CN113160109B - 反背景差分的细胞图像分割方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种反背景差分的细胞图像分割方法，所述反背景差分的细胞图像分割方法包括步骤：(A1)对获取的细胞原始图像进行降噪处理，获得第一图像；(A2)对所述第一图像进行反背景差分处理，获得第二图像；(A3)对所述第二图像进行全局阈值分割处理，获得第三图像；(A4)对所述第三图像中细胞区域进行孔洞填充以及图像滤波，获得第四图像。本发明具有分割精度高、效率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及细胞评估和细胞图像处理方法，特别涉及反背景差分的细胞图像分割方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)具有多向分化潜能和免疫调节特性，能在适当诱导条件下分化为成骨、脂肪和软骨细胞系，被广泛应用于各种组织再生应用以及免疫相关疾病治疗，如急性和慢性移植物抗宿主病。然而，从骨髓等组织中分离的MSCs量很少，无法满足MSCs在研究和临床治疗中的使用量需求，因此需要在体外进行大规模扩增培养。满足质量标准的细胞制品对于后续的细胞治疗应用极其重要。当前使用分子生物学标准技术评估细胞质量，如定量PCR、免疫组织化学染色等，均是侵入性的方法，会对培养的细胞造成不可逆转的损害，无法满足临床要求。人工显微镜监测是评估细胞质量最基本的方法，但该方法主观性强以及会在大规模细胞培养中带来极大的工作负担，难以进行客观准确的评价。利用相差显微镜获取的图像在对细胞质量进行客观、非侵入式评估方面具有很大应用潜力。
利用相差显微图像分析技术评估MSCs质量的关键在于细胞图像分割。然而，相差显微间充质干细胞图像具有背景复杂、对比度低以及光晕伪影等特点，使得现有的分割方法不能取得令人满意的结果，且不能同时处理不同培养时期的细胞图像。由于对比度低，使用单一阈值分割方法，可能无法将细胞从背景中分割出来。将图像划分为细胞、光晕和背景三类区域的多级阈值方法可以改善分割结果，但是由于某些细胞和背景之间的像素强度存在重叠，所以仍不能很好地分割出细胞。低对比度也对主动轮廓和水平集的方法提出了挑战。基于主动轮廓方法在相差显微镜图像中检测细胞边缘的位置，但如果边界模糊，则结果较差。基于水平集的方法使用细胞轮廓内部和外部的强度变化来计算对象的能量，但对初始化很敏感。细胞分割受到亚细胞结构之间差异的影响，细胞图像强度梯度在细胞内部较小，而在细胞膜周围则较大，经常导致如标记控制的分水岭分割算法过度分割。使用基于机器学习的方法可以进行细胞分割，如实例分割、随机森林、U-Net模型等，但由于耗时的手动标记细胞数据和模型训练可能不适合对细胞数据进行快速大规模分析。此外，由于MSCs形态特征是不断变化的，利用形态学模型的方法可能不适合进行细胞分割。因此，有必要研发一种能将细胞从背景分割出来，且能同时处理细胞不同培养时期的图像的方法。
发明内容
为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种分割精度高、效率高的反背景差分的细胞图像分割方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
反背景差分的细胞图像分割方法，所述反背景差分的细胞图像分割方法包括以下步骤：
(A1)对获取的细胞原始图像进行降噪处理，获得第一图像；
(A2)对所述第一图像进行反背景差分处理，获得第二图像；
(A3)对所述第二图像进行全局阈值分割处理，获得第三图像；
(A4)对所述第三图像中细胞区域进行孔洞填充以及图像滤波，获得第四图像。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
1.分割效果好；
本申请充分考虑了细胞图像特征、提高了图像的质量以及利用了图像的全局和局部信息，在微弱边缘部分能保留更多的细节信息，处理细胞不同培养时期的图像所得到结果更接近细胞真实情况；
通过对细胞图像进行反背景差分处理，解决了细胞与背景对比度低的问题，消除了光晕，保留了细胞图像原始细节信息，同时抑制细胞与背景强度重叠的干扰因素，提高图像质量；
反背景差分法和Otsu阈值分割法组合使用，有效解决了使用传统阈值分割方法或单独使用Otsu阈值分割方法无法很好地将细胞从背景中分割出来的问题；
