CN113185578A - 一种模块化多肽-aie探针mp及其合成方法、包含其的试剂盒 - Google Patents

一种模块化多肽-aie探针mp及其合成方法、包含其的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种模块化多肽‑AIE探针MP的合成方法，包括以下步骤：将溴化亚铜和AIE分子PyTPA分别溶于二甲基亚砜中，得到溴化亚铜的二甲基亚砜溶液和PyTPA的二甲基亚砜溶液；将多肽溶于去离子水中，在氮气氛围下，加入溴化亚铜的二甲基亚砜溶液、PyTPA的二甲基亚砜溶液和抗坏血酸钠水溶液，恒温反应，得到粗产物；将粗产物进行高效液相色谱纯化，即得到模块化多肽‑AIE探针MP。利用本发明提供的模块化多肽‑AIE探针MP与滑动基底(SLIPS)上的纳米小球自组装成的光子晶体的组合策略，可以更加精准地定量化检测肿瘤标志物MMP‑2,具有检测时间短、灵敏度高、线性范围广、高通量同时检测等优势，对生物分析和疾病诊断有着重要的应用价值。

Description

一种模块化多肽-AIE探针MP及其合成方法、包含其的试剂盒
技术领域
本发明属于荧光分析和界面功能材料应用领域，具体涉及一种模块化多肽-AIE探针MP及其合成方法、包含其的试剂盒。
背景技术
基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)广泛分布在生物体内，参与重要的生理过程，如降解和重塑细胞外基质、炎症、癌症发生等过程。MMP-2在肿瘤的发展过程中扮演着重要的角色，主要通过降解癌细胞周围环境中的基质，促进新生血管的形成及调节细胞之间黏附等作用来促使癌细胞的转移。目前，已经发现在很多癌症中的MMP-2呈现出高表达的状态，如乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等。此外，大量的医学文献已经证明癌症患者血清中MMP-2、MMP-9与肿瘤的侵袭关系密切，可以用于肿瘤的诊断、鉴别、以及预后评估。
目前检测MMP-2的分析方法主要有比色法、化学发光、酶联免疫吸附测定、表面等离子体共振等。模块化多肽-AIE探针MP对MMP-2呈现出较高的特异性和灵敏度，还呈现出低的荧光背景信号和优异的光稳定性。在MMP-2的存在下，模块化多肽-AIE探针MP中的酶切单元被裂解，从而释放出亲水的多肽残基和AIE荧光团的残基，由于AIE分子的亲疏水的改变从而导致了AIE分子的聚集，开启了荧光信号。一方面，通过界面材料上的光子晶体的自组装，光子晶体中的慢光子效应可以选择性地提升有效荧光信号比；另一方面，样品溶液在滑动基底上的富集效应可以使AIE分子更加聚集在光子晶体表面，进一步放大荧光信号。此外，高通量微孔板的制备可以进一步使用该组合策略实现对MMP-2的高通量、高特异性、高灵敏度的检测。这种组合策略对生物分析、疾病诊断有着较大的应用前景和实用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种MMP-2响应的模块化多肽-AIE探针MP，还提供了该模块化多肽-AIE探针MP的合成方法，以及利用该模块化多肽-AIE探针MP进行荧光检测的方法。
本发明提供一种模块化多肽-AIE探针MP，其结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003038254580000021
式Ⅰ中，AA表示精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的任一种或多种的组合，n的取值为6-40。
本发明还提供了上述模块化多肽-AIE探针MP的合成方法，包括以下步骤：
S101，将溴化亚铜和AIE分子PyTPA分别溶于二甲基亚砜中，得到溴化亚铜的二甲基亚砜溶液和PyTPA的二甲基亚砜溶液；
S102，将多肽溶于去离子水中，在氮气氛围下，加入溴化亚铜的二甲基亚砜溶液、PyTPA的二甲基亚砜溶液和抗坏血酸钠水溶液，恒温反应，得到粗产物；
S103，将粗产物进行高效液相色谱纯化，即得到模块化多肽-AIE探针MP。
进一步地，所述多肽的序列为：N端-C端：(AA)n-GG-PLGLAG-Pra-NH2；AA表示精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的任一种或多种的组合，n的取值为6～40。
