CN113188981A - 一种多因子细胞因子自动分析方法 - Google Patents

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Abstract

一种多因子细胞因子自动分析方法：提取FCS格式或LMD格式文件中的流式细胞数据；对所有细胞的FSC‑H去除细胞碎片；将有效细胞分为若干个细胞群，将若干个细胞群重新分为两个细胞群；将两个细胞群分为与所检测细胞因子个数相同的若干个细胞群；对每个细胞群内所有细胞抗体APC的荧光强度进行核密度概率密度函数曲线的峰个数检测；对细胞群继续进行分群；将细胞点数少于60的细胞群与周围距离最近的细胞群进行合并；将每个细胞群与所检测的细胞因子进行对应；对每个细胞群内所有细胞的PE抗体的荧光强度进行离群点检测，并去除离群点；计算每个细胞因子的细胞群PE抗体的平均荧光强度。本发明能够有效去除噪音干扰和强度波动获取细胞群的准确荧光强度。

Description

一种多因子细胞因子自动分析方法
技术领域
本发明涉及一种细胞因子分析方法。特别是涉及一种多因子细胞因子自动分析方法。
背景技术
细胞因子是一种在机体内十分微量，主要是通过相应的细胞受体起作用的，一般分子量低于10kd，多数分布在3kd左右的多肽，通过血液或淋巴液进行传递，通过自分泌、内分泌或旁分泌进行细胞之间的通讯和信号交流。细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有效手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。
细胞因子流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。目前多因子细胞因子的分析需要通过在2维散点图上面将不同标记的微球群区分开来,传统方法通过固定范围或者人工手动圈群的方法实现。
传统的细胞因子流式分析法存在的以下问题：
1、每个数据内二维散点图的分布不尽相同，所以按照固定范围圈选细胞会在一定程度上影响细胞分类的效果；
2、人工圈选则会因为操作人员的主管因素影响细胞分类结果，同时也会需要人工成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种可以在节约人力成本的同时节约时间成本，能够自动获取细胞群的准确荧光强度的多因子细胞因子自动分析方法。
本发明所采用的技术方案是：一种多因子细胞因子自动分析方法，包括如下步骤：
1)提取FCS格式或LMD格式文件中的流式细胞数据；流式细胞数据包含：每个流式细胞前向角散射光FSC数据、侧向散射光SSC数据及若干抗体对应的荧光强度值；
2)对所有细胞的FSC-H采用核密度估计方法，去除细胞碎片；
3)对去除细胞碎片后流式细胞的FSC-H、SSC-H及抗体APC的荧光强度值，采用聚类的方法，将有效细胞分为若干个细胞群，将各个细胞群FSC-H的平均值与分群阈值进行比较，将若干个细胞群重新分为两个细胞群；
4)分别对两个细胞群内所有细胞抗体APC的荧光强度采用高斯混合模型的聚类算法，将两个细胞群分为与所检测细胞因子个数相同的若干个细胞群；
5)利用核密度概率密度函数计算公式对每个细胞群内所有细胞抗体APC的荧光强度进行计算核密度概率密度函数，对核密度概率密度函数曲线的峰个数进行检测，如果峰的个数大于1，则进入步骤6)，否则进入步骤7)；
6)对细胞群FSC-H采用核密度概率密度函数计算公式计算核密度概率密度函数，并根据核密度概率密度函数的波峰和波谷对细胞群继续进行分群；
7)检测所有细胞群内细胞点数，将细胞点数少于60的细胞群与周围距离最近的细胞群进行合并；
8)根据每个细胞群抗体APC的平均荧光强度，将每个细胞群与所检测的细胞因子进行对应；
9)采用高斯混合模型对每个细胞群内所有细胞的PE抗体的荧光强度进行离群点检测，并去除离群点；
10)计算每个细胞因子的细胞群PE抗体的平均荧光强度。
