CN113166217A - 用于癌症诊断和治疗的新型folr1特异性结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对叶酸受体α(FOLR1)具有特异性的新型结合蛋白。本发明还涉及进一步包含诊断或治疗活性成分的FOLR1结合蛋白。本发明的另外方面涉及这些FOLR1结合蛋白在医学中的用途，例如在FOLR1相关癌症的诊断和治疗中的用途。

Description

用于癌症诊断和治疗的新型FOLR1特异性结合蛋白
技术领域
本发明涉及对叶酸受体α(FOLR1)具有特异性的新型结合蛋白。本发明还涉及进一步包含诊断或治疗活性成分的FOLR1结合蛋白。本发明的另外方面涉及这些FOLR1结合蛋白在医学中的用途，例如在FOLR1相关癌症的诊断和治疗中的用途。
背景技术
叶酸受体α(FOLR1)是糖基磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白，对叶酸的活性形式具有很高的结合亲和力，并且协调将其向细胞内部转运。FOLR1在正常人体组织(例如肾脏的近端小管细胞)中仅以低浓度和有限的分布表达。
在一些实体瘤中，FOLR1大量过表达，尤其是在上皮来源的实体癌类型中。FOLR1表达频率最高的癌症类型是卵巢癌、子宫内膜癌、脑癌、肺癌和肾癌。此外，发现FOLR1在头颈癌、乳腺癌、胃癌和结肠直肠癌中以中等频率表达。
在所有女性癌症中，卵巢癌的死亡率最高。据报道，几乎所有上皮性卵巢癌中FOLR1的水平都升高，并且与高水平的肿瘤侵袭性相关，导致患者的无病间隔期较低和总体生存期较差。尽管最初对化疗有反应，但由于肿瘤对化疗的耐药性，大多数患者经历了疾病复发。非小细胞肺癌占大多数肺癌，其中这些患者的预后很差，5年全期生存率较低。在许多雌激素受体/孕激素受体阴性乳腺癌中观察到高FOLR1组织表达。此外，还在患有罕见且侵袭性形式的胸部癌和胸膜间皮瘤的患者中，检测到了FOLR1的过表达。
对于高FOLR1水平的肿瘤，仅描述了很少的靶向诊断或治疗方法。FOLR1相关化疗(铂)耐药性卵巢癌的潜在治疗的一个实例是抗体-药物缀合物Mirvetuximabsoravtansine，其目前正在临床测试中。临床测试中的另一种单克隆抗体是用于卵巢癌和肺癌的Farletuzumab。
现有方案未能充分解决FOLR1相关癌症的诊断和治疗，因此，许多患者无法从当前策略中充分受益。
毫无疑问，强烈需要用于诊断和治疗FOLR1相关肿瘤的新策略。
本发明的一个目的是提供用于FOLR1特异性靶向的分子，以便进行靶向诊断和治疗选择，包括检测FOLR1阳性肿瘤。靶向这种肿瘤相关蛋白可能为尚未满足对新的诊断和治疗途径需求的患者提供益处。由于FOLR1在正常组织中的分布较低且受限，因此靶向FOLR1提示了潜在的无毒诊断和治疗方法。因此，对FOLR1具有特异性的结合蛋白可以为癌症提供有效的医学选择，并最终改善患者的生活质量。
本发明提供了新型FOLR1结合分子，用于FOLR1相关癌症的诊断和治疗中的新的和改进的策略。
上述目的和优点是通过所附权利要求的主题来实现的。通过提供FOLR1结合蛋白的实例，本发明满足了以上提出的需求。以上概述并不一定描述了本发明解决的所有问题。
发明内容
本公开提供以下[1]至[15]，但不特别限于此：
[1]一种叶酸受体α(FOLR1)结合蛋白，其包含由根据SEQ ID NO：46的氨基酸序列的泛素衍生的氨基酸，其中对应于SEQ ID NO：46的第9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68和70位的氨基酸被取代。
[2]根据[1]所述的FOLR1结合蛋白，其中
对应于SEQ ID NO：46的第9位的氨基酸选自E、L、S或N，并且
对应于SEQ ID NO：46的第10位的氨基酸选自E、Q、Y或I，并且
对应于SEQ ID NO：46的第12位的氨基酸选自Y、E、W或D，并且，
对应于SEQ ID NO：46的第42位的氨基酸选自E、K、Y、Q或M，并且
对应于SEQ ID NO：46的第44位的氨基酸选自L、Y、V或F，并且
对应于SEQ ID NO：46的第46位的氨基酸选自Y、D或S，并且
对应于SEQ ID NO：46的第62位的氨基酸选自L、R、D或I，并且
对应于SEQ ID NO：46的第63位的氨基酸选自G、F、L或A，并且
对应于SEQ ID NO：46的第64位的氨基酸选自G、D或Y，并且
对应于SEQ ID NO：46的第65位的氨基酸选自A、D、Y、G或M，并且
对应于SEQ ID NO：46的第66位的氨基酸选自V、H、Y或T，并且
对应于SEQ ID NO：46的第68位的氨基酸选自K、D、P或T，并且
对应于SEQ ID NO：46的第70位的氨基酸选自Q、P、T、W或H，并且
任选地，进一步对SEQ ID NO：46的一个或多个氨基酸进行修饰。
[3]根据[2]所述的FOLR1结合蛋白，其包含与SEQ ID NO：46的序列同一性为70％至85％的氨基酸，优选与SEQ ID NO：46的序列同一性为75％至83％的氨基酸，优选与SEQID NO：46的序列同一性为76％至83％的氨基酸，优选与SEQ ID NO：46的序列同一性为79％至83％的氨基酸。
[4]根据[1]至[3]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO：46的第11位的氨基酸选自K或R，并且对应于SEQ ID NO：46的第45位的氨基酸选自W、R或G。
[5]根据[1]至[4]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其包含
选自EEKY、EERY、EQKY、LYKE、SYKW或NIKD的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：46的第9、10、11和12位，和
选自ELLWY、KLLWY、KLLRY、YLYWD、YLYGD、QLVWD或MLFWS的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：46的第42、43、44、45和46位，和
选自LGGAVLKLQ、LGDAVLKLQ、LGGAVLKLP、RFGDHLDLT、RFGYHLDLT、DLGGYLPLW或IAYMTLTLH的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：46的第62、63、64、65、66、67、68、69和70位。
[6]根据[1]至[5]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含1、2、3、4、5个氨基酸位置的取代，所述氨基酸位置选自对应于SEQ ID NO：44的第6、8、13、14、20、23、24、25、29、30、31、32、33、34、48、49、51、52、58、59、60、71和72位的位置，优选选自K6V、K6Q、L8R、L8E、L8Y、I13T、T14A、T14P、S20C、S20G、I23T、I23V、E24G、E24A、N25D、K29R、K29E、K29T、I30V、I30L、Q31R、D32G、D32N、K33R、K33Q、E34A、K48E、Q49R、E51K、E51D、D52G、D58N、Y59H、N60T、N60S、L71P、R72G、R72Y或R72K中的任一种。
[7]根据[1]至[6]任一项所述的FOLR1，其中所述FOLR1结合蛋白是包含多个根据[1]至[6]任一项所述的FOLR1结合蛋白的多聚体，优选是根据[1]至[6]任一项所述的FOLR1结合蛋白的二聚体，更优选是根据[1]至[6]任一项所述的FOLR1结合蛋白的同型二聚体。
[8]根据[1]至[7]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其包含分别选自SEQ ID NO：1-45和SEQ ID NO：69-73的组的氨基酸序列或选自与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由分别选自SEQ ID NO：1-45和SEQ ID NO：69-73的组的氨基酸序列或选自与其具有至少90％同一性的氨基酸序列组成。
[9]根据[1]至[8]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含一个或多个1至80个氨基酸的偶联结构域，其包含一个或多个用于化学部分偶联的偶联位点，优选地其中所述化学部分选自螯合剂、药物、毒素、染料和小分子中的任一种。
[10]根据[1]至[9]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含至少一种诊断活性部分，其任选地选自放射性核素、荧光蛋白、光敏剂、染料或酶，或以上的任意组合。
[11]根据[1]至[9]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含至少一种治疗活性部分，其任选地选自单克隆抗体或其片段、放射性核素、细胞毒性化合物、细胞因子、趋化因子、酶，或其衍生物，或以上的任意组合。
[12]根据[1]至[11]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含至少一种调节药代动力学的部分，其任选地选自聚乙二醇、人血清白蛋白、白蛋白结合蛋白或肽、免疫球蛋白结合蛋白或肽、或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖，或包含氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸的非结构化氨基酸序列。
[13]根据[1]至[12]任一项所述的FOLR1结合蛋白，其用于FOLR1相关肿瘤的诊断或治疗，优选用于FOLR1相关肿瘤的肿瘤成像和放射疗法治疗。
[14]包含根据[1]至[13]任一项所述的FOLR1结合蛋白的组合物，其用于医学，优选用于FOLR1相关肿瘤的诊断或治疗，优选用于FOLR1相关肿瘤的肿瘤成像和放射疗法治疗。
[15]产生根据[1]至[13]任一项所述的FOLR1结合蛋白的方法，其包括以下步骤：a)在适于获得所述FOLR1结合蛋白的条件下培养宿主细胞，和b)分离所述FOLR1结合蛋白。
该概述不一定描述本发明的所有特征。通过阅读随后的详细说明，其他实施方案将变得清楚。
附图说明
附图显示了：
图1显示了叶酸受体α(FOLR1)结合蛋白的选定氨基酸序列。与泛素(SEQ ID NO：46)的差异以灰色显示。第一行数字为SEQ ID NO:46中的对应位置。
图2.Affilin-199490(Affilin-197556b的同型二聚体)以高亲和力与FOLR1的结合。使用SPR(Biacore)通过无标记相互作用测定进行分析。FOLR1被固定在CM-5芯片上。这些线显示不同的浓度：0nM、0.1nM、0.3nM、0.93nM、2.77nM、8.3nM、25nM和75nM。用1:1langmuir模型拟合数据后，计算出Affilin-199490的KD值小于0.5nM。
图3.Affilin-199490不与FOLR2(叶酸受体β)结合，但与FOLR1(叶酸受体α)特异性结合。使用SPR(Biacore)通过无标记相互作用测定进行分析。
具体实施方式
本发明人已经开发了一种解决方案以通过提供新型的FOLR1结合蛋白来满足本领域对癌症诊断和治疗扩大的医学选择的强烈持续需求。如本文所定义的FOLR1特异性蛋白的功能特征在于对FOLR1具有高特异性亲和力，但对FOLR2不具有高特异性亲和力。特别地，本发明提供了基于泛素突变蛋白的FOLR1结合蛋白(也称为
Figure BDA0003096428010000041
分子)。如本文所述的FOLR1结合蛋白提供的分子形式具有良好的物理化学性质，在细菌中高水平表达，并允许容易的生产方法。对于FOLR1相关癌症的诊断和治疗，新型的FOLR1结合蛋白可以拓宽迄今为止尚未满足的医学策略。特别地，FOLR1结合蛋白可以用于成像目的，例如用于表达FOLR1的肿瘤细胞的存在，以及用于表达FOLR1的肿瘤的放射疗法治疗。
在下面更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们是可以变化的。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面和实施方案的目的，并不旨在限制由所附权利要求反映的本发明的范围。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。这包括蛋白质工程和纯化领域的技术人员，还包括开发用于技术应用以及用于治疗和诊断的新型靶标特异性结合分子的领域的技术人员。
优选地，本文所使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.和
Figure BDA0003096428010000042
H.编辑(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，瑞士)中所述进行定义。
除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书和随后的权利要求书，词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的变体被理解为暗示包括一个指定的整数或步骤，或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。术语“包含”或“含有”可以涵盖对“由...组成”的限制，出于任何原因和在任何程度上这种限制是必要的。
