CN113181348A - 促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，包括如下结构层：杀菌层；治疗层；愈合层。本发明还公开了促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，包括：取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后制成海绵体状的杀菌层结构；取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀后制成海绵体状的治疗层结构；取冬瓜皮、当归、黄芪、白术、茯苓和五倍子，粉碎并熬制，之后浓缩为浸膏，并与人工真皮支架混匀制成海绵体状的愈合层结构；分别向杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的多孔结构内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将三者压合，即得。本发明可用于防治冻伤的发生，且对促进冻伤创口愈合等效果显著，防治效果优异。

Description

促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体及制备方法
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，特别涉及能够在高寒地区放置冻伤的三维多孔结构体的制备方法。
背景技术
冻伤在寒冷地区易于发生，尤其是在海拔高的山脉或高原，在冬季时发生冻伤后极不容易恢复。冻伤处较于容易发生瘙痒，若挠抓或不慎导致出现伤口，会出现细菌感染、脓肿、失血及局部血液循化障碍等现象，若不及时治疗，冻伤处症状较轻时可能会造成皮肤的过性损伤，需及时救治；症状较重时可致永久性功能障碍，需进行专业救治。甚至严重时可危及生命，需紧急抢救。因此，冻伤未发生前的预防、前期杀菌和发展期的杀菌治疗、促使其创伤快速愈合是治疗的关键点。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体。
本发明再有一个目的是提供促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法。
为此，本发明提供的技术方案为：
促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和具有溶菌酶功能的组分的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:20～28；
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:10～18；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮26～30份、当归18～22份、黄芪10～16份、白术8～12份、茯苓8～10份和五倍子2～4份。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体中，所述杀菌层、治疗层和愈合层的孔隙内填充有包含具有溶菌酶功能的组分的混合物。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体中，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮28份、当归20份、黄芪13份、白术10份、茯苓9份和五倍子3份。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体中，所述具有溶菌酶活性的组分与所述壳聚糖及其衍生物水凝胶的质量比为1:24，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:14。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体中，所述杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为1～3:1～4:1～2。
促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、按照质量比1:20～28取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后制成海绵体状的杀菌层结构；
步骤二、按照质量比为1:10～18取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀后制成海绵体状的治疗层结构；
步骤三、依照如下重量份数冬瓜皮26～30份、当归18～22份、黄芪10～16份、白术8～12份、茯苓8～10份和五倍子2～4份，依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与人工真皮支架混匀制成海绵体状的愈合层结构；
步骤四、在0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法中，步骤一中制成所述杀菌层结构的具体方法为：采用真空冷冻干燥方法，首先于温度-20～-30℃下持续1～2小时，之后于温度-30～-45℃下持续2～3h，再于温度-45～-65℃下持续2～3h，真空度小于15Pa。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法中，步骤二中制成所述治疗层结构的具体方法为：首先对混合物以超声频率600-990kHz进行超声处理10～150秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20～-40℃下持续2～4小时，之后于温度-40～-60℃下持续3～6h，真空度小于15Pa。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法中，步骤三中制成所述愈合层结构的具体方法为：首先对混合物以超声频率800-990kHz进行超声处理60～200秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20～-40℃下持续1～2小时，之后于温度-40～-75℃下持续4～8h，真空度小于15Pa。