本发明的一种多因子细胞因子自动分析方法，首先可以对上传待分析的多个数据进行并行运算，每个文件分析时间约10s，可以在节约人力成本的同时节约时间成本；其次对所有的数据进行更加客观性的分析，能够准确抓取分离出目标细胞群,不会使细胞分群受到人为主观因素的影响；最后能够有效去除噪音干扰和强度波动，从而自动获取标志细胞群的准确荧光强度。
附图说明
图1是本发明一种多因子细胞因子自动分析方法的流程图；
图2是流式检测图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的一种多因子细胞因子自动分析方法做出详细说明。
本发明的一种多因子细胞因子自动分析方法，通过基于GMM(Gaussian-Mixed-Model)模型的分群聚类算法,GMM即高斯混合模型，通过多个高斯分布模型的加权组合，可以用来拟合任意类型的分布。通过在指定维度上采用GMM分布拟合细胞分布，对细胞进行聚类分析,由此能够准确抓取分离出目标细胞群,并有效去除噪音干扰和强度波动,从而自动获取标志细胞群的准确荧光强度。
如图1所示，本发明的一种多因子细胞因子自动分析方法，包括如下步骤：
1)提取FCS格式或LMD格式文件中的流式细胞数据；流式细胞数据包含：每个流式细胞前向角散射光FSC数据、侧向散射光SSC数据及若干抗体对应的荧光强度值；
2)对所有细胞的FSC-H采用核密度估计方法，去除细胞碎片；
所述的对所有细胞的FSC-H采用核密度估计方法，去除细胞碎片，核密度概率密度函数计算公式如下：
Figure BDA0003048674820000021
其中，f为核密度概率密度函数，fschi为i个流式细胞的FSC-H，i＝1...n；h为带宽，默认设为10；K为核函数，采用高斯核函数，计算公式：
Figure BDA0003048674820000022
利用python的scipy.signal模块中的函数find_peaks进行对所有流式细胞FSC-H值计算出的核密度概率密度函数曲线进行峰值检测，峰值检测时将输入参数prominence和height的值均设置为核密度概率密度最大值×0.1，检测结果为该核密度概率密度函数曲线的若干个峰值及谷值，如果检测结果包含两个以上峰值，则将所有FSC-H值小于最小谷值的流式细胞划为碎片细胞，所述的最小谷值是指大于最小峰值的首个谷值。
3)对去除细胞碎片后流式细胞的FSC-H、SSC-H及抗体APC的荧光强度值，采用聚类的方法，将有效细胞分为若干个细胞群，将各个细胞群FSC-H的平均值与分群阈值进行比较，将若干个细胞群重新分为两个细胞群；包括：
(3.1)聚类方法以欧氏距离为基础，首先选择一个细胞点作为第1个细胞群的聚类中心，再选择一个与第1个细胞群的聚类中心欧氏距离最大的细胞点作为第2个细胞群的聚类中心，然后以此类推，确定所有细胞群的聚类中心；最后计算其余未作为聚类中心的细胞点与各个细胞群聚类中心的欧氏距离，按照最小距离原则归入距离最小的细胞群，从而将有效细胞分为若干个细胞群；
(3.2)然后对所有有效细胞点的FSC-H采用核密度估计算法，计算出有效细胞点的FSC-H的核密度概率密度函数，利用python的scipy.signal模块中的函数find_peaks对每个细胞群的FSC-H核密度概率密度函数曲线进行峰值检测，峰值检测时输入参数prominence和height的值均设置为核密度概率密度最大值×0.1，检测结果为该核密度概率密度函数曲线的若干个峰值及谷值，通过峰值之间的大小比较，找到最大的两个峰值之间的最小谷值，并通过核密度概率密度函数计算出最小谷值所对应的FSC-H值作为分群阈值；
(3.3)计算每个细胞群FSC-H的平均值，并将每群细胞FSC-H平均值与分群阈值进行比较，将FSC-H平均值大于分群阈值的所有细胞群分作为一个新的细胞群，将FSC-H平均值小于分群阈值的所有细胞群分作为为另一个新的细胞群。
4)分别对两个细胞群内所有细胞抗体APC的荧光强度采用高斯混合模型的聚类算法，将两个细胞群分为与所检测细胞因子个数相同的若干个细胞群；
具体是直接使用Python scikit-learn机器学习算法库中高斯混合模型的函数GaussianMixtureModel完成的，分别向高斯混合模型输入每个细胞群内所有细胞抗体APC荧光强度值，并设置参数n_components为细胞因子数，输出为每个细胞所属的细胞群。
