合物温育适当的时间长度，说明性地大约10秒至10分钟。位于与泡罩546相邻的器械内的可伸缩磁体从溶液中捕获磁珠533，形成对着泡罩546内表面的团块。然后将液体移出泡罩546并且通过泡罩544返回并进入泡罩522内，所述泡罩522现在用作废物容器。来自注入通道515c至515e中的一个或多个的一种或多种洗涤缓冲液经由泡罩544和通道543提供至泡罩546。任选地，使磁体缩回，并且通过经由通道543从泡罩544和546来回移动珠来清洗磁珠533。一旦磁珠533被洗涤，就通过活化磁体将磁珠533重新捕获在泡罩546中，然后将洗涤溶液移至泡罩522。可以根据需要重复该过程，以从核酸结合磁珠533中洗涤裂解缓冲液和样品碎片。
在洗涤后，将贮存在注入通道515f中的洗脱缓冲液移至泡罩548，并且使磁体缩回。溶液经由通道552在泡罩546和548之间循环，打碎泡罩546中的磁珠533的团块，并且允许捕获的核酸与珠脱离并进入溶液内。再次活化磁体，捕获泡罩546中的磁珠533，并且将洗脱的核酸溶液移入泡罩548内。
将来自注入通道515g的第一阶段PCR主混合物与泡罩548中的核酸样品混合。任选地，通过经由通道553迫使混合物在548和564之间来混合混合物。在几个混合循环之后，溶液包含在泡罩564中，在其中提供第一阶段PCR引物的团块，对于每个靶至少一组引物，并且执行第一阶段多重PCR。如果存在RNA靶，则可以在第一阶段多重PCR之前或同时执行使用合适的逆转录酶的逆转录(RT)步骤。FilmArray®器械中的第一阶段多重PCR温度循环说明性地执行15-30个循环，尽管根据具体应用的要求，其它水平的扩增可能是期望的。如本领域已知的，第一阶段PCR主混合物可以是各种主混合物中的任一种。在一个说明性实例中，第一阶段PCR主混合物可以是US2015/0118715中公开的任何化学物质，所述专利引入本文作为参考，用于与每个循环花费20秒或更少的PCR方案一起使用。
在第一阶段PCR已进行所需数目的循环后，可以将样品稀释，说明性地通过迫使大部分样品回到泡罩548内，在泡罩564中仅留下少量，并且从注入通道515i添加第二阶段PCR主混合物。可替代地，可以将来自515i的稀释缓冲液移至泡罩566，然后通过在泡罩564和566之间来回移动流体，与泡罩564中的扩增样品混合。如果需要的话，可以使用来自注入通道515j和515k的稀释缓冲液重复稀释几次，或者可以保留注入通道515k用于测序或用于其它PCR后分析，然后将来自注入通道515h的第二阶段PCR主混合物添加到一些或全部稀释的扩增样品中。应理解，可以通过改变稀释步骤的数目，或通过在与稀释缓冲液或第二阶段PCR主混合物混合之前改变丢弃的样品百分比来调节稀释水平，所述第二阶段PCR主混合物包含用于扩增的组分，说明性地聚合酶、dNTP和合适的缓冲液，尽管其它组分可能是合适的，特别是对于非PCR扩增方法。如果需要的话，样品和第二阶段PCR主混合物的这种混合物可以在移动到第二阶段孔582用于第二阶段扩增之前在泡罩564中预热。此类预热可以避免在第二阶段PCR混合物中热启动组分(抗体、化学或其它)的需要。
说明性的第二阶段PCR主混合物是不完整的，缺少引物对，并且102个第二阶段孔582中的每一个预装载有特异性PCR引物对(或有时多个引物对)。如果需要的话，第二阶段PCR主混合物可以缺少其它反应组分，并且这些组分也可以预装载在第二阶段孔582中。每个引物对可以与第一阶段PCR引物对相似或相同，或者可以嵌套在第一阶段引物对内。样品从泡罩564移动到第二阶段孔582完成PCR反应混合物。一旦填充了高密度阵列581，就通过任何数目的手段将个别第二阶段反应密封在它们各自的第二阶段泡罩中，如本领域已知的。在已经引入作为参考的美国专利号8,895,295中讨论了填充和密封高密度阵列581而无交叉污染的说明性方法。说明性地，高密度阵列581的孔582中的各种反应同时进行热循环，说明性地使用一个或多个Peltier装置，尽管用于热循环的其它装置是本领域已知的。
在某些实施方案中，第二阶段PCR主混合物含有dsDNA结合染料LCGreen® Plus(BioFire Diagnostics，LLC)，以生成指示扩增的信号。然而，应理解，该染料仅是说明性的，并且可以使用其它信号，包括其它dsDNA结合染料和荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的探针，如本领域已知的。可替代地，阵列581的孔582可以无需信号而提供，其中结果通过后续处理报告。
当气动压力用于移动小袋510内的材料时，在一个实施方案中，可以采用“囊状物(bladder)”。囊状物组件810，其一部分在图2和3中示出，包括容纳多个可充气囊状物822、844、846、848、864和866的囊状物板824，所述囊状物各自可以个别地充气，说明性地通过压缩气体源。因为囊状物组件810可以经受压缩气体并且多次使用，所以囊状物组件810可以由比小袋更坚韧或更厚的材料制成。可替代地，囊状物822、844、846、848、864和866可以由用垫圈、密封件、阀和活塞紧固在一起的一系列板形成。其它布置也在本发明的范围内。
次级PCR反应的成功取决于由多重第一阶段反应生成的模板。通常，使用高纯度的DNA执行PCR。方法例如苯酚提取或商业DNA提取试剂盒提供了高纯度的DNA。通过小袋510处理的样品可能需要调整以补偿较不纯的制剂。PCR可以被生物样品的组分抑制，这是潜在的障碍。说明性地，热启动PCR、更高浓度的Taq聚合酶、MgCl2浓度的调节、引物浓度的调节和助剂(例如DMSO、TMSO或甘油)的添加任选地可以用于补偿较低的核酸纯度。虽然纯度问题可能更多是第一阶段扩增和单一阶段PCR的关注，但应理解，也可以在第二阶段扩增中提供类似的调节。
当将小袋510放置在器械800内时，将囊状物组件810压靠在小袋510的一个面上，使得如果特定的囊状物膨胀，则压力将迫使液体从小袋510中的相应泡罩中流出。除对应于小袋510的许多泡罩的囊状物之外，囊状物组件810可以具有另外的气动致动器，例如囊状物或气动驱动的活塞，对应于小袋510的各种通道。图2和3显示了说明性的多个活塞或硬密封件838、843、852、853和865，其对应于小袋510的通道538、543、553和565，以及密封件871、872、873、874，其最小化进入配件590内的回流。当启动时，硬密封件838、843、852、853和865形成夹管阀(pinch valve)，以夹断且关闭相应的通道。为了将液体约束在小袋510的特定泡罩内，硬密封件在来回泡罩的通道上被启动，使得致动器充当夹管阀以将通道关闭。说明性地，为了在不同的泡罩中混合两个体积的液体，密封连接通道的夹管阀致动器被启动，并且泡罩上方的气动囊状物被交替加压，迫使液体来回通过连接泡罩的通道，以混合在其中的液体。夹管阀致动器可以具有各种形状和尺寸，并且可以配置成一次夹断多于一个通道。虽然本文讨论了气动致动器，但应理解，考虑了向小袋提供压力的其它方式，包括各种机电致动器，例如线性步进电动机，电动机驱动的凸轮，由气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶，辊，摇臂，以及在某些情况下，旋塞弹簧(cocked spring)。