2.分割效率高；
计算效率高，如图像分辨率2688×2200pixels，计算时间小于8s。
附图说明
参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：
图1是根据本发明实施例的细胞图像的分割方法的流程图；
图2是根据本发明实施例的细胞图像的分割方法流程图对应处理结果图；
图3是获得的骨髓干细胞的强度分布图像；
图4是根据本发明实施例的获得对比度增强的图像；
图5是根据本发明实施例的采集到的骨髓干细胞图像；
图6是根据本发明实施例的单独使用Otsu阈值分割得到的图像；
图7是根据本发明实施例的差分图的处理结果图；
图8是根据本发明对比例的分割后骨髓干细胞的图像。
具体实施方式
图1-8和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。
实施例1：
图1给出了本发明实施例的反背景差分的细胞图像分割方法的流程图，如图1所示，所述反背景差分的细胞图像分割方法包括以下步骤：
(A1)对获取的细胞原始图像进行降噪处理，获得第一图像；
(A2)对所述第一图像进行反背景差分处理，获得第二图像；
(A3)对所述第二图像进行全局阈值分割处理，获得第三图像；
(A4)对所述第三图像中细胞区域进行孔洞填充以及图像滤波，获得第四图像。
为了提高图像分割的效果，进一步地，所述细胞图像分割方法还包括以下步骤：
(A5)对所述第四图像进行修正，修正方式为，对所述第四图像中的细胞区域进行形态学膨胀简单恢复细胞原始形状，解决部分细胞区域丢失问题，并确定细胞初始轮廓的位置，利用图像局部梯度信息修正细胞轮廓，得到最终分割结果。
为了提高图像分割的效果，进一步地，所述细胞图像分割方法还包括以下步骤：
(A5)对所述第四图像进行修正，修正方式为，直接以所述第四图像中的细胞区域为初始细胞轮廓的位置，再利用图像局部梯度信息进行轮廓扩张演化，得到最终分割结果。
为了提高图像分割的效果及分割效率，进一步地，在步骤(A1)中，若所述原始图像是彩色图像，则对彩色图像做灰度化处理。
为了准确地采集细胞的原始图像，进一步地，所述原始图像的获得方式为：
细胞复苏：取出冻存的细胞，加热冻存管，使所述冻存管内含物融化；
在无菌条件下打开冻存管，将细胞冻存悬液移入离心管中，细胞悬液与所述离心管内的完全培养基混合，并离心；
细胞培养：去除离心管内上清液，向细胞沉淀物加入完全培养基并混合；
将细胞接种到培养瓶中，并加入完全培养基；放入培养箱中培养；
图像采集：使用相差显微镜采集培养过程中不同时期的细胞图像。
为了提高图像分割效果，进一步地，所述反背景差分的方式为：
建立细胞图像背景模型，将背景图像与所述第一图像进行差分，获得所述第二图像。
为了提高提高图像分割效果，进一步地，所述背景模型的建立方式为：
背景模型表达式为：
C(u,v)＝k0+k1u+k2v+k3u2+k4uv+k5v2；
C(u，v)表示在背景中坐标(u，v)处的像素强度；
利用以下线性系统，得到背景：
记为C＝AK；
使用最小二乘法估算出多项式系数K的值，多次迭代完善背景估计值：
K＝(ATA)-1ATg，g为所述第一图像的像素。
为了提高图像分割效果，进一步地，在步骤(A3)中，使用Otsu阈值分割算法处理所述第二图像，将所述第二图像划分为细胞和背景两部分，获取细胞区域。
为了提高图像分割效果，进一步地，在步骤(A4)中，使用形态学算法对所述第三图像中细胞区域进行孔洞填充，再对所述第三图像中连通域进行标记，计算每个连通域的面积，设定一个面积阈值，滤除错分割成细胞的区域。
实施例2：
根据本发明实施例1的反背景差分的细胞图像分割方法在间充质干细胞评估中的应用例。
本发明实施例的反背景差分的细胞图像分割方法，包括以下步骤：
(A1)对获取的细胞原始图像进行降噪处理，获得第一图像；
所述细胞原始图像的获得方式具体为：
细胞复苏：在15mL无菌离心管中加入9mL细胞完全培养基，并置于37℃水浴锅预热。取出装有成人骨髓间充质干细胞的冻存管，放入37℃水浴锅内，并不断摇动，直至内含物融化。用70％-75％的酒精消毒冻存管口及外壁，擦拭干净。
在无菌工作台内打开冻存管，用移液管将细胞悬液移入已预热的离心管中。往冻存管中加入1mL完全培养基进行冲洗，再用移液管将这1mL的细胞悬液移入离心管中。将离心管拧紧，放入离心机内。离心机设置离心速度为300g，离心5min。
