CN113195085A - 用于识别优化蛋白产生的系统和方法以及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本文描述了能够实现快速蛋白进化的系统、方法以及其试剂盒。在本文所述的方法中有用的系统包括：DNA合成部件；微流体系统，包括微流体装置，该微流体装置具有微流体通道和隔绝坞；以及计算部件，该计算部件被配置为分析测定结果，并且基于所述分析，设计用于迭代蛋白进化的改进的DNA序列。所述微流体系统被配置为允许将珠粒上的DNA序列关联到其在所述微流体装置内的位置，允许被捕获到珠粒的DNA序列的无细胞蛋白表达，以及允许这样产生的蛋白的测定。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月11日提交的题为“SYSTEMS AND METHODS FORIDENTIFICATION OF OPTIMIZED PROTEIN PRODUCTION AND KITS THEREFOR”的美国临时申请第No.62/744,578号的权益，其全部公开内容通过引用整体合并在本文中。
背景技术
在生物科学和相关领域中，开发用于治疗或合成生物制剂发现和产生的优化蛋白可能是有用的。本发明的一些实施例包括用于快速蛋白进化的设备和过程，其包括基因或亚基因设计和DNA合成的循环、无细胞蛋白产生以及产物蛋白功能的检测/评估。
发明内容
在第一方面，提供了一种用于快速蛋白进化的系统，该系统包括：微流体装置；以及微流体系统部件(例如，仪器)，该微流体系统部件被配置为：将多个珠粒输入到微流体装置中，所述多个珠粒中的每个珠粒包括(i)第一多个核酸序列中的一个核酸序列，其中，第一多个核酸序列中的每个核酸包括编码感兴趣的蛋白的核酸序列的序列变体，以及(ii)条形码；在有助于表达由多个珠粒中的每个珠粒的一个核酸序列所编码的相应蛋白的条件下，孵育位于微流体装置内的多个珠粒，从而产生多个相应蛋白；以及测定从多个珠粒的核酸序列产生的多个相应蛋白中的期望性质。该系统可包括多个蛋白聚集珠粒，其特异性结合到感兴趣的蛋白的表位或蛋白标签(例如，表位标签，诸如FLAG标签、金属螯合标签，例如His6、FlAsH、ReAsH等)。
在一些变型中，该系统可包括核酸合成部件，该核酸合成部件被配置为合成第一多个核酸序列(例如，和任何后续多个核酸序列)。第一多个核酸序列中的每个核酸序列可以对感兴趣的蛋白的序列变体编码。该系统可包括珠粒制备部件，该珠粒制备部件被配置为将第一多个核酸序列中的每个连接到珠粒(例如，由此生成该第一多个珠粒和/或任何后续多个珠粒)。珠粒制备部件可以是与核酸合成部件分开的设备，或者它可以是同一部件的一部分。
在一些变型中，该系统可包括条形码检测部件，该条形码检测部件被配置为将多个珠粒中的每个珠粒的核酸序列与微流体装置内的多个珠粒中的相应珠粒的位置关联。条形码检测部件可包括微流体系统部件的光学子系统，该光学子系统被配置为在视觉上检测条形码。条形码检测部件可包括被配置为通过测序来确定条形码的核酸测序部件。
在一些变型中，该系统可包括计算部件(例如，计算机)，该计算部件被配置为将来自期望性质测定的结果与第一多个核酸序列的各个核酸序列关联；以及，基于该关联，设计第二多个核酸序列，每个核酸序列对感兴趣的蛋白的另一序列变体编码。计算部件可以被进一步配置为将第二多个核酸序列的设计传输到核酸合成部件。
在一些变型中，微流体装置可包括壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室。微流体装置的微流体结构可包括用于第一液体介质的流动路径；以及多个物理隔绝坞(sequestration pens)。多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括围栏；以及通向流动路径的单个开口，并且其中，围栏包围被构造为保持悬浮在第二液体介质中的微物体的内部空间。多个隔绝坞中的每个隔绝坞还可包括从开口延伸到围栏中的内壁。微流体装置的多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口可以被定向成使得没有任何部分是直接面向流动路径中的，由此，当通道包含第一液体介质的流动并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括隔离区域和将隔离区域流体连接到流动路径的连接区域，并且其中，隔离区域是微流体装置中的未波及区域。连接区域可包括通入流动路径的近端开口和通入隔离区域的远端开口，近端开口具有从大约20微米到大约100微米的范围的宽度Wcon，并且其中，连接区域从近端开口到远端开口的长度Lcon是连接区域的近端开口的宽度Wcon的至少1.0倍。流动路径可包括微流体通道，并且其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞通向微流体通道。
在一些变型中，微流体装置还可包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中第一电极是内部腔室的第一壁的部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
在另一方面，提供了一种用于进化蛋白的过程，该过程包括将第一核酸序列库设置在微流体装置内，其中，第一库的各个核酸序列结合到相应珠粒，并且其中，微流体装置包括壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室，并且另外其中，第一库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的蛋白序列(例如，感兴趣的原始蛋白序列，其可以来自天然存在的蛋白或非天然存在的蛋白，在任一情况下具有表征的活性)的核酸序列的一个或多个变化(variation)；将表型报告物(reporter)引入微流体装置中并将其设置在第一库的每个核酸序列附近，其中，表型报告物包括溶液相试剂和/或多个微物体，并且被配置为提供来自感兴趣的蛋白序列的表型读数；将试剂混合物引入微流体装置中并将其设置在第一库的每个核酸序列附近，其中，试剂混合物被配置为表达来自第一库的每个核酸序列的蛋白序列；表达来自第一库的每个核酸序列的蛋白序列；检测来自第一库的一个或多个核酸序列的近端的区域的表型读数；识别来自第一库识的具有相应近端区域的各个核酸序列，该近端区域具有期望的表型读数；以及确定第一库的识别出的核酸序列的序列。
在一些变型中，该过程还可包括将第一库的各个核酸序列与在相应近端区域中检测到的表型读数关联；以及设计第二核酸序列库，其中，第二库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化，其中第二库的核酸序列的一个或多个变化根据该关联而选择。第一库的每个核酸序列可以链接到第一多个珠粒的相应珠粒。第一多个珠粒中的每个珠粒可包括多个链接的核酸，每个链接的核酸包括编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列的相同变化。
在一些变型中，该过程还可包括将第一库的核酸序列设计为与编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列不同；合成第一库的核酸序列；以及将第一库的每个核酸序列连接到第一多个珠粒的相应珠粒，从而形成第一携带核酸的珠粒库。
在一些变型中，第一多个珠粒中的每个珠粒还可包括相应的不同条形码。不同的条形码可包括不同的核酸序列。该过程还可包括在将第一核酸序列库设置在微流体装置中之后读取第一多个珠粒中的每个珠粒的条形码，从而识别每个珠粒及其相应核酸序列在微流体装置内的位置。该过程还可包括读取第一多个珠粒中的每个珠粒的条形码(例如，在检测到表型读数之后)。
在一些变型中，该过程还可包括将多个蛋白聚集珠粒设置在微流体装置内并将所述多个蛋白聚集珠粒中的一个或多个蛋白聚集珠粒设置在第一库的每个核酸序列附近，其中，所述多个蛋白聚集珠粒中的蛋白聚集珠粒特异性结合到(i)感兴趣的蛋白序列的表位或(ii)由第一库的每个核酸序列编码的蛋白标签(例如，表位标签)，以便在功能上被从其表达的蛋白序列包括。该过程还可包括将来自第一库的每个核酸序列的所表达的蛋白捕获到与其邻近设置的一个或多个蛋白聚集珠粒。
在一些变型中，该过程还可包括在表达蛋白序列之后使冲洗介质流经微流体装置，从而置换试剂混合物。可以在检测到表型报告物之前使冲洗介质流经微流体装置。引入表型报告物并将其设置在第一多个核酸中的每个核酸附近可以在将试剂混合物设置在第一库的每个核酸序列附近和/或使冲洗介质流经微流体装置之后进行。
在一些变型中，微流体装置的微流体结构可包括(i)用于第一液体介质的流动路径；和(ii)多个物理隔绝坞。所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括：围栏；和通向流动路径的单个开口；其中，围栏包围内部空间，该内部空间被构造为保持悬浮在第二液体介质中的生物微物体。所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞还可包括从开口延伸到围栏中的内壁。微流体装置的所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口可以被定向成使得没有任何部分是直接面向流动路径中的，由此，当流动路径包含第一液体介质的流并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。在一些实施例中，微流体装置还可包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中第一电极是内部腔室的第一壁的一部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的一部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
将第一核酸序列库设置在微流体装置内可包括将第一多个珠粒中的各个珠粒引入所述多个隔绝坞中的各个隔绝坞中。第一多个珠粒中的不多于一个珠粒可以被引入所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞中。
在一些变型中，将表型报告物引入微流体装置中可包括将所述多个微物体中的一个或多个微物体引入包含第一核酸序列库的核酸序列的各个隔绝坞中。
在一些变型中，感兴趣的蛋白包括酶。感兴趣的蛋白可包括结合到细胞表面标记的域。细胞表面标记可以是细胞表面受体(例如，参与细胞间信号传递的受体)或糖蛋白。感兴趣的蛋白可包括抗体(例如，诸如单链抗体的抗体片段，例如单链可变域、纳米抗体等，以及可选地，缺少糖基化的抗体)。
在一些变型中，表型报告物可包括溶液相试剂，该溶液相试剂在与感兴趣的蛋白接触时提供可检测的信号(例如，试剂可以由感兴趣的蛋白切割，并且该切割可能引起可检测的光的发射)。表型报告物可包括微物体，该微物体包括用于感兴趣的蛋白的结合位点、被配置为报告感兴趣的蛋白的功能的报告细胞或提供用于感兴趣的蛋白的酶活性的酶衬底的微物体。
在一些变型中，将第一库的各个核酸序列与在相应近端区域中检测到的表型读数关联可以通过第一计算机部件进行，第一计算机部件被配置为识别来自识别出的核酸序列的相比感兴趣的蛋白的功能更加需要的所表达的蛋白的功能。设计第二核酸序列库可以由第二计算机部件基于所表达的蛋白功能与第一核酸序列库的核酸序列的关联来进行。第一计算机部件可以与第二计算机部件相同。第一计算机部件可以采用机器学习算法来执行该关联。第二计算机部件可以采用机器学习算法来设计第二核酸序列库。
在一些变型中，试剂混合物可包括无细胞蛋白表达反应混合物。引入试剂混合物可包括使试剂混合物流入流动路径中并且允许试剂混合物扩散到隔绝坞中。可以通过并行核酸合成仪合成第一(和/或第二)核酸序列库。并行核酸合成仪可以是大规模并行核酸合成仪。并行核酸合成仪可以被配置为将多个长度短的合成核酸组装为较长的连体核酸。被配置为组装较长连体核酸的并行核酸合成仪可被进一步配置为并行地组装多个较长的连体核酸。第二核酸序列库中的每一个核酸序列可以链接到相应珠粒以形成第二携带核酸的珠粒库。
在一些变型中，使用第二核酸序列库代替第一核酸序列库来重复设置第一核酸序列库、引入表型报告物、表达蛋白序列、检测表型读数、识别各个核酸序列和确定识别到的核酸序列的过程。可以设计和合成进一步的核酸序列库。另一核酸序列库的核酸序列可以链接到相应珠粒以形成另一携带核酸的珠粒库。第一核酸序列库可包括编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域内的变化。编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域可以对产生感兴趣功能的蛋白区域编码。子区域可以对感兴趣的原始蛋白的酶活性位点或结合位点(例如，抗原识别位点或蛋白-蛋白结合位点)编码。
在一些变型中，第一核酸序列库可包括在编码感兴趣的蛋白的核酸序列的整个长度上的变化。第二核酸序列库和/或进一步的核酸序列库可包括在编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域内的变化。编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域可以对产生感兴趣功能的蛋白的区域编码。子区域可以对感兴趣的蛋白的酶活性位点或结合位点(例如，抗原识别位点或蛋白-蛋白结合位点)编码。第二核酸序列库和/或进一步的核酸序列库可包括在编码感兴趣的蛋白的核酸序列的整个长度上的变化。
在另一方面，提供了一种用于感兴趣的蛋白的快速进化的试剂盒，该试剂盒包括微流体装置，其中，微流体装置包括：壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室；以及表型报告物。表型报告物可包括当由感兴趣的蛋白接触时提供可检测信号的溶液相试剂(例如，试剂可以由感兴趣的蛋白切割，并且该切割可能引起可检测光的发射)。
在一些变型中，表型报告物可包括多个微物体，每个微物体被配置为提供来自感兴趣的蛋白序列的表型读数。所述多个微物体中的微物体可包括用于感兴趣的蛋白的结合位点，和/或包括用于感兴趣的蛋白的酶活性的酶衬底，和/或是被配置为报告感兴趣的蛋白的功能的报告细胞。
在一些实施例中，微流体装置的微流体结构可包括(i)用于第一液体介质的流动路径；以及(ii)多个物理隔绝坞。所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括：围栏；以及通向流动路径的单个开口；其中，围栏包围被构造化为保持悬浮在第二液体介质中的微物体的内部空间。隔绝坞可包括从开口延伸到围栏中的内壁。微流体装置的所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口可以被定向成使得没有任何部分是直接面向通道的流动路径中的，由此，当通道包含第一液体介质的流动并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。在一些变型中，微流体装置还可包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中第一电极是内部腔室的第一壁的一部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的一部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
在一些变型中，试剂盒还可包括用于在体外从核酸序列表达蛋白的试剂混合物。试剂混合物可以是无细胞蛋白表达混合物。试剂盒还可包括多个珠粒，每个珠粒被配置为结合到核酸序列。所述多个珠粒中的每个珠粒可包括唯一条形码。唯一条形码可以是唯一核酸序列。试剂盒还可包括多个蛋白聚集珠粒。所述多个蛋白聚集珠粒中的每个可以特异性结合感兴趣的蛋白的表位或蛋白标签。
在一些变型中，试剂盒还可包括用于一个或多个计算机部件的机器可读指令。机器可读指令可以使计算机部件或多个计算机部件能够将核酸序列库的各个核酸序列和与各个核酸序列相关的表型关联；和/或设计核酸序列库，其中，库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化，并且可选地，其中，库设计基于多个各个核酸序列和与各个核酸序列相关的表型之间的关联。
附图说明
图1A示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置和具有相关联的控制设备的系统。
图1B示出了根据本公开的实施例的具有隔绝坞的微流体装置。
图2A-2B示出了根据本公开的一些实施例的具有隔绝坞的微流体装置。
图2C示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置的隔绝坞。
图3示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置的隔绝坞。
图4A-4B示出了根据本公开的一些实施例的微流体装置的动电特征。
图5A示出了根据本公开的一些实施例的用于与微流体装置和相关联的控制设备一起使用的系统。
图5B示出了根据本公开的一些实施例的成像装置。
图6示出了根据本公开的一些实施例的用于快速蛋白进化的系统。
图7A-7D示出了根据本公开的一些实施例的用于快速蛋白进化的过程。
图8示出了根据本公开的一些实施例的用于快速蛋白进化的过程。
图9示出了用于使用本文所述的系统来快速进化蛋白序列以识别优化序列的迭代过程。
具体实施方式
本说明书描述了本公开的示例性实施例和应用。然而，本公开不限于这些示例性实施例和应用，也不限于示例性实施例和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的元件尺寸可以被夸大或者可以不成比例。此外，当在本文中使用术语“在…上”、“附接到”、“连接到”或“耦接到”或类似词语时，一个元件(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一元件上”、“附接到另一元件”、“连接到另一元件”、或“耦接到另一元件”，而不论该一个元件是直接位于该另一元件上、附接、连接或耦接到该另一元件，还是在该一个元件与该另一元件之间存在一个或多个中间元件。而且，除非上下文另有所指，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在…下、在…上、上部、下部、水平、竖直、“x”、“y”、“z”等)，它们是相对地且仅作为示例提供的，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。此外，在提及元件列表(例如，元件a、b、c)的情况下，这种提及旨在包括所列出的元件的任何一个本身、少于全部列出的元件的任意组合和/或全部所列出的元件的组合。本说明书中的段落划分仅为了便于查看，并且不限制所讨论元件的任意组合。
在微流体特征的尺寸被描述为具有宽度或面积的情况下，通常相对于x轴和/或y轴尺寸来描述该尺寸，这两个尺寸均位于与微流体装置的基板和/或盖平行的平面内。可以相对于z轴方向描述微流体特征的高度，该z轴方向垂直于与微流体装置的基板和/或盖平行的平面。在一些情况下，诸如通道或通路的微流体特征的横截面积可以参照x轴/z轴、y轴/z轴或x轴/y轴面积。
如本文所使用的，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许从绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，诸如本领域普通技术人员可以预期的，但这些变化对整体性能没有明显影响。当与数值或者可以表示为数值的参数或特征一起使用时，“基本上”意指在百分之十之内。
术语“ones”意味着多于一个。
如本文所使用的，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。
如本文所使用的：μm意味着微米，μm3意味着立方微米，pL意味着皮升，并且μL(或uL)意味着微升。
如本文所使用的，术语“设置”在其含义内包括“位于”。
如本文所使用的，“微流体装置”或“微流体设备”是一种包括一个或多个离散的微流体回路和至少一个端口的装置，微流体回路被配置为保持流体，每个微流体回路由流体互连的回路元件构成，包括但不限于(多个)区域、(多个)流动路径、(多个)通道、(多个)腔室和/或(多个)坞，并且至少一个端口被配置为允许流体(以及可选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体回路将包括流动区域和至少一个腔室，该流动区域可包括微流体通道或者可以是微流体通道，并且微流体回路将保持小于大约1mL(例如，小于大约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2微升)的流体体积。在某些实施例中，微流体回路保持大约1-2、1-3、1-4、1-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300微升。微流体回路可以被配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体连接的第二端。
如本文所使用的，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是具有包含至少一个回路元件的微流体回路的一种类型的微流体装置，该至少一个回路元件被配置为保持小于大约1微升的流体体积，例如，小于大约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳米流体装置可包括多个回路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000个或更多个)。在某些实施例中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)回路元件被配置为保持以下流体体积：大约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或者1至50nL。在其它实施例中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如，全部)回路元件被配置为保持以下流体体积：大约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或者250至750nL。
微流体装置或纳米流体装置在本文中可称为“微流体芯片”或“芯片”；或者“纳米流体芯片”或“芯片”。
如本文所使用的“微流体通道”或“流动通道”指具有明显长于水平和竖直尺寸的长度的微流体装置的流动区域。例如，流动通道可以是水平或竖直尺寸的长度的至少5倍，例如，是长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1000倍、长度的至少5000倍或者更长。在一些实施例中，流动通道的长度是大约100000微米至大约500000微米，包括在其之间的任何值。在一些实施例中，水平尺寸是大约100微米至大约1000微米(例如，大约150到大约500微米)，竖直尺寸是大约25微米至大约200微米(例如，从大约40至大约150微米)。应该注意，流动通道在微流体装置中可以具有各种不同的空间构造，并且因此不限于完美的线性元件。例如，流动通道可以是或者可包括具有以下构造的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下倾、分叉(例如，多个不同的流动路径)及其任意组合。此外，流动通道可以具有沿其路径的不同的横截面积(扩宽和收缩)，以在其中提供期望的流体流动。流动通道可包括阀，并且阀可以是微流体领域中已知的任何类型。包括阀的微流体通道的示例在美国专利6,408,878(Unger等人)和9,227,200(Chiou等人)中公开，其全部内容通过引用整体合并在本文中。
如本文关于流体介质所使用的那样，“使…扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着向下的浓度梯度的热力学运动。
短语“介质的流动”是指流体介质的主要由于除扩散以外的任何机制所导致的整体运动。例如，介质的流动可涉及由于点之间的压力差引起的流体介质从一个点到另一个点的运动。这种流动可包括液体的连续流动、脉冲流动、周期性流动、随机流动、间歇性流动或往复流动，或者其任意组合。当一种流体介质流入另一种流体介质中时，会产生介质的湍流和混合。
短语“基本上没有流动”是指流体介质的流动速率，其随时间的平均值小于材料组分(例如，感兴趣的分析物)扩散到流体介质中的扩散速率或者在流体介质内的扩散速率。这种材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的粒径(size)以及组分与流体介质之间的相互作用强度。
如本文中关于微流体装置内的不同区域所使用的那样，短语“流体连接”是指当不同区域基本上填充有液体(诸如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成流体的单一体(single body)。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上一定是相同的。相反，微流体装置的不同的流体连接区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，诸如蛋白、碳水化合物、离子或其它分子)，由于溶质沿着它们各自的向下的浓度梯度运动和/或由于流体流经微流体装置，这些成分不断变化。
如本文所使用的，“流动路径”是指限定介质流的轨迹并经历介质流的轨迹的一个或多个流体连接的回路元件(例如，(多条)通道、(多个)区域、(多个)腔室等)。因此，流动路径是微流体装置的波及区域的示例。其它回路元件(例如，未波及区域)可以与包括流动路径而不经历流动路径中的介质流的回路元件流体连接。
如本文所使用的，“隔离微物体”构成将微物体限制到微流体装置内的限定区域。
如本文所使用的，“隔离区域”是指微流体装置内的区域，其被配置为保持微物体，使得微物体不会由于流体流经微流体装置而被抽离该区域。根据上下文，术语“隔离区域”可以进一步指限定可包括底座/基板、壁(例如，由微流体回路材料制成)和盖的区域的结构。