另外，除施加正交于通道轴线的压力之外，还存在可逆或不可逆地关闭通道的各种方法。这些包括将袋子扭转跨越通道，热封，轧制致动器以及密封在通道中的各种物理阀，例如蝶形阀和球阀。另外，小型Peltier装置或其它温度调节器可以放置在通道附近，并且设定在足以冷冻流体的温度，有效地形成密封。另外，虽然图1的设计适于特征在于定位在每个泡罩和通道上的致动器元件的自动化器械，但也考虑了致动器可以保持静止，并且小袋510可以在一维或二维中过渡，使得少量致动器可以用于几个加工站点，包括样品破坏、核酸捕获、第一和第二阶段PCR、以及小袋510的其它应用例如免疫测定和免疫PCR。作用于通道和泡罩的辊可以证明在其中小袋510在站点之间平移的配置中特别有用。因此，尽管在当前公开的实施方案中使用气动致动器，但当术语“气动致动器”在本文中使用时，应理解，可以使用其它致动器和提供压力的其它方式，取决于小袋和器械的配置。
其它现有技术器械教导了在密封的柔性容器内的PCR。参见例如，美国专利号6,645,758和6,780,617和9,586,208，其引入本文作为参考。然而，包括在密封的PCR器皿内的细胞裂解可以改善易用性和安全性，特别是如果待测试的样品可能含有生物危害。在本文所示的实施方案中，来自细胞裂解以及所有其它步骤的废物保留在密封的小袋内。然而，应理解，可以取出小袋内容物用于进一步测试。
图2显示了可以与小袋510一起使用的说明性器械800。器械800包括支撑构件802，其可以形成壳体的壁或安装在壳体内。器械800还可以包括第二支撑构件(未示出)，其任选地可相对于支撑构件802移动，以允许小袋510的插入和撤回。说明性地，一旦小袋510已插入到器械800内，盖子可以覆盖小袋510。在另一个实施方案中，两个支撑构件可以是固定的，其中小袋510通过其它机械手段或通过气动压力固定就位。
在说明性实例中，加热器886和888安装在支撑构件802上。然而，应理解，这种布置仅是说明性的，并且其它布置也是可能的。具有囊状物822、844、846、848、864、866的囊状物板810，硬密封件838、843、852、853，形成囊状物组件808的密封件871、872、873、874可以说明性地安装在可移动支撑结构上，所述可移动支撑结构可以朝向小袋510移动，使得气动致动器与小袋510接触放置。当小袋510插入器械800内并且可移动支撑构件朝向支撑构件802移动时，小袋510的各种泡罩处于与囊状物组件810的各个囊状物和组件808的各种密封件相邻的位置，使得气动致动器的启动可以迫使液体从小袋510的一个或多个泡罩流出，或者可以对于小袋510的一个或多个通道形成夹管阀。在图3中更详细地示出了小袋510的泡罩和通道与组件808的囊状物和密封件之间的关系。
每个气动致动器经由阀899连接到压缩空气源895。虽然图2中仅显示了几个软管878，但应理解，每个气动配件经由软管878连接到压缩气体源895。压缩气体源895可以是压缩机，或者可替代地，压缩气体源895可以是压缩气筒，例如二氧化碳筒。如果需要便携性，则压缩气筒是特别有用的。其它压缩气体源也在本发明的范围内。
组件808说明性地安装在可移动支撑构件上，尽管应理解其它配置也是可能的。
器械810的几个其它部件也连接到压缩气体源895。安装在支撑构件802的第二侧814上的磁体850说明性地使用经由软管878来自压缩气体源895的气体展开和缩回，尽管移动磁铁850的其它方法是本领域已知的。磁体850位于支撑构件802中的凹部851中。应理解，凹部851可以是穿过支撑构件802的通道，使得磁体850可以接触小袋510的泡罩546。然而，取决于支撑构件802的材料，应理解，凹部851不需要一直延伸穿过支撑构件802，只要当磁体850展开时，磁体850足够接近以在泡罩546处提供足够的磁场，并且当磁体850缩回时，磁体850不显著影响泡罩546中存在的任何磁珠533。虽然提及了缩回磁体850，但应理解，可以使用电磁体，并且可以通过控制通过电磁体的电流来启动和停用电磁体。因此，虽然本说明书讨论了撤回或缩回磁体，但应理解这些术语足够宽泛，以包括撤回磁场的其它方式。应理解，气动连接可以是气动软管或气动空气歧管，因此减少了所需的软管或阀数目。
气动活塞阵列869的各种气动活塞868也经由软管878连接到压缩气体源895。虽然仅显示了将气动活塞868连接到压缩气体源895的两个软管878，但应理解气动活塞868各自连接到压缩气体源895。显示了十二个气动活塞868。
一对加热/冷却装置，说明性地珀尔帖加热器(Peltier heater)，安装在支撑件802的第二侧814上。第一阶段加热器886定位于加热且冷却泡罩564的内容物，用于第一阶段PCR。放置第二阶段加热器888以加热且冷却小袋510的第二阶段泡罩582的内容物，用于第二阶段PCR。然而，应理解，这些加热器也可以用于其它加热目的，并且如对于特定应用适当的，可以使用其它加热器。其它配置也是可能的。
当需要荧光检测时，可以提供光学阵列890。如图2中所示，光学阵列890包括光源898，说明性地经过滤的LED光源、经过滤的白光或激光照射以及照相机896。照相机896说明性地具有多个光电探测器，其各自对应于小袋510中的第二阶段孔582。可替代地，照相机896可以拍摄含有所有第二阶段孔582的图像，并且图像可以被分成对应于每个第二阶段孔582的分开视野。取决于配置，光学阵列890可以是静止的，或者光学阵列890可以放置在附接到一个或多个电动机的移动器(mover)上，并且移动以从每个个别第二阶段孔582获得信号。应理解，其它布置也是可能的。
如所示的，计算机894控制压缩空气源895的阀899，并且因此控制器械800的所有气动装置。计算机894还控制加热器886和888，以及光学阵列890。这些部件中的每一个都是电连接的，说明性地经由电缆891，尽管其它物理或无线连接也在本发明的范围内。应理解，计算机894可以容纳在器械800内或者可以在器械800外部。此外，计算机894可以包括控制一些或所有组件的内置电路板，可以计算扩增曲线、解链曲线、Cp、不同孔的Cp之间的差异(ΔCp) (或Cp之间的差异的绝对值)、标准曲线和其它相关数据，并且还可以包括外部计算机，例如台式或膝上型PC，以接收且展示来自光学阵列的数据。可以提供界面，说明性地键盘界面，包括用于输入信息和变量例如温度、循环时间等的键。说明性地，还提供了显示器892。例如，显示器892可以是LED、LCD或其它此类显示器。
可以通过检测敏感细菌和抗性细菌响应抗生素暴露的转录差异，在分子水平上测量抗生素敏感性。
通过测量转录差异，高阳性预测值(“PPV”)、真阳性/(真阳性+假阳性)是期望的。借助此信息，医生可以改变疗法，包括抗生素升级、降级或改变为不同抗生素。
阴性预测值(“NPV”)、真阴性/(真阴性+假阴性)目前更难以解释。NPV并不告诉你生物体是否敏感，因为按照目前的理解，存在太多的抗性机制以具有任何种类的合理NPV。因此，在一些实施方案中，NPV可能不那么有用。