优选的是，所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法中，步骤四中，所述杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为1～3:1～4:1～2。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明中，具有溶菌酶活性的组分具有良好的杀菌作用，壳聚糖及其衍生物水凝胶具有良好的保持湿度的性质，将二者混合后制备得到的杀菌层不仅有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用，而且作用时也能起到缓释效果，其三维结构保证了其具有很强的吸湿保湿能力，能够快速促进伤口愈合。肌醇烟酸酯能够促进末梢血管循环，且能够防治冻伤，和肝素泊洛沙姆水凝胶一起使用，促进冻伤处血液循环、降低伤口处的水肿，愈合层含有中药组分浸膏，与肌醇烟酸酯配合使用，增强防寒抗冻效果，同时，中药组合物中冬瓜皮为君药、当归为臣药，促进血液循化的同时收敛止伤，再与人工真皮支架一起，为皮肤再生提供良好的营养物质，促进组织增生，以促进其愈合。本发明的结构体多维一体，富有孔隙，形成的结构呈现海绵状，透气性极强，能够吸收冻伤处溢出的脓液，且在寒冷地区，具有溶菌酶活性的组分保持活性的时间更长，副作用小，能够防治冻伤和促进冻伤创口的快速愈合。本发明可用于防治冻伤的发生，且对促进冻伤创口愈合等效果显著，防治效果优异。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和具有溶菌酶功能的组分的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:20～28；
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:10～18；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮26～30份、当归18～22份、黄芪10～16份、白术8～12份、茯苓8～10份和五倍子2～4份；
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。本发明中，将具有杀菌作用的天然抗感染物质溶菌酶开创性得用于海绵状结构中，且与多种组分共同使用，用于防治冻伤和促进冻伤创口愈合。
本技术方案还可以包括以下技术细节，以更好地实现技术效果：所述具有溶菌酶活性的组分包括溶菌酶、其生物片段或盐、及溶菌酶相关肽段中的任意一种或多种的混合物。所述具有溶菌酶活性的组分包括溶菌酶、其生物片段或盐、及溶菌酶相关肽段中的任意一种或多种的混合物。本发明中使用的溶菌酶可以是来源于任何物种例如，源自哺乳动物、鸡等禽类、爬行动物、两栖动物、昆虫或者蚕、或者源自鸡蛋清等等。当然，也可以是通过生物方法合成的溶菌酶。本发明中溶菌酶盐可以是有机酸的盐、具有无机酸的盐、具有有机碱的盐或具有无机碱的盐或者，溶菌酶的某个氨基酸与金属形成的盐或其侧链形成的盐。本发明采用具有溶菌酶活性的组分也可以是构成溶菌酶的部分氨基酸序列或者短链的多肽片段或多肽片段的组合。当然，作为优选，本发明采用的是纯度较高的溶菌酶的物质，最优选的是源自鸡蛋清的高纯度的溶菌酶。
本发明中，具有溶菌酶活性的组分具有良好的杀菌作用，壳聚糖及其衍生物水凝胶具有良好的保持湿度的性质，将二者混合后制备得到的杀菌层不仅有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用，而且作用时也能起到缓释效果，其三维结构保证了其具有很强的吸湿保湿能力，能够快速促进伤口愈合。肌醇烟酸酯能够促进末梢血管循环，且能够防治冻伤，和肝素泊洛沙姆水凝胶一起使用，促进冻伤处血液循环、降低伤口处的水肿，愈合层含有中药组分浸膏，与肌醇烟酸酯配合使用，增强防寒抗冻效果，同时，中药组合物中冬瓜皮为君药、当归为臣药，促进血液循化的同时收敛止伤，再与人工真皮支架一起，为皮肤再生提供良好的营养物质，促进组织增生，以促进其愈合。本发明的结构体多维一体，富有孔隙，形成的结构呈现海绵状，透气性极强，能够吸收冻伤处溢出的脓液，且在寒冷地区，具有溶菌酶活性的组分保持活性的时间更长，副作用小，能够防治冻伤和促进冻伤创口的快速愈合。本发明可用于防治冻伤的发生，且对促进冻伤创口愈合等效果显著，可在冻伤的多个时期起到极好的作用，防治效果优异。
在上述方案中，作为优选，所述杀菌层、治疗层和愈合层的孔隙内填充有包含具有溶菌酶功能的组分的混合物。如伤口处溢出物较多，孔隙内的溶菌酶能够对其进行快速杀菌，避免细菌增生和扩散。
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮28份、当归20份、黄芪13份、白术10份、茯苓9份和五倍子3份。
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，所述具有溶菌酶活性的组分与所述壳聚糖及其衍生物水凝胶的质量比为1:24，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:14。
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，所述杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为1～3:1～4:1～2。
本发明还提供了所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、于温度0～4℃下，按照质量比1:20～28取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后制成海绵体状的杀菌层结构；