微流体(或纳米流体)装置可包括“波及”区域和“未波及”区域。如本文所使用的，“波及”区域由微流体回路的一个或多个流体互连回路元件组成，当流体正在流经微流体回路时，每个流体互连回路元件都经受着介质的流。波及区域的回路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分腔室。如本文所使用的，“未波及”区域由微流体回路的一个或多个流体互连回路元件组成，当流体流经微流体回路时，每个流体互连回路元件基本上不经受流体通量。只要流体连接被构造为使得能够扩散，但在波及区域与未波及区域之间基本上没有介质流，则未波及区域能够流体连接到波及区域。微流体装置因此可以被构造为基本上将未波及区域与波及区域中的介质流隔离，同时使得基本上仅实现在波及区域与未波及区域之间的扩散流体连通。例如，微流体装置的流动通道是波及区域的示例，而微流体装置的隔离区域(在下面进一步详细描述)是未波及区域的示例。
如本文所使用的，术语“透明的”是指允许可见光穿过而在光穿过时基本上不改变光的材料。
如本文所使用的，“明场”照明和/或图像是指来自广谱光源的微流体视场的白光照明，其中对比度由视场中的物体对光的吸收形成。
如本文所使用的，“结构光”是被调制以提供一种或多种照明效果的投射光。第一照明效果可以是照射装置表面的一部分而不照射(或至少最小化其照射)表面的相邻部分的投射光，例如，如下面更全面描述的用于活化DEP衬底内的DEP力的投射光图案。当使用结构光图案活化DEP力时，强度(例如诸如DMD的结构光调制器的占空比的变化)可以用于改变施加到光活化的DEP致动器的光功率，并且因此改变DEP力而不改变标称电压或频率。可以由结构光产生的另一照明效果包括可以针对表面不规则性和与光投射本身相关联的不规则性(例如，在照明区域的边缘处的下落)校正的投射光。结构光通常由结构光调制器生成，诸如数字镜装置(DMD)、微光闸阵列系统(MSA)、液晶显示器(LCD)等。用结构光照明表面的小区域，例如，所选择的感兴趣区域，提高了信噪比(SNR)，由于仅照明所选择的感兴趣区域减少了杂散光/散射光，从而降低了图像的暗度。结构光的一个重要方面是它可以随着时间快速改变。来自结构光调制器(例如，DMD)的光图案可以用于在诸如干净的镜子或远离焦点的表面的困难目标上自动聚焦。使用干净的镜子，可以复制多个自测试特征，诸如调制传递函数和场曲率/场倾斜的测量，而不需要更加昂贵的Shack-Hartmann传感器。在结构光图案的另一使用中，代替相机，可以利用简单的功率表在样本表面处测量空间功率分布。结构光图案也可以用作光学模块/系统部件对准的参照特征，以及用作手动聚焦的手动读数。通过使用结构光图案可能实现的另一种照明效果是对微流体装置内的水凝胶的选择性固化(curing)，例如凝固(solidification)。
如本文所使用的，透镜(或透镜组件)的“通光孔径”是可以用于其预期目的的透镜(或透镜组件)的部分的直径或尺寸。在一些情况下，通光孔径可以基本上等于透镜(或透镜组件)的物理直径。然而，由于制造限制，可能难以产生等于透镜(或透镜组件)的实际物理直径的通光孔径。
如本文所使用的，术语“有效区域”是指图像传感器或结构光调制器的部分，其可分别用于将结构光成像或提供到特定光学设备中的视场。有效区域受到光学设备的约束，诸如光学设备内的光路的孔径光阑。尽管有效区域对应于二维表面，但是有效区域的测量通常对应于通过具有相同面积的正方形的相对角的对角线的长度。
如本文所使用的，“图像光束”是从正由光学设备观察的装置表面、微物体或流体介质反射或发射的电磁波。该装置可以是本文所述的任何微流体装置。微物体和流体介质可以位于这种微流体装置内。
如本文所使用的，术语“微物体”大体上指可以根据本公开被隔离和/或操纵的任何微观物体。微物体的非限制性示例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠粒(例如，聚苯乙烯珠粒、LuminexTM珠粒等)；磁珠粒；微米棒(microrod)；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或源自膜制剂)；脂质纳米筏等；或者无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着到细胞的微珠粒、脂质体包覆的微珠粒、脂质体包覆的磁珠粒等)。珠粒可包括共价或非共价附接的部分/分子，诸如荧光标记、核酸(例如，寡核苷酸)、蛋白、碳水化合物、抗原、小分子信号部分或能够在测定中使用的其它化学/生物种类。脂质纳米筏已经在例如Ritchie等人(2009)“Reconstitutionof Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs”，Methods Enzymol，464：211-231中进行描述。
如本文所使用的，术语“细胞”与术语“生物细胞”可互换使用。生物细胞的非限制性示例包括：真核细胞、植物细胞、动物细胞(诸如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、鸟类细胞、鱼类细胞等)；原核细胞、细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞等；从组织解离的细胞，诸如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏或肺细胞、神经元、胶质细胞等；免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、浆细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，合子)、生殖细胞，例如卵母细胞、卵细胞和精细胞等；融合细胞、杂交瘤、培养细胞、来自细胞株的细胞、癌细胞、受感染的细胞、转染的和/或转化的细胞、报告细胞等。哺乳动物细胞可以来自例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、猪、灵长类动物等。
如果集落中能够繁殖的所有活细胞都是源自单个亲本细胞的子细胞，则生物细胞集落是“克隆的”。在某些实施例中，克隆集落中的所有子细胞源自通过不超过10次分裂的单个亲本细胞。在其它实施例中，克隆集落中的所有子细胞源自通过不超过14次分裂的单个亲本细胞。在其它实施例中，克隆集落中的所有子细胞源自通过不超过17次分裂的单个亲本细胞。在其它实施例中，克隆集落中的所有子细胞源自通过不超过20次分裂的单个亲本细胞。术语“克隆细胞”指相同克隆集落的细胞。
如本文所使用的，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如，大约2至大约20、大约4至大约40、大约6至大约60、大约8至大约80、大约10至大约100、大约20至大约200、大约40至大约400、大约60至大约600、大约80至大约800、大约100至大约1000、或大于1000个细胞)。
如本文所使用的，术语“维持细胞”和“维持多个细胞”是指提供包括流体和气体组分两者的环境以及可选地提供保持(多个)细胞存活和/或扩增(expanding)所需的条件的表面。
如本文所使用的，术语“扩增”在指代细胞时，是指细胞数量的增加。
流体介质的“组分”是存在于介质中的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白、糖类、碳水化合物、脂类、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
如本文所使用的，“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)并且包括多克隆和单克隆抗体两者；多链抗体，诸如IgG、IgM、IgA、IgE和IgD抗体；单链抗体，诸如驼源抗体；哺乳动物抗体，包括灵长类抗体(例如，人)、啮齿类抗体(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等)、兔类抗体(例如，兔)、有蹄类抗体(例如，牛、猪、马、驴、骆驼等)和犬科抗体(例如，狗)；灵长类化(例如，人源化)抗体；嵌合抗体，诸如小鼠-人、小鼠-灵长类抗体等；并且可以是完整分子或其片段(诸如轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'和F(ab)'2片段)，或者完整分子和/或片段的多聚体或聚集物；并且可以天然存在或通过例如免疫、合成或基因工程产生。如本文所使用的，“抗体片段”是指源自抗体或与抗体相关的结合抗原的片段。在一些实施例中，抗体片段可以被衍生化以表现出促进清除和吸收的结构特征，例如，通过掺入半乳糖残基。生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白，诸如抗体)的能力可以在这种微流体装置中测定。在测定的具体实施例中，包括要被测定以产生感兴趣的分析物的生物微物体(例如，细胞)的样本材料可以被加载到微流体装置的波及区域中。可以针对特定特性选择生物微物体中的一些(例如，哺乳动物细胞，诸如人类细胞)并且将其设置在未波及区域中。随后，剩余的样本材料可以流出波及区域并且测定材料流入波及区域。由于所选择的生物微物体在未波及区域中，因此所选择的生物微物体基本上不受剩余样本材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生可以从未波及区域扩散到波及区域中的感兴趣的分析物，其中感兴趣的分析物可以与测定材料反应以产生局部化的可检测的反应，每个局部化的可检测的反应可以与特定未波及区域相关。可以分析与检测到的反应相关联的任何未波及区域，以确定未波及区域中的生物微物体中的哪些(如果有的话)是感兴趣的分析物的充分的产生者。
如本文所指代的抗原是可以与另一分子(诸如Ag特异性受体)特异性结合的分子或其一部分。抗原可以是分子的任何部分，诸如构象表位或线性分子片段，并且通常可以被适应性免疫系统的高度可变的抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别。抗原可包括肽、多糖或脂质。抗原的特征可以在于其结合到抗体的可变Fab区域的能力。不同的抗体具有区分存在于抗原表面上的不同表位的潜力，其结构可以通过半抗原的存在来调节，该半抗原可以是小分子。
在一些实施例中，抗原是癌细胞关联抗原。癌细胞关联抗原可以是简单的或复杂的；抗原可以是蛋白上的表位、碳水化合物基团或链、除蛋白或碳水化合物以外的生物或化学试剂、或其任意组合；表位可以是线性的或构象的。
癌细胞关联抗原可以是独特地识别癌细胞(例如，一种或多种特定类型的癌细胞)的抗原，或者与其在正常细胞上的表达相比在癌细胞上被上调的抗原。通常，癌细胞关联抗原存在于癌细胞的表面，从而确保其能够被抗体识别。抗原可以与任何类型的癌细胞相关联，包括可以在本领域已知的或本文描述的肿瘤中发现的任何类型的癌细胞。特别地，抗原可以与肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等相关联。如本文所使用的，术语“与癌细胞相关联”，当用于指抗原时，意指抗原直接由癌细胞产生或由癌细胞与正常细胞之间的相互作用产生。
可以在微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白，包括但不限于酶或抗体)的能力。在测定的具体实施例中，包括待测定以产生感兴趣的分析物的生物微物体(例如，细胞、细胞器或膜)的样本材料可以被加载到微流体装置的波及区域中。生物微物体中的一些(例如，哺乳动物细胞或其组分，诸如人类细胞或其组分)可以针对特定特性进行选择并且设置在未波及区域中。随后，剩余的样本材料可以从波及区域流出，并且测定材料可以流入波及区域中。由于所选择的生物微物体在未波及区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样本材料的流出或测定材料的流入的影响。所选择的生物微物体可以被允许产生感兴趣的分析物。在该具体实施例中，感兴趣的分析物可以从未波及区域扩散到波及区域中，在该波及区域中感兴趣的分析物能够与测定材料反应以产生局部化的可检测的反应，每个局部化的可检测的反应可以关联到特定的未波及区域。可替代地或者额外地，可以在感兴趣的分析物仍然在未波及区域内时或在与微流体装置的未波及区域相邻的波及区域中时对感兴趣的分析物进行测定。大体上，该测定能产生局部化的可检测的反应，该局部化的可检测的反应可以关联到产生特定的感兴趣分析物的特定未波及区域。
靶蛋白功能的快速改善当前受到以下限制：(1)在设计-创建-测试-学习范例上迭代所需的时间，以及(2)在突变体库中生成多样性的能力(用于100个氨基酸蛋白的参数空间是天文数字：20100个可能的序列)。
描述了完全自主的、端到端的工作流程，其能够在没有人为干预的情况下完全自动化设计-构建-测试-学习循环，并且在图6中示出了用于快速蛋白进化的系统600。然而，本发明不限于使得在期望的情况下可以不使用人为干预。简而言之，前面的核酸合成部件620(诸如DNA写入模块或DNA合成仪)与珠粒加载部件相结合，可以与微流体系统640接口连接，该微流体系统包括微流体装置，该微流体装置被配置为输入、培养、测定和可选地输出微物体，诸如生物细胞和/或珠粒。核酸合成部件620可以生成数万个珠粒622，每个珠粒编码靶蛋白的唯一突变序列。还包括条形码，从而可以使用原位杂交方法来确定珠粒的身份，诸如在2017年9月29日提交的题为“DNA Barcode Compositions and Methods of In SituIdentification in a Microfluidic Device”的国际专利申请第No.PCT/US2017/054628号中描述的方法，并且出于所有目的其公开内容通过引用整体合并在本文中。在系统的一些其它实施例中，系统包括核酸测序部件。可选地，可以通过对附接到珠粒的条形码的核酸序列进行测序来确定条形码和/或变体核酸序列。
珠粒可以流入微流体系统640的微流体装置。在一些实施例中，每个珠粒622可以被分类到微流体装置的隔绝坞中，该隔绝坞可以是如本文所述的任何隔绝坞，使得每个隔绝坞仅存在一个珠粒。此外，可以将珠粒引入隔绝坞的隔离区域中，即未波及区域，以最小化来自其它隔绝坞的所表达的蛋白材料的流入。随后引入无细胞表达系统以使蛋白能够在坞中合成。随后可以筛选突变蛋白库以用于改善期望的感兴趣表型。条形码将表示突变体的身份，并且序列信息和功能读数随后可以用于确定变体核酸序列的进一步优化集合。可将关联性引入计算部件660，该计算部件可以使用诸如神经网络或其它机器学习过程(例如，“深度学习”过程)的算法来缩小差异或重新关注下一轮的变体核酸序列内的变化。计算部件660可以生成新改善的核酸序列，其随后可以被发送到核酸合成模块620(例如，DNA写入器)以重复该过程。这种通用的解决方案适用于从进化酶以提高催化活性到进化更具功能性的抗体的应用。该过程可以在没有人为干预的情况下运行，在24小时或更短时间内完成完整的学习循环，并且使用从实验循环的测试部分得到的分析来智能地筛选差异，这在当前技术中将是不可能的。
系统。提供了一种用于快速蛋白进化的系统，该系统包括：微流体装置；以及微流体系统部件(例如，仪器)，该微流体系统部件被配置为：将多个珠粒输入微流体装置中，所述多个珠粒中的每个珠粒包括(i)第一多个核酸序列中的一个核酸序列，以及(ii)条形码；在有助于表达由所述多个珠粒中的每个珠粒的所述一个核酸序列编码的相应蛋白的条件下，孵育位于微流体装置内的所述多个珠粒，从而产生多个相应蛋白；以及针对由所述多个珠粒的核酸序列产生的所述多个相应蛋白中的期望性质进行测定。
该系统还可包括多个蛋白聚集珠粒，其被配置为特异性结合到感兴趣的原始蛋白的表位或蛋白标签(例如，表位标签，诸如FLAG标签、金属螯合标签，例如His6、FlAsH、ReAsH等)，其可以是如下所述的任何合适的蛋白标签。一个或多个蛋白聚集珠粒可以设置在微流体装置内，接近微流体装置内的核酸标记的珠粒。所述一个或多个蛋白聚集珠粒可以结合由链接到珠粒的核酸序列产生的所表达蛋白(例如，相应的蛋白)，并且集中所表达的蛋白以用于测定相应蛋白的期望性质。
在一些变型中，该系统还可包括核酸合成部件，该核酸合成部件被配置为合成第一多个核酸序列(例如，和任何后续多个核酸序列)。第一多个核酸序列中的每个核酸序列可以对感兴趣的蛋白的序列变体编码。
该系统还可包括珠粒制备部件，该珠粒制备部件被配置为将第一多个核酸序列中的每一个连接到珠粒(例如，从而生成第一多个珠粒和/或任何后续多个珠粒)。在一些变型中，珠粒制备部件可以是与核酸合成部件分开的设备。
在一些变型中，该系统还可包括条形码检测部件，该条形码检测部件被配置为将所述多个珠粒中的每个珠粒的核酸序列与所述多个珠粒中的相应珠粒在微流体装置内的位置关联。在一些实施例中，条形码检测部件可包括微流体系统部件的光学子系统，该光学子系统被配置为在视觉上检测条形码。
在一些变型中，条形码检测部件可包括核酸测序部件，该核酸测序部件被配置为通过对条形码的核酸序列进行测序来确定条形码。核酸测序部件可以额外地或可替代地确定存在于核酸标记的珠粒上的变体核酸的序列。
该系统还可包括计算部件(例如，计算机)，该计算部件被配置为：将来自期望性质测定的结果与所述第一多个核酸序列的各个核酸序列关联；以及基于所述关联，设计第二多个核酸序列，其每个编码感兴趣的蛋白的进一步的序列变体。在一些变型中，计算部件可被进一步配置为将第二多个核酸序列的设计传输到核酸合成部件。在一些实施例中，被配置为关联来自期望性质测定的结果的计算部件可以是第一计算机，被配置为设计第二多个核酸序列的计算部件是第二计算机，其中第一计算机被配置为将结果传输到第二计算机。无论第一计算机与第二计算机相同还是两个计算机不同，第二库(和另外的库)的设计都基于所表达的蛋白功能与测试库的核酸序列的关联性。此外，第一和/或第二计算机可以采用机器学习算法来设计第二(和另外的)核酸序列库。
在一些变型中，微流体装置可包括：壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室。微流体装置的微流体结构可包括用于第一液体介质的流动路径；以及多个物理隔绝坞。所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括：围栏；以及通向流动路径的单个开口，并且其中，围栏包围被构造为保持悬浮在第二液体介质中的微物体的内部空间。在一些变型中，所述多个隔绝坞中的每个隔绝坞还可包括从开口延伸到围栏中的内壁。在一些变型中，微流体装置的多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口可以被定向成使得没有任何部分是直接面向流动路径中的，由此，当通道包含第一液体介质的流动并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括隔离区域和将隔离区域流体连接到流动路径的连接区域。隔离区域是微流体装置中的未波及区域。在一些实施例中，连接区域可包括通入流动路径的近端开口和通入隔离区域的远端开口，近端开口具有从大约20微米到大约100微米的范围内的宽度Wcon，并且其中，连接区域从近端开口到远端开口的长度Lcon是连接区域的近端开口的宽度Wcon的至少1.0倍。在一些变型中，流动路径可包括微流体通道，并且多个隔绝坞中的每个隔绝坞通向微流体通道。
在一些变型中，微流体装置还可包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中，第一电极是内部腔室的第一壁的一部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的一部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
在一些变型中，微流体装置可以类似于本文所述的任何微流体装置，并且可以具有如针对微流体装置100、175、200、300、320、400、450、520所述的特征和如图1A-5B所述的系统属性的任意组合。
核酸标记的珠粒。核酸标记的珠粒可以由任何合适的材料制成，诸如聚合物、金属、陶瓷、玻璃或其任意组合。核酸标记的珠粒可以是磁性的或可以不是磁性的。核酸标记的珠粒可包括编码感兴趣的蛋白的序列变体的核酸序列。核酸序列可以编码感兴趣的蛋白的整个蛋白序列，或者可以编码整个蛋白序列的所选择区域。如本文所使用的，序列变体(当指包括核酸的序列变体时，也可以称为变体核酸序列或变体序列)指包含一个或多个核苷酸/氨基酸的蛋白/核酸序列，该一个或多个核苷酸/氨基酸不同于编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列或不同于感兴趣的原始蛋白的氨基酸序列。对于任何序列变体，变化可以在编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列的一个、两个或更多个核苷酸处。核酸序列变体可以产生在感兴趣的原始蛋白的氨基酸序列的一个、两个或更多个氨基酸处不同的蛋白序列。在本文所述的方法中，第一核酸标记的珠粒库包括编码感兴趣的蛋白的核酸序列的第一序列变体库。在第一组测试和学习已经完成之后，可以基于测试/学习的结果设计第二序列变体库。第二序列变体库的每个序列变体在本文中称为“进一步的序列变体”，因为来自第一核酸序列变体库的核酸序列的变化(进而来自编码感兴趣的原始蛋白的氨基酸序列的核酸序列的变化)取决于表型读数的结果。
核酸标记的珠粒的核酸序列还可包括核酸的条形码序列。条形码核酸序列可以包含大约6至大约70个核苷酸；大约6至大约60个核苷酸；大约6至大约50个核苷酸；大约6至大约40个核苷酸，或其之间的任何数量的核苷酸。如本文进一步所述，条形码可被设计为在视觉上被检测，或者被设计为通过对条形码的核酸序列测序来测定，如本领域已知的。
在一些变型中，核酸标记的珠粒的核酸序列还可包括编码蛋白标签的核酸序列。当在本文所述的方法中表达时，蛋白标签允许所表达的蛋白被捕获到蛋白聚集珠粒并被集中以用于表型读数测定。蛋白标签可以是任何合适的蛋白标签，如下面进一步描述的。
在一些变型中，核酸标记的珠粒的核酸序列还可包括蛋白表达引发序列，如本领域已知的。引发序列可以是任何合适的引发序列，诸如但不限于T7引发序列。引发序列可以协助本文所述方法中使用的无细胞表达系统更有效地表达在核酸标记的珠粒的序列变体部分中编码的蛋白。
在一些变型中，核酸标记的珠粒的核酸序列还可包括接头序列。接头序列可包括在核酸序列内用于条形码核酸序列和/或变体核酸序列(或进一步的变体序列)的大规模并行测序。接头序列可以是本领域通常已知的任何合适的接头序列。
每个变体(或进一步的变体)核酸序列、条形码序列、蛋白聚焦标签序列(如果存在的话)、蛋白表达引发序列(如果存在的话)和/或接头序列(如果存在的话)沿着核酸标记的珠粒的核酸序列的设置从5’末端到3’末端可以被选择为合适的且本领域已知的。例如，引发序列可位于变体核酸序列的上游(例如，更靠近5’末端)。可以选择这些序列中的每一个序列的设置的设计以确保核酸或由其表达的蛋白的功能性不受不利影响。
蛋白聚集珠粒。蛋白聚集珠粒可以由任何合适的材料制成，诸如聚合物、金属、陶瓷、玻璃或其任意组合。蛋白聚集珠粒可以是磁性的或可以不是磁性的。蛋白聚集珠粒包括捕获部分，该捕获部分被配置为结合从附接到测试库的珠粒的变体核酸表达的蛋白的至少一部分。如本文所使用的，“捕获部分”是为蛋白的一部分(诸如肽序列)提供识别位点(例如蛋白标签)的化学或生物学种类、功能或基序。在一些变型中，蛋白聚集珠粒的捕获部分可包括被配置为结合到蛋白标签的肽序列，该蛋白标签可包括感兴趣的原始蛋白序列的表位。在一些变型中，蛋白聚集珠粒的捕获部分可以结合到表位标签(例如，蛋白标签)，其包括但不限于FLAG标签、E标签、Myc标签、T7、NE标签、Spot标签、V5标签、VSV标签等，其是本领域已知的。捕获部分可以是能够特异性识别并结合到表位标签的抗体，其中许多是本领域已知的并且可以商购的，诸如FLAG标签抗体(ThermoFisher目录号No.701629)。在一些变型中，蛋白聚集珠粒包括能够识别蛋白标签的金属螯合物种类，诸如His标签(聚组氨酸，其被镍或钴螯合物螯合，镍螯合物可以是Ni(II)-次氮基三乙酸(Ni-NTA)。另一金属螯合标签是TC标签(其被FLAsH或ReAsH双砷化合物结合)。任何合适的蛋白标签可以用于将所表达的蛋白捕获到蛋白聚集珠粒。
在本文所述的方法中，可将一个或多个蛋白聚集珠粒引入例如隔绝坞的未波及区域，例如，隔离区域，以捕获从链接到核酸标记的珠粒的变体核酸表达的蛋白。在任何方法中，在已经获得表型读数之后，包括所捕获的所表达蛋白的蛋白聚集珠粒可以从微流体装置选择性地输出。可以利用相同的表型读数测定来重新测试包括所表达的蛋白的输出的蛋白聚集珠粒；可以在不同测定中测试该输出的蛋白聚集珠粒；或者该输出的蛋白聚集珠粒可以受到不同种类的分析，诸如所表达的蛋白的质谱分析。
无细胞表达系统。根据其对感兴趣的蛋白的适用性，可以使用任何合适的无细胞表达系统来实现转录/翻译。一些非限制性示例包括
(Arbor biosciences，Sigma 70Master Mix Kit，目录号No.507024)；用于哺乳动物蛋白的Retic Lysate IVT试剂盒(ThermoFisher目录号No.AM1200)；用于哺乳动物蛋白的1-Step Human Coupled IVT试剂盒(ThermoFisher目录号No.88881)；用于哺乳动物蛋白的1-Step Human High YieldIVT试剂盒(ThermoFisher目录号No.88890)；Expressway TM Maxi Cell-Free EcoliExpression System(ThermoFisher目录号No.K990100)；用于线性模板的E.coli S39Extract system(Promega目录号No.L1030)；E coli S30 T7 High-yield ProteinExpression system，包括T7 RNA聚合酶(Promega目录号No.L1110，L1115)等。技术人员可以从这些或其它可商购的系统中选择合适的无细胞表达系统用于特定的感兴趣的蛋白。还可包括其它组分，诸如内质网的功能性片段，其可以用于帮助将所表达的蛋白折叠到感兴趣的蛋白的功能所需的适当次级结构。