用足够剂量的抗生素处理的敏感细菌最终将死亡。然而，在细菌显示可以用微生物学测试检测到的表型性状之前，该细菌经历了用分子测试应该可检测到的生物化学改变。一种此类测试是转录组重塑(transcriptome remodeling)。下述实施例集中于鉴定转录组差异，其区分且预测在暴露于抗生素后的死亡。
实施例1
可以通过检测敏感细菌和抗性细菌响应抗生素暴露的转录差异，在分子水平上测量抗生素敏感性。可以使用RNA测序或cDNA微阵列分析来说明性地发现这些转录差异。如上所述的多重化系统例如FilmArray系统的大型多重化和逆转录功能，可以促进对于多重细菌和抗生素的抗生素敏感性测量。在该实施例中，在暴露于抗生素之后靶向特异性和通用的细菌-抗生素组合，以确定是否可以在敏感菌株和抗性菌株之间检测到差异。应理解，此类方法可以延伸到其它抗生素或抗生素的混合物。
在现有技术的方法中，敏感培养物和抗性培养物两者均生长到对数早期，然后在断点暴露于抗生素或不暴露于抗生素(对照)，说明性地为30分钟，尽管可以使用其它时间。然后收获细胞并制备用于RNA测序。在此类方法中，需要大量的计算能力，以尝试理解敏感菌株和抗性菌株之间的mRNA表达差异。说明性地，为了理解来自此类现有技术方法的数据，需要清理数据以获得高质量的读数，需要将读数标准化以比较相等的采样，需要对转录物进行定量，并且相同转录物需要在四种条件(两种菌株(敏感或抗性)，各自+/-抗生素，提供了四种测试条件)下进行比较。然后鉴定在条件之间提供最大差异的mRNA。不能在条件之间区分的mRNA可以用作样品之间的标准化的内部参考。先前的研究(Barczak)鉴定了在敏感菌株相对于抗性菌株中，对环丙沙星(CIP)具有差异转录应答的四种标记物。
基于多重PCR的检测的初步研究使用：
● 铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，两种菌株：一种是抗性的，而另一种是敏感的。
S1 = 对环丙沙星敏感
R1 = 对环丙沙星抗性
● 用于两种菌株各自的抗生素环丙沙星。
● 用于两种菌株各自的无抗生素对照。
在该实施例中，每个菌株(S1和R1)生长到0.5 OD600 (~1 x 10 8 CFU/mL)，并且各自用或不用15 µg/mL环丙沙星处理10分钟(两种菌株，各自+/-抗生素，提供了四种测试条件)。应理解，OD和抗生素温育时间仅是说明性的，并且可以使用其它浓度和时间。遵循细菌裂解方案，通过使用TNA试剂盒在Magnapure上提取来生成cDNA，使用Qubit RNA HS AssayKit (Q32852)定量，去除基因组DNA，并使用具有dsDNA酶的Maxima H Minus cDNA Kit(M1682)生成cDNA。
使用了四个参考基因，所述参考基因各自的表达预计在敏感菌株和抗性菌株之间保持相对恒定，并且在抗生素的存在或不存在下保持恒定。四个参考基因是proC、rpoD、piv和pcaH。在台式(benchtop)实验中，所有这四个基因对于四种测试条件各自提供相似的Cp，即，对于每个基因，对于各自用和不用抗生素处理的敏感菌株和抗性菌株获得相似的Cp。因此，这四个基因是适当的参考基因，并且可以用于使来自其它基因的结果标准化，说明性地，由于细胞数目/样品中的差异。在一个说明性实施方案中，对于指示抗生素抗性的一个或多种基因，参考基因的Cp可以用于使各样品的Cp标准化。尽管一个参考基因可以用于此目的，但使用参考基因的组合可以帮助降低噪声或错误结果。说明性地，可以使用多重参考基因的Cp的几何平均值，尽管使用基因组合的其它方法是本领域已知的。因此，在本文的任何实施方案中，这些或其它参考基因之一或全部可以用于使各样品的Cp标准化。进一步地，尽管具有接近于系统最佳值的细菌负荷可能是有帮助的，但由于这种标准化，在各种实施方案中，定量可能不需要知道确切的细菌负荷。
其它基因在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式。这些基因中的几个位于群体感应途径或铁摄取途径中，而其它几个的途径是未知的。表1显示了由台式实验获得的结果，所述台式实验在抗生素的存在下测试了下述20个基因靶：lexA、sulA、recN、recA、prtN、ptrB、yhbY、LasI、RhlI、pqsH、pvdE、tonB、pvdA、ABC、PepSY、speD、PA14_RS20905、PA14_RS07980、PA14_RS07985和coA。
表1
Figure 356701DEST_PATH_IMAGE002
对于这些基因中的一些，对于存在和不存在抗生素，在敏感菌株和抗性菌株之间均发现了相似的ΔCp。此类基因被称为“通用抗生素抗性基因”，因为即使在不存在抗生素的情况下，它们也区分敏感菌株和抗性菌株。这些通用抗生素抗性基因中的几个位于群体感应途径或铁摄取途径中，而其它几个的途径是未知的。这些基因包括LasI、RhlI、pqsH、pvdE、PepSY、speD、PA14_RS20905和coA。LasI的扩增曲线显示于图5A中。如图5A中关于LasI所示的，无需抗生素(“ABX”)即可见到敏感菌株和抗性菌株之间的基因表达差异。图5A中所示的扩增曲线的Cp如下：
表2
Figure 414787DEST_PATH_IMAGE004
在所使用的测试条件下，对于敏感菌株，无论是否存在抗生素，Cp为约10.5，而对于抗性菌株，无论是否存在抗生素，Cp为约15。尽管大多数这些通用抗生素抗性基因在敏感菌株中显示上调，但注意到speD显示下调。
对于其它基因，仅在抗生素的存在下才发现明显的ΔCp。这些“特异性抗生素抗性基因”包括lexA、sulA、ptrB和PA14_RS07985，其中ptrB在抗性菌株中显示上调。lexA的扩增曲线显示于图5B中，其中具有抗生素的敏感菌株具有的Cp比其它三种条件早约2个循环。对于其它三种条件，具有和不具有抗生素的抗性菌株具有与不具有抗生素的敏感菌株基本上相同的Cp。Cp如下：
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE006
预计可以在分子测试中使用通用抗生素抗性基因和/或特异性抗生素抗性基因的某种组合，以确定未知样品对抗生素是敏感还是抗性。在测试之前，可以使样品与一种或多种抗生素一起温育，以测试通用抗生素抗性基因和特异性抗生素抗性基因两者。
上文注意到，一些基因可能是上调的，而其它基因是下调的。两者均可以用于抗生素抗性的测试中。当使用多重基因时，在一个说明性实例中，关于每个基因的偏移的绝对值可以用于输出指示敏感性或抗性的单个值。在另一个实施方案中，编码细菌的抗性或敏感表型的数学输出是，例如真实值(与绝对值相反)的线性组合或ΔCp的较高程度的真实值的多项式组合。用于组合Cp中的偏移的其它方法是已知的，并且可以用于生成定量或半定量输出。
测试的剩余基因显示ΔCp <1，并且未选择这些基因用于进一步研究。尽管没有进一步研究这些基因，但注意到，在敏感菌株和抗性菌株之间并未显示显著差异的这些其它基因中的一些或全部，可以用作参考基因。
实施例2