高斯混合模型是一种概率式的聚类方法。根据指定的细胞因子数k，假定细胞群内每个细胞抗体APC的荧光强度值均由k个混合多元高斯分布组合成；对每个细胞利用最大期望算法进行参数估计，得到每个细胞的每一个混合高斯分布的均值向量，协方差矩阵和混合系数；根据贝叶斯定理计算出每个细胞属于每一个细胞群的后验概率，并将各细胞分别划分到对应的后验概率最大的细胞群中。
5)利用核密度概率密度函数计算公式对每个细胞群内所有细胞抗体APC的荧光强度进行计算核密度概率密度函数，对核密度概率密度函数曲线的峰个数进行检测，如果峰的个数大于1，则进入步骤6)，否则进入步骤7)；包括
(5.1)利用核密度概率密度函数计算公式计算每个细胞群内细胞抗体APC的荧光强度的核密度概率密度函数；
(5.2)然后利用python的scipy.signal模块中的函数find_peaks对每个核密度概率密度函数曲线进行峰值检测，峰值检测时输入参数prominence和height的值均设置为核密度概率密度最大值×0.1，检测结果为该核密度概率密度函数曲线的若干个峰值及谷值；
(5.3)检测结果中如果峰的数量大于1，则按照峰的数量对细胞群继续分群，利用核密度概率密度函数根据每两个波峰之间波谷的谷值计算出谷值对应的抗体APC的荧光强度值作为分群阈值，将每个细胞群内细胞抗体APC的荧光强度分别与分群的阈值进行比较，大于阈值的细胞分进一个新的细胞群，小于阈值的细胞分为另一个新的细胞群；检测结果中如果峰的数量等于1，则不继续分群。
6)对细胞群FSC-H采用核密度概率密度函数计算公式计算核密度概率密度函数，并根据核密度概率密度函数的波峰和波谷对细胞群继续进行分群；
7)检测所有细胞群内细胞点数，将细胞点数少于60的细胞群与周围距离最近的细胞群进行合并；其中所述的合并，包括：
(7.1)计算每个细胞群内所有细胞APC抗体的平均荧光强度，计算公式如下：
Figure BDA0003048674820000041
其中，mfiapc为细胞群抗体APC的平均荧光强度，fiapci为第i个细胞的抗体APC的荧光强度，n为细胞群内细胞个数；
(7.2)将每两群细胞的APC抗体的平均荧光强度的差的绝对值作为该两群细胞之间的距离d，计算公式如下：
d＝|mfiapc1-mfiapc2|
其中，mfiapc1为第一个细胞群APC抗体的平均荧光强度，mfiapc2为第二个细胞群APC抗体的平均荧光强度；
(7.3)分别计算需要合并的每个细胞群与其余各细胞群之间的距离，通过比较，分别确定其余各细胞群中与每个需要合并的细胞群距离最小的细胞群，将需要合并的细胞群和与自己距离最小的细胞群合并，得到新的细胞群，使得最终的细胞群数量与细胞因子数量相同。
8)根据每个细胞群抗体APC的平均荧光强度，将每个细胞群与所检测的细胞因子进行对应；首先根据每个细胞群细胞抗体APC的荧光强度，计算该细胞群抗体APC的平均荧光强度，并按照由小到大进行排序，然后根据不同细胞因子APC平均荧光强度的由小到大的排序，按照排序将细胞群与所检测的细胞因子进行匹配。
9)采用高斯混合模型对每个细胞群内所有细胞的PE抗体的荧光强度进行离群点检测，并去除离群点；
是利用Python scikit-learn机器学习算法库的扩展模块集scikit-lego 0.3.0中利用高斯混合模型检测离群点的函数GMMOutlierDetector，对该函数GMMOutlierDetector输入每个细胞群抗体PE的荧光强度，设置参数n_components为2，threshold默认为0.85,method则采用分位数的计算方式quantile，输出为细胞群每个细胞是否属于离群点，并剔除每个细胞群内的离群点。
10)计算每个细胞因子的细胞群PE抗体的平均荧光强度。
所述的计算每个细胞因子的细胞群在PE维度上的平均荧光强度，公式如下：
Figure BDA0003048674820000051
其中，mfipe为细胞群抗体PE的平均荧光强度，fipei为第i个细胞的抗体PE的荧光强度，n为细胞群内细胞个数。