表型报告物。表型报告物(在本文中还称为表型的报告物)可以是任何类型的试剂或者指示感兴趣的蛋白的活性的物体。表型报告物可包括发光和/或荧光蛋白以产生视觉上可识别的结合、功能或酶活性。在一些情况下，可以添加额外的发光和/或荧光标记以检测结合、功能或酶活性的量。在一些实施例中，表型报告物包括提供蛋白功能的可检测结果的溶液相试剂。在其它实施例中，表型报告物是微物体，诸如微珠粒。在一些实施例中，表型报告物是被配置为报告感兴趣的蛋白的功能的报告细胞。在一些实施例中，表型报告物是包括结合亲和力位点并且提供表型读数的微物体。例如，微物体可包括被配置为报告感兴趣的蛋白的酶活性的酶衬底。在一些示例中，表型报告物是包括可以在淀粉酶测定中使用的衬底的珠粒。在一些示例中，表型报告物是溶液相试剂，其的一个非限制性示例是EnzChekTM Ultra Amylase Assay(ThermoFisher目录号No.E33651)，其可以与使用聚组氨酸(His6)标记的亲和标签的基于Ni-NTA磁珠粒的测定组合使用。可以使用任何合适的表型报告试剂/微物体，并且可由技术人员基于感兴趣的原始蛋白的功能进行选择，并且本公开不受在此列举的具体示例限制。表型报告物可用于使用任何类型的测定来检测任何类型蛋白的活性。在一些示例中，表型报告物可以用于检测酶、抗体和/或蛋白片段的活性。表型报告物可以用于检测感兴趣的蛋白的胞质功能和/或膜结合功能。在一些示例中，表型报告物在测定中用于测试变体基因库，以检测变体核酸序列的适合度的差异和/或发现基因型-表型链接。在一些示例中，表型报告物用于检测感兴趣的蛋白的进化。例如，表型报告物可以在测定中用于研究感兴趣的各个蛋白的基因或亚基因结构的进化。本文所述的装置可以提供受控环境以在进行这种测定时控制选择压力。
用于快速进化蛋白序列和功能的过程。提供一种用于进化感兴趣的蛋白的过程，并且更特别地，用于进化感兴趣的蛋白的蛋白活性的过程，如图9所示，该过程包括：将第一核酸序列库设置在微流体装置内，其中第一库的各个核酸序列结合到相应珠粒。第一库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的原始蛋白序列(例如，可选地具有限定活性的天然或非天然存在的蛋白或其片段)的核酸序列的一个或多个变化(例如，单核苷酸置换、插入或删除，或一系列相邻核苷酸的置换、插入或删除)。微流体装置具有壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室。该方法还包括将表型报告物引入微流体装置中并将其设置在第一库的每个核酸序列的近端。如在这种情况下所使用的，近端包括与核酸序列或与包含核酸序列的珠粒重叠和/或相邻的区域。例如，“近端”可以是在核酸序列的约300微米内(例如，在约250微米、约200微米、约150微米、约100微米或更小值内)的设置点。近端还可包括将提供表型读数的表型报告物设置在其它位置，使得表型读数可以在隔离区域、连接区域和/或通道(例如，邻近隔绝坞的通入通道的开口)中被检测到。表型报告物可包括溶液相试剂和/或多个微物体，并且提供来自感兴趣的原始蛋白序列的表型读数。表型报告物可以是如本文所述的任何表型报告物，并且可以提供任何合适的可检测信号作为表型读数的至少一部分。该方法包括将试剂混合物引入微流体装置并且将其设置在第一库的每个核酸序列附近，其中，试剂混合物包括允许从第一库的每个核酸序列表达蛋白序列的一个或多个部件。该方法包括从第一库的每个核酸序列表达蛋白序列；并且还包括检测来自第一库的一个或多个核酸序列的近端的区域的表型读数。该方法包括从第一库识别具有相应近端区域的各个核酸序列，该近端区域具有期望的表型读数；以及确定第一库的识别出的核酸序列的序列。
在一些实施例中，表型报告物可包括当被感兴趣的原始蛋白接触时提供可检测信号的溶液相试剂(例如，该试剂可以由感兴趣的原始蛋白切割，并且该切割可以引起可检测光的发射)。在一些变型中，表型报告物可包括微物体，其包括感兴趣的原始蛋白的结合位点、被配置为报告感兴趣的原始蛋白的功能的报告细胞或者提供用于感兴趣的蛋白的酶活性的酶衬底的微物体。
在一些变型中，随后可以进行将第一库的各个核酸序列与在相应近端区域中检测到的表型读数关联；并且可以设计第二核酸序列库，其中第二库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的原始蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化，并且是根据该关联选择的。如本文所提及的，“根据关联选择”可包括设计第二库的核酸序列以包括第一库中存在的变化的新组合，或者可包括设计第二库的核酸序列以包括增加第二库的多样性的新的变化。
在一些变型中，第一库的每个核酸序列链接到第一多个珠粒中的相应珠粒。第一多个珠粒中的每个珠粒可包括多个链接的核酸，每个链接的核酸具有编码感兴趣的原始蛋白序列的核酸序列的相同变化。
在一些变型中，该过程还可包括设计第一库的核酸序列以与编码感兴趣的原始蛋白序列的核酸序列不同；合成第一库的核酸序列；以及将第一库的每个核酸序列连接到第一多个珠粒的相应珠粒，从而形成第一携带核酸的珠粒库。
形成第一(第二或进一步的)库的多个珠粒中的每个珠粒还可包括相应的不同的条形码。这些不同的条形码可包括不同的核酸序列。条形码可以是本领域已知的任何合适的条形码，并且可以具有本文所述的长度的核酸序列。
在一些变型中，该过程还可包括在将第一核酸序列库设置在微流体装置中之后读取第一多个珠粒中的每个珠粒的条形码(例如，检测或确定)，从而识别每个珠粒及其相应核酸序列在微流体装置内的位置。这可以在该过程中的任何合适的时间点进行，其可以根据条形码是在视觉上检测的还是通过测序确定其序列而变化。在一些实施例中，读取条形码可以在检测表型读数之前进行。在一些实施例中，读取第一多个珠粒中的每个珠粒的条形码可以在检测表型读数之后进行。当读取条形码包括通过测序条形码的核酸序列来确定条形码时，可以将核酸标记的珠粒选择性地从微流体装置输出以用于进一步处理，以便测序条形码。
在一些变型中，试剂混合物可包括无细胞蛋白表达反应混合物。无细胞蛋白表达反应混合物可以是任何合适的反应混合物，其能够转录/翻译核酸标记的珠粒的核酸，如本领域已知的，其非限制性示例在本文中描述。引入试剂混合物可包括使试剂混合物流入微流体装置的流动路径中并且允许试剂混合物扩散到隔绝坞中。从库的变体核酸序列表达蛋白可以根据需要在任何合适的时间段内进行，以从变体核酸序列产生足够的蛋白。表达蛋白的时间段可以持续几分钟到几小时，并且可以持续1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、18小时或更长。
在一些变型中，该过程还可包括将多个蛋白聚集珠粒设置在微流体装置内，并且将所述多个蛋白聚集珠粒中的一个或多个蛋白聚集珠粒设置在第一(第二和进一步的)库的每个核酸序列附近。一个、两个、五个或更多个蛋白聚集珠粒可以设置在第一库的每个核酸序列附近。一个或多个蛋白聚集珠粒可以设置在大约300微米、大约250微米、大约200微米、大约150微米、大约100微米或更小值内。在核酸序列附近还可包括将一个或多个蛋白聚集珠粒设置在隔绝坞的连接区中和/或(多个)通道中。所述多个蛋白聚集珠粒中的蛋白聚集珠粒可以特异性结合到(i)感兴趣的原始蛋白序列的表位或(ii)由第一库的每个核酸序列编码的蛋白标签，以便在功能上包括由其表达的蛋白序列。蛋白标签可以是本领域已知的任何合适的蛋白标签，并且示例性蛋白标签类别在本文中描述。在各种实施例中，该过程还可包括将所表达的蛋白从第一库的每个核酸序列捕获到设置在其附近的一个或多个蛋白聚集珠粒。捕获所表达的蛋白可以贯穿表达蛋白的整个时间段进行并且可以在蛋白表达已经停止后持续约30分钟或1小时的时间段，或者捕获可以在表达蛋白的时间段结束时而结束。在足够的蛋白已经被捕获到蛋白标记的聚集珠粒后，蛋白标记的聚集珠粒可以暴露于表型报告物。
在一些实施例中，该过程还包括在表达蛋白序列之后使冲洗介质流经微流体装置，从而置换试剂混合物。冲洗介质可以是与表型报告物相兼容的溶液，例如盐溶液(例如，PBS等)。在一些实施例中，冲洗介质可以与第一液体介质相同或基本上类似。在一些实施例中，可以在检测到表型报告物之前使冲洗介质流经微流体装置。在一些其它实施例中，引入表型报告物并且将其设置在第一多个核酸中的每个核酸附近可以在将试剂混合物设置在第一库的每个核酸序列附近之后进行。
在一些变型中，微流体装置的微流体结构可包括(i)用于第一液体介质的流动路径；以及(ii)多个物理隔绝坞。多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括：围栏；以及通向流动路径的单个开口；其中围栏包围被构造为保持悬浮在第二液体介质中的生物微物体的内部空间。多个隔绝坞中的每个隔绝坞还可包括从开口延伸到围栏中的内壁。在一些实施例中，微流体装置的多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口可以被定向成使得没有任何部分是直接面向流动路径中的，由此，当流动路径包含第一液体介质的流动并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。在一些变型中，微流体装置还可包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中，第一电极是内部腔室的第一壁的一部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的一部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
在一些变型中，将第一核酸序列库设置在微流体装置内可包括将第一多个珠粒中的各个珠粒引入多个隔绝坞中的各个隔绝坞中。在一些实施例中，第一多个珠粒中的不多于一个珠粒可以被引入多个隔绝坞中的每个隔绝坞中。
在一些变型中，将表型报告物引入微流体装置中可包括将多个微物体中的一个或多个微物体引入包含第一核酸序列库的核酸序列的各个隔绝坞中。
在该过程的各种实施例中，感兴趣的蛋白可包括酶。在其它实施例中，感兴趣的蛋白可包括结合到细胞表面标记的域。细胞表面标记可以是细胞表面受体(例如，参与细胞间信号传递的受体)或糖蛋白。细胞表面受体可以是蛋白，诸如糖蛋白或蛋白复合物。
在一些实施例中，感兴趣的蛋白可包括抗体。抗体可以是：单链抗体，例如，不具有二硫键；纳米抗体，例如，来自骆驼科物种的重链抗体；单链可变片段；和/或可以不具有糖改性。
在一些变型中，将第一库的各个核酸序列与在相应近端区域中检测到的表型读数关联可以通过第一计算机部件进行，第一计算机部件被配置为从识别出的核酸序列中识别与感兴趣的原始蛋白的功能相比更加需要的所表达的蛋白的功能。在一些实施例中，设计第二核酸序列库可以由第二计算机部件基于所表达的蛋白功能与第一核酸序列库的核酸序列的关联来进行。在一些变型中，第一计算机部件可以与第二计算机部件相同。在一些实施例中，第一计算机部件可以采用机器学习算法来执行该关联。在一些变型中，第二计算机部件可以采用机器学习算法来设计第二核酸序列库。
第一(和/或第二)核酸序列库可以通过并行核酸合成仪合成。在一些实施例中，并行核酸合成仪可以是大规模并行核酸合成仪。在一些实施例中，并行核酸合成仪可以被配置为将多个长度较短的合成核酸组装为较长的连体核酸。待组装的多个长度较短的合成核酸可分别具有小于大约200个核苷酸、小于大约150个核苷酸、小于大约100个核苷酸或小于大约50个核苷酸的长度(例如，长度较短的合成核酸中的核苷酸数量)。在一些实施例中，被配置为组装较长的连体核酸的并行核酸合成仪可以被进一步配置为并行地组装多个较长的连体核酸。
在该过程的一些变型中，第二核酸序列库中的每一个核酸序列可以链接到相应珠粒以形成第二携带核酸的珠粒库。可以以任意组合对第二核酸序列库进行本文所述的任何过程，以提供与第二库的核酸序列相关联的第二组表型读数。在一些实施例中，可以设计和合成进一步的核酸序列库。该进一步的核酸序列库的核酸序列可以链接到相应珠粒以形成进一步的携带核酸的珠粒库。可以以任意组合对该进一步的核酸序列库进行本文所述的任何过程，以提供与第二库的核酸序列相关联的进一步的一组表型读数。
在一些变型中，第一核酸序列库可包括在编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列的子区域内的变化。编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列的子区域可以对产生感兴趣功能的蛋白的区域编码。在一些实施例中，子区域可以对感兴趣的原始蛋白的酶活性位点或结合位点(例如，抗原识别位点或蛋白-蛋白结合位点)编码。在一些变型中，第一核酸序列库可包括在编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列的整个长度上的变化。
在一些变型中，第二核酸序列库和/或进一步的核酸序列库可包括在编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列的子区域内的变化。编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列的子区域可以对产生感兴趣功能的蛋白的区域编码。子区域可以对感兴趣的原始蛋白的酶活性位点或结合位点(例如，抗原识别位点或蛋白-蛋白结合位点)编码。在一些其它实施例中，第二核酸序列库和/或进一步的核酸序列库可包括在编码感兴趣的原始蛋白的核酸序列的整个长度上的变化。
然而，该方法不限于在具有隔离区域的隔绝坞内进行，而是可以在微流体装置的任何合适的隔离区域内进行。即，微流体装置的任何未波及区域可以用于保持核酸标记的珠粒。此外，尽管该过程被描述为在微流体装置中进行，但是其可以可替代地以其它格式进行，例如在微阵列或微孔板的多个孔中进行，并且本公开不限于此。
试剂盒。提供了一种用于感兴趣的蛋白的快速进化的试剂盒，该试剂盒包括：微流体装置，其中，微流体装置包括壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室；以及表型报告物。在一些变型中，表型报告物可包括当由感兴趣的原始蛋白接触时提供可检测信号的溶液相试剂(例如，试剂可以由感兴趣的原始蛋白切割，并且该切割可能引起可检测光的发射)。在一些变型中，表型报告物可包括多个微物体，每个微物体被配置为提供来自感兴趣的原始蛋白序列的表型读数。多个微物体中的微物体可包括用于感兴趣的蛋白的结合位点，包括用于感兴趣的原始蛋白的酶活性的酶衬底，和/或是被配置为报告感兴趣的原始蛋白的功能的报告细胞。
在一些变型中，微流体装置的微流体结构可包括(i)用于第一液体介质的流动路径；以及(ii)多个物理隔绝坞。在一些实施例中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞可包括：围栏；和通向流动路径的单个开口；其中，围栏包围内部空间，该内部空间被构造为保持悬浮在第二液体介质中的微物体。在一些实施例中，隔绝坞可包括从开口延伸到围栏中的内壁。在一些变型中，微流体装置的多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口可以被定向成使得没有任何部分是直接面向通道的流动路径中的，由此，当通道包含第一液体介质的流并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。在一些变型中，微流体装置还可包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中，第一电极是内部腔室的第一壁的部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的一部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
在一些变型中，试剂盒还可包括用于在体外从核酸序列表达蛋白的试剂混合物。试剂混合物可以是无细胞蛋白表达混合物。
在一些变型中，试剂盒还可包括多个珠粒，每个珠粒被配置为结合到核酸序列。在一些实施例中多个珠粒中的每个珠粒可包括唯一条形码。在一些变型中，唯一条形码可以是唯一核酸序列。
在一些变型中，试剂盒还可包括多个蛋白聚集珠粒。在一些实施例中，多个蛋白聚集珠粒中的每个可以特异性结合感兴趣的原始蛋白序列的表位或蛋白标签。
在一些变型中，试剂盒还可包括用于计算机部件或多个计算机部件的机器可读指令。在一些实施例中，机器可读指令可以使计算机部件或多个计算机部件能够将核酸序列库的各个核酸序列和与各个核酸序列有关的表型关联；和/或设计核酸序列库，其中，该库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的原始蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化，并且可选地，其中，该库设计是基于多个各个核酸序列和与各个核酸序列相关的表型之间的关联。
微流体装置/系统特征交叉适用性。应该理解，本文所述的微流体装置、系统和动力技术的各种特征可以是可组合的或可互换的。例如，本文中参照微流体装置100、175、200、300、320、400、450、520描述的特征以及如图1A-5B所描述的系统属性可以是可组合或可互换的。
微流体装置。图1A示出了微流体装置100的示例。微流体装置100的透视图被示出为切除其盖110的一部分以提供微流体装置100内的局部视图。微流体装置100大体上包括微流体回路120，该微流体回路包括流动路径106，流体介质180可以流经该流动路径，可选地将一个或多个微物体(未示出)携带到微流体回路120中和/或经过微流体回路120。
如图1A中大体上所示，微流体回路120由围栏102限定。尽管围栏102可以以不同配置物理地构造，但在图1A中所示的示例中，围栏102被描绘为包括支撑结构104(例如，底座)、微流体回路结构108和盖110。支撑结构104、微流体回路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体回路结构108可以设置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以设置在微流体回路结构108上方。微流体回路结构108可以与支撑结构104和盖110一起限定微流体回路120的元件，以形成三层结构。
如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体回路120的底部，盖110可以位于其顶部。可替代地，支撑结构104和盖110可以以其它定向配置。例如，支撑结构104可以位于微流体回路120的顶部，盖110可以位于其底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，每个端口包括进入或离开围栏102的通道。通道的示例包括阀门、闸门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体回路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可以位于围栏102的其它部件中，诸如盖110。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体回路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体回路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体回路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流经流动路径106的方向。
支撑结构104可包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底均电连接到电极(例如，所有半导体衬底或半导体衬底的子集可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。
微流体回路结构108可以限定微流体回路120的回路元件。这样的回路元件可包括当微流体回路120填充有流体时可以流体地互连的空间或区域，诸如流动区域(其可包括或者可以是一个或多个流动通道)、腔室(其类别的回路元件还可包括子类别，其包括隔绝坞)、阱(trap)等。回路元件还可包括屏障等。在图1A中所示的微流体回路120中，微流体回路结构108包括框架114和微流体回路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体回路材料116。框架114可以是例如基本上围绕微流体回路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可包括金属材料。然而，微流体回路结构不必包括框架114。例如，微流体回路结构可以由(或基本上由)微流体回路材料116组成。
微流体回路材料116可以被图案化为具有腔室等，以限定微流体回路120的回路元件和互连，诸如腔室、坞和微流体通道。微流体回路材料116可包括柔性材料，诸如柔性聚合物(例如，橡胶、塑料、弹性体、硅树脂、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气的。可以形成微流体回路材料116的材料的其它示例包括模制玻璃、诸如硅树脂的可蚀刻材料(例如，可光图案化的硅树脂或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施例中，这样的材料(并且因此微流体回路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体回路材料116可以设置在支撑结构104上和框架114内部。
微流体回路120可包括流动区域，在该流动区域中可以设置一个或多个腔室和/或一个或多个腔室可以与流动区域流体连通。腔室可以具有将其与一个或多个流动区域流体连接的一个或多个开口。在一些实施例中，流动区域包括或对应于微流体通道122。尽管在图1A中示出了单个微流体回路120，但是合适的微流体装置可包括多个(例如，2或3个)这种微流体回路。在一些实施例中，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。如图1A所示，微流体回路120可包括多个微流体隔绝坞124、126、128和130，其中每个隔绝坞可以具有一个或多个开口。在隔绝坞的一些实施例中，隔绝坞可以仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。在一些其它实施例中，隔绝坞可以具有与流动路径106流体连通的多于一个开口，例如，n个开口，但是其中n-1个带阀的开口，使得除了一个开口之外的所有开口均是可关闭的。当所有带阀的开口关闭时，隔绝坞将材料从流动区域到隔绝坞中的交换限制为仅通过扩散进行。在一些实施例中，隔绝坞包括各种特征和结构(例如，隔离区域)，这些特征和结构已经被优化，用于即使在介质180正流经流动路径106时也将微物体保留在隔绝坞内(并且因此保留在诸如微流体装置100的微流体装置内)。
盖110可以是框架114和/或微流体回路材料116的整合部件。可替代地，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可包括与框架114和/或微流体回路材料116相同或不同的材料。在一些实施例中，盖110可以是微流体回路材料116的整合部件。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体回路材料116分开的结构，如图所示，或者是框架114或微流体回路材料116的整合部件。同样，框架114和微流体回路材料116可以是如图1A所示的单独结构，或相同结构的整合部件。不管各种可能的集成，微流体装置都可以保持三层结构，该三层结构包括基底层和覆盖层，基底层和覆盖层将微流体回路120所位于的中间层夹在中间。
在一些实施例中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施例中，盖110可包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施例中，盖110可包括刚性和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，定位在隔绝坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可包括与盖110的刚性材料接口连接的可变形材料。具有包括刚性材料和可变形材料两者的盖的微流体装置已经在例如美国专利第No.10,058,865号(Brinlinger等人)中进行描述，其内容通过引用整体合并在本文中。在一些实施例中，盖110还可包括一个或多个电极。一个或多个电极可包括导电氧化物，诸如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。可替代地，一个或多个电极可以是柔性电极，诸如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合，其嵌入在诸如聚合物(例如，PDMS)的可变形材料中。例如，在美国专利第No.9,227,200号(Chiou等人)中已经描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用整体合并在本文中。在一些实施例中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。
在图1A所示的示例中，微流体回路120被示出为包括微流体通道122和隔绝坞124、126、128、130。每个坞包括通向通道122的开口，但是以其他方式被封闭，使得坞可以基本上将坞内部的微物体与通道122的流动路径106或其它坞中的流体介质180和/或微物体隔离。隔绝坞的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面以提供围栏。隔绝坞通向微流体通道122的开口与流体介质180的流106成一定角度定向，使得流106不被引导到坞中。通道122中的大量流体流的矢量可以与隔绝坞的开口的平面相切或平行，并且不被引导到坞的开口中。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地隔离微流体回路120内的一个或多个微物体。根据本公开的隔绝坞可包括各种形状、表面和特征，这些形状、表面和特征被优化以与DEP、OET、OEW、流体流、磁力、向心力和/或重力一起使用，如将在下面详细讨论和示出的。