上述台式多重实验证实了，使用通用抗生素抗性基因和/或特异性抗生素抗性基因的细胞RNA浓度测量，作为抗生素抗性测试的可行性。测量细菌RNA转录物的浓度或检测细菌RNA转录物的存在的能力因以下事实而受到阻碍：大量这些转录物以远低于一个转录物/细胞的浓度存在(Bartholomaus等人)。这一点的实际结果是细胞基因组DNA (至少1个拷贝/细胞)的浓度(拷贝/细胞)经常远远超过任何细胞RNA转录物(经常<< 1个拷贝/细胞)的浓度。由于细菌转录物通常在序列上等同于其基因组拷贝(跨越开放阅读框)，因此基于多重RT-PCR的检测策略中的总信号代表DNA + RNA(其中经常[DNA] > [RNA])。在这些条件下，去除基因组DNA有助于促进RNA信号的检测。
可以使用多种策略来完成DNA去除，说明性地，通过修改细胞裂解条件以使得能够选择性释放RNA，修改核酸纯化以选择RNA，从纯化的核酸中选择性去除DNA，和/或其它方法是本领域已知的。在一个非限制性实例中，可以通过选择具有适当性质，例如RNA酶活性低或基本上不含RNA酶活性的DNA酶，酶促地完成从RNA+DNA混合物中选择性去除DNA。在一些实施方案中，针对双链体DNA具有高活性或针对DNA/RNA杂交体具有低活性(例如引物RNA结合)可能是期望的。已发现，在生成数百个碱基对的片段后，有时甚至在长时间温育后，关于各种商业dsDNA酶的DNA酶活性达到平台期。尽管许多DNA酶是已知的，但少数非限制性实例包括dsDNA酶(北极虾(Pandalus borealis)，重组，改造重组)、DNA酶I (牛脾脏，重组，其它来源)、Par_DSN (堪察加拟石蟹(Kamchatka crab))和DNA酶II (猪/牛脾脏，重组，其它来源)。
说明性地，使用来自北极虾的dsDNA酶，在1-10分钟内可见基本消化，而在20-30分钟内达到平台期。对于快速的DNA酶处理，说明性地不多于20分钟，且更说明性地不多于10分钟，且也许5分钟或更短，尽管取决于所使用的系统和酶，其它时间也是可能的，可能时，可见具有至少300 bp (也许500 bp或更高)扩增子的有效结果，因为此类更长的扩增子长度更有可能在DNA配对物序列中具有至少一个双链切割，其基本上阻止此类DNA被扩增。应理解，这仅是说明性的，并且可以使用其它扩增子长度，并且还可以使用温度来控制DNA酶反应的速度。在一些情形下，使用更长的扩增子长度是有悖常理的，尤其是在期望快速测定法时，因为更长的扩增子长度可能需要更长的延伸时间。然而，这可以被较短的DNA酶时间部分抵消。在一些测定法中，说明性地，由于较短的RNA原材料或所需的引物结合位点，较短的扩增子长度可能是需要的，或可能甚至是必需的。
在该说明性实施例中，类似于小袋510的小袋被开发为通过以下包括DNA酶处理步骤：包括冷冻干燥到配件内的DNA酶，说明性地来自北极虾的dsDNA酶，以及冷冻干燥到注射通道515e内的洗脱缓冲液中的轻微修饰，尽管应理解该dsDNA酶仅是说明性的，并且可以使用其它DNA酶，以及其它DNA去除方法。对于DNA酶步骤，在洗脱之后，将温度升高至适合于DNA酶的温度，说明性地42ºC，随后为逆转录和第一阶段多重PCR。在该实施例中，小袋含有45种不同的目的测定法(包括对照基因如rpoD)，其中mRNA以大于基因组的浓度存在的靶(“高拷贝靶”)，例如PA14_RS28865，以及以低于基因组的浓度存在的多种抗生素抗性基因靶，包括recA (特异性)和lasI (通用)。然而，应理解，这个测定法实验对象组仅是说明性的，并且可以使用测定法的任何组合。在一个说明性实施方案中，所有测定法都用于RNA靶，说明性地mRNA靶，尽管其它RNA靶可能适合于使用本文提供的方法的检测和/或定量。在该实施例中，开发了四种类似的小袋，具有和不具有dsDNA酶和洗脱缓冲液(+dsDNA酶或–dsDNA酶)，各自具有和不具有逆转录酶(+RT或–RT)。
如预计的，用该实验对象组的初步测试证实了，对于高拷贝靶PA14_RS28865，观察到不依赖于dsDNA酶处理的RNA依赖性信号。如图6中可见的，对于这种高拷贝靶，单独的逆转录(无需dsDNA酶步骤，-dsDNA酶+RT)足以生成可检测地超过基因组DNA浓度的cDNA浓度。如对于这种高拷贝靶预计的，+dsDNA酶+RT条件的Cp一般等价于来自–dsDNA酶+RT条件的Cp，指示了RNA浓度不受dsDNA酶处理的影响。注意到，对于以较高浓度提供的靶，预计较早的Cp，因此在图6-7中的较低值指示了较高的浓度。图7A-7J显示了不具有DNA酶处理(-dsDNA酶-RT)、具有DNA酶处理(+dsDNA酶-RT)、以及具有DNA酶处理随后为RT步骤(+dsDNA酶+RT)的各种其它靶的Cp。与高拷贝靶PA14_RS28865 (图7J)形成对比，dsDNA酶是检测RNA依赖性信号所期望的。这对于[RNA] < [DNA]的靶是预计的。对于lexA、atpA、oprD、RS25625、ompA、yhbY、RS02955和rnpB (图7A、7B、7D、7E、7F、7G、7H和7I)，当将+dsDNA酶–RT与+dsDNA酶+RT条件(中间方框和右侧方框)进行比较时，观察到Cp减少，指示了扩增和起始浓度的增加。注意到，在每种情况下，对于这些靶观察到的RNA依赖性Cp (+dsDNA酶+RT，右)大于仅对于DNA信号观察到的Cp (-dsDNA酶–RT，左)，确认了[RNA]小于[DNA]。认为增加逆转录效率或dsDNA酶效率作用于进一步区分+dsDNA酶+RT信号与+dsDNA酶–RT条件。这些数据证实了，对于[RNA] < [DNA]的靶，用dsDNA酶的处理可以用于将DNA浓度降低到小于RNA浓度的水平。也可以使用降低DNA或选择性地检测RNA的其它策略。在这些条件下，观察到的Cp可以用于提供引入小袋内的细菌群体内的给定测定法靶的RNA浓度测量。在将样品注入小袋内之前，用环丙沙星处理的早期测试，导致敏感抗生素抗性基因的Cp的预计改变。
图8、9A和9B中证实了说明性小袋充当快速表型敏感性测试的能力。如先前注意到的，由于通用抗生素抗性基因在两种菌株中以不同水平表达的事实(不考虑抗生素的存在)，它们可以用于区别敏感菌株与抗性菌株。图8显示了来自该说明性小袋的lasI转录物的Cp值(点显示了平均Cp (N=5)，误差条为+\- sd)。这些数据重现了在台式测试中获得的数据，其还显示了在敏感菌株中lasI转录物的较高表达 (参见上表2)。
如先前注意到的，特异性抗生素抗性基因通过检测经由有效抗生素的存在，在敏感菌株中诱导的转录改变，使得能够区分敏感菌株与抗性菌株。为了测试说明性实验对象组检测由有效抗生素诱导的转录改变的能力，进行下述实验。使铜绿假单胞菌的两个菌株在液体培养中生长至大约1E8 CFU/mL的密度(使用光密度的测量评价)，一个菌株具有> 8µg/mL的环丙沙星MIC (称为抗性的)，另一个菌株具有0.5 µg/mL的MIC (称为敏感的)。然后将每种培养物分到等体积的培养管内，并且取出等分试样用于在说明性实验对象组上测试(零时间点样品)。对于每个菌株，将环丙沙星以7.5 µg/mL或15 µg/mL加入不同的培养管中，并且将培养管(具有以及不具有环丙沙星)送回培养箱。取出样品，并且在10、30和60分钟，对于每个菌株和每种条件(+/-环丙沙星)，使用个别实验对象组进行测试。使用总RNA信号或来自一组四个对照基因(bamA、rpoD、prsL和pal)的信号，在每个小袋的基础上，使从说明性实验对象组中获得的每种测定法的Cp数据标准化。通过计算每个小袋的选定靶(所有RNA靶或四个对照基因)的Cp数据的几何平均值，然后计算每个测定法Cp与几何平均值的距离(称为相对表达水平)，来进行标准化。来自两种标准化方法的数据提供了基本上等价的结果，并且仅使用总RNA的数据显示于图9A-B中。