步骤二、按照质量比为1:10～18取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀后制成海绵体状的治疗层结构；
步骤三、依照如下重量份数冬瓜皮26～30份、当归18～22份、黄芪10～16份、白术8～12份、茯苓8～10份和五倍子2～4份，依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与粉碎后的人工真皮支架粉末混匀制成海绵体状的愈合层结构；
以上制备步骤中加入致孔剂、保湿剂、稳定剂、pH调节剂等制备海绵体中的必需组分。
步骤四、在0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，作为优选，可将各个结构放于具有溶菌酶功能的组分内晃动，使其内部充满粉末，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体；
本技术方案还可以包括以下技术细节，以更好地实现技术效果：所述具有溶菌酶活性的组分包括溶菌酶、其生物片段或盐、及溶菌酶相关肽段中的任意一种或多种的混合物。所述具有溶菌酶活性的组分包括溶菌酶、其生物片段或盐、及溶菌酶相关肽段中的任意一种或多种的混合物。本发明中使用的溶菌酶可以是来源于任何物种例如，源自哺乳动物、鸡等禽类、爬行动物、两栖动物、昆虫或者蚕、或者源自鸡蛋清等等。当然，也可以是通过生物方法合成的溶菌酶。本发明中溶菌酶盐可以是有机酸的盐、具有无机酸的盐、具有有机碱的盐或具有无机碱的盐或者，溶菌酶的某个氨基酸与金属形成的盐或其侧链形成的盐。本发明采用具有溶菌酶活性的组分也可以是构成溶菌酶的部分氨基酸序列或者短链的多肽片段或多肽片段的组合。当然，作为优选，本发明采用的是纯度较高的溶菌酶的物质，最优选的是源自鸡蛋清的高纯度的溶菌酶。
本发明的制备方法将各组分制成海绵体状的结构层后，再压合在一起，形成三维多孔结构体，形成的结构能够最大化得保持溶菌酶的活性，且海绵状结构透气保湿性能更加良好，促进防治冻伤的功能。
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，步骤一中制成所述杀菌层结构的具体方法为：采用真空冷冻干燥方法，首先于温度-20～-30℃下持续1～2小时，之后于温度-30～-45℃下持续2～3h，再于温度-45～-65℃下持续2～3h，真空度小于15Pa。阶段性降温利于溶菌酶活性成分的保持和作用时的缓释。同时也使得该结构层海绵状结构的孔隙更多
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，步骤二中制成所述治疗层结构的具体方法为：首先对混合物以超声频率600-990kHz进行超声处理10～150秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20～-40℃下持续2～4小时，之后于温度-40～-60℃下持续3～6h，真空度小于15Pa。采用超声处理能够促使肌醇烟酸酯和人工真皮支架粉末的融合，同时也使得海绵状结构的孔隙更多。
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，步骤三中制成所述愈合层结构的具体方法为：首先对混合物以超声频率800-990kHz进行超声处理60～200秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20～-40℃下持续1～2小时，之后于温度-40～-75℃下持续4～8h，真空度小于15Pa。采用超声处理也能够促使中药组分浸膏和肝素泊洛沙姆水凝胶融合更好，进一步增强肌醇烟酸酯与伤口的接触面积。
在本发明的其中一种技术方案中，作为优选，步骤四中，所述杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为1～3:1～4:1～2。
下面通过实施例进一步说明本申请的技术方案。
实施例1
促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和具有溶菌酶功能的组分的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:20；
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:10；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮26份、当归18份、黄芪10份、白术8份、茯苓8份和五倍子2份；
所述具有溶菌酶活性的组分包括溶菌酶及其生物片段。
本实施例中促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、于温度0～4℃下，取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后制成海绵体状的杀菌层结构；
步骤二、取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀后制成海绵体状的治疗层结构；
步骤三、依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与粉碎后的人工真皮支架粉末混匀制成海绵体状的愈合层结构；
以上制备步骤中加入致孔剂、保湿剂、稳定剂、pH调节剂等制备海绵体中的必需组分。
步骤四、在0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体；
实施例2
促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和具有溶菌酶功能的组分的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:22；
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:12；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮27份、当归19份、黄芪11份、白术9份、茯苓9份和五倍子3份；