微流体回路120可包括任何数量的微流体隔绝坞。尽管示出了五个隔绝坞，但微流体回路120可以具有更少或更多的隔绝坞。如图所示，微流体回路120的微流体隔绝坞124、126、128和130分别包括不同的特征和形状，其可以提供对于维持、隔离、测定或培养生物微物体有用的一个或多个益处。在一些实施例中，微流体回路120包括多个相同的微流体隔绝坞。
在图1A所示的实施例中，示出了包含单个通道122的单个流动路径106。然而，其它实施例可以在单个流动路径106内包含多个通道122，如图1B所示。微流体回路120还包括与流动路径106流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以进入流动路径106(和通道122)。在一些情况下，流动路径106包括基本上直的路径。在其它情况下，流动路径106以非线性或蜿蜒(winding)的方式布置，诸如之字形图案，由此流动路径106例如沿交替的方向行进穿过微流体装置100两次或更多次。流动路径106中的流动可从入口行进到出口，或者可以反向并从出口行进到入口。
在图1B中示出多通道装置的一个示例：微流体装置175，其在其它方面可以与微流体装置100类似。微流体装置175及其组成回路元件(例如，通道122和隔绝坞128)可以具有本文所述的任何尺寸。图1B所示的微流体回路具有两个入口/出口端口107以及包含四个不同通道122的流动路径106。可以选择微流体回路被细分成的通道数量以减小流体阻力。例如，微流体回路可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个通道，以提供所选范围的流体阻力。微流体装置175还包括从每个通道122开口的多个隔绝坞，其中隔绝坞中的每个隔绝坞类似于图1A的隔绝坞128，并且可以具有如本文描述的任何隔绝坞的任何尺寸或功能。然而，微流体装置175的隔绝坞可以具有不同的形状，诸如图1A的隔绝坞124、126或130或如本文其它任何地方所述的任何形状。此外，微流体装置175可包括具有不同形状的混合的隔绝坞。在一些情况下，多个隔绝坞被配置为(例如，相对于通道122)使得隔绝坞可以并行地加载有目标微物体。
返回图1A，微流体回路120还可包括一个或多个可选的微物体阱132。可选的阱132可以形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔绝坞124、126、128、130中的一或多者的开口相对定位。可选的阱132可以被配置为从流动路径106接收或捕获单个微物体，或可以被配置为从流动路径106接收或捕获多个微物体。在一些情况下，可选的阱132包括与单个目标微物体的体积近似相等的体积。
隔绝坞。本文所述的微流体装置可包括一个或多个隔绝坞，其中每个隔绝坞适合于保持一个或多个微物体(例如，生物细胞或关联在一起的细胞组)。隔绝坞可以被设置在流动区域内并向流动区域敞开，在一些实施例中，该流动区域是微流体通道。每个隔绝坞可以具有用于与一个或多个微流体通道流体连通的一个或多个开口。在一些实施例中，隔绝坞可以仅具有一个通向微流体通道的开口。
图2A-2C示出了微流体装置200的隔绝坞224、226和228，其可以类似于图1A的隔绝坞128。每个隔绝坞224、226和228可包括隔离区域240和将隔离区域240流体地连接到流动区域的连接区域236，在一些实施例中，该流动区域可包括微流体通道，诸如通道122。连接区域236可包括通向流动区域(例如，微流体通道122)的近端开口234和通向隔离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得在微流体通道122中流动的流体介质(未示出)通过隔绝坞224、226和228的流的最大渗透深度不延伸到隔离区域240中，如以下针对图2C所讨论的。在一些实施例中，来自微流体通道中的流的流线不进入隔离区域。因此，由于连接区域236，设置在隔绝坞224、226和228的隔离区域240中的微物体(未示出)或其它材料(未示出)可以与微流体通道122中的流体介质180的流隔离，并且基本上不受其影响。
图2A-2C的隔绝坞224、226和228分别具有直接向微流体通道122敞开的单个开口。隔绝坞的开口可以从微流体通道122横向敞开，如图2A所示，该图描绘了微流体装置200的竖直横截面。图2B示出了微流体装置200的水平横截面。电极活化衬底206可以位于微流体通道122以及隔绝坞224、226和228两者的下面。形成隔绝坞的底板(floor)的隔绝坞的围栏内的电极活化衬底206的上表面可以设置在微流体通道122(或流动区域，如果不存在通道的话)内的电极活化衬底206的上表面的相同水平面或基本上相同的水平面上，以形成微流体装置的流动通道(或流动区域，分别地)的底板。电极活化衬底206可以是无特征的或者可以具有不规则或图案化的表面，该表面从其最高高度到其最低凹陷变化小于约3微米(microns)、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。衬底的上表面跨微流体通道122(或流动区域)和隔绝坞两者的高度变化可以等于或小于隔绝坞的壁高度的大约10％、7％、5％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。可替代地，衬底的上表面跨微流体通道122(或流动区域)和隔绝坞两者的高度变化可以等于或小于衬底高度的大约2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％、0.2％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也可适用于本文所述的任何微流体装置。
微流体通道122和连接区域236可以是波及区域的示例，而隔绝坞224、226和228的隔离区域240可以是未波及区域的示例。类似224、226、228的隔绝坞具有隔离区域，其中，每个隔离区域仅具有一个开口，该开口通向隔绝坞的连接区域。进入和离开如此配置的隔离区域的流体介质交换可以被限制为基本上仅通过扩散发生。如所指出的，微流体通道122以及隔绝坞224、226和228可以被配置为包含一个或多个流体介质180。在图2A-2B所示的示例中，端口222连接到微流体通道122并且允许流体介质180被引入微流体装置200或从该微流体装置移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以用诸如二氧化碳气体的气体灌注。一旦微流体装置200容纳流体介质180，就可以选择性地生成和停止微流体通道122中的流体介质180的流242(参见图2C)。例如，如图所示，端口222可以设置在流动区域(微流体通道122)的不同位置(例如，相对端)，并且可以建立从用作入口的一个端口222到用作出口的另一端口222的流体介质的流242。
图2C示出了根据一些实施例的隔绝坞224的示例的详细视图，该隔绝坞可以容纳一个或多个微物体246。微流体通道122中的流体介质180的流242经过隔绝坞224的连接区域236的近端开口234可以引起流体介质180进入和离开隔绝坞224的次级流244。为了将隔绝坞224的隔离区域240中的微物体246与次级流244隔离，隔绝坞224的连接区域236的长度Lcon
(即，从近端开口234到远端开口238)应该大于次级流244进入连接区域236的穿透深度Dp。穿透深度Dp取决于许多因素，包括：微流体通道122的形状，其可以由连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon限定；微流体通道122在近端开口234处的宽度Wch；通道122在近端开口234处的高度Hch；以及连接区域236的远端开口238的宽度。在这些因素中，连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon和通道122在近端开口234处的高度Hch往往是最重要的。此外，穿透深度Dp可能受流体介质180在通道122中的速度和流体介质180的粘度的影响。然而，这些因素(即速度和粘度)可以在穿透深度Dp没有显著改变的情况下变化很大。例如，对于微流体芯片200，其连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon为约50微米，通道122在近端开口122处的高度Hch为约40微米，微流体通道122在近端开口122处的宽度Wch为约100微米至约150微米，次级流244的穿透深度Dp的范围从在0.1微升/秒的流速下小于Wcon的1.0倍(即，小于50微米)到在20微升/秒的流速下为Wcon的大约2.0倍(即，大约100微米)，这表示，对于流体介质180的速度增加200倍，Dp仅增加大约2.5倍。
在一些实施例中，微流体通道122和隔绝坞224、226或228的壁可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流242的矢量如下定向：微流体通道宽度Wch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流242；连接区域236在开口234处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流242；和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于微流体通道122中的介质180的流242。前述内容仅为示例，并且微流体通道122以及隔绝坞224、226和228的相对位置可以相对于彼此处于其它定向。
在一些实施例中，对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的配置可以固定，而流体介质180在微流体通道122中的流242的速率可以是可变的。因此，对于每个隔绝坞224，可以识别流体介质180在通道122中的流242的最大速度Vmax，其确保次级流244的穿透深度Dp不超过连接区域236的长度Lcon。当不超过Vmax时，所产生的次级流244能够被完全容纳在连接区域236内，并且不进入隔离区域240。因此，防止流体介质180在微流体通道122(波及区域)中的流242将微物体246抽出隔离区域240(其为微流体回路的未波及区域)，从而使微物体246被保留在隔离区域240内。因此，微流体回路元件尺寸的选择和操作参数(例如，流体介质180的速度)的进一步选择可以防止隔绝坞224的隔离区域240被来自微流体通道122或另一隔绝坞226或228的材料污染。然而，应该注意，对于许多微流体芯片配置，不需要担心Vmax本身，因为在能够达到Vmax之前，芯片将从与以高速流经芯片的流体介质180相关联的压力中破裂。
微流体通道122中第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122经过连接区域236扩散并且进入隔离区域240中的第二流体介质248中而与隔离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，隔离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从隔离区域240经过连接区域236扩散并且进入微流体通道122中的第一介质180中而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施例中，隔绝坞的隔离区域和流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换的程度大于流体交换的大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于大约99％。
在一些实施例中，第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。在一些实施例中，第一介质180和第二介质248可以开始是相同的，随后变得不同(例如，通过由隔离区域240中的一个或多个细胞对第二介质248的调节，或者通过改变流经微流体通道122的介质180)。
如图2C所示，连接区域236的宽度Wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以是本文中针对连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所识别的值中的任一个。在一些实施例中，隔离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon基本上相同。可替代地，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以不同于(例如，大于或小于)连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。在一些实施例中，连接区域236的宽度Wcon可在近端开口234和远端开口238之间变窄或变宽。例如，连接区域236可以使用各种不同的几何形状(例如，倒角连接区域、斜切连接区域)在近端开口与远端开口之间变窄或变宽。此外，连接区域236的任何部分或子部分(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)可以变窄或变宽。
图3描绘了包含微流体回路结构308的微流体装置300的另一示例性实施例，该微流体装置包括通道322和隔绝坞324，该隔绝坞具有类似于本文所述的用于微流体装置100、175、200、400、520和本文所述的任何其它微流体装置的任何隔绝坞的特征和性质。
图3的示例性微流体装置包括微流体通道322，其具有如本文所述的宽度Wch，并且容纳第一流体介质302的流310和一个或多个隔绝坞324(图3中仅示出一个)。隔绝坞324分别具有长度Ls、连接区域336和隔离区域340，其中隔离区域340容纳第二流体介质304。连接区域336具有宽度为Wcon1的近端开口334，该近端开口向微流体通道322敞开，以及宽度为Wcon2的远端开口338，该远端开口向隔离区域340敞开。宽度Wcon1可以与本文所述的Wcon2相同或不同。每个隔绝坞324的壁可以由微流体回路材料316形成，该微流体回路材料可以进一步形成连接区域壁330。连接区域壁330可以对应于相对于近端开口334横向定位并且至少部分地延伸到隔绝坞324的封闭部分中的结构。在一些实施例中，连接区域336的长度Lcon至少部分地由连接区域壁330的长度Lwall限定。连接区域壁330可以具有长度Lwall，其被选择为大于次级流344的穿透深度Dp。因此，次级流344可以完全容纳在连接区域内而不延伸到隔离区域340中。
连接区域壁330可以限定钩区域352，该钩区域是隔绝坞324的隔离区域340的子区域。由于连接区域壁330延伸到隔绝坞的内腔体中，所以连接区域壁330可以用作物理屏障以将钩区域352与次级流344屏蔽开，其中Lwall的长度的选择对钩区域的范围具有贡献。在一些实施例中，连接区域壁330的长度Lwall越长，则钩区域352越被庇护。
在类似于图2A-2C和图3的那些配置的隔绝坞中，隔离区域可以具有任何类型的形状和大小，并且可以被选择以调节营养物、试剂和/或介质到隔绝坞中的扩散以到达隔绝坞的远壁，例如，与连接区域到流动区域(或微流体通道)的近端开口相对。可以进一步选择隔离区域的尺寸和形状，以调节废产物和/或生物微物体的分泌产物从隔离区域经由隔绝坞的连接区域的近端开口向流动区域的扩散。大体上，隔离区域的形状对于隔绝坞将微物体与流动区域中的直接流动隔离的能力不是关键的。
在隔绝坞的一些其它实施例中，隔离区域可以具有将隔离区域与微流体装置的流动区域流体连接的多于一个的开口。然而，对于具有将隔离区域流体地连接到流动区域(或两个或更多个流动区域)的n个开口的隔离区域，n-1个开口可以带有阀。当n-1个带阀开口关闭时，隔离区域仅具有一个有效开口，并且进入/离开隔离区域的材料交换仅通过扩散发生。
具有其中可以放置、培养和/或监测生物微物体的坞的微流体装置的示例已经在例如以下文件中进行描述：美国专利第No.9,857,333号(Chapman等人)、美国专利第No.10,010,882号(White等人)和美国专利第No.9,889,445号(Chapman等人)，其公开内容分别通过引用整体合并在本文中。
隔绝坞尺寸。如本文所述，可以选择隔绝坞和隔绝坞通向的微流体通道的各种尺寸和/或特征，以限制污染物或不需要的微物体从流动区域/微流体通道引入隔绝坞的隔离区域中；将来自通道或来自隔离区域的流体介质中的组分的交换限制为基本上仅扩散交换；促进微物体进入和/或离开隔绝坞的转移；和/或促进生物细胞的生长或扩增。对于本文所述的任何实施例，微流体通道和隔绝坞可以具有任何合适的尺寸组合，可以由技术人员根据本公开的教导而选择，如下所述。
隔绝坞的连接区域的近端开口可以具有至少与隔绝坞所针对的微物体(例如，生物细胞，其可以是植物细胞，诸如植物原生质体)的最大尺寸一样大的宽度(例如，Wcon或Wcon1)。在一些实施例中，近端开口具有大约20微米、大约40微米、大约50微米、大约60微米、大约75微米、大约100微米、大约150微米、大约200微米或大约300微米的宽度(例如，Wcon或Wcon1)。前述内容仅为示例，并且近端开口的宽度(例如，Wcon或Wcon1)可选择为在以上列出的任何值之间的值(例如，大约20-200微米、大约20-150微米、大约20-100微米、大约20-75微米、大约20-60微米、大约50-300微米、大约50-200微米、大约50-150微米、大约50-100微米、大约50-75微米、大约75-150微米、大约75-100微米、大约100-300微米、大约100-200微米或大约200-300微米)。
在一些实施例中，隔绝坞的连接区域可以具有从近端开口到通向隔绝坞的隔离区域的远端开口的长度(例如，Lcon)，其是近端开口的宽度(例如，Wcon或Wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍、至少3.5倍、至少4.0倍、至少4.5倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍或至少10.0倍。因此，例如，隔绝坞的连接区域的近端开口可以具有从大约20微米到大约200微米(例如，大约50微米到大约150微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，并且连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度Lcon。作为另一个示例，隔绝坞的连接区域的近端开口可以具有从大约20微米到大约100微米(例如，大约20微米到大约60微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，并且连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度Lcon。
隔绝坞所通向的微流体装置的微流体通道可以具有指定的尺寸(例如，宽度或高度)。在一些实施例中，微流体通道在通向隔绝坞的连接区域的近端开口处的高度(例如，Hch)可以在以下范围中的任一范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述内容仅为示例，并且微流体通道(例如，122)的高度(例如Hch)可以被选择为在以上列出的任何值之间。此外，在除了在隔绝坞的近端开口处以外的微流体通道的区域中，微流体通道122的高度(例如，Hch)可以被选择为这些高度中的任一高度。
在通向隔绝坞的连接区域的近端开口处的微流体通道的宽度(例如，Wch)可以在以下范围中的任一范围内：大约20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-300微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、70-100微米、80-100微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米、100-120微米、200-800微米、200-700微米或200-600微米。前述内容仅为示例，并且微流体通道的宽度(例如，Wch)可以是被选择为在以上列出的任何值之间的值。此外，在微流体通道的除了隔绝坞的近端开口处之外的区域中，微流体通道的宽度(例如，Wch)可以被选择为这些宽度中的任一宽度。在一些实施例中，微流体通道在通向隔绝坞的连接区域的近端开口处的宽度Wch(例如，横向于流体流经通道的整体流动的方向而取的)可以基本上垂直于近端开口的宽度(例如，Wcon或Wcon1)。
微流体通道在通向隔绝坞的连接区域的近端开口处的横截面积可以为大约500-50000平方微米、500-40000平方微米、500-30000平方微米、500-25000平方微米、500-20000平方微米、500-15000平方微米、500-10000平方微米、500-7500平方微米、500-5000平方微米、1000-25000平方微米、1000-20000平方微米、1000-15000平方微米、1000-10000平方微米、1000-7500平方微米、1000-5000平方微米、2000-20000平方微米、2000-15000平方微米、2000-10000平方微米、2000-7500平方微米、2000-6000平方微米、3000-20000平方微米、3000-15000平方微米、3000-10000平方微米、3000-7500平方微米或3000至6000平方微米。前述内容仅为示例，并且微流体通道在近端开口处的横截面积可以被选择为在以上列出的值中的任何值之间。在各种实施例，在微流体通道的除了在近端开口处以外的区域处，微流体通道的横截面积可以被选择为在以上列出的任何值之间。在一些实施例中，横截面积被选择为对于微流体通道的整个长度是基本上一致的值。
在一些实施例中，微流体芯片被配置为使得隔绝坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)可以具有从大约20微米至大约200微米(例如，大约50微米至大约150微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度Lcon(例如，236或336)，并且微流体通道在近端开口处可以具有大约30微米至大约60微米的高度(例如，Hch)。作为另一示例，隔绝坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)可以具有从大约20微米到大约100微米(例如，大约20微米到大约60微米)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)，连接区域可以具有为近端开口的宽度的至少1.0倍(例如，至少1.5倍或至少2.0倍)的长度Lcon(例如，236或336)，并且微流体通道在近端开口处可以具有大约30微米到大约60微米的高度(例如Hch)。前述内容仅为示例，并且近端开口(例如，234或274)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)、连接区域的长度(例如，Lcon)和/或微流体通道(例如，122或322)的宽度(例如，Wch)可以是被选择为在以上列出的任何值之间的值。
在一些实施例中，隔绝坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)的宽度(例如，Wcon或Wcon1)是流动区域/微流体通道在近端开口处的高度(例如，Hch)的2.0倍或更小(例如，2.0、1.9、1.8、1.5、1.3、1.0、0.8、0.5或0.1倍)，或者具有位于由前述值中的任何两个值限定的范围内的值。
在一些实施例中，隔绝坞的连接区域的近端开口(例如，234或334)的宽度Wcon1可以与其通向隔离区域的远端开口(例如，238或338)的宽度Wcon2相同。在一些实施例中，近端开口的宽度Wcon1可以不同于远端开口的宽度Wcon2，并且Wcon1和/或Wcon2可以从针对Wcon或Wcon1所述的任何值中选择。在一些实施例中，限定近端开口和远端开口的壁(包括连接区域壁)可以基本上相对于彼此平行。在一些实施例中，限定近端开口和远端开口的壁可以被选择为彼此不平行。
连接区域的长度(例如，Lcon)可以为大约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米、大约100-150微米、大约20-300微米、大约20-250微米、大约20-200微米、大约20-150微米、大约20-100微米、大约30-250微米、大约30-200微米、大约30-150微米、大约30-100微米、大约30-80微米、大约30-50微米、大约45-250微米、大约45-200微米、大约45-100微米、大约45-80微米、大约45-60微米、大约60-200微米、大约60-150微米、大约60-100微米或大约60-80微米。前述内容仅为示例，并且连接区域的长度(例如，Lcon)可以被选择为在以上列出的任何值之间的值。
隔绝坞的连接区域壁的长度(例如，Lwall)可以是隔绝坞的连接区域的近端开口的宽度(例如，Wcon或Wcon1)的至少0.5倍、至少0.6倍、至少0.7倍、至少0.8倍、至少0.9倍、至少1.0倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.75倍、至少2.0倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3.0倍或至少3.5倍。在一些实施例中，连接区域壁可以具有大约20-200微米、大约20-150微米、大约20-100微米、大约20-80微米或大约20-50微米的长度Lwall。前述内容仅为示例，并且连接区域壁可以具有被选择为以上列出的任何值之间的长度Lwall。
隔绝坞可以具有大约40-600微米、大约40-500微米、大约40-400微米、大约40-300微米、大约40-200微米、大约40-100微米或大约40-80微米的长度Ls。前述内容仅为示例，并且隔绝坞可以具有被选择为在以上列出的值中的任何值之间的长度Ls。
根据一些实施例，隔绝坞可以具有指定的高度(例如，Hs)。在一些实施例中，隔绝坞具有大约20微米至大约200微米(例如，大约20微米至大约150微米、大约20微米至大约100微米、大约20微米至大约60微米、大约30微米至大约150微米、大约30微米至大约100微米、大约30微米至大约60微米、大约40微米至大约150微米、大约40微米至大约100微米或大约40微米至大约60微米)的高度Hs。前述内容仅为示例，并且隔绝坞可以具有被选择为在以上列出的值中的任何值之间的高度Hs。