贯穿本说明书，可以引用一些文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明、GenBank登录号序列提交文件等)。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明由于先前的发明而无权早于这种公开。本文引用的某些文件可以被描述为“通过引用并入”。在这些并入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间存在冲突的情况下，本说明书的文本优先。
本文所指的所有序列均在所附序列表中公开，其全部内容和公开构成本说明书的公开内容的一部分。
本申请中使用的重要术语的一般定义
本文所用的术语“FOLR1”或“叶酸受体α”是指Uniprot登录号P15328，特别是残基25-234。术语“FOLR1”包括所有表现出与Uniprot登录号P15328(人类)的FOLR1，尤其是残基25-234，或Uniprot登录号P35846(小鼠)，至少80％、85％、90％、95％、96％或97％或更高或100％的序列同一性的多肽。
如本文所用的术语“FOLR2”或“叶酸受体β”是指Uniprot登录号P14207或其他物种中的相应蛋白。
术语“FOLR1结合蛋白”是指对FOLR1具有高亲和力结合的蛋白。
术语“蛋白质”和“多肽”是指任何通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的链，并不指特定长度的产物。因此，“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任一个而使用，或与其互换使用。术语“多肽”还旨在指多肽的翻译后修饰的产物，这在本领域中是众所周知的。
术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指参考氨基酸在亲本多肽序列的特定位置被另一种氨基酸取代、缺失或插入。给定已知的遗传密码，以及重组和合成DNA技术，熟练的科学家能够容易地构建编码氨基酸变体的DNA。
如本文所用的术语“突变蛋白”是指例如SEQ ID NO：46所示的泛素的衍生物或类似蛋白，其通过氨基酸交换、插入、缺失或其任意组合而不同于所述氨基酸序列，前提是突变蛋白对FOLR1具有特异性结合亲和力。
术语
Figure BDA0003096428010000051
(Navigo Proteins GmbH的注册商标)是指非免疫球蛋白衍生的结合蛋白。
术语“取代”应理解为一种氨基酸被另一种氨基酸交换。术语“插入”包括在原始氨基酸序列上添加氨基酸。
术语“泛素”是指根据SEQ ID NO：46的泛素，并且是指具有至少95％同一性的蛋白，例如在第45、75、76位具有点突变(不影响与靶标(FOLR1)结合)。
术语“结合亲和力”和“结合活性”在本文中可以互换使用，它们是指多肽结合另一种蛋白质、肽或其片段或结构域的能力。结合亲和力通常通过平衡解离常数(KD)进行测量和报告，该常数用于评估和排序双分子相互作用的强度。
术语“融合蛋白”涉及包含至少第一蛋白质与至少第二蛋白质遗传连接的蛋白质。融合蛋白是通过将两种或更多种原本编码不同蛋白的基因连接起来而创建的。融合蛋白可以进一步包含不参与靶标结合的其他结构域，例如但不限于，例如多聚化部分、多肽标签、多肽接头或与不同于FOLR1的靶标结合的部分。
术语“氨基酸序列同一性”是指两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的同一性(或差异)的定量比较。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并且在必要时引入间隔以达到最大的序列同一性百分比之后，序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定序列同一性，将查询蛋白的序列与参考蛋白或参考多肽的序列进行比对。序列比对的方法是本领域众所周知的。例如，为了确定任意多肽相对于SEQ ID NO：46的氨基酸序列的氨基酸序列同一性的程度，优选采用本领域已知的SIM局部相似性程序。对于多重比对分析，如本领域技术人员已知的，优选使用Clustal Omega。
本发明实施方案的详细描述
FOLR1结合蛋白的结构表征。如本文所定义的FOLR1结合蛋白包含泛素的突变蛋白。FOLR1结合蛋白包含基于根据SEQ ID NO：46的泛素的氨基酸，其具有至少在第9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68和70位的取代。
在一些实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％的序列同一性。
在多种实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白与SEQ ID NO：46的氨基序列具有至少80％的序列同一性。如本文所公开的FOLR1结合蛋白与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％或85％的序列同一性。
在优选的实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可以与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有在70％同一性至85％同一性之间的任意氨基酸同一性。在甚至更优选的实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可以与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有在73％同一性至83％同一性之间的任意氨基酸同一性。在甚至更优选的实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可以与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有在75％同一性至83％同一性之间的任意氨基酸同一性。在甚至更优选的实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可以与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有在76％同一性至83％同一性之间的任意氨基酸同一性。在甚至更优选的实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可以与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有在79％同一性至83％同一性之间的任意氨基酸同一性。
如本文所定义的FOLR1结合蛋白包含SEQ ID NO：46的突变蛋白，即，包含泛素的突变蛋白。FOLR1结合蛋白包含基于SEQ ID NO：46的氨基酸，其具有至少在第9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68和70位的取代。在如本文所定义的FOLR1结合蛋白中，对应于SEQ IDNO：46的第9位的氨基酸为E、L、S或N，对应于SEQ ID NO：46的第10位的氨基酸为E、Q、Y或I，对应于SEQ ID NO：46的第12位的氨基酸为Y、E、W或D，对应于SEQ ID NO：46的第42位的氨基酸为E、K、Y、Q或M，对应于SEQ ID NO：46的第44位的氨基酸为L、Y、V或F，对应于SEQ ID NO：46的第46位的氨基酸为Y、D或S，对应于SEQ ID NO：46的第62位的氨基酸为L、R、D或I，对应于SEQ ID NO：46的第63位的氨基酸为G、F、L或A，对应于SEQ ID NO：46的第64位的氨基酸为G、D或Y，对应于SEQ ID NO：46的第65位的氨基酸为A、D、Y、G或M，对应于SEQ ID NO：46的第66位的氨基酸为V、H、Y或T，对应于SEQ ID NO：46的第68位的氨基酸为K、D、P或T，对应于SEQID NO：46的第70位的氨基酸为Q、P、T、W或H，并且任选地，进一步地SEQ ID NO：46的一个或多个，优选1、2、3、4或5个氨基酸被取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO：46的第11位的氨基酸是K或R，对应于SEQ ID NO：46的第45位的氨基酸是W、R或G。
氨基酸基序的结构表征。在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白包含在对应于如SEQID NO：46所定义的泛素的第9、10、11和12位的位置上的氨基酸残基基序，其中所述氨基酸残基基序选自EEKY、EERY、EQKY、LYKE、SYKW或NIKD的组(SEQ ID NO：61-66)。
在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白包含在对应于SEQ ID NO：46的第42、43、44、45和46位的位置上的氨基酸残基基序，其中所述氨基酸残基基序选自ELLWY、KLLWY、KLLRY、YLYWD、YLYGD、QLVWD或MLFWS的组(SEQ ID NO：54-60)。
在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白包含在对应于SEQ ID NO：46的第62、63、64、65、66、67、68、69和70位的位置上的氨基酸残基基序，其中所述氨基酸残基基序选自LGGAVLKLQ、LGDAVLKLQ、LGGAVLKLP、RFGDHLDLT、RFGYHLDLT、DLGGYLPLW或IAYMTLTLH(SEQ IDNO：47-53)。
在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白包含在对应于如SEQ ID NO：46所定义的泛素的第9、10、11和12位的位置上的氨基酸残基基序，其中所述氨基酸残基基序选自EEKY、EERY、EQKY、LYKE、SYKW或NIKD的组；在对应于SEQ ID NO：46的第42、43、44、45和46位的位置上的氨基酸残基基序，其中所述氨基酸残基基序选自ELLWY、KLLWY、KLLRY、YLYWD、YLYGD、QLVWD或MLFWS的组；在对应于SEQ ID NO：46的第62、63、64、65、66、67、68、69和70位的位置上的氨基酸残基基序，其中所述氨基酸残基基序选自LGGAVLKLQ、LGDAVLKLQ、LGGAVLKLP、RFGDHLDLT、RFGYHLDLT、DLGGYLPLW或IAYMTLTLH的组。
在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白包含在对应于如SEQ ID NO：46所定义的泛素的第9-12位、第42-46位和第62-70位的位置上的氨基酸基序，所述氨基酸基序选自EEKY、ELLWY和LGGAVLKLQ；EEKY、KLLWY和LGGAVLKLQ或LGGAVLKLP或LGDAVLKLQ；EERY、KLLWY和LGGAVLKLQ或LGDAVLKLQ；EEKY、KLLRY和LGGAVLKLQ；RLYKE、YLYWD和RFGDHLDLT或RFGYHLDLT；RLYKE、YLYGD和RFGYHLDLT；ESYKW、QLVWD和DLGGYLPLW；或YNIKD、MLFWS和IAYMTLTLH，如表1所示。
表1.FOLR1结合蛋白在选定位置的氨基酸
第一行数字为SEQ ID NO:46中的对应位置。
Figure BDA0003096428010000081
在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白在1、2、3、4、5个氨基酸位置包含进一步的取代，所述氨基酸位置选自对应于SEQ ID NO：46的第6、8、13、14、20、23、24、25、29、30、31、32、33、34、48、49、51、52、58、59、60、71和72位的位置。在一些实施方案中，所述取代选自K6V、K6Q、L8R、L8E、L8Y、I13T、T14A、T14P、S20C、S20G、I23T、I23V、E24G、E24A、N25D、K29R、K29E、K29T、I30V、I30L、Q31R、D32G、D32N、K33R、K33Q、E34A、K48E、Q49R、E51K、E51D、D52G、D58N、Y59H、N60T、N60S、L71P、R72G、R72Y和R72K的组中的任一种，优选地其中FOLR1结合蛋白包含与SEQ ID NO：46的序列同一性为70％至85％之间的氨基酸，优选与SEQ ID NO：46的序列同一性为75％至83％之间的氨基酸，优选与SEQ ID NO：46的序列同一性为76％至83％之间的氨基酸。在一些实施方案中，进一步的取代选自Y59H(例如，参见SEQ ID NO：7)。在一些实施方案中，进一步的取代选自E24A(例如，参见SEQ ID NO：1；与SEQ ID：46有81.6％的序列同一性；76个氨基酸中14个氨基酸被修饰)。在一些实施方案中，进一步的取代选自K29R和K48E的组中的任一种(例如，参见SEQ ID NO：4；与SEQ ID：46有80.3％的序列同一性；76个氨基酸中15个氨基酸被修饰)。在一些实施方案中，进一步的取代选自T14A、I30V和K48E的组中的任一种(例如，参见SEQ ID NO：2)(与SEQ ID：46有78.9％的序列同一性；16个氨基酸被修饰；参见例如SEQ ID NO：30所示的SEQ ID NO：2的二聚体)。在一些实施方案中，进一步的取代选自K6V、L8R和R72G的组中的任一种(例如，参见SEQ ID NO：24；与SEQ ID：46有78.9％的序列同一性；16个氨基酸被修饰)。在一些实施方案中，进一步的取代选自K6V、L8R、W45G、R72G的组中的任一种(例如，参见SEQ ID NO：25；与SEQ ID：46有77.6％的序列同一性；17个氨基酸被修饰)。在一些实施方案中，进一步的取代选自K6V、L8R、I13T、T14A、R72G的组中的任一种(例如，参见SEQ ID NO：27；与SEQ ID：46有76.3％的序列同一性；18个氨基酸被修饰)。