所述具有溶菌酶活性的组分包括溶菌酶及其盐。
本实施例中促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、于温度0～4℃下，取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后，对混合物采用真空冷冻干燥方法处理，首先于温度-20℃下持续1小时，之后于温度-30℃下持续2h，再于温度-45℃下持续2h，保持真空度小于15Pa，制成海绵体状的杀菌层结构。
步骤二、取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀得到混合物，首先对混合物以超声频率600kHz进行超声处理10秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20℃下持续2小时，之后于温度-40℃下持续3h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的治疗层结构。
步骤三、依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与粉碎后的人工真皮支架粉末混匀，首先对混合物以超声频率800kHz进行超声处理60秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20℃下持续1小时，之后于温度-40℃下持续4h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的愈合层结构；
以上制备步骤中加入致孔剂、保湿剂、稳定剂、pH调节剂等制备海绵体中的必需组分。
步骤四、在温度0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为1:1:1，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体。
实施例3
促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和溶菌酶的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:24；该溶菌酶来源于鸡蛋清。
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:14；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮28份、当归20份、黄芪13份、白术10份、茯苓9份和五倍子3份。
上述促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法包括如下步骤：
步骤一、于温度0～4℃下，取溶菌酶和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀，采用真空冷冻干燥方法，首先于温度-25℃下持续1.5小时，之后于温度-37.5℃下持续2.5h，再于温度-45～-65℃下持续2～3h，保持真空度小于15Pa，制成海绵体状的杀菌层结构。
步骤二、取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀，首先对混合物以超声频率800kHz进行超声处理10～150秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-30℃下持续3小时，之后于温度-50℃下持续4.5h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的治疗层结构。
步骤三、依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与粉碎后的人工真皮支架粉末混匀，首先对混合物以超声频率900kHz进行超声处理130秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-30℃下持续1.5小时，之后于温度-57.5℃下持续6h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的愈合层结构；
以上制备步骤中加入致孔剂、保湿剂、稳定剂、pH调节剂等制备海绵体中的必需组分。
步骤四、在0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为3:5:3，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体。
实施例4
促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和具有溶菌酶功能的组分的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:26；
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:16；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮28份、当归20份、黄芪14份、白术10份、茯苓9份和五倍子3份；
所述具有溶菌酶活性的组分为溶菌酶、其盐的混合物。
上述促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，包括如下方法：
步骤一、于温度0～4℃下，取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后，采用真空冷冻干燥方法，首先于温度-28℃下持续1.8小时，之后于温度-40℃下持续2.8h，再于温度-60℃下持续2～3h，保持真空度小于15Pa，制成海绵体状的杀菌层结构。