连接区域在隔绝坞的近端开口处的高度Hcon可以是以下高度中的任一范围内的高度：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述内容仅为示例，并且连接区域的高度Hcon可以被选择为在以上列出的任何值之间。通常，连接区域的高度Hcon被选择为与微流体通道在连接区域的近端开口处的高度Hch相同。此外，隔绝坞的高度Hs通常被选择为与连接区域的高度Hcon和/或微流体通道的高度Hch相同。在一些实施例中，Hs、Hcon和Hch可以被选择为与以上针对所选择的微流体装置列出的任何值相同的值。
隔离区域可以被配置为容纳仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对少量的微物体。在其它实施例中，隔离区可以容纳多于10个、多于50个或多于100个微物体。因此，隔离区的体积可以是例如至少1×104、1×105、5×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106、1×107、3×107、5×107、1×108、5×108或8×108立方微米或更大。前述内容仅为示例，并且隔离区域可以被配置为容纳多个微物体，并且体积被选择为在以上列出的任何值之间(例如，在1×105立方微米与5×105立方微米之间、在5×105立方微米与1×106立方微米之间、在1×106立方微米与2×106立方微米之间或在2×106立方微米与1×107立方微米之间的体积)。
根据一些实施例，微流体装置的隔绝坞可以具有指定体积。可以选择隔绝坞(或隔绝坞的隔离区域)的指定体积，使得单个细胞或少量(例如，2-10或2-5个)细胞可以快速地调节介质，从而获得有利的(或最佳的)生长条件。在一些实施例中，隔绝坞具有大约5x105、6x105、8x105、1x106、2x106、4x106、8x106、1x107、3x107、5x107或大约8x107立方微米或更大的体积。在一些实施例中，隔绝坞具有大约1纳升至大约50纳升、2纳升至大约25纳升、2纳升至大约20纳升、大约2纳升至大约15纳升或大约2纳升至大约10纳升的体积。前述内容仅为示例，并且隔绝坞可以具有被选择为以上列出的任何值之间的任何值的体积。
根据一些实施例，微流体通道(例如，122或322)内的流体介质的流可以具有指定的最大速度(例如，Vmax)。在一些实施例中，最大速度(例如，Vmax)可以被设定在大约0.2、0.5、0.7、1.0、1.3、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.7、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20微升/秒。前述内容仅为示例，并且微流体通道内的流体介质的流可以具有被选择为以上列出的任何值之间的值的最大速度(例如，Vmax)。
在各种实施例中，微流体装置具有如本文所述的实施例中的任一实施例中配置的隔绝坞，其中微流体装置具有大约5至大约10个隔绝坞、大约10至大约50个隔绝坞、大约25至大约200个隔绝坞、大约100至大约500个隔绝坞、大约200至大约1000个隔绝坞、大约500至大约1500个隔绝坞、大约1000至大约2500个隔绝坞、大约2000至大约5000个隔绝坞、大约3500至大约7000个隔绝坞、大约5000至大约10000个隔绝坞、大约7500至大约15000个隔绝坞、大约12500至大约20000个隔绝坞、大约15000至大约25000个隔绝坞、大约20000至大约30000个隔绝坞、大约25000至大约35000个隔绝坞、大约30000至大约40000个隔绝坞、大约35000至大约45000个隔绝坞或大约40000至大约50000个隔绝坞。隔绝坞不必全部是相同的尺寸并且可包括各种配置(例如，隔绝坞内的不同宽度、不同特征)。
涂覆溶液和涂覆剂。在一些实施例中，微流体装置的至少一个内表面包括涂覆材料，该涂覆材料提供适合于(多个)生物微物体的维持、扩增和/或移动的有机和/或亲水分子的层(即，生物微物体在微流体装置内展现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可移植性)。经调节的表面可以减少表面结垢、参与提供水合层和/或以其它方式保护生物微物体不与微流体装置内部的非有机材料接触。
在一些实施例中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂覆材料。
(多个)涂覆的内表面可包括流动区域(例如，通道)、腔室或隔绝坞或隔绝坞的表面，或者其组合。在一些实施例中，多个隔绝坞中的每一个具有涂覆有涂覆材料的至少一个内表面。在其它实施例中，多个流动区域或通道中的每一个具有至少一个涂覆有涂覆材料的内表面。在一些实施例中，多个隔绝坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面涂覆有涂覆材料。涂覆可以在引入(多个)生物微物体之前或之后施加，或者可以与(多个)生物微物体同时引入。在一些实施例中，(多个)生物微物体可以在包括一种或多种涂覆剂的流体介质中输入到微流体装置中。在其它实施例中，在将(多个)生物微物体引入微流体装置之前，微流体装置(例如，具有电极活化衬底的微流体装置，例如但不限于包括介电泳(DEP)电极的装置)的(多个)内表面可以用包括涂覆剂的涂覆溶液处理或“涂底漆”。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任意组合。
基于合成聚合物的涂覆材料。该至少一个内表面可包括包含聚合物的涂覆材料。聚合物可以非共价结合(例如，其可以非特异性地粘附)到该至少一个表面。聚合物可以具有各种结构基序，例如在嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。多种含亚烷基醚的聚合物可适用于本文所述的微流体装置中，包括但不限于诸如
L64、P85和F127(包括F127NF)的
聚合物。合适的涂覆材料的其它示例在US2016/0312165中描述，其内容通过引用整体合并在本文中。
共价链接的涂覆材料。在一些实施方式中，至少一个内表面包括共价链接的分子，其提供适合于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，以为这样的细胞提供调节的表面。共价链接的分子包括链接基团，其中，链接基团共价链接到微流体装置的一个或多个表面，如下所述。链接基团也共价链接到表面改性部分，该表面改性部分被配置为提供适合于(多个)生物微物体的维持/扩增/移动的有机和/或亲水分子层。
在一些实施例中，被配置为提供适合于生物微物体的维持/扩增的有机和/或亲水分子层的共价链接部分可包括烷基或氟烷基(其包括全氟烷基)部分；单糖或多糖(其可包括但不限于葡聚糖)；醇类(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯基膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍基和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸根阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸酯阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
在各种实施例中，被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价链接部分可包括非聚合部分，例如烷基部分、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。可替代地，共价链接部分可包括聚合部分，其可包括这些部分中的任一部分。
在一些实施例中，微流体装置可以在衬底的内表面上具有疏水层，该疏水层包括共价链接的烷基部分。共价链接的烷基部分可包括形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子，并且可以是未分支的烷基部分。在一些实施例中，烷基可包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可以被氟化或全氟化)。在一些实施例中，烷基可包括接合到第二片段的第一片段，第一片段可包括全氟烷基，第二片段可包括未取代的烷基，其中第一和第二片段可直接或间接地接合(例如，通过醚键的方式)。烷基的第一片段可位于链接基团远端，烷基的第二片段可位于链接基团近端。
在其它实施例中，共价链接部分可包括至少一个氨基酸，其可包括多于一种类型的氨基酸。因此，共价链接部分可包括肽或蛋白。在一些实施例中，共价链接部分可包括可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可移植性或其任意组合的氨基酸。
在其它实施例中，共价链接部分还可包括链霉亲和素或生物素部分。在一些实施例中，改性的生物部分(例如，生物素化的蛋白或肽)可以被引入到携带共价链接的链霉亲和素的微流体装置的内表面，并经由共价链接的链霉亲和素偶联到表面，从而提供呈现蛋白或肽的改性的表面。
在其它实施例中，共价链接部分可包括至少一个环氧烷烃部分，并且可包括如上所述的任何环氧烷烃聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100000Da)或替代地是聚环氧乙烷(PEO，Mw>100000)。在一些实施例中，PEG可以具有大约1000Da、5000Da、10000Da或20000Da的Mw。在一些实施例中，PEG聚合物可以进一步被亲水或带电荷部分取代，诸如但不限于醇功能团(alcohol functionality)或羧酸部分。
共价链接部分可包括一种或多种糖。共价链接的糖可以是单糖、二糖或多糖。共价链接的糖可被改性以引入反应性配对部分，该反应性配对部分允许偶联或精制以附着到表面。一个示例性的共价链接部分可包括葡聚糖多糖，其可以通过非分支的接头间接偶联到表面。
提供经调节的表面的涂覆材料可以仅包括一种共价链接部分，或者可以包括多于一种不同种类的共价链接部分。例如，聚乙二醇调节的表面可以具有共价链接的环氧烷烃部分，该环氧烷烃部分具有指定数量的全部相同的环氧烷烃单元，例如具有相同的链接基团和与表面的共价附着、相同总长度和相同数量的环氧烷烃单元。可替代地，涂覆材料可以具有多于一种附着到表面的共价链接部分。例如，涂覆材料可包括具有共价链接的环氧烷烃部分的分子，该部分具有第一指定数量的环氧烷烃单元，并且涂覆材料还可包括另一组分子，其具有诸如连接到具有更多数量的环氧烷烃单元的共价附着的环氧烷烃链接部分的蛋白或肽的大体积部分。不同类型的分子可以以任何合适的比率变化以获得期望的表面特性。例如，具有第一分子(具有具有第一指定数量的环氧烷单元的化学结构)和第二分子(包含可通过生物素/链霉亲和素结合对联接至共价附着的亚烷基链接部分的肽或蛋白部分)的混合物的经调节的表面可以具有以下第一分子与第二分子的比率：大约99：1；大约90：10；大约75：25；大约50：50；大约30：70；大约20：80；大约10：90；或者被选择为在这些值之间的任何比率。在这种情况下，具有不同的、空间要求较低的末端和较少主链原子的第一组分子可以有助于对整个衬底表面的功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。第一分子与第二分子的混合物的比率的选择也可以调节由携带肽或蛋白部分的第二分子引入的表面改性。
经调节的表面性质。各种因素可以改变经调节的表面的物理厚度，例如在衬底上形成经调节的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、浸渍和静电涂覆)。在一些实施例中，经调节的表面可以具有大约1nm至大约10nm的厚度。在一些实施例中，经调节的表面的共价链接部分在共价链接到微流体装置(其可包括具有介电泳(DEP)或电润湿(EW)电极的电极活化衬底)的表面时可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或大约1.5至3.0nm)的厚度。这些值与通过旋涂制备的表面的值形成对比，例如，该表面通常可以具有大约30nm的厚度。在一些实施例中，经调节的表面不需要完美形成的单层来适当地起作用以用于DEP配置的微流体装置内的操作。在其它实施例中，由共价链接部分形成的经调节的表面可以具有大约10nm至大约50nm的厚度。
单一部分或多部分经调节的表面。共价链接的涂覆材料可以通过分子的反应形成，该分子已经包含被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且共价链接的涂覆材料可以具有如下所示的式I的结构。可替代地，共价链接的涂覆材料可以形成为两部分的序列，其具有式II的结构，通过将被配置为提供适合于维持和/或扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联到表面改性配体上，该表面改性配体本身已经共价链接到表面。在一些实施例中，表面可以形成为两部分或三部分序列，包括链霉亲和素/生物素结合对，以引入蛋白、肽或混合的改性表面。
涂覆材料可以共价链接到DEP配置的或EW配置的衬底的表面的氧化物。涂覆材料可以经由链接基团(“LG”)附着到氧化物，该链接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。链接基团LG可以直接或间接地连接到被配置为提供适合于在微流体装置中维持/扩增(多个)生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当链接基团LG直接连接到该部分时，不存在可选的接头(“L”)且n为0，当链接基团LG间接连接到该部分时，存在接头L且n为1。接头L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和/或磷原子的任意组合的非氢原子，其受到本领域已知的化学键合限制。它可以被一个或多个部分的任意组合中断，该一个或多个部分可以选自醚、氨基、羰基、酰氨基和/或膦酸酯基团、亚芳基、杂亚芳基或杂环基团。在一些实施例中，偶联基团CG表示从反应部分Rx和反应配对部分Rpx(即，被配置为与反应部分Rx反应的部分)的反应所得到的基团。CG可以是甲酰胺基、三唑基、取代的三唑基、甲酰胺基、硫代酰胺基、肟基、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者是可以在反应部分与其各自的反应配对部分反应时形成的任何其它合适的基团。在一些实施例中，CG还可以表示链霉亲和素/生物素结合对。
合适的涂层处理和改性以及制备方法的其它细节可在美国专利申请公开第No.US2016/0312165号(Lowe,Jr.等人)、美国专利申请公开号No.US2017/0173580号(Lowe,Jr.等人)、国际专利申请公开WO2017/205830号(Lowe,Jr.等人)和国际专利申请公开WO2019/01880号(Beemiller等人)中找到，这些公开内容分别通过引用整体合并在本文中。
微流体装置动力技术。本文所述的微流体装置可与任何类型的动力技术一起使用。如本文所述，系统的控制和监测设备可包括用于在微流体装置的微流体回路中选择和移动诸如微物体或液滴的物体的动力模块。动力技术可包括例如介电泳(DEP)、电润湿(EW)和/或其它动力技术。取决于被移动的物体类型和其它考虑，微流体装置可以具有多种动力配置。返回图1A，例如，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可包括DEP电极活化衬底，用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的微物体上引起动力，从而选择、捕获和/或移动各个微物体或微物体组。
在一些实施例中，经由一个或多个电极(未示出)跨流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔绝坞中)施加动力以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施例中，将动力施加到微流体回路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔绝坞中。在一些实施例中，动力用于防止隔绝坞内的微物体从该隔绝坞中移位。此外，在一些实施例中，动力用于从根据本公开的实施例先前收集的隔绝坞中选择性地移除微物体。
在一些实施例中，微流体装置被配置为光学致动的电动装置，诸如在光电子镊(OET)和/或光电湿润(OEW)配置的装置中。合适的OET配置的装置(例如，包含光学致动的介电泳电极活化衬底)的示例可包括在美国专利第No.RE 44,711号(Wu等人)(最初作为美国专利第7,612,355号公布)、美国专利第No.7,956,339号(Ohta等人)、美国专利第No.9,908,115号(Hobbs等人)和美国专利第No.9,403,172号(Short等人)中说明的那些，这些专利中的每一个均通过引用整体合并在本文中。合适的OEW配置的装置的示例可包括美国专利第No.6,958,132号(Chiou等人)和美国申请第No.9,533,306号(Chiou等人)中说明的那些，其每一个均通过引用整体合并在本文中。包括组合的OET/OEW配置的装置的合适的光学致动的电动装置的示例可包括美国专利申请公开第No.2015/0306598号(Khandros等)、美国专利申请公开第No.2015/0306599号(Khandros等)和美国专利申请公开第No.2017/0173580号(Lowe等)中说明的那些，这些专利中的每一个均通过引入整体合并在本文中。
应该理解，出于简化目的，图1-5B的各种示例可以示出微流体装置的一部分，而没有描绘其它部分。此外，图1-5B可以是一个或多个微流体系统的一部分，并被实施为一个或多个微流体系统。在一个非限制性示例中，图4A和图4B分别示出了具有区域/腔室402的微流体装置400的围栏102的一部分的侧截面图和俯视截面图，该部分可以是具有更详细结构的流体回路元件的一部分，诸如生长腔室、隔绝坞(其可以类似于本文所述的任何隔绝坞)、流动区域或流动通道。例如，微流体装置400可以类似于微流体装置100、175、200、300、520或如本文所述的任何其它微流体装置。此外，微流体装置400可包括其它流体回路元件，并且可以是包括上述控制和监测设备152的系统的部分，该系统具有介质模块160、动力模块162、成像模块164、可选的倾斜模块166和其它模块168中的一个或多个。微流体装置175、200、300、520和本文所述的任何其它微流体装置可以类似地具有针对图1A-1B和4A-4B详细描述的任何特征。
如图4A的示例所示，微流体装置400包括具有底部电极404和覆盖底部电极404的电极活化衬底406的支撑结构104，以及具有顶部电极410的盖110，其中顶部电极410与底部电极404间隔开。顶部电极410和电极活化衬底406限定区域/腔室402的相对表面。因此，容纳在区域/腔室402中的流体介质180提供了顶部电极410与电极活化衬底406之间的电阻连接。还示出了电源412，其被配置为连接到底部电极404和顶部电极410，并且在电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室402中生成DEP力所需的。电源412可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施例中，图4A和图4B所示的微流体装置200可以具有光学致动的DEP电极活化衬底。因此，可以由动力模块162控制的来自光源416的光418的图案的改变可以选择性地激活和停用电极活化衬底406的内表面408的区域414处的DEP电极的改变图案。(在下文中，具有DEP电极活化衬底的微流体装置的区域414被称为“DEP电极区域”。)如图4B所示，指向电极活化衬底406的内表面408上的光图案418可以以诸如正方形的图案照明所选择的DEP电极区域414a(以白色示出)。未被照明的DEP电极区域414(交叉阴影线)在下文中被称为“暗”DEP电极区域414。在每个暗DEP电极区域414处，通过DEP电极活化衬底406(即，从底部电极404向上直到电极活化衬底406的与流动区域106中的流体介质180交界的内表面408)的相对电阻抗大于通过区域/腔室402中的流体介质180(即，从电极活化衬底406的内表面408到盖110的顶部电极410)的相对电阻抗。然而，被照明的DEP电极区域414a展现出通过电极活化衬底406的降低的相对阻抗，该降低的相对阻抗小于通过每个被照明的DEP电极区域414a处的区域/腔室402中的流体介质180的相对阻抗。
在激活电源412的情况下，前述DEP配置在被照明的DEP电极区域414a与相邻的暗DEP电极区域414之间的流体介质180中产生电场梯度，这进而产生吸引或排斥流体介质180中的附近的微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源416投射到微流体装置400中的光图案418，可以在区域/腔室402的内表面408处的许多不同的这种DEP电极区域414处选择性地激活和停用吸引或排斥流体介质180中的微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源412的频率和流体介质180和/或微物体(未示出)的介电性质之类的参数。取决于施加到DEP配置的功率的频率以及流体介质(例如，诸如PBS的高导电介质或适合于维持生物细胞的其它介质)的选择，可以产生负DEP力。负DEP力可以排斥微物体，使其远离所感应的非均匀电场的位置。在一些实施例中，结合DEP技术的微流体装置可以产生负DEP力。
图4B所示的被照明的DEP电极区域414a的正方形图案420仅为示例。DEP电极区域414的任何图案都可以被投射到微流体装置400中的光418的图案照明(并且由此激活)，并且被照明/被激活的DEP电极区域414的图案可以通过改变或移动光图案418来重复地改变。
在一些实施例中，电极活化衬底406可包括光电导材料或由其组成。在这样的实施例中，电极活化衬底406的内表面408可以是无特征的。例如，电极活化衬底406可包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。例如，a-Si:H可包括大约8％至40％的氢(按100*氢原子数/氢原子和硅原子的总数计算)。a-Si:H层的厚度可为大约500nm至大约2.0μm。在这样的实施例中，DEP电极区域414可以根据光图案418在电极活化衬底406的内表面408上的任何地方和以任何图案形成。DEP电极区域214的数量和图案因此不必固定，而是可以对应于光图案418。具有包括诸如上面讨论的光电导层的DEP配置的微流体装置的示例已经在例如美国专利第No.RE44,711号(Wu等人)(最初作为美国专利第No.7,612,355号公布)中进行描述，其内容分别通过引用整体合并在本文中。
在其它实施例中，电极活化衬底406可包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，诸如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底406可包括多个光电晶体管，这些光电晶体管包括例如横向双极光电晶体管，其中每个光电晶体管对应于DEP电极区域414。可替代地，电极活化衬底406可包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这种电极对应于DEP电极区域414。电极活化衬底406可包括这样的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。可替代地，图案可以是形成六边形点阵的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件可以在电极活化衬底406的内表面408处的DEP电极区域414与底部电极404之间形成电连接，并且这些电连接(即，光电晶体管或电极)可以由光图案418选择性地激活和停用，如上所述。
例如，在美国专利第No.7,956,339号(Ohta等人)和美国专利第No.9,908,115号(Hobbs等人)中已经描述了具有包括光电晶体管的电极活化基板的微流体装置的示例，这些专利的全部内容分别通过引用整体合并在本文中。已经在例如美国专利第No.9,403,172号(Short等人)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的示例，其内容通过引用整体合并在本文中。
在DEP配置的微流体装置的一些实施例中，顶部电极410是围栏402的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底406和底部电极404是围栏102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室402可以位于第一壁与第二壁之间。在其它实施例中，电极410是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底406和/或电极410中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源416可以可替代地用于从下方照明围栏102。
利用图4A-4B的具有DEP电极活化衬底的微流体装置400，如本文针对图1A所述，控制和监测设备152的动力模块162可以通过将光图案418投射到微流体装置400中以围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案420)激活电极活化衬底406的内表面408的DEP电极区域414a处的第一组一个或多个DEP电极，来选择区域/腔室402中的流体介质180中的微物体(未示出)。动力模块162随后可以通过相对于微流体装置400移动光图案418以激活在DEP电极区域414处的第二组一个或多个DEP电极，来移动原位生成的捕获的微物体。可替代地，微流体装置400可以相对于光图案418移动。