Claims (9)

1.一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取FCS格式或LMD格式文件中的流式细胞数据；流式细胞数据包含：每个流式细胞前向角散射光FSC数据、侧向散射光SSC数据及若干抗体对应的荧光强度值；
2)对所有细胞的FSC-H采用核密度估计方法，去除细胞碎片；
3)对去除细胞碎片后流式细胞的FSC-H、SSC-H及抗体APC的荧光强度值，采用聚类的方法，将有效细胞分为若干个细胞群，将各个细胞群FSC-H的平均值与分群阈值进行比较，将若干个细胞群重新分为两个细胞群；
4)分别对两个细胞群内所有细胞抗体APC的荧光强度采用高斯混合模型的聚类算法，将两个细胞群分为与所检测细胞因子个数相同的若干个细胞群；
5)利用核密度概率密度函数计算公式对每个细胞群内所有细胞抗体APC的荧光强度进行计算核密度概率密度函数，对核密度概率密度函数曲线的峰个数进行检测，如果峰的个数大于1，则进入步骤6)，否则进入步骤7)；
6)对细胞群FSC-H采用核密度概率密度函数计算公式计算核密度概率密度函数，并根据核密度概率密度函数的波峰和波谷对细胞群继续进行分群；
7)检测所有细胞群内细胞点数，将细胞点数少于60的细胞群与周围距离最近的细胞群进行合并；
8)根据每个细胞群抗体APC的平均荧光强度，将每个细胞群与所检测的细胞因子进行对应；
9)采用高斯混合模型对每个细胞群内所有细胞的PE抗体的荧光强度进行离群点检测，并去除离群点；
10)计算每个细胞因子的细胞群PE抗体的平均荧光强度。
2.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤2)所述的对所有细胞的FSC-H采用核密度估计方法，去除细胞碎片，核密度概率密度函数计算公式如下：
Figure FDA0003048674810000011
其中，f为核密度概率密度函数，fschi为i个流式细胞的FSC-H，i＝1...n；h为带宽，默认设为10；K为核函数，采用高斯核函数，计算公式：
Figure FDA0003048674810000012
利用python的scipy.signal模块中的函数find_peaks进行对所有流式细胞FSC-H值计算出的核密度概率密度函数曲线进行峰值检测，峰值检测时将输入参数prominence和height的值均设置为核密度概率密度最大值×0.1，检测结果为该核密度概率密度函数曲线的若干个峰值及谷值，如果检测结果包含两个以上峰值，则将所有FSC-H值小于最小谷值的流式细胞划为碎片细胞，所述的最小谷值是指大于最小峰值的首个谷值。
3.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤3)包括：
(3.1)聚类方法以欧氏距离为基础，首先选择一个细胞点作为第1个细胞群的聚类中心，再选择一个与第1个细胞群的聚类中心欧氏距离最大的细胞点作为第2个细胞群的聚类中心，然后以此类推，确定所有细胞群的聚类中心；最后计算其余未作为聚类中心的细胞点与各个细胞群聚类中心的欧氏距离，按照最小距离原则归入距离最小的细胞群，从而将有效细胞分为若干个细胞群；
(3.2)然后对所有有效细胞点的FSC-H采用核密度估计算法，计算出有效细胞点的FSC-H的核密度概率密度函数，利用python的scipy.signal模块中的函数find_peaks对每个细胞群的FSC-H核密度概率密度函数曲线进行峰值检测，峰值检测时输入参数prominence和height的值均设置为核密度概率密度最大值×0.1，检测结果为该核密度概率密度函数曲线的若干个峰值及谷值，通过峰值之间的大小比较，找到最大的两个峰值之间的最小谷值，并通过核密度概率密度函数计算出最小谷值所对应的FSC-H值作为分群阈值；
(3.3)计算每个细胞群FSC-H的平均值，并将每群细胞FSC-H平均值与分群阈值进行比较，将FSC-H平均值大于分群阈值的所有细胞群分作为一个新的细胞群，将FSC-H平均值小于分群阈值的所有细胞群分作为为另一个新的细胞群。