进一步地，酶切单元PLGLAG位置可为多肽亲水单元和AIE分子中间的任意位置。
进一步地，步骤S102中，恒温反应的温度条件为25～45℃。
进一步地，步骤S103中，高效液相色谱纯化的条件为：液相色谱柱(5μm,4.6*250mm)，紫外检测波长为254nm，流速2mL/min，以乙腈/水为流动相进行梯度洗脱：乙腈/水中各含有0.1％三氟乙酸，0-20min 20％-60％(体积百分比)乙腈，20-30min 60％-90％(体积百分比)乙腈，30-45min 90％-100％(体积百分比)乙腈。
本发明还提供了利用上述模块化多肽-AIE探针MP荧光检测MMP-2的方法，包括以下步骤：
S201，MMP-2样品的激活：将对氨基苯汞乙酸盐(APMA)和MMP-2样品溶液加入到TCNB缓冲液中，在37℃水浴中温和摇动孵育，得到活化的MMP-2样品；
S202，荧光检测：将活化的MMP-2样品和模块化多肽-AIE探针MP加入离心管中在37℃下孵育20～25min，之后在80℃下灭活3～5min，向灭活后的MMP-2样品和模块化多肽-AIE探针MP的混合溶液中添加聚四苯乙烯制成的纳米小球，在基底上自组装完成后进行荧光测量。
进一步地，TCNB缓冲液的配方为：100mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl和0.05％(质量体积百分比)活性剂聚氧乙烯月桂醚Brij-35；TCNB缓冲液的pH为7.5。配制步骤为：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.0285g，CaCl2 0.2775g，NaCl 2.1915g，活性剂Brij-350.1250g，加水溶解后，用0.1mol/L的HCl溶液调节pH值为7.5，然后置于250mL容量瓶定容至250mL。
进一步地，步骤S202中，使用的基底为光子晶体滑动基底或MMP-2高通量检测器件。
进一步地，使用光子晶体滑动基底进行荧光检测时的荧光光谱仪测试条件荧光光谱仪测试条件(固体)为λex＝453nm，狭缝：1/3nm，长波长滤光片(>480nm)。
进一步地，使用MMP-2高通量检测器件进行荧光检测时的测试条件为λex＝453nm，λem＝650nm。
进一步地，光子晶体滑动基底的制备过程为：在干净的基材上镀一层平展的特氟龙薄膜，利用油相浸润，得到滑动基底；将光子晶体乳胶悬浮液缓慢滴加于滑动基底上，即得到光子晶体滑动基底；经油相润湿后得到的滑动基底的接触角表征范围为90°～120°；光子晶体滑动基底主要从两个方面对有效的荧光信号进行处理：(1)光子晶体的慢光子效应可以被用来对有效的荧光信号进行放大；(2)浸润性滑动基底可以通过三相线的变化来富集溶液中的物质；由于光子晶体的荧光放大效应和滑动基底的靶标富集作用，进而优化了探针MP对MMP-2的检测信号，这使得不同浓度的MMP-2的荧光信号得以准确地区分。
进一步地，制备光子晶体滑动基底使用的基材为玻璃片、塑料片、金属片、陶瓷片、木片、织布或滤纸中的任一种；油相为润滑油、硅油、机械油、聚酯或合成酯中的任一种；光子晶体乳胶悬浮液的浓度为0.0001wt％～10wt％。优选地，光子晶体乳胶悬浮液的浓度为0.01wt％～0.1wt％，单分散粒径直径可为100nm～1000nm。
进一步地，MMP-2高通量检测器件的制备过程为：利用冲压模具将特氟龙薄膜冲压成圆形薄膜；随后置于油相中浸泡使圆形的特氟龙薄膜附着一层油膜；然后将其填充在微孔板的底部，再将光子晶体乳胶悬浮液缓慢滴加于微孔板上，即得到MMP-2高通量检测器件；模块化多肽-AIE探针MP和MMP-2高通量检测器件结合进行荧光检测具有以下优点：抗干扰性好、灵敏度高，节约试剂，易于制备与保存，对生物分析、疾病诊断和医学临床分析有着重要的意义。
进一步地，油相为润滑油、硅油、机械油、聚酯或合成酯中的任一种；微孔板的规格为386孔、96孔、48孔、24孔或6孔，圆孔的直径为1mm～20mm。光子晶体乳胶悬浮液的浓度为0.0001wt％～10wt％。优选地，光子晶体乳胶悬浮液的浓度为0.01wt％～0.1wt％，单分散粒径直径可为100nm～1000nm。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括100mM对氨基苯汞乙酸盐的DMSO溶液、TCNB缓冲液、标准品MMP-2、模块化多肽-AIE探针MP、MMP-2高通量检测器件。