图9A-9B呈现了当在时间10、30和60分钟下，暴露于零、7.5或15 µg/mL环丙沙星时，抗性菌株(图9A)和敏感菌株(图9B)两者中的测定法靶lexA的相对表达水平。数据作为箱形图呈现，其中离群点以黑色显示。当菌株暴露于7.5或15 μg/mL环丙沙星时，在不存在环丙沙星的情况下(图9A，0环丙沙星点)，抗性菌株中lexA的相对表达并未改变(图9A将7.5和15 µg/mL组与零组进行比较)。对于敏感菌株(图9B)，数据看起来非常不同。在敏感菌株中，数据显示了在环丙沙星的存在下，lexA转录物的明确时间依赖性诱导(将0环丙沙星分组与7.5或15 µg/mL环丙沙星分组进行比较)。相对表达规模(几何平均值标准化的Cp)直接衍生自Cp值；因此，较低的值指示了对实验对象组的较高输入。这些数据证实了，响应有效抗生素的转录诱导可以用于确定抗生素敏感性，说明性地使用上述系统。如独立的RNA测序实验中确定的，对环丙沙星的明确时间依赖性应答以及使用说明性实验对象组观察到的lexA靶可见的诱导量级，与这种敏感菌株中观察到的lexA基因诱导的时间依赖性和量级几乎确切地匹配。
对于通用抗生素抗性基因，从+dsDNA酶+RT小袋获得的Cp可以用于鉴定样品是否对抗生素敏感或抗性。如上文实施例1中所讨论的，预计在装载到小袋内之前，在抗生素的存在下，细菌样品的温育导致特异性抗生素抗性基因中的Cp偏移。说明性地，在装载到小袋510内之前，细菌样品可以在器皿(说明性地如美国专利申请号2014-0283945中所述的装载小瓶)中温育10分钟，尽管其它装置和温育时间长度可能是期需的。
上文证实了可以在类似于小袋510的小袋中进行mRNA检测和定量。实施例1中呈现的数据证实了，使用通用抗生素抗性基因和/或特异性抗生素抗性基因的细胞RNA浓度测量，作为抗生素抗性测试的可行性。设想了关于细菌应答实验对象组的几个实施方案。在一个实施方案中，对于针对单个小袋中的多重药物的敏感性测试单个细菌物种。在此类实施方案中，对于测试的每种药物将需要至少一个特异性抗生素抗性基因。样品可以针对一种混合物中的所有抗生素进行温育，或分开的等分试样可以针对个别抗生素进行温育。在另一个实施方案中，在已知对该抗生素具有抗性的许多细菌中，针对敏感性测试一种抗生素，其中每个不同的物种或菌株具有对于该物种或菌株特异性的一个或多个靶，说明性地，报告所述特异性物种或菌株的存在，连同所存在的物种或菌株对该抗生素是敏感的还是抗性的。应理解，如本领域已知的，任一或两个实施方案可以使用封闭系统方法如小袋510来执行，或者可以使用任何合适的器械来执行。
在另一个实施方案中，抗生素对于细菌的最小抑菌浓度(MIC)可以通过使用其为+DNA酶+RT的小袋510来确定，说明性地，其中使已知量的样品与已知标准浓度的抗生素一起温育持续特定时间段，然后将样品注入小袋内，并且作为Cp的函数定量样品中的mRNA量。说明性地，温育可以是10分钟或30分钟，尽管可以使用其它温育时间。同样示例性地，可以将断点浓度用作标准浓度，尽管可以选择其它浓度。许多基因都是特异性抗生素抗性基因，尽管可以使用其它基因。对于每种菌株和抗生素，相对于抗生素的MIC可见不同表达模式，并且反映(指示)抗生素的MIC。说明性地，如上文讨论的，可以将MIC报告为定量输出的结果。在另一个实施方案中，每个个别基因的Cp指纹可以用于区分或比较菌株(参见例如，引入本文作为参考的美国专利号9,200,329，实施例4)。
类似地，可以在单个小袋510中测试多重抗生素的MIC。说明性地，可以使样品的等分试样与几种抗生素一起在分开的器皿中温育，每种如上所述，然后在注入小袋内之前合并。应理解，与将样品等分到几个器皿内用于分开温育相比，如果在单个器皿中进行温育并组合，则抗生素的组合可能对存在的细菌具有协同作用，并且可能给出不同表达模式。可能需要分开或组合的温育。输出结果是每种抗生素的敏感性和/或MIC，其可以帮助临床医生选择适当的治疗。
实施例3
虽然本文提及了FilmArray系统，但其它系统适合于本文使用的方法。本发明的某些实施方案还可以涉及或包括PCR系统，其配置为从扩增曲线或解链曲线或其组合调用(call)。说明性实例在已经引入作为参考的美国专利号8,895,295中描述，用于与小袋510或类似实施方案一起使用。然而，应理解，在美国专利号8,895,295中描述的实施方案仅是说明性的，并且根据本公开内容可以使用其它系统。例如，参考图10，显示了根据本公开内容的示例性方面的说明性系统700的方框图，所述说明性系统700包括控制元件702、热循环元件708和光学元件710。
在至少一个实施方案中，系统可以包括容纳在样品器皿714中的至少一种PCR反应混合物。在某些实施方案中，样品器皿714可以包括配置为允许和/或实现模板核酸的扩增的PCR反应混合物。某些说明性实施例还可以包括至少一个样品块或室716，其配置为接收至少一个样品器皿714。样品器皿714可以包括以个别、条状、板状或其它形式的任何多个样品器皿，并且说明性地，可以由样品块或室716提供或接收。
一个或多个实施方案还可以包括至少一个样品温度控制装置718和/或720，其配置为操纵和/或调控样品的温度。此类样品温度控制装置可以配置为升高、降低和/或维持样品的温度。在一个实例中，样品控制装置718是加热系统，而样品控制装置720是冷却系统。说明性样品温度控制装置包括(但不限于)加热和/或冷却块、元件、交换器、线圈、散热器、制冷机、灯丝、Peltier装置、强制鼓风机、处理机、通风口、分配器、压缩机、冷凝器、水浴、冰浴、火焰和/或其它燃烧或可燃形式的热、热包、冷包、干冰、干冰浴、液氮、微波和/或其它波发射装置、冷却设备、加热设备、以其它方式操纵样品温度的设备，和/或配置为升高、降低和/或维持样品温度的任何其它合适的装置。
说明性PCR系统700还包括光学系统710，其配置为检测由样品714 (或其一部分或试剂)发射的荧光量。如本领域已知的，此类光学系统710可以包括一个或多个荧光通道，并且可以同时或个别地检测来自多个样品的荧光。
PCR系统的至少一个实施方案可以进一步包括CPU 706，其被编程或配置为操作、控制、执行或以其它方式使加热系统718和冷却系统720推进，以使PCR反应混合物热循环，说明性地在光学系统710收集荧光信号的同时。然后，CPU 706可以生成扩增曲线、解链曲线或任何组合，其可以打印或不打印、展示在用户终端704的屏幕上或以其它方式输出。任选地，可以基于例如在用户终端704的屏幕上的扩增曲线和/或解链曲线，来输出正、负或其它调用。任选地，仅输出调用，说明性地，对于测试的每个靶输出一个调用。