在图1中提供了其他实例。
SEQ ID NO：46中未被取代的位置的结构表征。在多种实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白的进一步结构特征在于某些残基不进行突变，例如，对应于SEQ ID NO：46(泛素)的第1、2、3、4、5、7、15、16，17、18、19、21、22、26、27、28、35、36、37、38、39、40、41、43、47、50、53、54、55、56、57、61、67、69、73、74、75、76位的氨基酸残基。因此，在多种实施方案中，在第1-5、7、15-19、21、22、26-28、35-41、43、47、50、53-57、61、67、69、71、73-76位的氨基酸残基对应于SEQ ID NO：46所示的氨基酸。
多聚体。在优选的实施方案中，FOLR1结合蛋白是包含多个如本文所定义的FOLR1结合蛋白的多聚体。多聚体可以包含两个、三个、四个或多个FOLR1结合蛋白。在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白包含彼此连接的2个、3个、4个或更多个FOLR1结合蛋白，即，FOLR1结合蛋白可以是二聚体、三聚体或四聚体等。在一些实施方案中，多聚体是如上所定义的FOLR1结合蛋白的二聚体。在多种实施方案中，FOLR1结合蛋白是同型二聚体。同型二聚体FOLR1结合蛋白是其中两个具有相同氨基酸序列的FOLR1结合蛋白彼此连接的蛋白。同型二聚体可以通过将SEQ ID NO：1-29的组中的任一个或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列中的任一个的两个相同蛋白质融合来产生。例如，SEQ ID NO：33的FOLR1结合蛋白是两个相同的SEQ ID NO：4的氨基酸序列的同型二聚体。同型二聚体的选定实例示于SEQ ID NO：30-43和表2中。
表2.同型二聚体FOLR1结合蛋白
Figure BDA0003096428010000091
Figure BDA0003096428010000101
在其他实施方案中，所述多聚体是异质二聚体，例如FOLR1特异性Affilin蛋白的两个氨基酸序列具有不同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，两个或更多个FOLR1结合蛋白直接连接。在一些实施方案中，两个或更多个FOLR1结合蛋白通过肽接头连接。在多种实施方案中，两个或更多个FOLR1结合蛋白通过多达30个氨基酸的肽接头连接。在其他实施方案中，两个或更多个FOLR1结合蛋白通过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸的肽接头连接。在一个实施方案中，两个FOLR1结合蛋白通过16个氨基酸连接，优选地，两个相同的FOLR1结合蛋白通过16个氨基酸连接。
一个实施方案涉及接头，所述接头由诸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或脯氨酸的氨基酸构成。接头可以由甘氨酸和丝氨酸组成，并且可以富含甘氨酸(例如，接头中超过50％的残基可以是甘氨酸残基)。在一些实施方案中，两个或更多个FOLR1结合蛋白通过根据SEQID NO：67或与其具有90％同一性的肽接头中任一种的氨基酸序列的肽接头连接。用于蛋白质融合的其他接头是本领域已知的，并且可以使用。
如本文所述的FOLR1结合蛋白包含以下氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成，所述氨基酸序列分别选自SEQ ID NO：1-45和SEQ ID NO：69-74的组，或分别选自与SEQ IDNO：1-45和SEQ ID NO：69-74具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FOLR1结合蛋白包含与SEQ ID NO：2(Affilin-197556b)的氨基酸序列表现出至少90％同一性的氨基酸序列。例如，SEQ ID NO：1-23和SEQ ID NO：30-43以及SEQ ID NO：69-74包含与SEQID NO：2的氨基酸序列表现出至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，FOLR1结合蛋白包含与SEQ ID NO：24(Affilin-189864)的氨基酸序列表现出至少90％同一性的氨基酸序列。例如，SEQ ID NO：25-27与SEQ ID NO：2具有至少90％的同一性。在一些其他实施方案中，FOLR1结合蛋白包含与SEQ ID NO：29(Affilin-187803)或与SEQ ID NO：28(Affilin-187770)的氨基酸序列表现出至少90％同一性的氨基酸序列。例如但不限于，选定的FOLR1结合蛋白示于图1。
功能特征。在一些实施方案中，如本文所述的FOLR1结合蛋白与在细胞上表达的FOLR1结合(如通过FACS确定的)和/或与FOLR1的结合亲和力为500nM或更小(如通过表面等离子共振测定确定的)。
在一些实施方案中，如本文所述的FOLR1结合蛋白对FOLR1的结合亲和力(KD)小于500nM。FOLR1结合蛋白以可测量的结合亲和力结合FOLR1，所述结合亲和力小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM，并且更优选地小于1nM。合适的方法是本领域技术人员已知的或在文献中描述的。确定结合亲和力的方法本身是已知的，并且可以选自例如本领域已知的以下方法：酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子共振(SPR)、动力学排斥分析(KinExA测定)、生物膜层干涉技术(BLI)、流式细胞术、荧光光谱技术、等温滴定量热法(ITC)、分析超速离心、放射免疫分析法(RIA或IRMA)和增强化学发光(ECL)。在下面的实施例中描述了一些方法。通常，解离常数KD是在20℃、25℃或30℃下确定的。如果没有另外特别说明，则本文所述的KD值是在25℃下通过SPR确定的。KD值越低，生物分子对其结合伴侣的结合亲和力越大。KD值越高，结合伴侣之间的结合越弱。表4中提供了FOLR1结合蛋白与FOLR1的结合亲和力的实例(参见实施例5)。
在一些实施方案中，如本文所述的FOLR1结合蛋白对FOLR1的特异性结合亲和力(KD)小于500nM，但对FOLR2却并非如此。在一些实施方案中，如通过表面等离子共振测定(参见图3)所确定的，如在表达FOLR2的细胞系上测试的，并如在实施例中进一步描述的(参见实施例6)，如本文所述的FOLR1(叶酸受体α)结合蛋白与FOLR1特异性结合，但没有检测到与FOLR2(叶酸受体β)的结合。因此，如本文所述的FOLR1结合蛋白的结合是高度特异性的。FOLR1和FOLR2是同源性低(小于80％)且表达模式不同的叶酸受体亚型。FOLR1主要在恶性癌细胞上表达，而FOLR2在炎症部位的活化巨噬细胞上表达。对FOLR1的高选择性结合对于FOLR1相关癌症的靶向医学应用可能重要，但对于炎症而言则可能不重要，并且可能具有降低的潜在毒副作用。
在一些实施方案中，如通过表面等离子共振测定所确定的，如本文所述的FOLR1结合蛋白与FOLR1结合，但没有检测到与免疫球蛋白IgG1的人Fc结构域的结合。
半数最大有效浓度EC50是指在规定的暴露时间后引起基线和最大值之间的一半响应的FOLR1结合蛋白浓度，因此其代表观察到最大效果的50％时的FOLR1结合蛋白浓度，在这种情况下，在细胞结合、流式细胞术实验中荧光强度信号达到最大的一半。在一些实施方案中，如本文所述的FOLR1结合蛋白对表达FOLR1的细胞的EC50小于100nM、小于50nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM，更优选地小于1nM。在一些实施方案中，在小鼠血清存在下于37℃孵育至少24小时后，如本文所述的FOLR1结合蛋白对FOLR1的EC50小于1nM。合适的方法对本领域技术人员是已知的。EC50值越低，FOLR1结合蛋白与FOLR1的结合就越强。表5(参见实施例9)和表6(参见实施例10)提供了即使在血清存在下也仍然稳定的FOLR1结合蛋白的实例。
在一些实施方案中，在高温下，优选在62℃至87℃之间，如本文所述的FOLR1结合蛋白是稳定的。对于稳定性分析，例如与化学或物理展开有关的基于光谱或基于荧光的方法对本领域技术人员是已知的。例如，可以使用标准方法，通过测量热熔解(Tm)温度来确定分子的稳定性(以摄氏度计，℃)，该温度下一半的分子展开。通常，Tm越高，分子越稳定。如在实施例4和表3中进一步详细描述的，通过差示扫描荧光法(DSF)确定温度稳定性。
偶联位点。在一些实施方案中，如本文所述的FOLR1结合蛋白进一步包含一个或多个用于化学部分偶联的偶联位点。偶联位点能够与其他化学基团反应以将FOLR1结合蛋白偶联至化学部分。偶联位点的限定数目和限定位置使得化学部分能够与如本文所述的FOLR1结合蛋白位点特异性偶联。因此，如果需要，大量化学部分可以与FOLR1结合蛋白结合。本领域技术人员可以将偶联位点的数目调节至对于某些应用而言的最佳数目，从而相应地调节化学部分的量。在选定的实施方案中，偶联位点可以选自能够用特定化学方法进行标记的一个或多个氨基酸的组，例如一个或多个半胱氨酸残基、一个或多个赖氨酸残基、一个或多个酪氨酸残基、一个或多个色氨酸残基或一个或多个组氨酸残基。FOLR1结合蛋白可以包含1至20个偶联位点，优选1至6个偶联位点，优选2个偶联位点，或优选一个偶联位点。
偶联结构域。一个实施方案提供了包含至少一个1至80个氨基酸的偶联结构域的FOLR1结合蛋白，该偶联结构域包含一个或多个偶联位点。在一些实施方案中，1至80个氨基酸的偶联结构域可以包含丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，以及作为偶联位点的半胱氨酸。在SEQID NO：44和45中提供了具有偶联结构域的FOLR1结合蛋白的实例(3个氨基酸“SAC”的偶联结构域，偶联位点是半胱氨酸)。在其他实施方案中，5至80个氨基酸的偶联结构域可以由丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸以及作为偶联位点的半胱氨酸组成。在一个实施方案中，偶联结构域由20-60％的丙氨酸、20-40％的脯氨酸、10-60％的丝氨酸以及在如本文所述的FOLR1结合蛋白的C-末端或N-末端作为偶联位点的一个或多个半胱氨酸组成。在一些实施方案中，氨基酸丙氨酸、脯氨酸和丝氨酸随机分布在整个偶联结构域氨基酸序列中，使得最多不超过2个、3个、4个或5个相同的氨基酸残基相邻，优选最多3个氨基酸。1至20个偶联结构域的组成可以不同或相同。
在一些实施方案中，化学部分选自螯合剂、药物、毒素、染料和小分子中的任一种。
在一些实施方案中，化学部分中的至少一个是被设计为用于偶联一个或多个其他部分的络合剂的螯合剂，以将靶标化合物偶联至如本文所公开的FOLR1结合蛋白。一个实施方案涉及一种FOLR1结合蛋白，其中所述螯合剂是用于偶联一个或多个放射性同位素或其他可检测标记的络合剂，如实施例(实施例7-10)中所述。
诊断部分。在多种实施方案中，FOLR1结合蛋白进一步包含诊断部分。在其他实施方案中，FOLR1结合蛋白进一步包含一个以上的诊断部分。在一些实施方案中，这样的诊断部分可以选自放射性核素、荧光蛋白、光敏剂、染料、或酶，或以上的任意组合。在一些实施方案中，包含至少一个诊断部分的FOLR1结合蛋白可以用作例如成像剂，例如以评估肿瘤细胞的存在或转移、肿瘤分布、和/或肿瘤的复发。用于检测或监测癌细胞的方法涉及成像方法。这样的方法涉及通过例如放射成像或光致发光或荧光使FOLR1相关癌细胞成像。
治疗部分。在多种实施方案中，FOLR1结合蛋白进一步包含治疗活性部分。在其他实施方案中，FOLR1结合蛋白进一步包含一个以上的治疗活性部分。在一些实施方案中，这种治疗活性部分可以选自单克隆抗体或其片段、受体的胞外结构域或其片段、放射性核素、细胞毒性化合物、细胞因子、趋化因子、酶、或其衍生物，或以上的任意组合。在一些实施方案中，包含治疗活性组分的FOLR1结合蛋白可用于将任何以上列出的组分靶向递送至表达FOLR1的肿瘤细胞并在其中聚集，从而导致对正常细胞产生低水平毒性。
放射性核素。适用于体内或体外成像应用或放射治疗的放射性核素包括例如(但不限于)γ发射同位素组、正电子发射体组，β发射体组和α发射体组。在一些实施方案中，合适的缀合伴侣包括螯合剂，例如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或其活化衍生物、纳米颗粒和脂质体。在多种实施方案中，DOTA可以适合作为放射性同位素和其他用于成像的试剂的络合剂，如在实施例中进一步详细描述的。