进一步地，试剂盒内的MMP-2高通量检测器件组装成具有5种光子禁带，5种光子禁带的反射峰依次为458nm、486nm、531nm、618nm、672nm，其中光子禁带为618nm的光子晶体具有最佳的信号放大。
本发明提供的模块化多肽-AIE探针MP通过多肽序列与含有叠氮(-N3)的AIE分子PyTPA通过“点击”反应共价连接制得，其包括亲水单元、MMP-2的酶切单元和AIE分子共价连接单元，亲水单元为氨基酸组成的多肽序列，多肽序列中的Pra可以更改为其它具有AIE效应的荧光分子，其发射波长覆盖于400nm～1200nm。
利用本发明的检测方法，可配置一系列浓度梯度靶标检测液和待检测浓度检测液进行同一条件(温度和时间)下荧光强度的对比，从而定量分析待测液中检测物的浓度。
利用本发明提供的模块化多肽-AIE探针MP与滑动基底(SLIPS)上的纳米小球自组装成的光子晶体的组合策略，可以更加精准地定量化检测肿瘤标志物MMP-2(Matrixmetalloproteinase 2),具有检测时间短、灵敏度高、线性范围广、高通量同时检测等优势，对生物分析和疾病诊断有着重要的应用价值。模块化多肽-AIE探针MP对MMP-2具有较高的特异性响应，在MMP-2的存在下，亲水性探针MP被切成亲水性的多肽残基和疏水性的AIE残基，该探针MP由于疏水性的增加导致AIE残基的聚集使荧光增强；本发明的模块化多肽-AIE探针MP对MMP-2的检测限浓度可低至3.6ng/mL，其检测范围为3.6～1600ng/mL。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的模块化多肽-AIE探针MP的结构式。
图2为本发明实施例1提供的模块化多肽-AIE探针MP的质谱表征图。
图3为实施例1制得的模块化多肽-AIE探针MP与纳米小球在滑动基底自组装检测MMP-2的示意图。
图4为本发明实施例1提供的模块化多肽-AIE探针MP与肿瘤标志物的反应机理图。
图5为不同粒径大小组装的反射图谱和模块化多肽-AIE探针MP探针对MMP-2响应的荧光图谱。
图6为本发明实施例1提供的模块化多肽-AIE探针MP和不同浓度MMP-2反应在SLIPS上的荧光响应光谱。
图7为本发明实施例1提供的模块化多肽-AIE探针MP以MMP-2高通量检测器件为基底进行检测的结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
实施例1：
本发明的实施例1提供了一种模块化多肽-AIE探针MP的合成方法，包括以下步骤：
步骤S101，将0.45mg溴化亚铜溶于0.5mL二甲基亚砜溶液中，得到溴化亚铜的二甲基亚砜溶液；将15.9mg PyTPA溶于1.0mL二甲基亚砜溶液中，得到PyTPA的二甲基亚砜溶液；将4.2mg抗坏血酸钠溶于0.5mL水中，得到抗坏血酸钠水溶液；
步骤S102，将30mg多肽溶于1.0mL去离子水中并置于10mL两口烧瓶中，在氮气氛围下，加入步骤S101制得的溴化亚铜的二甲基亚砜溶液、PyTPA的二甲基亚砜溶液和抗坏血酸钠水溶液，40℃条件恒温反应24h，得到粗产物；多肽的序列为：N端-C端：RRRRRR-GG-PLGLAG-Pra-NH2；
步骤S103，将粗产物进行高效液相色谱纯化，即得到12mg模块化多肽-AIE探针MP，产率为28％。
上述制得的模块化多肽-AIE探针MP的结构式如图1所示，质谱表征见图2。
实施例2：
本发明的实施例2提供了一种利用光子晶体滑动基底和实施例1制备的模块化多肽-AIE探针MP检测MMP-2含量的方法，包括以下步骤：
制备光子晶体滑动基底：将ITO玻璃清洗后镀上一层平展的特氟龙薄膜，然后将其放置旋涂机上，不断滴加润滑油，当观察到特氟龙薄膜被润滑油充分均匀浸润，取下并静止30min，得到滑动基底；先将浓度为0.2wt％的光子晶体乳胶悬浮液稀释10倍，之后取5μL缓慢滴加于上述制备好的滑动基底上，并放置阴凉处风干，即得到光子晶体滑动基底；