在其它实施例中，微流体装置400可以是DEP配置的装置，其不依赖于在电极活化衬底406的内表面408处的DEP电极的光激活。例如，电极活化衬底406可包括选择性可寻址和可激励的电极，该电极与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对地定位。开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)可以选择性地打开和闭合以激活或去激活DEP电极区域414处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室402中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源412的频率和区域/腔室402中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特性，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和停用一组DEP电极(例如，在形成正方形图案420的一组DEP电极区域414处)，可以选择区域/腔室402中的一个或多个微物体，并且在区域/腔室402内移动所述一个或多个微物体。图1A中的动力模块162可以控制这样的开关，并且因此激活和停用DEP电极中的各个DEP电极以选择和移动区域/腔室402周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址和可激励的电极的DEP电极活化衬底的微流体装置是本领域已知的，并且已经在例如美国专利第No.6,294,063号(Becker等人)和美国专利第No.6,942,776号(Medoro)中描述，其内容分别通过引用整体合并在本文中。
不管微流体装置400是否具有介电泳电极活化衬底、电湿润电极活化衬底或者介电泳和电湿润活化衬底两者的组合，电源412可以被用于提供向微流体装置400的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源412可以与图1A中参考的电源192相同或者是其部件。电源412可以被配置为将AC电压及/或电流提供到顶部电极410和底部电极404。对于AC电压，电源412可以提供频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围，其足以生成足够强的净DEP力(或电润湿力)以选择和移动区域/腔室402中的各个微物体(未示出)，如上所述，和/或以改变区域/腔室202中的支撑结构104的内表面408的湿润性质，同样如上所述。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见例如美国专利第No.6,958,132号(Chiou等人)、美国专利第No.RE44,711号(Wu等人)(最初作为美国专利第No.7,612,355号公布)和美国专利申请公开第No.2014/0124370号(Short等人)、No.2015/0306598号(Khandros等人)、No.2015/0306599号(Khandros等人)和No.2017/0173580号(Lowe,Jr等人)，其公开内容分别通过引用整体合并在本文中。
在微流体装置内可以单独地或组合地利用其它力来移动所选择的微物体。微流体通道内的大量流体流动可以移动流动区域内的微物体。也可使用可在微流体通道内、隔绝坞内或另一种类的腔室(例如，储存器)内操作的局部化的流体流来移动所选择的微物体。局部化流体流可以用于将所选择的微物体从流动区域移出到非流动区域中，诸如隔绝坞中，或反之亦然，从非流动区域移动到流动区域中。如美国专利第No.10,058,865号(Brinlinger等人)所述，通过使微流体装置的可变形壁变形可以致动局部化的流动，其内容通过引用整体合并在本文中。
重力可以被用于将微流体通道内的微物体移动到隔绝坞中和/或移出隔绝坞或其它腔室，如在美国专利第No.9,744,533号(Breilinger等人)中所述，其内容通过引用整体合并在本文中。重力的使用(例如，通过倾斜微流体装置和/或微流体装置所附接到的支撑件)对于细胞从流动区域进入隔绝坞或从隔绝坞到流动区域的整体移动可以是有用的。可以采用磁力来移动包括顺磁性材料的微物体，该微物体可包括附着到生物微物体或与生物微物体相关联的磁性微物体。可替代地或额外地，向心力可以用于在微流体通道内移动微物体，以及将其移入或移出微流体装置中的隔绝坞或其它腔室。
在移动微物体的另一可替代模式中，激光生成的移位力(dislodging force)可以用于从隔绝坞或微流体装置中的任何其它腔室中输出微物体或协助输出微物体，如国际专利公开第No.WO2017/117408号(Kurz等人)中所描述，其内容通过引用整体合并在本文中。
在一些实施例中，DEP力与其它力组合，诸如流体流(例如，通道中的整体流体流或通过使微流体装置的可变形表面变形而致动的局部化流体流、激光生成的移位力和/或重力)，以便在微流体回路120内操纵、运输、分离和分类微物体和/或液滴。在一些实施例中，DEP力可以在其它力之前施加。在其它实施例中，DEP力可以在其它力之后施加。在其它情况下，DEP力可以与其它力同时施加，或者以与其它力交替的方式施加。
系统。返回图1A，示出了用于操作和控制微流体装置的系统150，诸如用于控制微流体装置100。电源192可以向微流体装置100提供电力，以根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压源或电流源。
系统150还可包括介质源178。介质源178(例如，容器、储存器等)可包括多个部分或容器，每个部分或容器用于保持不同的流体介质180。因此，介质源178可以是微流体装置100外部并与其分离的装置，如图1A所示。可替代地，介质源178可以全部或部分位于微流体装置100的围栏102内部。例如，介质源178可包括作为微流体装置100的一部分的储存器。
图1A还示出了控制和监测设备152的示例的简化框图描绘，该控制和监测设备构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用。如图所示，这种控制和监测设备152的示例可包括主控制器154，该主控制器包括用于控制介质源178的介质模块160、用于控制微物体(未示出)和/或介质(例如，介质的液滴)在微流体回路120中的移动和/或选择的动力模块162、用于控制成像装置(例如，相机、显微镜、光源或其任意组合)以捕获图像(例如，数字图像)的成像模块164以及用于控制微流体装置100的倾斜的可选的倾斜模块166。控制设备152还可包括用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其它功能的其它模块168。如图所示，监测设备152还可包括显示装置170和输入/输出装置172。
主控制器154可包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据作为非暂时性数据或信号存储在存储器158中的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。可替代地或者额外地，控制模块156可包括硬连线数字电路和/或模拟电路。介质模块160、动力模块162、成像模块164，可选的倾斜模块166和/或其它模块168可以类似地配置。因此，本文所述的关于微流体装置100或任何其它微流体装置执行的功能、过程行为、动作或过程步骤可以由如上所述配置的主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、可选的倾斜模块166和/或其它模块168中的任何一个或多个执行。类似地，主控制器154、介质模块160、动力模块162、成像模块164、可选的倾斜模块166和/或其它模块168可以通信地耦接，以传输和接收在本文所述的任何功能、过程、行为、动作或步骤中使用的数据。
介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178将所选择的流体介质180输入到围栏102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制介质从围栏102中的移除(例如，通过出口端口
(未示出))。因此，可以选择性地将一个或多个介质输入微流体回路120中和从其中移除。介质模块160还可以控制微流体回路120内部的流动路径106中的流体介质180的流。介质模块160还可以向介质源178提供调节气体条件，例如，提供包含5％(或更高)的CO2的环境。介质模块160还可以控制介质源的围栏的温度，例如，以向介质源中的饲养细胞提供适当的温度控制。
动力模块。动力模块162可以被配置为控制微物体(未示出)在微流体回路120中的选择和移动。微流体装置100的围栏102可包括一个或多个电动机构，所述一个或多个电动机构包括介电泳(DEP)电极活化衬底、光电镊子(OET)电极活化衬底、电润湿(EW)电极活化衬底和/或光电润湿(OEW)电极活化衬底，其中动力模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的活化以选择和移动流动路径106中和/或隔绝坞124、126、128和130内的微物体和/或液滴。电动机构可以是任何合适的单个的或组合的机构，如本文在描述用于在微流体装置内使用的动力技术的段落中所述。DEP配置的装置可包括一个或多个电极，所述一个或多个电极在微流体回路120中施加非均匀电场，该非均匀电场足以在微流体回路120中的微物体上施加介电泳力。OET配置的装置可包括可光电激活的电极，以通过光诱导的介电泳提供对微流体回路120中的微物体的移动的选择性控制。
成像模块164可以控制成像装置。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置的图像数据。来自成像装置的图像数据可包括由成像装置捕获的任何类型的信息(例如，微物体的存在或不存在、介质的液滴、诸如荧光标签等的标签的积聚，等等)。使用由成像装置捕获到的信息，成像模块164可以进一步计算物体(例如，微物体、介质的液滴)的位置和/或这样的物体在微流体装置100内的运动速率。
成像装置(如下所述的成像模块164的一部分)可包括用于捕获微流体回路120内部的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置还可包括用于将激发辐射和/或光束引导到微流体回路120中并收集从微流体回路120(或其中容纳的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。反射光束可包括源自LED或宽光谱灯(例如汞灯(例如，高压汞灯)或氙弧灯)的反射的发射。成像装置还可包括显微镜(或光学系统)，其可包括或不包括目镜。
支撑结构。系统150还可包括支撑结构190，该支撑结构被配置为支撑和/或保持包括微流体回路120的围栏102。在一些实施例中，可选的倾斜模块166可以被配置为激活支撑结构190以使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。可选的倾斜模块166可以被配置为将微流体装置100支撑和/或保持在水平定向(即，相对于x轴和y轴成0°)、垂直定向(即，相对于x轴和/或y轴成90°)或其之间的任何定向。微流体装置100(和微流体回路120)相对于轴的定向在本文中被称为微流体装置100(和微流体回路120)的“倾斜”。例如，支撑结构190可以可选地用于使微流体装置100相对于x轴倾斜(例如，如由可选的倾斜模块166控制的)0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或在其之间的任何角度。当微流体装置以大于大约15°的角度倾斜时，可以执行倾斜以产生微物体从流动区域(例如，微流体通道)进入隔绝坞/从隔绝坞进入流动区域的整体移动。在一些实施例中，支撑结构190可以相对于x轴(水平)以0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°或10°的固定角度保持微流体装置100，只要DEP是将微物体从隔绝坞移出到微流体通道中的有效力即可。由于电极活化衬底的表面基本上是平坦的，因此即使当隔绝坞的与其通向微流体通道的开口相对的远端沿竖直方向设置在比微流体通道更低的位置处时，也可以使用DEP力。
在微流体装置相对于水平以固定角度倾斜或保持的一些实施例中，微流体装置100可以以一定定向设置，使得流动路径106的底座的内表面以一定角度定位在横向于流动路径敞开的一个或多个隔绝坞的底座的内表面上方或下方。如本文所使用的，术语“上方”表示流动路径106在由重力限定的竖直轴上定位成高于一个或多个隔绝坞(即，流动路径106上方的隔绝坞中的物体将具有比流动路径中的物体更高的重力势能)，并且反过来，用于将流动路径106定位在一个或多个隔绝坞下方。在一些实施例中，支撑结构190可以相对于x轴(水平)以小于大约5°、大约4°、大约3°或小于大约2°的固定角度保持，从而将隔绝坞放置在相对于流动路径更低的势能处。在一些其它实施例中，当在微流体装置内进行长期培养(例如，超过大约2、3、4、5、6、7或更多天)时，该装置可被支撑在培养支撑件上，并且可以以大约10°、15°、20°、25°、30°或在其之间的任何角度的更大角度倾斜，以在长期培养时间段期间将生物微物体保留在隔绝坞内。在培养时间段结束时，容纳培养的生物微物体的微流体装置可以被返回到系统150内的支撑件190，其中倾斜角度减小到如上所述的值，从而提供DEP的使用以将生物微物体移出隔绝坞。在美国专利第No.9,744,533号(Brinlinger等人)中描述了使用由倾斜引起的重力的其它示例，其内容通过引用整体合并在本文中。
巢。现在转到图5A，系统150可包括被配置为保持微流体装置520的结构(也称为“巢”)500，其可以类似于微流体装置100、200或本文所述的任何其它微流体装置。巢500可包括能够与微流体装置520(例如，光学致动的电动装置100、200等)接口连接并且能够提供从电源192到微流体装置520的电连接的插座502。巢500还可包括集成的电信号生成子系统504。电信号生成子系统504可以被配置为将偏置电压供应到插座502，使得当微流体装置520被插座502保持时，偏置电压被施加在微流体装置中的一对电极上。因此，电信号生成子系统504可以是电源192的一部分。向微流体装置520施加偏置电压的能力并不意味着当微流体装置520由插座502保持时，偏置电压将一直被施加。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏置电压，例如，仅在需要促进在微流体装置520中生成电动力时施加时，例如生成介电泳或电润湿时。
如图5A所示，巢500可包括印刷电路板组件(PCBA)522。电信号生成子系统504可以安装在PCBA 522上并且电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 522上的插座502。
在一些实施例中，巢500可包括电信号生成子系统504，该电信号生成子系统被配置为测量微流体装置520处的放大电压，随后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置520处的测量电压为期望值。在一些实施例中，波形放大回路可以具有由安装在PCBA322上的一对DC-DC转换器生成的+6.5V至-6.5V电源，从而在微流体装置520处得到高达13Vpp的信号。
在某些实施例中，巢500还包括控制器508，诸如用于感测和/或控制电信号产生子系统504的微处理器。合适的微处理器的示例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。控制器508可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中示出)通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施例中，控制器308通过接口(例如，插头或连接器)与(图1A的)主控制器154进行通信。
如图5A所示，支撑结构500(例如，巢)还可包括热控制子系统506。热控制子系统506可以被配置为调节由支撑结构500保持的微流体装置520的温度。例如，热控制子系统506可包括珀耳帖热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。在图5A所示的实施例中，支撑结构500包括入口516和出口518，以从冷却单元的外部储存器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入流体路径514中并通过冷却块，随后将冷却的流体返回到外部储存器。在一些实施例中，珀尔帖热电装置、冷却单元和/或流体路径514可以安装在支撑结构500的壳体512上。在一些实施例中，热控制子系统506被配置为调节珀尔帖热电装置的温度，以便实现微流体装置520的目标温度。珀耳帖热电装置的温度调节可以例如通过热电电源来实现，例如PololuTM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)。热控制子系统506可包括反馈电路，诸如由模拟电路提供的温度值。可替代地，反馈电路可以由数字电路提供。
巢500可包括串行端口524，该串行端口允许控制器508的微处理器经由接口与外部主控制器154进行通信。此外，控制器508的微处理器可以与电信号生成子系统504和热控制子系统506进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器508、接口和串行端口524的组合，电信号生成子系统504和热控制子系统506可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，主控制器154可以通过执行用于输出电压调整的缩放计算来辅助电信号生成子系统504，等等。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统506和电信号生成子系统504获得的温度和波形数据。可替代地或额外地，GUI可以允许更新控制器508、热控制子系统506和电信号生成子系统504。
光学子系统。图5B是具有用于成像和操纵微流体装置520中的微物体的光学设备510的光学子系统550的示意图，该微流体装置可以是本文所述的任何微流体装置。光学设备510可以被配置为执行微流体装置520的围栏内的一个或多个微物体的成像、分析和操纵。
光学设备510可以具有第一光源552、第二光源554和第三光源556。第一光源552可以将光传输到结构光调制器560，该结构光调制器可包括数字镜装置(DMD)或微型快门阵列系统(MSA)，其中的任一个可以被配置为接收来自第一光源552的光并且选择性地将所接收的光的子集传输到光学设备510中。可替代地，结构光调制器560可包括产生其自己的光(并因此不需要光源552)的装置，诸如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)装置、硅基铁电液晶装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。结构光调制器560可以是例如投影仪。因此，结构光调制器560能够发射结构光和非结构光两者。在某些实施例中，系统的成像模块和/或动力模块可以控制结构光调制器560。
在实施例中，当结构化光调制器560包括反射镜时，调制器可以具有多个反射镜。多个反射镜中的每个反射镜可具有约5微米x 5微米至约10微米x 10微米或其之间的任何值的尺寸。结构化光调制器560可以包括2000x 1000、2580x 1600、3000x 2000或其之间的任何值的反射镜(或像素)的阵列。在一些实施例中，仅使用结构化光调制器560的照明区域的一部分。结构化光调制器560可以将所选择的光的子集传输到第一二向色分束器558，该第一二向色分束器558可以将该光反射到第一镜筒透镜562。
第一镜筒透镜562可以具有大的通光孔径，例如，大于大约40mm至大约50mm或更大的直径，从而提供大的视场。因此，第一镜筒透镜5621可以具有足够大的孔径以捕获从结构光调制器560发出的所有(或基本上所有)光束。
可替代地或额外地，具有大约400nm至大约710nm波长的结构光515可以向微流体装置提供荧光激发照明。
第二光源554可以提供非结构化的明场照明。明场照明光525可以具有任何合适的波长，并且在一些实施例中，可以具有约400nm至约760nm的波长。第二光源554可将光传输到第二二向色分束器564(其也可接收来自第三光源556的光535)，并且第二光、明场照明525可从其传输到第一二向色分束器558。第二光、明场照明525随后可以从第一分束器558传输到第一镜筒透镜562。
第三光源556可以通过匹配的对中继透镜(未示出)将光传输到反射镜566。第三光照明535可以从其反射到第二二向色分束器5338，并且从其传输到第一分束器5338，并且向前延伸到第一镜筒透镜5381。第三照明光535可以是激光并且可以具有任何合适的波长。在一些实施例中，激光照明535可以具有大约350nm至大约900nm的波长。激光照明535可以被配置为加热微流体装置内的一个或多个隔绝坞的部分。激光照明535可以被配置为加热流体介质、微物体、隔绝坞的壁或壁的一部分、设置在微流体通道或微流体通道的隔绝坞内的金属靶、或微流体装置内的光可逆的物理屏障，并且在美国申请公开号第No.2017/0165667号(Beaumont等人)和2018/0298318(Kurz等人)中更详细地描述，其公开内容分别通过引用整体合并在本文中。在其它实施例中，激光照明535可以被配置为启动微流体装置的改性表面的表面改性部分的光裂解或为微流体装置内的隔绝坞内的微物体提供粘附功能的部分的光裂解。使用激光的光裂解的其它细节可以在国际申请公开号第No.WO2017/205830号(Lowe，Jr等人)中找到，其公开内容通过引用整体合并在本文中。
来自第一、第二和第三光源(552、554、5560)的光穿过第一镜筒透镜562，并传输到第三二向色分束器568和滤光器变换器572。第三二向色分束器568可反射光的一部分并将光透射通过滤光器变换器572中的一个或多个滤光器并到达物镜570，该物镜可以是具有可根据需求切换的多个不同物镜的物镜变换器。一些光(515、525和/或535)可以穿过第三二向色分束器568，并且由光束块(未图示)终止或吸收。从第三二向色分束器568反射的光穿过物镜570以照明样本平面574，该样本平面可以是微流体装置520的一部分，诸如本文所述的隔绝坞。
如图5A所示，巢500可以与光学设备510集成在一起，并且是设备510的一部分。巢500可以提供到围栏的电连接，并且还被配置为提供到围栏的流体连接。用户可以将微流体装置520加载到巢500中。在一些其它实施例中，巢500可以是独立于光学设备510的单独部件。
光可以从样本平面574反射和/或发射，以返回穿过物镜570、穿过滤光器变换器572、并穿过第三二向色分束器568到达第二镜筒透镜576。光可以穿过第二镜筒透镜576(或成像镜筒透镜576)并且从反射镜578反射到成像传感器580。杂散光挡板(未示出)可以放置在第一镜筒透镜562与第三二向色分束器568之间、第三二向色分束器568与第二镜筒透镜576之间以及第二镜筒透镜576与成像传感器580之间。
物镜。光学设备可包括物镜570，该物镜被特别设计和配置为用于观察和操纵微流体装置520中的微物体。例如，常规显微镜物镜被设计为观察载玻片上的或通过5mm的含水流体的微物体，而微流体装置520中的微物体在观察平面574内的多个隔绝坞内部，其具有20、30、40、50、60、70、80微米或其之间的任何值的深度。在一些实施例中，透明盖520a(例如，具有大约750微米的厚度的玻璃或ITO盖)可以被放置在多个隔绝坞的顶部上，这些隔绝坞设置在微流体衬底520c上方。因此，通过使用常规的显微镜物镜获得的微物体的图像可能具有大的像差(例如，球差和色差)，这会降低图像的质量。光学设备510的物镜570可以被配置为校正光学设备1350中的球差和色差。物镜570可以具有一个或多个可用的放大倍率，例如4X、10X、20X。
照明模式。在一些实施例中，结构光调制器560可以被配置为调制从第一光源552接收到的光束并且将多个照明光束515(可以是结构光束)传输到微流体装置的围栏中，例如，包含隔绝坞的区域中。结构光束可包括所述多个照明光束。多个照明光束可以被选择性地激活以生成多个照明图案。一些实施例中，结构光调制器560可以被配置为生成照明图案，类似于针对图4A-4B所描述的，该照明图案可以被移动和调整。光学设备560还可包括控制单元(未示出)，该控制单元被配置为调整照明图案以选择性地激活衬底520c的多个DEP电极中的一个或多个DEP电极并且生成DEP力以在微流体装置520内的多个隔绝坞内移动一个或多个微物体。例如，可以以受控方式随时间调整多个照明图案以操纵微流体装置520中的微物体。多个照明图案中的每一个可以被移位以移位所生成的DEP力的位置并且将结构光从一个位置移动到另一个位置，以便在微流体装置520的围栏内移动微物体。
在一些实施例中，光学设备510可以被配置为使得视场内的样本平面574中的多个隔绝坞中的每个隔绝坞在图像传感器580处和结构光调制器560处同时聚焦。在一些实施例中，结构光调制器560可以设置在图像传感器580的共轭平面处。在各种实施例中，光学设备510可以具有共焦配置或共焦性质。光学设备510可被进一步配置为，使得仅视场内的样本平面574中的流动区域的每个内部区域和/或多个隔绝坞中的每个隔绝坞被成像到图像传感器580上，以便减少整体噪声，从而提高图像的对比度和分辨率。
在一些实施例中，第一镜筒透镜562可以被配置为生成准直光束并且将准直光束传输到物镜570。物镜570可以接收来自第一镜筒透镜562的准直光束，并且将准直光束聚焦到流动区域的每个内部区域以及图像传感器580或光学设备510的视场内的样本平面574中的多个隔绝坞中的每个隔绝坞中。在一些实施例中，第一镜筒透镜562可以被配置为生成多个准直光束并且将多个准直光束传输到物镜570。物镜570可以从第一镜筒透镜562接收多个准直光束，并且将多个准直光束会聚到图像传感器580或光学设备510的视场内的样本平面574中的多个隔绝坞中的每个隔绝坞中。