调节药代动力学的部分。在一些实施方案中，FOLR1结合蛋白进一步包含至少一种调节药代动力学的部分，其任选选自聚乙二醇、人血清白蛋白、白蛋白结合肽、免疫球蛋白结合肽、或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、或多糖(例如，羟乙基淀粉)、或增加流体动力学半径的非结构化氨基酸序列(例如包含氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸的多聚体)。在多种实施方案中，所述部分将FOLR1结合蛋白的半衰期延长至少1.5倍。产生具有延长的半衰期的FOLR1结合蛋白的多种技术是本领域已知的，例如，将调节药代动力学的部分与如上所述的FOLR1结合蛋白直接融合或化学偶联方法。可以通过肽接头序列或通过如上所述的偶联位点将调节药代动力学的部分连接在例如FOLR1结合蛋白的一个或多个位点上。
蛋白质部分或非蛋白质部分与FOLR1结合蛋白的缀合可以使用本领域众所周知的化学方法来进行。在一些实施方案中，可以使用对半胱氨酸或赖氨酸残基衍生化具有特异性的偶联化学。化学偶合可以通过本领域技术人员众所周知的化学方法来进行，包括但不限于取代、添加或环加成或氧化化学(例如形成二硫化物)。
用于纯化/检测的分子。在一些实施方案中，可以在FOLR1结合蛋白的N-末端或C-末端或两端上延伸额外的氨基酸。额外的序列可以包括例如用于纯化或检测而引入的序列。在一个实施方案中，额外的氨基酸序列包括赋予对某些色谱柱材料亲和力的一个或多个肽序列。此类序列的典型实例包括但不限于Strep-标签、寡组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、内含肽、内含肽片段、或蛋白G的白蛋白结合域。SEQ ID NO：45提供了具有Strep-标签的FOLR1结合蛋白的一个实例。
医学用途。多种实施方案涉及用于医学的如本文所公开的FOLR1结合蛋白。在一个实施方案中，FOLR1结合蛋白用于医学以诊断或治疗与FOLR1表达相关的癌症。如本文所公开的FOLR1结合蛋白允许选择性诊断和治疗FOLR1相关癌细胞或癌组织。已知FOLR1在肿瘤细胞中上调，可能导致肿瘤细胞不受控制的生长以及转移的形成。FOLR1相关肿瘤的实例是卵巢癌、子宫内膜癌、脑癌、肺癌、肾癌、头颈癌、乳腺癌、胃癌和结肠直肠癌。
一个实施方案是一种诊断(包括监测)患有FOLR1相关癌症的受试者的方法，该诊断(监测)方法包括向所述受试者施用所述的FOLR1结合蛋白，其任选地与放射性分子缀合。在多种实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可以用于诊断FOLR1相关癌症，任选地，其中FOLR1结合蛋白与放射性分子缀合。在一些实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可以用作生物标志物。在一些实施方案中，可以采用使用带标记(例如放射性标记或荧光标记)的FOLR1结合蛋白的成像方法来可视化特定组织或细胞上的FOLR1，例如，以评估FOLR1相关肿瘤细胞的存在、FOLR1相关肿瘤的分布、FOLR1相关肿瘤的复发和/或评估患者对治疗的反应。
一个实施方案是一种治疗患有FOLR1相关癌症的受试者的方法，该治疗方法包括向该受试者施用所述的FOLR1特异性结合蛋白，其任选地与放射性分子和/或细胞毒性剂缀合。在多种实施方案中，如本文所公开的FOLR1结合蛋白可用于治疗FOLR1相关癌症，任选地，其中所述FOLR1结合蛋白与细胞毒剂和/或放射性分子缀合和/或在靶标特异性CarT细胞表面表达。一些实施方案涉及用合适的放射性同位素或细胞毒性化合物标记的FOLR1结合蛋白在治疗FOLR1相关肿瘤细胞中的用途，特别是用于控制或杀死FOLR1相关肿瘤细胞(例如恶性细胞)。在一个实施方案中，将治疗剂量的放射物选择性地递送至FOLR1相关肿瘤细胞但不递送至正常细胞。
如本文所公开的FOLR1特异性结合蛋白可用于肿瘤靶向治疗或诊断，而不识别炎症组织。由于对FOLR1(而不是对FOLR2)的特异性结合，例如在自身免疫性患者或有炎症的患者中，FOLR1肿瘤靶向治疗可能是有益的。
组合物。多种实施方案涉及包含如本文所公开的FOLR1结合蛋白的组合物。包含如上述定义的FOLR1结合蛋白的组合物，用于医学，优选用于诊断或治疗各种FOLR1相关癌症肿瘤，例如卵巢癌、子宫内膜癌、脑癌、肺癌、肾癌、头颈癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌等，优选卵巢癌、乳腺癌和肺癌。包含如上所述的FOLR1结合蛋白的组合物可以用于诊断和治疗目的的临床应用。特别地，包含如上所述的FOLR1结合蛋白的组合物可用于临床应用，用于成像、监测、消除或灭活表达FOLR1的病理细胞。
多种实施方案涉及用于诊断FOLR1相关癌症的诊断组合物，其包含如本文所定义的FOLR1结合蛋白和诊断上可接受的载体和/或稀释剂。这些包括例如但不限于稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。所述组合物可以是液体制剂、冻干制剂、颗粒剂、乳剂或脂质体制剂的形式。
如上所述，包含如本文所述的FOLR1结合蛋白的诊断组合物可用于诊断FOLR1相关癌症。
多种实施方案涉及用于治疗疾病的药物(例如，治疗)组合物，其包含如本文所公开的FOLR1结合蛋白，以及药学上(例如，治疗上)可接受的载体和/或稀释剂。所述药物(例如治疗)组合物任选地可以包含其他辅助剂和本身已知的赋形剂。这些包括但不限于稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。
如上所述，包含如本文所定义的FOLR1结合蛋白的药物组合物可用于治疗疾病。
所述组合物含有有效剂量的如本文所定义的FOLR1结合蛋白。蛋白质的施用量取决于生物体、疾病类型、患者的年龄和体重以及本身已知的其他因素。根据盖伦制剂，这些组合物可以通过注射或输注、全身、腹腔内、肌内、皮下、透皮或其他惯用的应用方法进行肠胃外施用。
该组合物可以是液体制剂、冻干剂、乳膏、局部用洗剂、气雾剂、粉剂、颗粒剂、乳剂或脂质体制剂的形式。制剂的类型取决于疾病的类型、施用途径、疾病的严重程度、患者以及医学领域技术人员已知的其他因素。
所述组合物的各种组分可以与使用说明一起包装成试剂盒。
FOLR1结合蛋白的制备。如本文所述的FOLR1结合蛋白可以通过许多常规的和众所周知的技术中的任一种来制备，例如普通的有机合成策略、固相辅助合成技术、片段连接技术或通过可商购的自动化合成仪制备。另一方面，它们也可以通过常规重组技术单独制备或与常规合成技术结合来制备。此外，它们也可以通过无细胞的体外转录/翻译来制备。
多种实施方案涉及编码如本文所公开的FOLR1结合蛋白的多核苷酸。一个实施方案进一步提供了包含所述多核苷酸的表达载体，和包含所述分离的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
多种实施方案涉及一种如本文所公开的FOLR1结合蛋白的产生方法，该方法包括在允许所述FOLR1结合蛋白表达的合适条件下培养宿主细胞，以及任选地分离所述FOLR1结合蛋白。
例如，可以在合适的宿主中表达编码FOLR1结合蛋白的一种或多种多核苷酸，并且产生的FOLR1结合蛋白可以被分离。宿主细胞包含所述核酸分子或载体。合适的宿主细胞包括原核生物或真核生物。载体是指可用于将蛋白质编码信息转入宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。多种细胞培养系统也可以用来表达重组蛋白，所述细胞培养系统例如但不限于哺乳动物、酵母、植物或昆虫。培养原核或真核宿主细胞的合适条件是本领域技术人员公知的。可以应用本领域任何技术人员众所周知的技术，以任何规模(从小容量摇瓶到大发酵罐)进行用于蛋白质生产目的的细胞培养和蛋白质表达。
一个实施方案涉及一种制备如上所详述的结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备编码如本文所定义的FOLR1结合蛋白的核酸；(b)将所述核酸导入表达载体中；(c)将所述表达载体导入宿主细胞中；(d)培养所述宿主细胞；(e)使所述宿主细胞经受能表达FOLR1结合蛋白的培养条件，从而产生如本文所定义的FOLR1结合蛋白；(f)任选地分离步骤(e)中产生的FOLR1结合蛋白；以及(g)任选地使FOLR1结合蛋白与如本文所定义的其他功能部分缀合。
通常，可以使用本领域众所周知的常规方法和技术从培养混合物中分离出纯化的FOLR1结合蛋白，所述常规方法和技术例如为离心、沉淀、絮凝、色谱法的不同实施方案、过滤、透析、浓缩及其组合等。色谱法是本领域众所周知的，包括但不限于离子交换色谱、凝胶过滤色谱(尺寸排阻色谱)、疏水相互作用色谱或亲和色谱。
为了简化纯化，可以将FOLR1结合蛋白与对分离材料具有增加的亲和力的其他肽序列融合。优选地，选择对FOLR1结合蛋白的功能不具有有害作用的融合，或由于引入特异性蛋白酶切割位点而可以在纯化后分离的融合。这样的方法对于本领域技术人员也是已知的。
实施例
提供以下实施例以进一步说明本发明。通过引起与FOLR1的结合的对泛素(SEQ IDNO：46)的特定修饰特别例证了本发明。然而，本发明不限于此，并且以下实施例仅基于以上描述显示了本发明的实用性。
实施例1.FOLR1结合蛋白的鉴定
文库构建和文库的克隆。
通过由合成的三核苷酸亚磷酰胺(ELLA Biotech)生成的随机寡核苷酸在内部合成包含随机氨基酸位置的文库，以实现良好均衡的氨基酸分布，同时在随机位置排除半胱氨酸和其他氨基酸残基。
泛素的序列(SEQ ID NO：46)：
MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRAA
SEQ ID NO：46在氨基酸第6、8、9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68、70、72位是随机的。通过PCR扩增相应的cDNA文库，并使用技术人员已知的标准方法将其与修饰的pCD87SA噬菌粒(本文称为pCD12)连接。pCD12噬菌粒包含修饰的torA前导序列(缺失氨基酸序列QPAMA)以实现蛋白质加工，而在N末端不添加氨基酸。连接混合物的等分试样用于大肠杆菌ER2738(Lucigen)的电穿孔。除非另有说明，否则使用已建立的重组遗传方法。
实施例2.FOLR1结合蛋白的鉴定
靶标。将编码人FOLR1(uniprot登录号P15328；第25-234位残基)的DNA序列与人IgG1的Fc片段遗传融合(C-末端连着His-标签)，或者与Avi-标签遗传融合(C-末端连着His-标签)。OriGene Technologies提供了使用人密码子的全长cDNA，将其克隆到哺乳动物表达载体pCEP4中，并在摇瓶中以从400ml到2L的不同规模在哺乳动物Expi293F细胞中表达。将具有pCEP4-FOLR1-Avi-His构建体的表达培养物再与pCEP4-BirA进行共转染，以诱导靶蛋白的定点生物素化。通过SDS-PAGE，并用针对FOLR1、人IgG1的Fc部分或生物素的抗体通过免疫印迹分析来分析表达培养物。
将FOLR1-Fc-His表达的细胞培养上清液离心并过滤，以用于在HisTrap excel1mL柱(GE Healthcare)上进行亲和色谱。通过注入含咪唑的缓冲液洗脱靶蛋白，并将其应用于Superdex 200XK 16/600凝胶过滤柱。将FOLR1-Avi-His表达的细胞培养上清液进行离心、过滤和脱盐，以应用于在链霉亲和素突变蛋白基质(Roche)上进行亲和色谱。通过注入含生物素的缓冲液洗脱靶蛋白，并将其应用于Superdex 200 10/300凝胶过滤柱。通过SDS-PAGE和SE-HPLC分析并确认回收的靶蛋白的纯度。通过浓度依赖性ELISA证实靶蛋白对底物叶酸的生物活性。
通过TAT噬菌体展示进行初步筛选。使用噬菌体展示作为筛选系统，针对FOLR1富集天然文库。用携带文库的噬菌粒pCD12转化感受态细菌ER2738细胞(Lucigene)后，使用技术人员已知的标准方法进行噬菌体扩增和纯化。将靶蛋白固定在磁珠上来进行筛选。从而将与IgG1-Fc融合的靶蛋白固定在Protein A或Protein G
Figure BDA0003096428010000161
上。将与Avi-标签融合的定点生物素化靶蛋白或与IgG1-Fc融合的靶蛋白(另外经过随机生物素化)固定在链霉亲和素(Streptavidin)或中性抗生物素蛋白(Neutravidin)SpeedBeadsTM上。噬菌体孵育期间的FOLR1浓度从200nM(第一轮)降低到100nM(第二轮)，到50nM(第三轮)，和到25nM(第四轮)。在第一次筛选中，使用生物素化的IgG1的Fc片段进行预筛，从第二轮开始。在第二次筛选中，最后三轮将噬菌体颗粒与小鼠血清进行预孵育，分别是第2轮预孵育3h，第3轮和第4轮预孵育23h，并用生物素化的IgG1的Fc片段进行预筛。从上清液中磁性分离FOLR1噬菌体复合物，并洗涤数次。用胰蛋白酶洗脱结合FOLR1的噬菌体。为了鉴定靶标特异性噬菌体库，通过噬菌体库ELISA分析每轮筛选的洗脱和再扩增的噬菌体。用FOLR1(2.5μg/ml)包被培养基结合微量滴定板(Greiner Bio-One)的孔。使用α-M13HRP缀合的抗体(GE Healthcare)检测结合的噬菌体。
将结合靶标的噬菌体库克隆到表达载体中。根据本领域已知的方法，通过PCR扩增在噬菌体库ELISA中显示与FOLR1特异性结合的筛选库，用适当的限制性核酸酶切割，并连接到包含Strep-Tag II(IBA GmbH)的表达载体pET-28a(Merck，德国)的衍生物中。
单菌落命中分析。转化BL21(DE3)细胞(Merck，德国)后，生长出卡那霉素抗性的单菌落。通过使用自诱导培养基(Studier，2005，Protein Expr.Purif.41(1)：207-234)在384孔板(Greiner Bio-One)中培养来实现FOLR1结合蛋白的表达。收获细胞，然后分别进行化学裂解或通过BugBuster试剂(Novagen)进行酶裂解，并通过冷冻/解冻循环进行机械裂解。离心后，通过ELISA将得到的上清液用固定在High Bind 384 ELISA微量滴定板(GreinerBio-One)上的靶标进行筛选。通过Strep-