CPU 706可以包括程序存储器、微控制器或微处理器(MP)、随机存取存储器(RAM)、以及输入/输出(I/O)电路，所有这些都经由地址/数据总线互连。程序存储器可以包括操作系统如Microsoft Windows®、OS X®、Linux®、Unix®等。在一些实施方案中，CPU 706还可以包括以下或以其它方式与以下通信连接：数据库或其它数据存储机制(例如，一个或多个硬盘驱动器、光存储驱动器、固态存储装置等)。数据库可以包括数据如解链曲线、退火温度、变性温度、以及生成和分析解链曲线所必需的其它数据。CPU 706可以包括多重微处理器、多重RAM和多重程序存储器、以及许多不同类型的I/O电路。例如，CPU 706可以将RAM和程序存储器实现为半导体存储器、磁性可读存储器和/或光学可读存储器。
除其它软件应用程序之外，微处理器还可以适应并配置为执行多个软件应用程序中的任何一个或多个、和/或驻留在程序存储器中的多个软件例行程序中的任何一个或多个。多个例行程序之一可以包括热循环例行程序，其可以包括根据两步PCR方案，将控制信号分别提供给加热系统718和冷却系统720，以加热和冷却样品714。多个例行程序中的另一个可以包括荧光例行程序，其可以包括向光学系统710提供控制信号，以发射荧光信号并检测由样品714散射的荧光量。多个例行程序中的又一个可以包括样品调用例行程序，其可以包括对于N个循环中的每个，在循环内温度调整段期间，从光学系统710获得荧光数据(温度、荧光对)，通过在分别的循环内温度调整段期间，组合来自N个循环各自的荧光数据，来生成复合解链曲线，分析复合解链曲线以做出正或负调用，并且在用户终端704上展示复合解链曲线、个别解链曲线和/或调用的指示。
在一些实施方案中，CPU 706可以经由有线或无线信号，在通信网络722-732上，与用户终端704、加热系统718、冷却系统720、光学系统710和样品块716通信，并且在一些情况下，可以经由居间的无线或有线装置在通信网络上进行通信，所述无线或有线装置可以是无线路由器、无线中继器、移动电话提供商的基地收发站等。通信网络可以是无线通信网络，例如第四代或第三代蜂窝网络(分别为4G或3G)、Wi-Fi网络(802.11标准)、WiMAX网络、广域网(WAN)、局域网(LAN)、互联网等。此外，通信网络可以是专有网络，安全的公共互联网，虚拟专用网络和/或一些其它类型的网络，例如专用接入线、平常的普通电话线、卫星链路、这些的组合等。当通信网络包括因特网时，数据通信可以经由因特网通信协议在通信网络上发生。再进一步地，通信网络可以是有线网络，其中数据通信可以经由以太网或通用串行总线(USB)连接而发生。
在一些实施方案中，CPU 706可以被包括在用户终端704内。在其它实施方案中，CPU 706可以经由有线或无线连接(例如，作为远程服务器)与用户终端704通信，以在用户终端704上展示个别解链曲线、复合解链曲线、调用等。用户终端704可以包括用户界面、通信单元、以及用户输入装置，例如展示在用户终端704的用户界面上的“软”键盘、经由有线或无线连接通信的外部硬件键盘(例如，蓝牙键盘)、外部鼠标、或者除CPU 706或类似于CPU706的另一个CPU之外的任何其它合适的用户输入装置。
说明性PCR系统和/或热循环仪器(热循环仪)的说明性特征、组件、元件和/或构件的另外实例是本领域已知的，和/或在上文或美国专利申请号2014-0273181中描述的，所述美国专利申请整体引入本文作为参考。
参考文献
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本文描述的是：
1. 一种用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法，其包括：
(a)使所述样品与抗生素一起温育，
(b)从所述样品中分离RNA，
(c)针对各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增来自所述各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因的靶，以生成多个扩增靶，
(e)定量多个扩增靶中的每个，以提供多个定量的扩增靶，并且生成指示抗生素敏感性的值，和
(f)由指示抗生素敏感性的值确定抗生素抗性。
2. 权利要求1的方法，其中
步骤(c)进一步包括针对参考基因，将所述RNA逆转录，
步骤(d)进一步包括扩增所述参考基因，
步骤(e)进一步包括定量所述参考基因，以生成参考值，和
步骤(f)包括将所述参考值与多个定量的扩增靶进行比较。
3. 条款2的方法，其中
步骤(c)进一步包括针对至少一个另外的参考基因将RNA逆转录，
步骤(d)进一步包括扩增来自所述至少另外的参考基因的至少一个另外的靶，和
步骤(e)包括定量所述至少一个另外的参考基因，以用于生成参考值。
4. 条款2-3中任一项的方法，其进一步包括
从多种定量的扩增基因各自的参考值计算值，其中所述值选自真实值或绝对值，其中指示抗生素敏感性的值是使用所述多种定量的扩增基因各自的值获得的输出(例如数学输出)，任选地，其中所述输出(例如，数学输出)是所述多种定量的扩增基因各自的绝对值之和。
5. 条款1-4中任一项的方法，其中所述多种基因包括通用抗生素抗性基因。
6. 条款1-5中任一项的方法，其中所述多种基因包括特异性抗生素抗性基因。
7. 条款1-6中任一项的方法，其中所述多种基因包括通用抗生素抗性基因和特异性抗生素抗性基因。
8. 条款1-7中任一项的方法，其中所述细菌是已知对抗生素具有抗性的多种细菌之一。
9. 条款1-8中任一项的方法，其中步骤(a)包括使所述样品与多种另外的抗生素一起温育，其中所述多种基因的第一组与所述抗生素有关，并且所述多种基因的另外组与所述另外的抗生素有关。
10. 条款1-9中任一项的方法，其进一步包括在步骤(c)之前，从所述样品中去除DNA。
11. 条款1-10中任一项的方法，其中来自多种基因的多个扩增靶包括至少300bp的一个或多个扩增子。
12. 条款1-11中任一项的方法，其中所述多个扩增靶各自导致至少300bp的扩增子。
13. 条款1-12中任一项的方法，其中来自多种基因的多个扩增靶包括至少500bp的一个或多个扩增子。
14. 条款1-13中任一项的方法，其中去除DNA包括持续不多于10分钟的通过DNA酶的消化。
15. 一种用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法，其包括：
(a)使所述样品与抗生素一起温育，
(b)从所述样品中分离RNA，
(c)针对在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增来自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的基因的靶，以生成扩增靶，
(e)定量所述扩增靶，以生成指示抗生素敏感性的值，和
(f)由指示抗生素敏感性的值确定抗生素抗性。
16. 一种用于确定样品中细菌的抗生素抗性的容器，其包括