在一些实施例中，光学设备510可以被配置为利用多个照明点照明隔绝坞的至少一部分。物镜570可以从第一镜筒透镜562接收多个准直光束，并且将可以形成照明图案的多个照明点投影到视场内的样本平面574中的多个隔绝坞中的每个隔绝坞中。例如，多个照明点中的每一个可以具有大约5微米x 5微米；10微米x 10微米；10微米x 30微米、30微米x60微米、40微米x 40微米、40微米x 60微米、60微米x 120微米、80微米x 100微米、100微米x140微米以及其之间的任何值的尺寸。照明点可以分别具有圆形、正方形或矩形的形状。可替代地，可以在多个照明点(例如，照明图案)内对照明点分组以形成较大的多边形形状，例如矩形、正方形或楔形形状。照明图案可以包围(例如，围绕)未照明空间，该未照明空间可以是正方形、矩形或多边形。例如，多个照明点中的每一个可以具有大约150至大约3000、大约4000至大约10000、或5000至大约15000平方微米的面积。照明图案可以具有大约1000至大约8000、大约4000至大约10000、7000至大约20000、8000至大约22000、10000至大约25000平方微米以及其之间的任何值的面积。
光学系统510可以用于确定如何重新定位微物体以及向微流体装置的隔绝坞中和从微流体装置的隔绝坞中重新定位微物体，以及对存在于装置的微流体回路内的微物体数量计数。重新定位和计数微物体的其它细节可在以下文献中找到：美国申请公开号第No.2016/0160259号(Du)；美国专利第No.9,996,920号(Du等人)；和国际申请公开号第WO2017/102748号(Kim等)。光学系统510也可以用于测定方法中以确定试剂/测定产物的浓度，并且其它细节可以在以下文献中找到：美国专利第No.8,921,055号(Chapman)、10,010,882号(White等人)和9,889,445号(Chapman等人)；国际申请公开号第No.WO2017/181135号(Lionberger等人)；以及国际申请序列号第No.PCT/US2018/055918号(Lionberger等人)。如本文所述，适用于在用于观察和操纵在微流体装置内的微物体的系统内使用的光学设备的特征的其它细节可在WO2018/102747(Lundquist等人)中找到，其公开内容通过引用整体合并在本文中。
用于维持微流体装置的隔绝坞内的细胞的活力的额外系统部件。为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的额外部件提供有助于维持功能细胞的环境条件。例如，这些额外部件可以提供营养物、细胞生长信号传递种类、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中移除废产物。
示例
一般材料和方法。
系统和微流体装置：将OptoSelectTM纳米流体芯片(Berkeley Lights，Inc.)与
optofluidic仪器(Berkeley Lights，Inc.)一起使用。该仪器包括：用于该芯片的安装台，其耦接到温度控制器；泵和流体介质调节部件；以及包括相机和适合于激活芯片内的光电晶体管的结构光源的光学系统。OptoSelectTM芯片包括采用OptoElectroPositioning(OEPTM)技术配置的衬底，该技术提供光电晶体管激活的DEP力。该芯片还包括多个微流体通道，每个微流体通道具有流体地连接到其的多个NanoPenTM腔室(或隔绝坞)。每个隔绝坞的体积为大约1x 106立方微米。
引发溶液：完全生长介质包含0.1％
F127(Life 
Cat#P6866)。
用于培养的制备：将具有改性表面的微流体装置加载到系统上，并用100％二氧化碳在15psi下吹扫5分钟。在二氧化碳吹扫之后，立即以5微升/秒将引发溶液灌注通过微流体装置8分钟。随后使培养介质以5微升/秒流经微流体装置5分钟。
引发方案。250微升的100％二氧化碳以12微升/秒的速率流入。随后是250微升含0.1％
F27(Life
Cat#P6866)的PBS以12微升/秒流入。引发的最后步骤包括250微升PBS以12微升/秒流入。培养介质的引入如下。
灌注方案。灌注方法是以下两种方法中的任一种：
1.以0.01微升/秒灌注2小时；以2微升/秒灌注64秒；并且重复。
2.以0.02微升/秒灌注100秒；停止流动500秒；以2微升/秒灌注64秒；并且重复。
实验1。淀粉酶工程。转到图7A，框710、720示出了核酸库的设计和构建，该核酸库包括核酸序列702、702′、702″，其在沿着对于淀粉酶编码的基因序列706的长度的一个或多个核酸位点处引入各个核酸变化。在其它实施例中，核酸取代可以限于对于淀粉酶编码的基因序列的一部分。例如，取代可以限于编码淀粉酶的酶活性位点的基因序列的部分。核酸序列可以手动设计，可以是随机的，或者可以通过基于计算机的算法选择。这些设计过程710中的任何一个都可以在本文所述的方法内执行。在框720中，DNA合成部件，诸如DNA写入器(例如，Gen9系统、GeneArt等)或具有较小单元的机外连接的DNA并行合成系统，可以产生基因长度变体序列。变体核酸序列可以已经产生为包含包括条形码704的核酸序列，该条形码可以如在2017年9月29日提交的题为“DNA Barcode Compositions and Methods of InSitu Identification in a Microfluidic Device”的国际专利申请第No.PCT/US2017/054628号中所述构建和检测，并且出于所有目的其公开内容通过引用整体合并在本文中。然而，可使用可通过PCT/US2017/054628中描述的杂交流方法检测的任何合适的替代的条形码序列704。
在另一种替代方案中，可以通过选择性地输出核酸标记的珠粒并且对每个珠粒的核酸序列进行测序而不是在视觉上检测它来确定条形码序列。在该替代类型的条形码确定中，变体核酸序列也可通过测序确定，并且变体核酸序列通过已知位置与表型报告读数相关。
在合成核酸库之后，将每个不同的核酸序列附着到珠粒，这可以用已经并入各个核酸序列的每个内的条形码进行，或者每个不同的核酸序列可以经由连接而附着至已经附着到各个珠粒的唯一条形码，作为框720的一部分。这可以在核酸合成部件内进行，或者可以通过与核酸合成部件分开的仪器进行。现在利用核酸标记的珠粒722的特定核酸变体序列识别了条形码序列，并且该信息可以存储在(多个)计算部件的存储器中。
随后将变体核酸序列的珠粒结合的条形码库输入到具有围栏的微流体装置中，如图7A的框730处所述。在该实验中，微流体装置是如上文在一般材料部分中所述的装置，但不限于此。在该示例中，将携带核酸的珠粒引入微流体装置的通道中。随后将包括图7A的各个标记的珠粒722的核酸标记的珠粒引入微流体装置的未波及区域708。在该示例中，未波及区域是隔绝坞的隔离区域，隔绝坞可以是如本文描述的任何隔绝坞。(参见图7B的框740)。将单个珠粒722引入隔绝坞的隔离区域708中可以使用光学致动的介电泳来实现，或者可以使用诸如局部流体流致动、磁力或重力的其它力来实现。
图5B的框750示出了确定珠粒722的条形码可以经由将荧光标记剂的连续流引入微流体装置的流动通道中来进行，如PCT/US2017/054628中所述。在面板755中示出了针对珠粒722的结果。面板755是荧光标记的杂交试剂的每个流的拍摄记录，其表示在隔离区域708中存在哪个短条形码片段。例如，在沿着面板755左手侧标记为“1”的荧光标记的试剂的第一流中，允许四个光谱上不同的杂交序列从微流体通道扩散到未波及区域708中。对于珠粒722，A、B和C荧光检测通道的杂交序列中的每一个都能够结合到珠粒722的条形码序列704，而D荧光通道的杂交试剂不结合。在流2和3中，类似地引入四种不同的且不同荧光标记的杂交探针，但没有一个流包含可结合至在通道D中捕获的条形码的剩余未识别部分的杂交探针。最后，在流4中，引入在D通道中标记的杂交试剂，其能够结合到珠粒722，并且在D通道中产生荧光信号。在该示例中，珠粒722的条形码704具有与杂交探针的序列1A1B1C4D互补的序列。这种视觉检测可以可替代地在实验的稍后时间点执行，但是通常方便的是在实验开始时识别每个特定条形码的位置。这允许精确识别特定珠粒的位置和其携带的特定变体核酸序列。
图5C的框760示出了将表型报告微物体724引入隔绝坞中，在隔绝坞的隔离区域内的珠粒722附近，该隔离区域是未波及区域708。表型报告微物体724可以设置在隔绝坞的隔离区域内。对于该示例，表型报告微物体724可以是包括衬底的珠粒，其可以用于淀粉酶测定中，或者可以不需要微物体，但是可以是与使用His6标记的亲和标签的基于Ni-NTA磁珠粒的测定组合的溶液相试剂，诸如EnzChekTM Ultra淀粉酶测定(ThermoFisher目录号No.E33651)。
图7C的框770示出了试剂混合物726的引入，其可以允许从珠粒722上存在的各个变体核酸的蛋白表达。这可以是无细胞蛋白表达系统。由于该试剂是溶液，所以它被引入微流体装置的通道的流动路径中并且可以扩散到隔绝坞的隔离区域中。
图7D的框780示出了蛋白表达的开始，并且在存在表型报告物的情况下，检测信号728的功能活性，并且可以对该信号进行定量。例如，通过酶淀粉酶测定检测到的信号量可以除以荧光His6标记的亲和力测定的结果，以提供珠粒722的各个核酸序列的定量的功能水平，以提供表型读数。在一些变型中，蛋白聚集微物体也可存在于每个隔离区域中，靠近核酸标记的珠粒，其可以通过捕获包括在所表达的蛋白中的蛋白聚集标签，诸如表位标签或多组氨酸标签，来捕获表达的蛋白，从而在隔离区域708内集中所表达的蛋白。捕获的所表达蛋白仍然能够在功能测定中起作用并产生信号728。
图7D的框790将表型数据呈现给计算部件以识别具有期望表型结果的坞，随后将这些结果与珠粒722上存在的变体核酸(基因或亚基因)序列相关联，该序列可从变体核酸序列与检测/确定的条形码序列的存储的关联性获得。
图7D的框795将表型结果与序列的关联呈现给相同或不同计算部件，计算部件使用这些结果生成新的(第二和进一步数量的循环)核酸序列库以在后续轮实验中继续改善表型结果。计算部件可以利用算法来生成第二核酸序列库。该方法也可以手动执行，但是计算部件的速度可以允许该方法的设计901/构建920(合成)/测试930/学习940循环的更快迭代，如图9所示。循环的每个部分可以被优化以允许循环在24小时的时间段内进行，以允许为了追求新的高功能蛋白的快速蛋白进化。
实验2。抗体工程。除了表型报告物可包括诸如配体阻断测定、绿色荧光蛋白表达测定等的抗体功能测定以外，可以与实验1类似地进行该实验。例如，抗体可以是治疗抗体和/或可以是：单链抗体，例如，不具有二硫键；纳米抗体，例如，来自骆驼科物种的重链抗体；或单链可变片段；可选地没有糖改性。抗体的浓度可以例如在2017年4月14日提交的题为“Method,Systems,and Kits for In-Pen Assays”的国际专利申请第No.PCT/US2017/027795号所述的那样确定，出于所有目的其公开内容通过引用整体合并在本文中。所报告的表型可以基于功能测定或者功能测定与治疗抗体浓度的组合，如PCT/US2017/027795的坞测定所定义的。
实验3。淀粉酶工程。在图8中示出了进行快速蛋白进化实验的另一种方法。核酸标记的珠粒822(其可以类似于核酸珠粒722、622并且至少包含条形码序列和变体核酸序列)被引入未波及区域808中，如图8的点810处所示，未波及区域可以是微流体装置的隔绝坞的隔离区域。液体介质836是任何合适的液体介质，其允许维持核酸标记的珠粒822和测定的其它组分。核酸序列还可包括允许无细胞表达系统进行蛋白翻译的合适引发序列，该无细胞表达系统可以是本领域已知的用于产生淀粉酶的任何合适的无细胞表达系统。在一些变型中，核酸序列还可包括接头序列，该接头序列被配置为使条形码的核酸序列适应于通过合成的测序或任何高度并行的测序方法来确定。蛋白聚集珠粒832也被引入隔离区域808中，并被设置在核酸标记的珠粒822的近端。
在图8的点820处，可以允许从存在于珠粒822上的单个变体核酸的蛋白表达的试剂混合物826被引入微流体装置中并被允许扩散到未波及区域808中。其可以是无细胞蛋白表达系统，如上所述。当在点830处产生蛋白时，其被捕获到蛋白聚集珠粒，使用包括在所表达的蛋白中的任何合适的蛋白标签。这被显示为被捕获到珠粒834的蛋白(“P”)，从而在隔离区域808内集中所表达的蛋白。
在点840处，已经产生了足够的蛋白。通过引入新鲜的液体介质836来置换试剂混合物826，该液体介质扩散到隔离区域808中，并且不置换核酸珠粒822或蛋白标记的聚集珠粒834。
在点850处，将表型报告物824引入隔离区域808中，并设置在蛋白标记的聚集珠粒834的近端。
在点860处，类似于实验1，可以进行功能测定并且表型报告物可以产生可以定量的可检测信号828。检测到的信号828被存储在存储器中并且与微流体装置的特定隔绝坞的隔离区域808的位置关联。
核酸标记的珠粒822的条形码的检测可以以若干方式和在若干点处进行。如上所述，可以在视觉上进行检测。当条形码的检测在视觉上进行时，视觉检测可以在点810、840、850、860中的任何一个点处发生。在点820、830处进行可能不太典型，但是仍然可以进行检测。
在其它变型中，可以通过对条形码核酸序列测序来确定条形码。这可以通过从微流体装置内的已知位置808选择性地输出核酸标记的珠粒822，并且使用任何大规模并行测序方法对一个或多个珠粒的条形码序列进行测序来实现。已知位置808可以存储在存储器中，并且与通过测序在视觉上检测/确定的序列关联。来自已知位置的表型报告物测定结果可以与检测到的条形码/序列关联。
在一些变型中，条形码序列先前在核酸标记的珠粒的合成期间与变体核酸序列关联，并且条形码/序列关联性存储在存储器中。随后，对标记的珠粒的核酸序列的测序可以仅需要条形码本身的测序。在其它变型中，变体核酸序列的序列与条形码序列同时获得，并且与由该变体核酸序列产生的表型读数关联。
在任何情况下，可将核酸标记的珠粒822输出，以用于在图8中所示的各个点处确定条形码序列和/或变体核酸序列。通常，可以在点840、850、860中的任一点处选择性地输出珠粒822。
此外，在进行了表型报告物读数后，蛋白标记的蛋白聚集珠粒834可以从未波及区域808(例如，隔绝坞的隔离区域)输出。珠粒834可以被输出以在第二轮表型报告物读数中重新测试或在另一测定或另一类型的分析中测试。
随后将表型结果与变体核酸序列的关联性呈现给相同或不同的计算部件，如上面在实验1中所述，以生成一组新的进一步的变体核酸序列，以形成第二核酸标记的珠粒库以在随后轮实验中继续改善表型结果。
当特征或元素在本文中被称为位于另一特征或元素“之上”时，其可以直接位于另一特征或元素上或者可以存在中间特征和/或元素。反之，当特征或元素被称为“直接”位于另一特征或元素“之上”时，不存在中间特征或元素。还将理解，当特征或元素被称为“连接”、“附接”或“耦接”至另一特征或元素时，其可直接地连接、附接或耦接到另一特征或元素或者可以存在中间特征或元素。反之，当特征或元素被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接耦接”至另一特征或元素时，不存在中间特征或元素。尽管关于一个实施例描述或示出，但如此描述或示出的特征和元素可以适用于其它实施例。本领域技术人员还应该理解，提及“相邻”另一特征设置的结构或特征可以具有与该相邻特征重叠或位于相邻特征下方的部分。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不旨在限制本发明。例如，如本文所使用的，除非上下文中另有明确指示，否则单数形式“一(a)”、“一个(an)”以及“该(the)”也旨在包括复数形式。还应该理解，术语“包括(comprises)”和/或“包含(comprising)”在用于本说明书中时指定所陈述的特征、步骤、操作、元素和/或部件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、步骤、操作、元素、部件和/或其群组的存在或添加。如本文所使用的，术语“和/或”包括相关联的所列项目中的一个或多个的任一以及所有组合，并且可以缩写为“/”。
空间相关术语，诸如“下”、“下方”、“下部”、“上”、“上部”等可以在本文中为了便于描述而使用，以描述附图中所示的一个元素或特征相对于另一元素或特征的关系。应该理解，空间相关术语旨在包含除了附图中所描绘的定向之外，在使用和操作中的装置的不同定向。例如，如果附图中的装置被倒转，则被描述为在另外的元素或特征“下”或“之下”的元素将被定向为在另外的元素或特征“上”。因此，示例性的术语“下”可包含上和下两个定向。该装置还能以其它方式定向(旋转90度或者以其它定向)，并且本文所使用的与空间相关的描述语被相应地解释。类似地，除非另有具体说明，否则术语“向上”、“向下”、“竖直”、“水平”等仅用于说明目的。
尽管术语“第一”和“第二”在本文中可以用于描述各种特征/元素(包括步骤)，但这些特征/元素不应受限于这些术语，除非上下文另有说明。这些术语可用于区分一个特征/元素与另一特征/元素。因此，下面所讨论的第一特征/元素可被称为第二特征/元素，并且类似地，下面讨论的第二特征/元素可在不脱离本发明的教导的情况下被称为第一特征/元素。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”和诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的各种变型意指各种部件可以共同用于方法和制品(例如，包括装置和方法的成分和设备)中。例如，术语“包括(comprising)”将被理解为暗示包括任何所述的元素或步骤，但不排除任何其它元素或步骤。
如在本文的说明书及权利要求中所使用的，包括如在示例中所使用且除非另外明确地指定，所有数值可当作有前置词“大约”或“近似地”，即使该术语未明确出现。短语“大约”或“近似地”可在描述量和/或位置时使用，以指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可以具有作为所陈述的值(或值范围)的+/-0.1％、所陈述的值(或值范围)的+/-1％、所陈述的值(或值范围)的+/-2％、所陈述的值(或值范围)的+/-5％、所陈述的值(或值范围)的+/-10％等的某个值。本文所给出的任何数值还应被理解为包括大约或近似为该值，除非上下文另外指示。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“大约10”。本文所述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。还应理解，当公开了值时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于”该值以及值之间的可能范围，如本领域技术人员适当理解的。例如，如果公开了值“X”，则还公开了“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是数值)。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示终点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应该理解，认为公开了大于、大于或等于、小于或等于、以及等于10和15，以及在10至15之间。还应该理解，两个特定单元之间的每个单元也被公开。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
尽管上面描述了各种说明性实施例，但在不脱离如权利要求所述的本发明的范围的情况下，可对各种实施例作出任何多种改变。例如，各种所述方法步骤执行的顺序通常可在替代实施例中改变，并且在其它替代实施例中可完全略过一个或多个方法步骤。各种装置及系统实施例的可选特征可以包括在一些实施例中而不包括在其它实施例中。因此，主要出于示例性目的提供前述描述，并且不应解释为限制如其在权利要求中所阐述的本发明的范围。
包括在本文中的示例和说明以说明而非限制的方式示出可在其中实践主题的具体实施例。如所述，可以利用和从中推导出其它实施例，使得在不脱离本公开的范围的情况下可以作出结构性及逻辑性的取代及变化。仅为方便起见，本发明的主题的这样的实施例可以在本文中单独地或共同地由术语“发明”所指代，并且如果实际上公开多于一个的发明或发明概念，则不旨在自愿地将本申请的范围限制为任何单一发明或发明概念。因此，尽管本文已经说明和描述了具体实施例，但被推断为实现相同目的的任何布置可以取代所示的具体实施例。本公开旨在涵盖各种实施例的任何及所有调整或变型。对于本领域技术人员而言，在审阅上述描述之后，上述实施例的组合及本文中未具体描述的其它实施例将是显而易见的。
本公开的一些实施例的列举
1.一种用于快速蛋白进化的系统，该系统包括：微流体装置；以及微流体系统部件(例如，仪器)，该微流体系统部件被配置为：将多个珠粒输入到微流体装置中，多个珠粒中的每个珠粒包括(i)第一多个核酸序列中的一个核酸序列，以及(ii)条形码，其中，第一多个核酸序列中的每个核酸序列对感兴趣的蛋白的序列变体(例如，感兴趣的原始蛋白序列，其可以是天然存在的感兴趣的蛋白或非天然存在的蛋白，在任一种情况下可选地具有限定的活性)编码；在有助于表达由多个珠粒中的每个珠粒的该一个核酸序列所编码的相应蛋白的条件下，孵育位于微流体装置内的多个珠粒，从而产生多个相应蛋白；以及测定由多个珠粒的核酸序列产生的多个相应蛋白中的期望性质。
2.实施例1所述的系统，还包括多个蛋白聚集珠粒，其特异性结合到所述感兴趣的蛋白的表位。
3.实施例1所述的系统，还包括多个蛋白聚集珠粒，其特异性结合到表位标签(例如，FLAG标签、金属螯合标签，例如His6、FlAsH、ReAsH等)。
4.实施例1至3中任一项所述的系统，还包括核酸合成部件，所述核酸合成部件被配置为合成第一多个核酸序列(例如，通常，还合成任意多个核酸序列，包括后续多个核酸)。
5.实施例1至4中任一项所述的系统，其中，该系统还包括珠粒制备部件，该珠粒制备部件被配置为将核酸序列连接到珠粒(例如，第一多个核酸序列中的每个核酸序列可以连接到珠粒，由此生成第一多个珠粒；更一般地，可以因此生成任何多个珠粒，包括任意的后续多个珠粒)。
6.实施例5所述的系统，其中，珠粒制备部件是与所述核酸合成部件分开的设备。
7.实施例1至6中任一项所述的系统，还包括条形码检测部件，该条形码检测部件被配置为将多个珠粒中的每个珠粒的核酸序列与多个珠粒中的相应珠粒在微流体装置内的位置关联。
8.实施例7所述的系统，其中，条形码检测部件包括微流体系统部件的光学子系统，该光学子系统被配置为在视觉上检测条形码。
9.实施例7所述的系统，其中，条形码检测部件包括被配置为通过测序来确定条形码的核酸测序部件。
10.实施例1至9中任一项所述的系统，还包括计算部件(例如，计算机)，该计算部件被配置为：将来自期望性质测定的结果与第一多个核酸序列的各个核酸序列关联；以及，基于所述关联，设计第二多个核酸序列，每个核酸序列对感兴趣的蛋白的进一步的序列变体编码。
11.实施例10所述的系统，其中，计算部件被进一步配置为将第二多个核酸序列的设计传输到核酸合成部件。
12.实施例1至11中任一项所述的系统，其中，微流体装置包括：壳体，该壳体包括底座和设置在所述底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室。
13.实施例12所述的系统，其中，微流体装置的微流体结构包括：用于第一液体介质的流动路径；以及多个物理隔绝坞。
14.实施例13所述的系统，其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞包括：围栏；以及通向流动路径的单个开口，并且其中，围栏包围被构造为保持悬浮在第二液体介质中的微物体的内部空间。
15.实施例14所述的系统，其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞还包括从开口延伸到围栏中的内壁。
16.实施例14或15所述的系统，其中，微流体装置的多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口被定向成使得没有任何部分是直接面向所述流动路径中的，由此，当通道包含第一液体介质的流并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在所述内部空间中的扩散混合。
17.实施例14到16中任一项所述的系统，其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞包括隔离区域和将隔离区域流体连接到流动路径的连接区域，并且其中，隔离区域是微流体装置中的未波及区域。
18.实施例17所述的系统，其中，连接区域包括通入流动路径中的近端开口和通入隔离区域中的远端开口，近端开口具有范围从大约20微米至大约100微米的宽度Wcon，并且其中，连接区域从近端开口到远端开口的长度Lcon是连接区域的近端开口的宽度Wcon的至少1.0倍。
19.实施例13至18中任一项所述的系统，其中，流动路径包括微流体通道，并且其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞通向所述微流体通道。
20.实施例1至19中任一项所述的系统，其中，微流体装置还包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中，第一电极是内部腔室的第一壁的部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
21.一种用于进化蛋白的过程，该过程包括：将第一核酸序列库设置在微流体装置内，其中，微流体装置包括：壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室，并且另外，其中，第一库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的蛋白序列(例如，感兴趣的原始蛋白序列，其可以是天然存在的感兴趣蛋白或非天然存在的蛋白，在任一情况下可选地具有限定的活性)的核酸序列的一个或多个变化；将表型报告物引入微流体装置中并将其设置在第一库的每个核酸序列附近，其中，表型报告物包括溶液相试剂和/或多个微物体，并且被配置为提供来自感兴趣的蛋白序列的表型读数；将试剂混合物引入微流体装置中并将其设置在第一库的每个核酸序列附近，其中，试剂混合物被配置为表达来自第一库的每个核酸序列的蛋白序列；表达来自第一库的每个核酸序列的相应蛋白序列；检测来自第一库的一个或多个核酸序列附近的区域的表型读数；从第一库识别出具有相应近端区域的单个核酸序列，该近端区域具有期望表型读数；以及确定第一库的识别出的核酸序列的核苷酸序列。