Figure BDA0003096428010000171
HRP缀合物(IBA GmbH)与TMB-Plus底物(Biotrend，德国)结合，检测与FOLR1结合的蛋白质。通过添加0.2M H2SO4溶液终止反应，并在酶标仪中于450nm对620nm下测量。
成熟文库的构建。为了使选定的变体成熟，使用dNTP类似物dPTP和8-氧代-dGTP(Jena Bioscience)进行易错PCR。将获得的成熟文库的cDNA与如上所述的pCD12连接，并在大肠杆菌SS320中测试了转化。
成熟筛选和分析。为了使亲和力成熟，进行两轮淘选。在第一轮和第二轮中分别用80nM和8nM浓度的与IgG1-Fc融合的随机生物素化靶蛋白进行第一次成熟筛选。对于这两轮，在第一轮和第二轮中分别将噬菌体颗粒与小鼠血清预孵育3小时和23小时，并用生物素化的IgG1的Fc片段进行预筛。在第一轮和第二轮中分别用浓度为50nM和1nM的Avi-标签融合的定点生物素化靶蛋白进行第二次成熟筛选。对于这两轮，在第一轮和第二轮中将噬菌体颗粒与小鼠血清预孵育23小时。为了分析针对特定靶标结合的成熟的筛选库，进行噬菌体库ELISA，然后将阳性库克隆到表达载体pET-28a中，并进行如上所述命中ELISA。
实施例3.FOLR1结合蛋白的表达和纯化
使用技术人员已知的标准方法将FOLR1结合蛋白克隆到表达载体中，如下所述进行纯化和分析。所有的FOLR1特异性蛋白均被表达，并通过亲和色谱和凝胶过滤高度纯化。亲和色谱纯化后，使用
Figure BDA0003096428010000172
系统和SuperdexTM200 HiLoad 16/600柱(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱(SE HPLC或SEC)。该柱的体积为120ml，并用2CV平衡。对样品施用1ml/min流速的纯化缓冲液。当信号强度达到10mAU时开始收集级分。在SDS-PAGE分析之后，合并阳性级分并测量其蛋白质浓度。
进一步分析包括SDS-PAGE、SE-HPLC和RP-HPLC。使用摩尔吸收系数在280nm处通过吸光度测量来确定蛋白质浓度。使用Dionex HPLC系统和Vydac 214MS54 C4(4.6×250mm，5μm，
Figure BDA0003096428010000181
)柱(GE Healthcare)进行RP色谱(RP HPLC)。例如，分别根据SE-HPLC和RP-HLCP，Affilin 202521(具有C末端偶联序列“SAC”的SEQ ID NO：30)具有约100％的纯度。
实施例4.FOLR1结合蛋白在高温下稳定
通过差示扫描荧光法(DSF)确定FOLR1特异性蛋白的热稳定性。将每个探针以0.1μg/μL的浓度转移到MicroAmp Optical 384孔板上，并以适当的稀释度添加SYPRO Orange染料。将温度斜坡设置为25℃至95℃，升温速率为每分钟1℃(V2A-7 Applied Biosystems)。在520nm的激发波长和623nm的发射波长下持续测量荧光(V2A-7，Applied Biosystems)。确定了热解折叠(thermal unfolding)的转变中点(Tm，熔点)，并对于选定的FOLR1结合蛋白如表3所示。
表3.FOLR1结合蛋白的温度稳定性
Affilin SEQ ID DSF，℃
197556a 1 80
199490 30 85
199489 31 79
197251 3 80
199484 32 71
199483 33 62
197525 5 82
199487 35 64
199488 34 70
187731 6 87
199477 37 79
199478 36 85
197340 8 72
196920 9 73
196964 12 74
196868 14 79
197383 17 80
196934 18 81
199479 38 65
199480 39 70
199481 40 71
199482 41 72
197126 19 79
199485 43 76
199486 42 72
196888 21 76
181919 26 63
187803 29 62
实施例5.FOLR1结合蛋白的分析(表面等离子共振，SPR)
CM5传感器芯片(GE Healthcare)用SPR运行缓冲液进行平衡。通过使EDC和NHS的混合物通过使暴露于表面的羧基活化，以产生反应性酯基。将700-1500RU FOLR1(配体上)固定在流通池上。没有配体的流通池用作参考。配体固定后注入乙醇胺用于封闭未反应的NHS基团。配体结合后，蛋白质分析物积聚在表面上，从而增加了折射率。实时测量折射率的这种变化，并将其绘制为响应或共振单位(RU)与时间的关系。将分析物以30μl/min的流速连续稀释到芯片上。进行缔合30秒，解离60秒。每次运行后，用30μl再生缓冲液再生芯片表面，并用运行缓冲液平衡。将对照样品以30μl/min的流速施加到基质上，同时缔合60秒并解离120秒。如前所述进行再生和再平衡。通过使用Biacore 3000(GE Healthcare)进行结合研究；通过制造商提供的BIAevaluation 3.0软件使用Langmuir 1∶1模型(RI＝0)进行数据评估。
图2、图3和表4显示了FOLR1结合蛋白与FOLR1-Fc的结合亲和力。
表4.通过SPR测定(Biacore)确定的FOLR1结合蛋白与FOLR1-Fc的结合亲和力(KD)。
Affilin SEQ ID Biacore，M
197556a 1 4.11E-10
199490 30 1.19E-10
199489 31 2.06E-10
199487 35 1.51E-10
199488 34 8.49E-11
199477 37 1.87E-11
199478 36 2.07E-10
199479 38 4.74E-11
199480 39 3.09E-11
199481 40 3.12E-11
199482 41 2.61E-11
197126 19 2.15E-09
189864 24 2.91E-11
189872 25 4.17E-12
181919 26 1.68E-08
189853 27 7.42E-12
187803 29 3.88E-07
实施例6.功能表征：与细胞表面表达的FOLR1特异性结合，但不与FOLR2特异性结合(流式细胞术)
流式细胞术用于分析FOLR1结合蛋白与表面暴露的FOLR1特异性相互作用，但不与FOLR2相互作用。胰蛋白酶消化转染的HEK293-FOLR1-细胞、HEK293-FOLR2-细胞和空载体对照HEK293-pEntry-细胞，并将其重悬于含有FCS的培养基中，洗涤并在预冷的FACS封闭缓冲液中染色。制备1×106个细胞/ml的细胞浓度以用于细胞染色，并将每个细胞系一式三份地以100μl/孔加入96孔板(Greiner)。将50nM的Affilin蛋白或单克隆抗人FOLR1抗体(克隆LK26；BioLegend，908301)作为阳性对照或抗人FOLR2抗体(克隆EM35；Sysmex，BD029864)添加到FOLR过表达的细胞和对照细胞中。45分钟后，除去上清液，并以100μl/孔加入兔抗Strep-标签抗体(GenScript；A00626)(在FACS封闭缓冲液中以1∶300稀释)。用以1∶1000稀释的抗小鼠-IgG-Alexa 488(Invitrogen；A-10680)检测抗FOLR1抗体和抗FOLR2抗体。除去一抗后，应用以1：1000稀释的山羊抗兔IgG Alexa Fluor488抗体(Invitrogen；A11008)。在Guava easyCyte 5HT装置(Merck-Millipore)上以激发波长488nm和发射波长520nm进行流式细胞术测量。
所有FOLR1结合蛋白均与HEK293-FOLR1过表达细胞显示出特异性结合，但与FOLR1阴性细胞系(例如HEK293-pEntry)无结合。所有用来测试与FOLR2的结合的FOLR1结合蛋白均显示不与FOLR2结合。对照：抗FOLR1抗体作为阳性对照；泛素作为阴性对照(HEK293-FOLR1细胞)。
实施例7.用DOTA标记融合蛋白
FOLR1结合蛋白与20倍过量的马来酰亚胺-DOTA(2,2',2”-(10-(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸，CheMatech)在50mM HEPES、150mM氯化钠、5mM EDTA pH 7.0中于室温下孵育3小时。为了减少可能会与DOTA分子相互作用的金属离子，将所有柱和
Figure BDA0003096428010000201
装置(GEHealthcare)与0.1M EDTA溶液孵育30分钟。为了制备溶液，仅使用无金属或金属少的组分。孵育后，通过在100mM乙酸钠pH 5.0-5.8中进行凝胶过滤(Superdex S200，GE Healthcare)将样品与未结合的DOTA分子分离。蛋白质样品还与5mM氯化铁(II)在室温下孵育1小时，以证明DOTA分子与放射性同位素偶联的有效性。孵育后，使用HiTrap脱盐柱(GE Healthcare)除去未结合的铁。用MALDI-TOF分析确定标记程度。在进一步的实验中，将FOLR1蛋白与DOTA偶联并用Lu3+标记。在pH 5.8的100nM乙酸钠中，Lu3+的上样量为c＝0.2mg/ml，标记温度高达70℃。通过CD光谱在207nm下分析分子。
实施例8.基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-TOF)
如下进行基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-TOF MS)：使用C18-P10-ZipTips(Millipore；目录号ZTC18S096)纯化和浓缩FOLR1结合蛋白。将尖端用0.1％(v/v)的三氟酸(TFA)水溶液洗涤，并用50％(v/v)乙腈/0.1％TFA洗脱。样品用2％(v/v)TFA水溶液处理，并包埋在2,5-二羟基苯乙酮(2,5-dihydroxyacetophenone，DHAP)基质(Bruker，目录号8231829)中。在autoflexTM速度质谱仪(Bruker)上测量FOLR1结合蛋白的质量。蛋白质校准标准品(Bruker，部件号8206355和部件号8207234)用于调谐autoflex速度质谱仪。
通过MALDI-TOF质谱分析具有和不具有DOTA标记的FOLR1结合蛋白，并比较其峰。MALDI-TOF分析表明，标记在FOLR1结合蛋白上的DOTA分子可用于与氯化铁(II)分子偶联。
尽管在标记FOLR1结合蛋白后KD略有变化，但标记并未显著影响FOLR1结合蛋白与靶标的亲和力。结果汇总在表5和表6中。
实施例9.FOLR1结合蛋白的血清稳定性(流式细胞术)
分析了在血清存在下FOLR1结合蛋白的稳定性。将结合蛋白与在100％小鼠血清中从1μM(Affilin-199479，Affilin-199487，Affilin-197556a，Affilin-199488，Affilin-199488-Dota，Affilin-199490和Affilin-199490-Dota)和200nM(Affilin-199489)开始的稀释系列在37℃下孵育0h或24h。如上所述，通过FACS，将100μl的Affilin-血清溶液用于分析在HEK293-FOLR1-细胞上的血清稳定性(实施例6)。FACS分析证实即使在小鼠血清中孵育24小时后，Affilin蛋白也与FOLR1结合(参见表5)。进一步测试了FOLR1蛋白(结果未显示)，证实了即使在血清存在下也与FOLR1结合。
表5.血清存在下FOLR1结合蛋白的结合(流式细胞术)
Figure BDA0003096428010000211
实施例10.FOLR1结合蛋白的血清稳定性(ELISA)
用0.1μg/ml-2.5μg/ml FOLR1-Fc在4℃过夜固定高结合板(Greiner，781061)。将197556a(具有C-末端序列SAWSHPQFEK的SEQ ID NO：1)、202521(具有C末端偶联序列“SAC”的SEQ ID NO：30；参见SEQ ID NO：44)和202521-Dota-Lu(具有C末端偶联序列“SAC”并用Lu3+镥标记的Dota的SEQ ID NO：30)的稀释系列在100％小鼠血清中于37℃孵育过夜。将ELISA板用1×PBS洗涤，并在室温下用3％BSA/0.5％吐温/PBS封闭2小时。将稀释系列在血清存在下孵育0小时或24小时后，于室温下在ELISA板上孵育1小时。用PBST洗涤后，将孔用生物素化的抗泛素抗体(1：1000)在室温下孵育1小时。用链霉亲和素-HRP(1：10.000)将结合可视化。FOLR1结合蛋白在24h血清孵育后未显示KD位移。因此，ELISA分析证实了，即使在小鼠血清中孵育24小时后，Affilin蛋白与FOLR1的高亲和力结合仍保持不变(参见表6)。
表6.在血清存在下FOLR1结合蛋白的结合(ELISA)
Figure BDA0003096428010000212
Figure BDA0003096428010000221
序列表
<110> 纳维格蛋白质有限公司
<120> 用于癌症诊断和治疗的新型FOLR1特异性结合蛋白
<130> FSP1V211426ZX
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197556a
<400> 1
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Cys Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 2