MMP-2样品活化：将10mM对氨基苯汞乙酸盐APMA和MMP-2溶液添加到TCNB缓冲液(pH 7.5、100mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl和质量体积百分比为0.05％的Brij-35)中，在37℃水浴中温和摇动孵育1h，以激活待测样品中的MMP-2的活性，得到活化的MMP-2样品；
荧光检测：将不同浓度的活化MMP-2样品(0.0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60μg/mL)与10μM实施例1制得的模块化多肽-AIE探针MP放入含有10μM TCNB缓冲液的Eppendorf管中，37℃下孵育20min，随后在80℃下灭活5min使蛋白酶失活，向灭活后的MMP-2样品和模块化多肽-AIE探针MP的混合溶液中添加聚四苯乙烯制成的纳米小球，之后在玻璃制备的光子晶体滑动基底上进行自组装，待溶液挥发干后用荧光分光光度计记录这些样品的荧光信号，然后绘制荧光强度与MMP-2浓度的曲线及其线性关系。荧光光谱仪的具体参数为λex＝453nm，狭缝宽度：1/3nm，长波长滤光片(>480nm)。
实施例1制得的模块化多肽-AIE探针MP与纳米小球在滑动基底自组装检测MMP-2的示意图见图3，实施例1制得的模块化多肽-AIE探针MP与肿瘤标志物MMP-2的反应机理图见图4，纳米小球不同粒径大小组装后反射图谱和模块化多肽-AIE探针MP探针对MMP-2响应的荧光图谱见图5，结果表明光子晶体的反射光谱与探针MP荧光光谱显示PC4与MP的荧光光谱是最佳匹配的，能使探针的荧光信号得到最佳的增强。模块化多肽-AIE探针MP和不同浓度MMP-2反应在SLIPS上的荧光响应光谱见图6，结果表明SLIPS上该检测策略对MMP-2的定量检测具有高灵敏度和低检测限。
实施例3：
本发明的实施例3提供了一种利用MMP-2高通量检测器件和实施例1制备的模块化多肽-AIE探针MP检测不同密度下的HeLa细胞外分泌的MMP-2含量的方法，包括以下步骤：
制备MMP-2高通量检测器件：首先利用冲压模具将特氟龙薄膜冲压成直径为6mm的圆形薄膜；随后置于润滑油中浸泡4h使圆形的特氟龙薄膜附着一层油膜；然后将特氟龙薄膜填充在96微孔板的底部压平压实；将浓度为0.2wt％的光子晶体乳胶悬浮液稀释10倍，之后取5μL缓慢滴加于96微孔板上，并放置阴凉处风干，即得到MMP-2高通量检测器件；
从肿瘤细胞HeLa细胞系中收集MMP-2样品：待HeLa细胞在完全生长培养基(DMEM)中生长至约80％密度下，进行细胞传代操作，并用血小球计数板计算出总的HeLa细胞密度，然后分装为5种密度。在含完全生长培养基中培养24后，PBS清洗细胞，并更换不含酚红指示剂的DMEM-F12来继续培养24h，此时，收集细胞的培养液，并计算出此时的细胞密度，收集的培养液在4℃下离心5min(400×g)以除去漂浮的细胞和碎片，并保留上清液；
MMP-2样品激活：将收集的上清液与TCNB缓冲液按体积比1：1混合并加入10mMAPMA在37℃水浴中温和摇动孵育1小时以激活样品中的MMP-2；
荧光检测：向激活后的混合溶液中加入10μM实施例1制得的模块化多肽-AIE探针MP，继续孵育20min，随后在80℃下灭活5min，然后加入纳米小球的悬浮液定体积后，转移到MMP-2高通量检测器件(含有标准品MMP-2的不同梯度浓度的微孔)中，待溶液挥发干后用酶标仪同时快速检测荧光信号；最后根据测量结果绘制标准的荧光曲线，进而确定不同密度下的HeLa细胞外分泌的MMP-2含量。酶标仪的具体参数为λex＝453nm，λem＝650nm。
实施例1提供的模块化多肽-AIE探针MP以MMP-2高通量检测器件为基底进行检测的结果图见图7，结果显示该高通量器件能够用于同时高通量精确检测不同密度下HeLa细胞外分泌的MMP-2酶。图7a为制得的MMP-2高通量检测器件的示意图，图7b为MMP-2标准品的线性关系图，图7c为计算出的不同密度下HeLa细胞分泌出的MMP-2浓度。
实施例4：
本发明的实施例4提供了一种试剂盒，该试剂盒包括100mM对氨基苯汞乙酸盐DMSO溶液、TCNB缓冲液、标准品MMP-2、模块化多肽-AIE探针MP、实施例3制备的MMP-2高通量检测器件，该试剂盒的使用步骤如下：