包括第一阶段反应泡罩的第一阶段反应区，所述第一阶段反应泡罩包含用于多种基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，和
流体连接到所述第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因，所述第二阶段反应区配置用于对所有多个第二阶段反应室进行热循环。
17. 一种用于分析样品的装置，其包括：
配置为接收容器的开口，所述容器包括第一阶段反应区，所述第一阶段反应区包含用于多种基因或参考基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，和
流体连接到所述第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因或参考基因，所述多个第二阶段反应室进一步包含产生指示扩增量的信号的可检测标记，
用于控制所述第一阶段反应区的温度的第一加热器，
用于对所述第二阶段反应区进行热循环的第二加热器，
配置为检测所述第二阶段反应室各自中的信号的检测装置，和
CPU，其配置为确定多种基因中的每个和参考基因的Cp，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并配置为输出关于多种基因中的每个和参考基因的值，所述多种基因在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，其中所述值是关于多种基因各自的ΔCp或ΔCp的绝对值，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并且其中所述CPU配置为由多种基因各自的值确定抗生素抗性，所述多种基因在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式。
18. 一种用于确定抗生素针对样品中的细菌的最小抑菌浓度(MIC)的方法，其包括：
(a)使所述样品的等分试样与已知标准浓度的抗生素一起温育，
(b)从所述样品的等分试样中分离RNA，所述RNA包含相对于所述抗生素的MIC显示数量上不同的表达水平的基因，
(c)针对所述基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增所述基因的靶，以生成扩增靶，
(e)定量所述扩增靶，以提供定量的扩增靶并生成指示MIC的值，和
(f)将所述MIC报告为所述基因的定量输出结果。
19. 条款18的方法，其中所述抗生素的已知标准浓度是断点浓度。
20. 条款18或19的方法，其中来自所述样品的RNA包含多种另外基因，其相对于所述抗生素的MIC显示数量上不同的表达水平，所述方法进一步包括：
针对所述多种另外基因，将所述RNA逆转录，
扩增来自所述多种另外基因的靶，以生成来自所述多种另外基因的多个扩增靶，
定量来自多种另外基因的多个扩增靶中的每个，以生成指示多种另外基因各自的MIC的值，和
将所述MIC报告为所述基因和多种另外基因的定量输出组合。
21. 条款18-20中任一项的方法，其中
步骤(a)包括使所述样品的多个另外等分试样各自与已知标准浓度的另外抗生素一起温育，
在步骤(b)之前取出所述样品的等分试样和所述样品的多个另外等分试样，
对于每种另外抗生素，针对多种基因，将所述RNA逆转录，
对于每种另外抗生素，扩增来自多种基因的靶，以对于每种另外抗生素生成来自多种基因的多个扩增靶，
对于每种另外抗生素，定量来自多种基因的多个扩增靶中的每个，以对于每种另外抗生素生成指示多种基因各自的MIC的值，和
将每种另外抗生素的MIC报告为对于每种另外抗生素的多种基因的定量输出组合。
22. 条款18-21中任一项的方法，其中
步骤(d)进一步包括扩增来自参考基因的靶，
步骤(e)进一步包括定量所述参考基因，以生成参考值，和
步骤(f)包括将所述参考值与所述定量的扩增靶进行比较。
23. 条款18-22中任一项的方法，其中所述基因是特异性抗生素抗性基因。
24. 条款18-23中任一项的方法，其进一步包括在步骤(c)之前，从所述样品中去除DNA。
25. 条款18-24中任一项的方法，其中所述扩增靶包括至少300bp的一个或多个扩增子。
26. 条款18-25中任一项的方法，其中每个扩增靶导致至少300bp的扩增子。
27. 条款18-26中任一项的方法，其中所述扩增靶包括至少500bp的一个或多个扩增子。
28. 条款24-27中任一项的方法，其中去除DNA包括持续不多于10分钟的通过dsDNA酶的消化。
29. 条款1-15或18-28中任一项的方法，其中所述方法的一个或多个步骤使用条款16的容器进行和/或在条款16的容器中进行，任选地，其中分离步骤、逆转录步骤和/或扩增步骤使用条款16的容器进行和/或在条款16的容器中进行。
30. 条款1-15或18-28中任一项的方法，其中所述方法的一个或多个步骤使用条款17的装置进行和/或在条款17的装置中进行，任选地，其中分离步骤、逆转录步骤和/或扩增步骤使用条款17的装置进行和/或在条款17的装置中进行。
31. 一种用于确定抗生素对样品中的细菌的作用的方法，其包括：
(a)使所述样品与所述抗生素一起温育，
(b)从所述样品中分离RNA，
(c)针对多种基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增来自所述多种基因的靶，以生成多个扩增靶，和
(e)将所述扩增靶与来自另一细菌样品的扩增靶进行比较，所述另一细菌样品未与所述抗生素一起温育。
32. 条款32的方法，其进一步掺入条款2-14中任一项的步骤。
33. 条款16的容器在条款1-15、18-28或31-32中任一项的方法中的用途。
34. 条款17的装置在权利要求1-15、18-28或31-32中任一项的方法中的用途。
尽管本发明已参考优选实施方案进行详细描述，但各种变化和修改存在于如所附权利要求中描述和定义的本发明的范围和精神内。

Claims (29)

1.一种用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法，其包括：
(a)使所述样品与抗生素一起温育，
(b)从所述样品中分离RNA，
(c)针对各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增来自所述各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因的靶，以生成多个扩增靶，
(e)定量来自多种基因的多个扩增靶中的每个，以提供多个定量的扩增靶，并且生成指示抗生素敏感性的值，和
(f)由指示抗生素敏感性的值确定抗生素抗性。
2.权利要求1的方法，其中
步骤(c)进一步包括针对参考基因，将所述RNA逆转录，
步骤(d)进一步包括扩增来自所述参考基因的靶，
步骤(e)进一步包括定量所述参考基因，以生成参考值，和
步骤(f)包括将所述参考值与来自多种基因的多个定量的扩增靶进行比较。
3.权利要求2的方法，其中
步骤(c)进一步包括针对至少一个另外的参考基因将RNA逆转录，