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197556b
<400> 2
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 3
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197251
<400> 3
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Gly
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Gly Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 4
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 196962
<400> 4
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Thr Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 5
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197525
<400> 5
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 6
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 187731
<400> 6
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 7
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197132
<400> 7
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp His Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 8
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197340
<400> 8
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Arg Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asn Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 9
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 196920
<400> 9
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Gly
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Lys Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Ser Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 10
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197103
<400> 10
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asp Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Pro Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 11
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197032
<400> 11
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Arg Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Pro Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 12
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 196964
<400> 12
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Leu Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Thr Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 13
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197312
<400> 13
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Thr Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Asp Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 14
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 196868
<400> 14
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Thr Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 15
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197044
<400> 15
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Gly Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Glu Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Pro Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 16
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197230
<400> 16
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Glu Ile Gln Gly
20 25 30
Arg Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 17
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197383
<400> 17
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asn
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 18
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 196934
<400> 18
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 19
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197126
<400> 19
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Ala Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 20
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197014
<400> 20
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 21
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 196888
<400> 21
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 22
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197106
<400> 22
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Gln Ala Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 23
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 197252
<400> 23
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Val Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Arg Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Gly Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Gly Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 24
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 189864
<400> 24
Met Gln Ile Phe Val Val Thr Arg Leu Tyr Lys Glu Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Tyr Leu Tyr Trp Asp Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Phe Gly
50 55 60
Asp His Leu Asp Leu Thr Leu Gly Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 25
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 189872
<400> 25
Met Gln Ile Phe Val Val Thr Arg Leu Tyr Lys Glu Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Tyr Leu Tyr Gly Asp Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Phe Gly
50 55 60
Asp His Leu Asp Leu Thr Leu Gly Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 26
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 181919
<400> 26
Met Gln Ile Phe Val Val Thr Arg Leu Tyr Lys Glu Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Tyr Leu Tyr Trp Asp Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Phe Gly
50 55 60
Tyr His Leu Asp Leu Thr Leu Gly Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 27
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 189853
<400> 27
Met Gln Ile Phe Val Val Thr Arg Leu Tyr Lys Glu Thr Ala Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Tyr Leu Tyr Trp Asp Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Arg Phe Gly
50 55 60
Tyr His Leu Asp Leu Thr Leu Gly Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 28
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 187770
<400> 28