根据样品个数计算所需要用到的高通量板孔数；
每个MMP-2标准品和实际样品按体积比1：1与TCNB缓冲液混合，总体积为100μL，先加入10mM的APMA反应1h，并加入模块化多肽-AIE探针MP溶液，置于离心管中，在37℃下反应20min；
将上述反应液立即转移到80℃反应3min，然后滴加10μL在试剂盒中高通量板的孔中，待与光子晶体纳米小球自组装完成；
将处理后的高通量板放入酶标仪中进行荧光波长为650nm的读数；
计算出标准品和实际样品的数值，根据标准品的数值作出标准曲线，随后计算出实际样品中的含量。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种模块化多肽-AIE探针MP，其特征在于，所述模块化多肽-AIE探针MP的结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003038254570000011
式Ⅰ中，AA表示精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的任一种或多种的组合，n的取值为6-40。
2.权利要求1所述模块化多肽-AIE探针MP的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101，将溴化亚铜和AIE分子PyTPA分别溶于二甲基亚砜中，得到溴化亚铜的二甲基亚砜溶液和PyTPA的二甲基亚砜溶液；
S102，将多肽溶于去离子水中，在氮气氛围下，加入溴化亚铜的二甲基亚砜溶液、PyTPA的二甲基亚砜溶液和抗坏血酸钠水溶液，恒温反应，得到粗产物；
S103，将粗产物进行高效液相色谱纯化，即得到模块化多肽-AIE探针MP。
3.根据权利要求2所述的模块化多肽-AIE探针MP的合成方法，其特征在于，所述多肽的序列为：N端-C端：(AA)n-GG-PLGLAG-Pra-NH2；AA表示精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸中的任一种或多种的组合，n的取值为6～40。
4.利用权利要求1所述模块化多肽-AIE探针MP或权利要求2-3任一项所述合成方法合成的模块化多肽-AIE探针MP荧光检测MMP-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S201，将对氨基苯汞乙酸盐和MMP-2样品溶液加入到TCNB缓冲液中，在37℃水浴中温和摇动孵育，得到活化的MMP-2样品；
S202，将活化的MMP-2样品和模块化多肽-AIE探针MP加入离心管中在37℃下孵育20～25min，之后在80℃下灭活3～5min，向灭活后的MMP-2样品和模块化多肽-AIE探针MP的混合溶液中添加纳米小球，在基底上自组装完成后进行荧光测量。
5.根据权利要求4所述的利用模块化多肽-AIE探针MP荧光检测MMP-2的方法，其特征在于，使用的基底为光子晶体滑动基底或MMP-2高通量检测器件。
6.根据权利要求4所述的利用模块化多肽-AIE探针MP荧光检测MMP-2的方法，其特征在于，光子晶体滑动基底的制备过程为：在干净的基材上镀一层平展的特氟龙薄膜，利用油相浸润，得到滑动基底；将光子晶体乳胶悬浮液缓慢滴加于滑动基底上，即得到光子晶体滑动基底。
7.根据权利要求4所述的利用模块化多肽-AIE探针MP荧光检测MMP-2的方法，其特征在于，MMP-2高通量检测器件的制备过程为：利用冲压模具将特氟龙薄膜冲压成圆形薄膜；随后置于油相中浸泡使圆形的特氟龙薄膜附着一层油膜；然后将其填充在微孔板的底部，再将光子晶体乳胶悬浮液缓慢滴加于微孔板上，即得到MMP-2高通量检测器件。
8.根据权利要求6或7所述的利用模块化多肽-AIE探针MP荧光检测MMP-2的方法，其特征在于，所述油相为润滑油、硅油、机械油、聚酯或合成酯中的任一种；所述光子晶体乳胶悬浮液的浓度为0.0001wt％～10wt％。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的模块化多肽-AIE探针MP或权利要求2-3任一项所述合成方法合成的模块化多肽-AIE探针MP。
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