4.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤4)是直接使用Python scikit-learn机器学习算法库中高斯混合模型的函数GaussianMixtureModel完成的，分别向高斯混合模型输入每个细胞群内所有细胞抗体APC荧光强度值，并设置参数n_components为细胞因子数，输出为每个细胞所属的细胞群。
5.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤5)包括
(5.1)利用核密度概率密度函数计算公式计算每个细胞群内细胞抗体APC的荧光强度的核密度概率密度函数；
(5.2)然后利用python的scipy.signal模块中的函数find_peaks对每个核密度概率密度函数曲线进行峰值检测，峰值检测时输入参数prominence和height的值均设置为核密度概率密度最大值×0.1，检测结果为该核密度概率密度函数曲线的若干个峰值及谷值；
(5.3)检测结果中如果峰的数量大于1，则按照峰的数量对细胞群继续分群，利用核密度概率密度函数根据每两个波峰之间波谷的谷值计算出谷值对应的抗体APC的荧光强度值作为分群阈值，将每个细胞群内细胞抗体APC的荧光强度分别与分群的阈值进行比较，大于阈值的细胞分进一个新的细胞群，小于阈值的细胞分为另一个新的细胞群；检测结果中如果峰的数量等于1，则不继续分群。
6.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤7)中所述的合并，包括：
(7.1)计算每个细胞群内所有细胞APC抗体的平均荧光强度，计算公式如下：
Figure FDA0003048674810000031
其中，mfiapc为细胞群抗体APC的平均荧光强度，fiapci为第i个细胞的抗体APC的荧光强度，n为细胞群内细胞个数；
(7.2)将每两群细胞的APC抗体的平均荧光强度的差的绝对值作为该两群细胞之间的距离d，计算公式如下：
d＝|mfiapc1-mfiapc2|
其中，mfiapc1为第一个细胞群APC抗体的平均荧光强度，mfiapc2为第二个细胞群APC抗体的平均荧光强度；
(7.3)分别计算需要合并的每个细胞群与其余各细胞群之间的距离，通过比较，分别确定其余各细胞群中与每个需要合并的细胞群距离最小的细胞群，将需要合并的细胞群和与自己距离最小的细胞群合并，得到新的细胞群，使得最终的细胞群数量与细胞因子数量相同。
7.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤8)是：首先根据每个细胞群细胞抗体APC的荧光强度，计算该细胞群抗体APC的平均荧光强度，并按照由小到大进行排序，然后根据不同细胞因子APC平均荧光强度的由小到大的排序，按照排序将细胞群与所检测的细胞因子进行匹配。
8.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤9)是利用Python scikit-learn机器学习算法库的扩展模块集scikit-lego 0.3.0中利用高斯混合模型检测离群点的函数GMMOutlierDetector，对该函数GMMOutlierDetector输入每个细胞群抗体PE的荧光强度，设置参数n_components为2，threshold默认为0.85,method则采用分位数的计算方式quantile，输出为细胞群每个细胞是否属于离群点，并剔除每个细胞群内的离群点。
9.根据权利要求1所述的一种多因子细胞因子自动分析方法，其特征在于，步骤10)所述的计算每个细胞因子的细胞群在PE维度上的平均荧光强度，公式如下：
Figure FDA0003048674810000032
其中，mfipe为细胞群抗体PE的平均荧光强度，fipei为第i个细胞的抗体PE的荧光强度，n为细胞群内细胞个数。
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