步骤二、取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀，首先对混合物以超声频率900kHz进行超声处理120秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-35℃下持续3小时，之后于温度-50℃下持续5h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的治疗层结构。
步骤三、依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与粉碎后的人工真皮支架粉末混匀，首先对混合物以超声频率950kHz进行超声处理150秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-32℃下持续1.8小时，之后于温度-60℃下持续7h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的愈合层结构；
以上制备步骤中加入致孔剂、保湿剂、稳定剂、pH调节剂等制备海绵体中的必需组分。
步骤四、在0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为2:3:2，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体。
实施例5
促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和具有溶菌酶功能的组分的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:28；
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:18；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮30份、当归22份、黄芪16份、白术12份、茯苓10份和五倍子4份；
所述具有溶菌酶活性的组分为溶菌酶、其生物片段或盐、及溶菌酶相关肽段的混合物。
上述促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，包括如下方法：
步骤一、于温度0～4℃下，取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后采用真空冷冻干燥方法，首先于温度-30℃下持续2小时，之后于温度-45℃下持续3h，再于温度-65℃下持续3h，保持真空度小于15Pa，制成海绵体状的杀菌层结构。
步骤二、取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀，首先对混合物以超声频率990kHz进行超声处理150秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-40℃下持续4小时，之后于温度-60℃下持续6h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的治疗层结构。
步骤三、依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与粉碎后的人工真皮支架粉末混匀，首先对混合物以超声频率990kHz进行超声处理200秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-40℃下持续2小时，之后于温度-75℃下持续8h，真空度小于15Pa，制成海绵体状的愈合层结构；
以上制备步骤中加入致孔剂、保湿剂、稳定剂、pH调节剂等制备海绵体中的必需组分。
步骤四、在0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为3:4:1，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体。
效果验证
实验方法：
1.取70只SD健康大鼠分为7组，每组10只，分别为空白对照组即模型组、阳性对照组和5个给药组，首先将大鼠麻醉，使用75％酒精对其背部和尾部进行消毒，使用紫药水在每只大鼠背部上标记出三个区域，尾部标记1个区域，每只大鼠的标记位置和方式均相同。然后使用灭菌手术剪刀将上述标记区域的皮肤剪除至肌肉层，剪除面积不大于0.5cm×0.5cm，且防止损伤筋膜层，每只大鼠的伤口处理保持一致。之后除空白对照组后，其他各组分别将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和阳性对照药物(云南本草茅仁堂冻疮膏皲裂膏冻裂康草本修护霜)敷在对应组别的大鼠伤口处，进行第一次敷药。1.5小时后，将各组大鼠放入-15℃的冰柜中培养75小时，并于放入冰柜4小时后进行第二次敷药，敷药方法与第一次相同，之后每隔于第12小时、20小时、28小时、36小时、44小时、52小时、60小时和68小时也分别均敷药一次，并于75小时后才冰柜中取出，观察伤口愈合情况并给予定型评价。根据综合治疗效果给予定量评价，评分从1到10共分10个等级，数值越高表示治疗效果越好。其中“+”代表愈合进程快且渗血等副作用少，“－”代表愈合进程慢且渗血等副作用明显。愈合是指创面被新生肉芽组织填满，并完全上皮化。结果如下表1所示：
表1各组别大鼠愈合进程评价表
Figure BDA0002987180450000121
Figure BDA0002987180450000131
从表1可见，各个实施例组别的创面愈合非常快，治疗效果评分很高，可知本发明的三维多孔结构体在寒冷条件下对冻伤伤口具有良好的愈合效果。而阳性对照组的冻伤伤口愈合较慢且有出血现象，对冻伤伤口的愈合效果差。表1的实验结果表明，本发明的三维多孔结构体各组分在寒冷条件下能够对冻伤伤口的愈合具有良好的协同起效优势。
2.另取70只SD健康大鼠分为7组，每组10只，分别为空白对照组即模型组、阳性对照组和5个给药组。之后除空白对照组后，其他各组分别将实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和阳性对照药物(云南本草茅仁堂冻疮膏皲裂膏冻裂康草本修护霜)敷在对应组别的大鼠四肢和背部(背部去毛)各自均匀涂抹处。1.5小时候，将各组大鼠放入-30℃的冰柜中培养4小时，结束后从冰柜中取出，观察四肢和背部冻伤情况。结果如下表1所示：