22.实施例21所述的过程，还包括：将第一库的各个核酸序列与在相应的附近区域中检测到的表型读数关联；以及设计第二核酸序列库，其中，第二库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化，第二库的每个核酸序列的一个或多个变化根据所述关联而选择。
23.实施例21或22所述的过程，其中，第一库的每个核酸序列链接到第一多个珠粒的相应珠粒。
24.实施例23所述的过程，其中，第一多个珠粒中的每个珠粒包括多个链接的核酸，每个链接的核酸包括编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列的相同变化。
25.实施例21至24中任一项所述的过程，其中所述过程还包括：将第一库的核酸序列设计为与编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列不同；合成第一库的核酸序列；以及可选地，将第一库的每个核酸序列连接到第一多个珠粒的相应珠粒，从而形成第一携带核酸的珠粒库。
26.实施例23至25中任一项所述的过程，其中，第一多个珠粒中的每个珠粒还包括相应的不同的条形码。
27.实施例26所述的过程，其中，不同的条形码包括不同的核酸序列。
28.实施例26或27所述的过程，其中，所述过程还包括在将第一核酸序列库设置在微流体装置中之后读取第一多个珠粒中的每个珠粒的条形码，从而识别每个珠粒及其相应的核酸序列在微流体装置内的位置。
29.实施例26或27所述的过程，其中，所述过程还包括读取第一多个珠粒中的每个珠粒的条形码(例如，在检测到表型读数之后)。
30.实施例21至29中任一项所述的过程，其中，所述过程还包括：将多个蛋白聚集珠粒设置在微流体装置内并将多个蛋白聚集珠粒中的一个或多个蛋白聚集珠粒设置在第一库的每个核酸序列附近，其中，多个蛋白聚集珠粒中的蛋白聚集珠粒特异性结合到(i)感兴趣的蛋白序列的表位或(ii)由第一库的每个核酸序列编码的蛋白标签(例如，表位标签)，以便在功能上被从其表达的相应蛋白序列包括。
31.实施例30所述的过程，还包括将从第一库的每个核酸序列所表达的相应蛋白捕获到在其附近设置的一个或多个蛋白聚集珠粒。
32.实施例30或31所述的过程，其中，所述过程还包括在表达蛋白序列之后使冲洗介质流经微流体装置，从而置换试剂混合物，并且其中，引入表型报告物并将其设置在第一多个核酸中的每个核酸附近在使冲洗介质流经微流体装置之后进行。
33.实施例32所述的过程，其中，在检测表型报告物之前使冲洗介质流经微流体装置。
34.实施例21至33中任一项所述的过程，其中，引入表型报告物并将其设置在第一多个核酸中的每个核酸附近在将试剂混合物设置在第一库的每个核酸序列附近之后进行。
35.实施例21至34中任一项所述的过程，其中，微流体装置的微流体结构包括：(i)用于第一液体介质的流动路径；和(ii)多个物理隔绝坞。
36.实施例35所述的过程，其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞包括：围栏；和通向流动路径的单个开口；其中，围栏包围内部空间，该内部空间被构造为保持悬浮在第二液体介质中的生物微物体。
37.实施例36所述的过程，其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞还包括从开口延伸到围栏中的内壁。
38.实施例36或37所述的过程，其中，微流体装置的多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口被定向成使得没有任何部分是直接面向流动路径中的，由此，当流动路径包含第一液体介质的流并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。
39.实施例21至38中任一项所述的过程，其中，微流体装置还包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中，第一电极是内部腔室的第一壁的部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
40.实施例35至38中任一项所述的过程，其中，将第一核酸序列库设置在微流体装置内包括将第一多个珠粒中的各个珠粒引入多个隔绝坞中的各个隔绝坞中。
41.实施例40所述的过程，其中，第一多个珠粒中的不多于一个珠粒被引入多个隔绝坞中的每个隔绝坞中。
42.实施例40或41所述的过程，其中，将表型报告物引入微流体装置中包括将多个微物体中的一个或多个微物体引入包含第一核酸序列库的核酸序列的各个隔绝坞中。
43.实施例21至42中任一项所述的过程，其中，感兴趣的蛋白包括酶。
44.实施例21至42中任一项所述的过程，其中，感兴趣的蛋白包括结合到细胞表面标记的域。
45.实施例44所述的过程，其中，所述细胞表面标记是细胞表面受体(例如，参与细胞间信号传递的受体)或糖蛋白。
46.实施例21至45中任一项所述的过程，其中，感兴趣的蛋白包括抗体(例如，单链抗体、纳米抗体等)。
47.实施例21至46中任一项所述的过程，其中，表型报告物包括溶液相试剂，该溶液相试剂在被感兴趣的蛋白接触时提供可检测信号(例如，试剂可以由感兴趣的蛋白切割，并且切割可能引起可检测光的发射)。
48.实施例21至46中任一项所述的过程，其中，表型报告物包括微物体，该微物体包括用于感兴趣的蛋白的结合位点、被配置为报告感兴趣的蛋白的功能的报告细胞、或提供用于感兴趣的蛋白的酶活性的酶衬底的微物体。
49.实施例21至48中任一项所述的过程，其中，将第一库的各个核酸序列与在相应的附近区域中检测到的表型读数关联通过第一计算机部件进行，第一计算机部件被配置为识别来自识别出的核酸序列的与感兴趣的蛋白的功能相比更加期望的所表达的蛋白的功能。
50.实施例49所述的过程，其中，设计第二核酸序列库由第二计算机部件基于所表达的蛋白功能与第一核酸序列库的核酸序列的关联来进行。
51.实施例50所述的过程，其中，第一计算机部件与第二计算机部件相同。
52.实施例47至51中任一项所述的过程，其中，第一计算机部件采用机器学习算法来执行关联。
53.实施例47至52中任一项所述的过程，其中，第二计算机部件采用机器学习算法来设计第二核酸序列库。
54.实施例21至53中任一项所述的过程，其中，试剂混合物包括无细胞蛋白表达反应混合物。
55.实施例35至54中任一项所述的过程，其中，引入试剂混合物包括使试剂混合物流入流动路径中并且允许试剂混合物扩散到隔绝坞中。
56.实施例21至55中任一项所述的过程，其中，第一(和/或第二)核酸序列库通过并行核酸合成仪合成。
57.实施例56所述的过程，其中，并行核酸合成仪是大规模并行核酸合成仪。
58.实施例56或57所述的过程，其中，并行核酸合成仪被配置为将多个长度短的合成核酸组装为较长的连体核酸。
59.实施例58所述的过程，其中，被配置为组装较长的连体核酸的并行核酸合成仪被进一步配置为并行地组装多个较长的连体核酸。
60.实施例22至59中任一项所述的过程，其中，第二核酸序列库中的每一个核酸序列链接到相应珠粒以形成第二携带核酸的珠粒库。
61.实施例22至60中任一项所述的过程，其中，使用第二核酸序列库代替第一核酸序列库重复实施例21至55中任一项所述的过程。
62.实施例61所述的过程，其中，设计并合成进一步的核酸序列库。
63.实施例62所述的过程，其中，进一步的核酸序列库的核酸序列链接到相应珠粒以形成进一步的携带核酸的珠粒库。
64.实施例62或63所述的过程，其中，使用进一步的核酸序列库代替第一核酸序列库进行实施例21至55中任一项所述的过程。
65.实施例21至64中任一项所述的过程，其中，第一核酸序列库包括编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域内的变化。
66.实施例65所述的过程，其中，编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域对产生感兴趣功能的蛋白的区域编码。
67.实施例66所述的过程，其中，子区域对感兴趣的蛋白的酶活性位点或结合位点(例如，抗原识别位点或蛋白-蛋白结合位点)编码。
68.实施例65至67中任一项所述的过程，其中，第一核酸序列库包括在编码感兴趣的蛋白的核酸序列的整个长度上的变化。
69.实施例65至68中任一项所述的过程，其中，第二核酸序列库和/或进一步的核酸序列库包括在编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域内的变化。
70.实施例69所述的过程，其中，编码感兴趣的蛋白的核酸序列的子区域对产生感兴趣功能的蛋白的区域编码。
71.实施例70所述的过程，其中，子区域对感兴趣的蛋白的酶活性位点或结合位点(例如，抗原识别位点或蛋白-蛋白结合位点)编码。
72.实施例69至71中任一项所述的过程，其中，第二核酸序列库和/或进一步的核酸序列库包括在编码感兴趣的蛋白的核酸序列的整个长度上的变化。
73.一种用于感兴趣的蛋白(例如，感兴趣的原始蛋白序列，其可以是天然存在的感兴趣的蛋白或非天然存在的蛋白，在任一情况下可选地具有限定的活性)的快速进化的试剂盒，所述试剂盒包括：微流体装置，其中，微流体装置包括：壳体，该壳体包括底座和设置在底座的表面上的微流体结构，其中，底座和微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室；以及表型报告物。
74.实施例73所述的试剂盒，其中，表型报告物包括当被感兴趣的蛋白接触时提供可检测信号的溶液相试剂(例如，试剂可以由感兴趣的蛋白切割，并且切割可以引起可检测光的发射)。
75.实施例73或74所述的试剂盒，其中，表型报告物包括：多个微物体，每个微物体被配置为提供来自感兴趣的蛋白序列的表型读数。
76.实施例75所述的试剂盒，其中，多个微物体中的微物体包括用于感兴趣的蛋白的结合位点，包括用于感兴趣的原始蛋白的酶活性的酶衬底，和/或是被配置为报告感兴趣的蛋白的功能的报告细胞。
77.实施例73至76中任一项所述的试剂盒，其中，微流体装置的微流体结构包括：(i)用于第一液体介质的流动路径；以及(ii)多个物理隔绝坞。
78.实施例77所述的试剂盒，其中，多个隔绝坞中的每个隔绝坞包括：围栏；以及通向流动路径的单个开口；其中，围栏包围被构造为保持悬浮在第二液体介质中的微物体的内部空间。
79.实施例78所述的试剂盒，其中，隔绝坞包括从开口延伸到围栏中的内壁。
80.实施例73至79中任一项所述的试剂盒，其中，微流体装置的多个隔绝坞中的每个隔绝坞的开口被定向成使得没有任何部分是直接面向通道的流动路径中的，由此，当通道包含第一液体介质的流并且隔绝坞包含第二液体介质时，第一液体介质向内部空间中的第二液体介质中的直接流动受阻，同时允许第一液体介质与第二液体介质在内部空间中的扩散混合。
81.实施例73至80中任一项所述的试剂盒，其中，微流体装置还包括DEP配置，该DEP配置包括：第一电极；电极活化衬底；以及第二电极，其中，第一电极是内部腔室的第一壁的部分，并且电极活化衬底和第二电极是内部腔室的第二壁的部分，并且其中，电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
82.实施例73至81中任一项所述的试剂盒，还包括用于在体外从核酸序列表达蛋白的试剂混合物。
83.实施例82所述的试剂盒，其中，试剂混合物是无细胞蛋白表达混合物。
84.实施例73至83中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括多个珠粒，每个珠粒被配置为结合到核酸序列。
85.实施例84所述的试剂盒，其中，多个珠粒中的每个珠粒包括唯一条形码。
86.实施例85所述的试剂盒，其中，唯一条形码是唯一核酸序列。
87.实施例73至86中任一项所述的试剂盒，其中，试剂盒还包括多个蛋白聚集珠粒。
88.实施例87所述的试剂盒，其中，多个蛋白聚集珠粒中的每个特异性结合感兴趣的原始蛋白序列的表位或蛋白标签(例如，表位标签)。
89.实施例73至88中任一项所述的试剂盒，还包括用于计算机部件或多个计算机部件的机器可读指令。
90.实施例89所述的试剂盒，其中，所述机器可读指令使计算机部件或多个计算机部件能够将核酸序列库的各个核酸序列和与各个核酸序列相关的表型关联；和/或设计核酸序列库，其中，该库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的原始蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化，并且可选地，其中，库设计是基于多个各个核酸序列和与所述各个核酸序列相关的表型之间的关联。
Claims (49)
1.一种用于快速蛋白进化的系统，包括：
微流体装置；以及
微流体系统部件，被配置为：
将多个珠粒输入到所述微流体装置中，所述多个珠粒中的每个珠粒包括(i)第一多个核酸序列中的一个核酸序列，以及(ii)条形码，其中，所述第一多个核酸序列中的每个核酸序列编码感兴趣的蛋白的序列变体；
在有助于表达由所述多个珠粒中的每个珠粒的所述一个核酸序列所编码的相应蛋白的条件下，孵育位于微流体装置内的所述多个珠粒，从而产生多个相应蛋白；以及
测定从所述多个珠粒的核酸序列产生的所述多个相应蛋白中的期望性质。
2.根据权利要求1所述的系统，还包括多个蛋白聚集珠粒，所述多个蛋白聚集珠粒特异性结合到所述感兴趣的蛋白的表位或蛋白标签。
3.根据权利要求1所述的系统，还包括核酸合成部件，所述核酸合成部件被配置为合成所述第一多个核酸序列。
4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述系统还包括珠粒制备部件，该珠粒制备部件被配置为将所述第一多个核酸序列中的每个核酸序列连接到所述多个珠粒中的一个珠粒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的系统，还包括条形码检测部件，该条形码检测部件被配置为将所述多个珠粒中的每个珠粒的核酸序列与所述多个珠粒中的相应珠粒在所述微流体装置内的位置关联。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，所述条形码检测部件包括所述微流体系统部件的光学子系统，该光学子系统被配置为在视觉上检测所述条形码。
7.根据权利要求5所述的系统，其中，所述条形码检测部件包括核酸测序部件，该核酸测序部件被配置为通过测序确定所述条形码。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的系统，还包括计算部件，该计算部件被配置为：
将来自期望性质测定的结果与所述第一多个核酸序列的各个核酸序列关联；以及，
基于所述关联，设计第二多个核酸序列，该第二多个核酸序列的每个核酸序列对感兴趣的蛋白的进一步的序列变体编码。
9.根据权利要求8所述的系统，其中，所述计算部件被进一步配置为将第二多个核酸序列的设计传达到所述核酸合成部件。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的系统，其中，所述微流体装置包括：
壳体，包括底座和设置在所述底座的表面上的微流体结构，其中，所述底座和所述微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室。
11.根据权利要求10所述的系统，其中，所述微流体装置的所述微流体结构包括：
用于第一液体介质的流动路径；以及
多个物理隔绝坞。
12.根据权利要求11所述的系统，其中，所述多个物理隔绝坞中的每个隔绝坞包括：
围栏；以及
通向所述流动路径的单个开口，并且
其中，所述围栏包围被构造为保持悬浮在第二液体介质中的微物体的内部空间。
13.根据权利要求11所述的系统，其中，所述多个物理隔绝坞中的每个隔绝坞包括隔离区域和将所述隔离区域流体连接到所述流动路径的连接区域，并且其中，所述隔离区域是所述微流体装置中的未波及区域。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的系统，其中，所述微流体装置还包括DEP配置，该DEP配置包括：
第一电极；
电极活化衬底；以及
第二电极，
其中，第一电极是所述内部腔室的第一壁的部分，并且所述电极活化衬底和第二电极是所述内部腔室的第二壁的部分，并且其中，所述电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
15.一种用于进化蛋白的处理，所述处理包括：
将第一核酸序列库设置在微流体装置内，其中，所述微流体装置包括：壳体，该壳体包括底座和设置在所述底座的表面上的微流体结构，其中，所述底座和所述微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室，并且进一步，其中，第一核酸序列库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化；
将表型报告物引入所述微流体装置中并将其设置在第一核酸序列库的每个核酸序列附近，其中，所述表型报告物包括溶液相试剂和/或多个微物体，并且被配置为提供来自感兴趣的蛋白序列的表型读数；
将试剂混合物引入所述微流体装置中并将其设置在第一核酸序列库的每个核酸序列附近，其中，所述试剂混合物被配置为表达来自第一核酸序列库的每个核酸序列的相应蛋白序列；
表达来自第一核酸序列库的每个核酸序列的相应蛋白序列；
检测来自第一核酸序列库的一个或多个核酸序列的附近区域的表型读数；
识别来自第一核酸序列库的具有相应的附近区域的各个核酸序列，该相应的附近区域具有期望的表型读数；以及
确定第一核酸序列库的识别出的核酸序列的核苷酸序列。
16.根据权利要求15所述的处理，还包括：
将第一核酸序列库的各个核酸序列与在相应的附近区域中检测到的表型读数关联；以及
设计第二核酸序列库，其中，第二核酸序列库的每个核酸序列包括来自编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列的一个或多个变化，第二核酸序列库的每个核酸序列的所述一个或多个变化是根据所述关联而选择的。
17.根据权利要求15所述的处理，其中，第一核酸序列库的每个核酸序列链接到第一多个珠粒的相应珠粒。
18.根据权利要求17所述的处理，其中，所述处理还包括：
将第一核酸序列库的核酸序列设计为与编码感兴趣的蛋白序列的核酸序列不同；
合成第一核酸序列库的核酸序列；以及
将第一核酸序列库的每个核酸序列连接到所述第一多个珠粒的相应珠粒，从而形成第一携带核酸的珠粒库。
19.根据权利要求17所述的处理，其中，所述第一多个珠粒中的每个珠粒还包括相应的不同的条形码。
20.根据权利要求19所述的处理，其中，所述处理还包括在将第一核酸序列库设置在所述微流体装置中之后，读取所述第一多个珠粒中的每个珠粒的条形码，从而识别每个珠粒及其相应的核酸序列在所述微流体装置内的位置。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，所述处理还包括：
将多个蛋白聚集珠粒设置在所述微流体装置内并将所述多个蛋白聚集珠粒中的一个或多个蛋白聚集珠粒设置在第一核酸序列库的每个核酸序列附近，
其中，所述多个蛋白聚集珠粒中的蛋白聚集珠粒特异性结合到(i)感兴趣的蛋白序列的表位或(ii)由第一核酸序列库的每个核酸序列编码的蛋白标签，以便在功能上被从每个核酸序列表达的相应蛋白序列所包括。
22.根据权利要求21所述的处理，还包括将从第一核酸序列库的每个核酸序列表达的相应蛋白捕获到在其附近设置的一个或多个蛋白聚集珠粒。
23.根据权利要求22所述的处理，其中，所述处理还包括在表达所述蛋白序列之后，使冲洗介质流经所述微流体装置，从而置换所述试剂混合物，并且其中，引入所述表型报告物并将其设置在第一多个核酸中的每个核酸附近在使所述冲洗介质流经所述微流体装置之后进行。
24.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，引入所述表型报告物并将其设置在第一多个核酸中的每个核酸附近在将所述试剂混合物设置在第一核酸序列库的每个核酸序列附近之后进行。
25.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，所述微流体装置的所述微流体结构包括：
(i)用于第一液体介质的流动路径；和
(ii)多个物理隔绝坞。
26.根据权利要求25所述的处理，其中，所述多个物理隔绝坞中的每个隔绝坞包括：
围栏；以及
通向所述流动路径的单个开口；
其中，所述围栏包围内部空间，该内部空间被构造为保持悬浮在第二液体介质中的生物微物体。
27.根据权利要求24所述的处理，其中，所述微流体装置还包括DEP配置，该DEP配置包括：
第一电极；
电极活化衬底；以及
第二电极，
其中，第一电极是所述内部腔室的第一壁的部分，并且所述电极活化衬底和第二电极是所述内部腔室的第二壁的部分，并且其中，所述电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
28.根据权利要求25所述的处理，其中，将第一核酸序列库设置在所述微流体装置内包括将第一多个珠粒中的各个珠粒引入所述多个隔绝坞中的各个隔绝坞中。
29.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，所述感兴趣的蛋白序列包括酶。
30.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，所述感兴趣的蛋白序列包括结合到细胞表面标记的域。
31.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，所述表型报告物包括溶液相试剂，该溶液相试剂在被所述感兴趣的蛋白序列接触时提供能够检测的信号。
32.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，所述表型报告物包括微物体，该微物体包括用于感兴趣的原始蛋白序列的结合位点、被配置为报告感兴趣的原始蛋白序列的功能的报告细胞、或提供用于感兴趣的蛋白序列的酶活性的酶衬底的微物体。
33.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，将第一核酸序列库的各个核酸序列与在相应的附近区域中检测到的表型读数关联由第一计算机部件进行，第一计算机部件被配置为识别来自识别出的核酸序列的与感兴趣的蛋白序列的功能相比更加期望的所表达的相应蛋白序列的功能，其中，第一计算机部件采用机器学习算法来执行所述关联。
34.根据权利要求33所述的处理，其中，设计第二核酸序列库由第二计算机部件基于所表达的蛋白功能与第一核酸序列库的核酸序列的关联来进行。
35.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，所述试剂混合物包括无细胞蛋白表达反应混合物。
36.根据权利要求16所述的处理，其中，第二核酸序列库中的每一个核酸序列链接到相应珠粒，以形成第二携带核酸的珠粒库。
37.根据权利要求15至20中任一项所述的处理，其中，第一核酸序列库包括在编码所述感兴趣的蛋白序列的核酸序列的子区域内的变化，其中，编码所述感兴趣的蛋白序列的核酸序列的子区域对产生感兴趣功能的蛋白的区域编码。
38.根据权利要求37所述的处理，其中，所述子区域对感兴趣的原始蛋白序列的酶活性位点或结合位点编码。
39.一种用于感兴趣的蛋白的快速进化的试剂盒，所述试剂盒包括：
微流体装置，其中，所述微流体装置包括：壳体，该壳体包括底座和设置在所述底座的表面上的微流体结构，其中，所述底座和所述微流体结构限定用于保持第一液体介质和悬浮在其中的微物体的内部腔室；以及
表型报告物。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中，所述表型报告物包括当被所述感兴趣的蛋白接触时提供能够检测的信号的溶液相试剂。
41.根据权利要求39所述的试剂盒，其中，所述表型报告物包括：多个微物体，每个微物体被配置为提供来自所述感兴趣的蛋白的表型读数。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中，所述多个微物体中的微物体包括用于所述感兴趣的蛋白的结合位点，和/或包括用于所述感兴趣的蛋白的酶活性的酶衬底，和/或是被配置为报告所述感兴趣的蛋白的功能的报告细胞。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒，其中，所述微流体装置的所述微流体结构包括：
(i)用于第一液体介质的流动路径；以及
(ii)多个物理隔绝坞。
44.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒，其中，所述微流体装置还包括DEP配置，该DEP配置包括：
第一电极；
电极活化衬底；以及
第二电极，
其中，第一电极是所述内部腔室的第一壁的部分，并且所述电极活化衬底和第二电极是所述内部腔室的第二壁的部分，并且其中，所述电极活化衬底包括光电导材料、半导体集成电路或光电晶体管。
45.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒，还包括用于在体外从核酸序列表达蛋白的试剂混合物。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中，所述试剂混合物是无细胞蛋白表达混合物。
47.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括多个珠粒，每个珠粒被配置为结合到核酸序列。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中，所述多个珠粒中的每个珠粒包括唯一条形码。
49.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括多个蛋白聚集珠粒，其中，所述多个蛋白聚集珠粒中的每个蛋白聚集珠粒特异性结合感兴趣的蛋白序列的表位或表位标签。
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