Met Gln Ile Phe Val Val Thr Glu Ser Tyr Lys Trp Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Gln Leu Val Trp Asp Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Asp Leu Gly
50 55 60
Gly Tyr Leu Pro Leu Trp Leu Tyr Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 29
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 187803
<400> 29
Met Gln Ile Phe Val Gln Thr Tyr Asn Ile Lys Asp Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Met Leu Phe Trp Ser Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Ile Ala Tyr
50 55 60
Met Thr Leu Thr Leu His Leu Lys Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 30
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199490
<400> 30
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165
<210> 31
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199489 SEQ ID NO: 2的二聚体
<400> 31
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
130 135 140
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 32
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199484 SEQ ID NO 4的同型二聚体
<400> 32
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Thr Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Thr Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165
<210> 33
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199483 SEQ ID NO: 4的同型二聚体
<400> 33
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Thr Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Thr Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
130 135 140
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 34
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199488 SEQ ID NO: 5的同型二聚体
<400> 34
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Val Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165
<210> 35
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199487 SEQ ID NO: 5的同型二聚体
<400> 35
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Arg Val Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
130 135 140
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 36
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199478 SEQ ID NO: 6的同型二聚体
<400> 36
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165
<210> 37
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199477 SEQ ID NO: 6的同型二聚体
<400> 37
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
130 135 140
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 38
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199479 SEQ ID NO 18的同型二聚体
<400> 38
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp Ala Val Leu Lys
130 135 140
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 39
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199480 SEQ ID NO. 18的同型二聚体
<400> 39
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu
85 90 95
Arg Tyr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Gly Asn Val
100 105 110
Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys
115 120 125
Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp
130 135 140
Tyr Asn Ile Leu Gly Asp Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg
145 150 155 160
Ala Ala
<210> 40
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199481 SEQ ID NO 18的同型二聚体
<400> 40
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165
<210> 41
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199482 SEQ ID NO 18的同型二聚体
<400> 41
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
85 90 95
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Arg Tyr Ile Thr Leu Glu
100 105 110
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Gly Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
115 120 125
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
130 135 140
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Asp
145 150 155 160
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165 170
<210> 42
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199486 SEQ ID NO 20的同型二聚体
<400> 42
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Pro Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165
<210> 43
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 199485 SEQ ID NO: 20的同型二聚体
<400> 43
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Pro Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
130 135 140
Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150
<210> 44
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 202521 具有C-末端SAC但不具有Strep标签的（199490）SEQ ID NO: 2的同型二聚体
<400> 44
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Ser Ala Cys
165 170
<210> 45
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 具有C-末端SAC和Strep标签的199490（SEQ ID NO: 2的同型二聚体）
<400> 45
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Ala Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Val Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Glu Leu Leu Trp Tyr Gly Glu Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala Ser Ala Cys Ala Ser Trp Ser His
165 170 175
Pro Gln Phe Glu Lys
180
<210> 46
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 泛素
<400> 46
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Trp Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序62-70
<400> 47
Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys Leu Gln
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序62-70
<400> 48
Leu Gly Asp Ala Val Leu Lys Leu Gln
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序62-70
<400> 49
Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys Leu Pro
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序62-70
<400> 50
Arg Phe Gly Asp His Leu Asp Leu Thr
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序62-70
<400> 51
Arg Phe Gly Tyr His Leu Asp Leu Thr
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序62-70
<400> 52
Asp Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Leu Trp
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序62-70
<400> 53
Ile Ala Tyr Met Thr Leu Thr Leu His
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序42-46
<400> 54
Glu Leu Leu Trp Tyr
1 5
<210> 55
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序42-46