表2各组别大鼠四肢和背部评价表
组别 四肢肿胀情况 背部肿胀情况
模型组 红肿，充血 红肿，充血
阳性对照组 轻微红肿，略充血 轻微红肿，略充血
实施例1 正常，无红肿，无充血 正常，无红肿，无充血
实施例2 正常，无红肿，无充血 正常，无红肿，无充血
实施例3 正常，无红肿，无充血 正常，无红肿，无充血
实施例4 正常，无红肿，无充血 正常，无红肿，无充血
实施例5 正常，无红肿，无充血 正常，无红肿，无充血
从表2可见，各个实施例组别的大鼠四肢和背部均无红肿和充血情况，可知本发明的三维多孔结构体在寒冷条件下可用于防治冻伤。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体及制备方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (10)

1.促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，其特征在于，从冻伤创口向外的方向上依次包括如下结构层：
杀菌层，其为包括壳聚糖及其衍生物水凝胶和具有溶菌酶功能的组分的三维多孔结构，所述壳聚糖及其衍生物水凝胶与和具有溶菌酶功能的组分质量比为1:20～28；
治疗层，其为包括肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的三维多孔结构，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:10～18；
愈合层，其为包括中药组分浸膏和人工真皮支架的三维多孔结构，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮26～30份、当归18～22份、黄芪10～16份、白术8～12份、茯苓8～10份和五倍子2～4份。
2.如权利要求1所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，其特征在于，所述杀菌层、治疗层和愈合层的孔隙内填充有包含具有溶菌酶功能的组分的混合物。
3.如权利要求1所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，其特征在于，所述中药组分浸膏包括如下重量份数的组分：冬瓜皮28份、当归20份、黄芪13份、白术10份、茯苓9份和五倍子3份。
4.如权利要求1所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，其特征在于，所述具有溶菌酶活性的组分与所述壳聚糖及其衍生物水凝胶的质量比为1:24，所述肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶的质量比为1:14。
5.如权利要求1所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体，其特征在于，所述杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为1～3:1～4:1～2。
6.如权利要求1所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、按照质量比1:20～28取具有溶菌酶功能的组分和壳聚糖及其衍生物水凝胶混匀后制成海绵体状的杀菌层结构；
步骤二、按照质量比为1:10～18取肌醇烟酸酯和肝素泊洛沙姆水凝胶混匀后制成海绵体状的治疗层结构；
步骤三、依照如下重量份数冬瓜皮26～30份、当归18～22份、黄芪10～16份、白术8～12份、茯苓8～10份和五倍子2～4份，依次取各中药组分，粉碎并熬制，之后浓缩为中药组分浸膏，然后将中药组分浸膏与人工真皮支架混匀制成海绵体状的愈合层结构；
步骤四、在0～4℃下，分别向所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构的孔隙内填充具有溶菌酶功能的组分，之后将所述杀菌层结构、治疗层结构和愈合层结构压合，得到促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体。
7.如权利要求6所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，其特征在于，步骤一中制成所述杀菌层结构的具体方法为：采用真空冷冻干燥方法，首先于温度-20～-30℃下持续1～2小时，之后于温度-30～-45℃下持续2～3h，再于温度-45～-65℃下持续2～3h，真空度小于15Pa。
8.如权利要求6所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，其特征在于，步骤二中制成所述治疗层结构的具体方法为：首先对混合物以超声频率600-990kHz进行超声处理10～150秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20～-40℃下持续2～4小时，之后于温度-40～-60℃下持续3～6h，真空度小于15Pa。
9.如权利要求6所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，其特征在于，步骤三中制成所述愈合层结构的具体方法为：首先对混合物以超声频率800-990kHz进行超声处理60～200秒，然后依照如下条件利用采用真空冷冻干燥方法制备：首先于温度-20～-40℃下持续1～2小时，之后于温度-40～-75℃下持续4～8h，真空度小于15Pa。
10.如权利要求6所述的促进冻伤创口愈合的溶菌酶三维多孔结构体的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述杀菌层、治疗层和愈合层的厚度比例为1～3:1～4:1～2。
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