步骤(d)进一步包括扩增来自所述至少一个另外的参考基因的至少一个另外的靶，和
步骤(e)包括定量所述至少一个另外的参考基因，以用于生成参考值。
4.权利要求2的方法，其进一步包括
从多种定量的扩增基因各自的参考值计算值，其中所述值选自真实值或绝对值，其中指示抗生素敏感性的值是使用所述多种定量的扩增基因各自的值获得的输出。
5.权利要求1的方法，其中所述多种基因包括通用抗生素抗性基因。
6.权利要求1的方法，其中所述多种基因包括特异性抗生素抗性基因。
7.权利要求1的方法，其中所述多种基因包括通用抗生素抗性基因和特异性抗生素抗性基因。
8.权利要求1的方法，其中所述细菌是已知对抗生素具有抗性的多种细菌之一。
9.权利要求1的方法，其中步骤(a)包括使所述样品与多种另外的抗生素一起温育，其中所述多种基因的第一组与所述抗生素有关，并且所述多种基因的另外组与所述另外的抗生素有关。
10.权利要求1的方法，其进一步包括在步骤(c)之前，从所述样品中去除DNA。
11.权利要求10的方法，其中来自多种基因的多个扩增靶包括至少300bp的一个或多个扩增子。
12.权利要求10的方法，其中所述多个扩增靶各自导致至少300bp的扩增子。
13.权利要求10的方法，其中来自多种基因的多个扩增靶包括至少500bp的一个或多个扩增子。
14.权利要求10的方法，其中去除DNA包括持续不多于10分钟的通过DNA酶的消化。
15.一种用于确定样品中细菌的抗生素抗性的方法，其包括：
(a)使所述样品与抗生素一起温育，
(b)从所述样品中分离RNA，
(c)针对在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增来自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的基因的靶，以生成扩增靶，
(e)定量所述扩增靶，以生成指示抗生素敏感性的值，和
(f)由指示抗生素敏感性的值确定抗生素抗性。
16. 一种用于确定样品中细菌的抗生素抗性的容器，其包括
包括第一阶段反应泡罩的第一阶段反应区，所述第一阶段反应泡罩包含用于多种基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，和
流体连接到所述第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因，所述第二阶段反应区配置用于对所有多个第二阶段反应室进行热循环。
17. 一种用于分析样品的装置，其包括：
配置为接收容器的开口，所述容器包括第一阶段反应区，所述第一阶段反应区包含用于多种基因或参考基因的逆转录和扩增的多对引物，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，和
流体连接到所述第一阶段反应区的第二阶段反应区，所述第二阶段反应区包括多个第二阶段反应室，每个第二阶段反应室包含一对引物，用于进一步扩增各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式的多种基因或参考基因，所述多个第二阶段反应室进一步包含产生指示扩增量的信号的可检测标记，
用于控制所述第一阶段反应区的温度的第一加热器，
用于对所述第二阶段反应区进行热循环的第二加热器，
配置为检测所述第二阶段反应室各自中的信号的检测装置，和
CPU，其配置为确定多种基因中的每个和参考基因的Cp，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并配置为输出关于多种基因各自的值，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，其中所述值是关于多种基因各自的ΔCp或ΔCp的绝对值，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式，并且其中所述CPU配置为由多种基因各自的值确定抗生素抗性，所述多种基因各自在敏感菌株和抗性菌株之间显示不同表达模式。
18.一种用于确定抗生素针对样品中的细菌的最小抑菌浓度(MIC)的方法，其包括：
(a)使所述样品的等分试样与已知标准浓度的抗生素一起温育，
(b)从所述样品的等分试样中分离RNA，所述RNA包含相对于所述抗生素的MIC显示数量上不同的表达水平的基因，
(c)针对所述基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增所述基因的靶，以生成扩增靶，
(e)定量所述扩增靶，以提供定量的扩增靶并生成指示MIC的值，和
(f)将所述MIC报告为所述基因的定量输出结果。
19.权利要求18的方法，其中所述抗生素的已知标准浓度是断点浓度。
20.权利要求18的方法，其中来自所述样品的RNA包含多种另外基因，其相对于所述抗生素的MIC显示数量上不同的表达水平，所述方法进一步包括：
针对所述多种另外基因，将所述RNA逆转录，
扩增来自所述多种另外基因的靶，以生成来自所述多种另外基因的多个扩增靶，
定量来自多种另外基因的多个扩增靶中的每个，以生成指示多种另外基因各自的MIC的值，和
将所述MIC报告为所述基因和多种另外基因的定量输出组合。
21.权利要求20的方法，其中
步骤(a)包括使所述样品的多个另外等分试样各自与已知标准浓度的另外抗生素一起温育，
在步骤(b)之前取出所述样品的等分试样和所述样品的多个另外等分试样，
对于每种另外抗生素，针对多种基因，将所述RNA逆转录，
对于每种另外抗生素，扩增来自多种基因的靶，以对于每种另外抗生素生成来自多种基因的多个扩增靶，
对于每种另外抗生素，定量来自多种基因的多个扩增靶中的每个，以对于每种另外抗生素生成指示多种基因各自的MIC的值，和
将每种另外抗生素的MIC报告为每种另外抗生素的多种基因的定量输出组合。
22.权利要求18的方法，其中
步骤(d)进一步包括扩增来自参考基因的靶，
步骤(e)进一步包括定量所述参考基因，以生成参考值，和
步骤(f)包括将所述参考值与所述定量的扩增靶进行比较。
23.权利要求18的方法，其中所述基因是特异性抗生素抗性基因。
24.权利要求18的方法，其进一步包括在步骤(c)之前，从所述样品中去除DNA。
25.权利要求24的方法，其中所述扩增靶包括至少300bp的一个或多个扩增子。
26.权利要求24的方法，其中每个扩增靶导致至少300bp的扩增子。
27.权利要求24的方法，其中所述扩增靶包括至少500bp的一个或多个扩增子。
28.权利要求24的方法，其中去除DNA包括持续不多于10分钟的通过dsDNA酶的消化。
29.一种用于确定抗生素对样品中的细菌的作用的方法，其包括：
(a)使所述样品与所述抗生素一起温育，
(b)从所述样品中分离RNA，
(c)针对多种基因，将所述RNA逆转录，
(d)扩增来自所述多种基因的靶，以生成多个扩增靶，和
(e)将所述扩增靶与来自另一细菌样品的扩增靶进行比较，所述另一细菌样品未与所述抗生素一起温育。
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