<400> 55
Lys Leu Leu Trp Tyr
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序42-46
<400> 56
Lys Leu Leu Arg Tyr
1 5
<210> 57
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序42-46
<400> 57
Tyr Leu Tyr Trp Asp
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序42-46
<400> 58
Tyr Leu Tyr Gly Asp
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序42-46
<400> 59
Gln Leu Val Trp Asp
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序42-46
<400> 60
Met Leu Phe Trp Ser
1 5
<210> 61
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序9-12
<400> 61
Glu Glu Lys Tyr
1
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序9-12
<400> 62
Glu Glu Arg Tyr
1
<210> 63
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序9-12
<400> 63
Glu Gln Lys Tyr
1
<210> 64
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序9-12
<400> 64
Leu Tyr Lys Glu
1
<210> 65
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序9-12
<400> 65
Ser Tyr Lys Trp
1
<210> 66
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基序9-12
<400> 66
Asn Ile Lys Asp
1
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 67
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> c-末端序列（StrepTaq）
<400> 68
Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5 10
<210> 69
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Affilin 197103 E10Q
<400> 69
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Thr Glu Asp Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Pro Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 70
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Affilin 197312 E10Q
<400> 70
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Thr Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Asp Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Gln Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 71
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Affilin 197014 E10Q
<400> 71
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
65 70 75
<210> 72
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Affilin 199486 E10Q
<400> 72
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met Gln Ile Phe
85 90 95
Val Lys Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ile Pro Leu Glu Val Glu Pro Ser
100 105 110
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
115 120 125
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys Gln Leu Glu Asp
130 135 140
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
145 150 155 160
Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
165
<210> 73
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Affilin 199485 E10Q
<400> 73
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ile Pro Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ala Val Leu Lys Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala Met Gln Ile Phe
65 70 75 80
Val Lys Thr Leu Glu Gln Lys Tyr Ile Pro Leu Glu Val Glu Pro Ser
85 90 95
Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile
100 105 110
Pro Pro Asp Gln Gln Lys Leu Leu Trp Tyr Gly Lys Gln Leu Glu Asp
115 120 125
Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Leu Gly Gly Ala Val Leu Lys
130 135 140
Leu Pro Leu Arg Leu Arg Ala Ala
145 150

Claims (14)

1.一种叶酸受体α(FOLR1)结合蛋白，其包含与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有70％至83％的序列同一性的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO：46的第9、10、12、42、44、46、62、63、64、65、66、68和70位的氨基酸被如下取代：
SEQ ID NO：46的第9位选自E、L、S或N，并且
SEQ ID NO：46的第10位选自E、Q、Y或I，并且
SEQ ID NO：46的第12位选自Y、E、W或D，并且，
SEQ ID NO：46的第42位选自E、K、Y、Q或M，并且
SEQ ID NO：46的第44位选自L、Y、V或F，并且
SEQ ID NO：46的第46位选自Y、D或S，并且
SEQ ID NO：46的第62位选自L、R、D或I，并且
SEQ ID NO：46的第63位选自G、F、L或A，并且
SEQ ID NO：46的第64位选自G、D或Y，并且
SEQ ID NO：46的第65位选自A、D、Y、G或M，并且
SEQ ID NO：46的第66位选自V、H、Y或T，并且
SEQ ID NO：46的第68位选自K、D、P或T，并且
SEQ ID NO：46的第70位选自Q、P、T、W或H。
2.根据权利要求1所述的FOLR1结合蛋白，其包含与SEQ ID NO：46的序列同一性为75％至83％的氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的FOLR1结合蛋白，其中对应于SEQ ID NO：46的第11位的氨基酸选自K或R，并且对应于SEQ ID NO：46的第45位的氨基酸选自W、R或G。
4.根据权利要求1至3任一项所述的FOLR1结合蛋白，其包含
选自EEKY、EERY、EQKY、LYKE、SYKW或NIKD的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：46的第9、10、11和12位，和
选自ELLWY、KLLWY、KLLRY、YLYWD、YLYGD、QLVWD或MLFWS的氨基酸残基，其对应于SEQ IDNO：46的第42、43、44、45和46位，和
选自LGGAVLKLQ、LGDAVLKLQ、LGGAVLKLP、RFGDHLDLT、RFGYHLDLT、DLGGYLPLW或IAYMTLTLH的氨基酸残基，其对应于SEQ ID NO：46的第62、63、64、65、66、67、68、69和70位。
5.根据权利要求1至4任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含1、2、3、4、5个氨基酸位置的取代，所述氨基酸位置选自对应于SEQ ID NO：46的第6、8、13、14、20、23、24、25、29、30、31、32、33、34、48、49、51、52、58、59、60、71和72位的位置，优选选自K6V、K6Q、L8R、L8E、L8Y、I13T、T14A、T14P、S20C、S20G、I23T、I23V、E24G、E24A、N25D、K29R、K29E、K29T、I30V、I30L、Q31R、D32G、D32N、K33R、K33Q、E34A、K48E、Q49R、E51K、E51D、D52G、D58N、Y59H、N60T、N60S、L71P、R72G、R72Y或R72K中的任一种。
6.根据权利要求1至5任一项所述的FOLR1，其中所述FOLR1结合蛋白是包含多个根据权利要求1至5任一项所述的FOLR1结合蛋白的多聚体，优选是根据权利要求1至5任一项所述的FOLR1结合蛋白的二聚体，更优选是根据权利要求1至5任一项所述的FOLR1结合蛋白的同型二聚体。
7.根据权利要求1至6任一项所述的FOLR1结合蛋白，其包含分别选自SEQ ID NO：1-45和SEQ ID NO：69-74的组的氨基酸序列或选自与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，或由分别选自SEQ ID NO：1-45和SEQ ID NO：69-74的组的氨基酸序列或选自与其具有至少90％同一性的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1至7任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含一个或多个1至80个氨基酸的偶联结构域，其包含一个或多个用于化学部分偶联的偶联位点，优选地其中所述化学部分选自螯合剂、药物、毒素、染料和小分子中的任一种。
9.根据权利要求1至8任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含至少一种诊断活性部分，其任选地选自放射性核素、荧光蛋白、光敏剂、染料或酶，或以上的任意组合。
10.根据权利要求1至8任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含至少一种治疗活性部分，其任选地选自单克隆抗体或其片段、放射性核素、细胞毒性化合物、细胞因子、趋化因子、酶，或其衍生物，或以上的任意组合。
11.根据权利要求1至10任一项所述的FOLR1结合蛋白，其进一步包含至少一种调节药代动力学的部分，其任选地选自聚乙二醇、人血清白蛋白、白蛋白结合肽、免疫球蛋白结合肽、或免疫球蛋白或免疫球蛋白片段、多糖，或包含氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸的非结构化氨基酸序列。
12.根据权利要求1至11任一项所述的FOLR1结合蛋白，其用于FOLR1相关肿瘤的诊断或治疗，优选用于FOLR1相关肿瘤的成像和FOLR1相关肿瘤的放射疗法治疗。
13.包含根据权利要求1至12任一项所述的FOLR1结合蛋白的组合物，其用于医学，优选用于FOLR1相关肿瘤的诊断或治疗，优选用于FOLR1相关肿瘤的成像和FOLR1相关肿瘤的放射疗法治疗。
14.产生根据权利要求1至13任一项所述的FOLR1结合蛋白的方法，其包括以下步骤：a)在适于获得所述FOLR1结合蛋白的条件下培养宿主细胞，和b)分离产生的所述FOLR1结合蛋白。
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