细胞培养：离心结束后，在无菌工作台内打开离心管，用移液管尽量弃去上清液后，向下层沉淀物中加入1mL已预热的完全培养基，轻轻吹匀。将细胞全部接种到T25培养瓶中，并加入足量的完全培养基，轻轻摇晃、混匀，使细胞均匀分布。将细胞培养瓶转入培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)中培养；
细胞图像采集：使用相差显微镜定期采集培养过程中不同时期的细胞图像用于分析；
若细胞原始图像是彩色图像，则先执行灰度化处理：采用如下表达式对RGB三分量加权平均得到较为合理的灰度图像，如图2(a)所示：
gray(u,v)＝0.299*r(u,v)+0.578*g(u,v)+0.114*b(u,v)；
由于培养基存在杂质、光照条件不同、显微镜镜头状态差异等原因，在采集的细胞图像中，存在着噪声；在不降低对比度的前提下，尽可能消除噪声带来的影响，使用二维高斯滤波器对细胞图像进行降噪处理，获得第一图像，如图2(b)所示；
(A2)对所述第一图像进行反背景差分处理，获得第二图像；
分析细胞图像特征知：细胞局部区域强度可能与细胞其它区域强度处在不同的范围，背景区域强度不一定具有相同的范围，一些背景区域可能更暗，其强度与细胞重叠，即细胞与背景像素强度有明显的重叠，如图3(a)所示；由其3D视图知，细胞图像强度大小整体上满足：细胞<背景<光晕，如图3(b)所示；降噪后的细胞图像使用传统分割方法仍然不能很好地实现细胞和背景的分离；
鉴于此，本发明结合反背景差分法和Otsu阈值分割法，将图像划分为细胞和背景两部分，进而获取细胞区域；为增强细胞与背景的对比度，同时抑制细胞与背景强度重叠的干扰因素，提高图像质量，提出对降噪后的细胞图像进行反背景差分处理；反背景差分法与背景差分法的思路相反，是用背景图像减去当前图像，也包含两个步骤：背景建模和差分运算，其中最重要的是建立背景模型；由于单幅细胞图像无法从视频序列中学习到背景模型，因此动态目标检测中的背景差分方法不能直接用于细胞图像分割；考虑到显微透镜的像差，采用卡内基梅隆大学的Yin等人提出的将背景建模为二阶多项式函数的方法；
背景模型表达式为：
C(u,v)＝k0+k1u+k2v+k3u2+k4uv+k5v2；
C(u，v)表示在背景中坐标(u，v)处的像素强度；
利用以下线性系统，得到背景：
记为C＝AK；
使用最小二乘法估算出多项式系数K的值，多次迭代完善背景估计值：
K＝(ATA)-1ATg，g为所述第一图像的像素；
使用表达式C＝AK计算出背景图像，为正常显示背景图像，对其进行对比度拉伸，如图2(c)所示，背景图像减去细胞图像，得到第二图像(差分图像)，如图2(d)所示；该方法与传统背景模型更新不同，可以为每幅图像重新建模，计算速度未受到影响；此外，得到的差分图像优势在于：1)增强了细胞与背景的对比度，利用阈值分割方法可以实现将细胞从背景中分割出来；2)抑制了细胞与背景强度重叠的干扰因素，提高了图像质量。3)消除了光晕，保留了细胞图像原始细节信息；
步骤(A2)有效增强了图像中细胞和背景的对比度，同时背景干扰因素得到有效抑制，如图4所示；相较于细胞原始图像，细胞区域变为高强度较亮区域，背景变为低强度暗区域，由细胞图像特征知：像素强度可能同时具有正值和负值，将负像素强度替换为0值，即可消除光晕，在此情况下，细胞与背景这两类区域完全可分；
(A3)对所述第二图像进行全局阈值分割处理，具体是利用Otsu分割算法处理第二图像，获得第三图像；
未进行步骤(A2)的处理，仅进行步骤(A3)的处理，图像中细胞和背景之间对比度低，如图5所示；直接单独使用Otsu分割算法进行处理时，该算法将光晕划分为一类，将细胞和背景划分为另一类，未能将细胞从背景中分割出来，如图6(a)所示；考虑到光晕具有高强度的特征，使用多级阈值将图像划分为细胞、背景和光晕三类仍然不能很好地将细胞分割出来，主要是由于背景与细胞以及光晕像素强度范围存在较强的重叠，如图6(b)所示；
步骤(A2)中若使用背景差分法处理得到第二图像(差分图像)，如图7(a)所示，再进行步骤(A3)的处理，由于未消除光晕，仍然不能区分细胞和背景这两类区域，如图7(b)所示；步骤(A2)中使用反背景差分法处理得到第二图像(差分图像)，如图7(c)所示，再进行步骤(A3)的处理，可以很好地区分细胞和背景这两类区域，如图7(d)所示。
步骤(A2)和步骤(A3)组合使用，解决了单独使用步骤(A3)不能处理的问题；但，如图2(e)所示，经过阈值分割后，只得到细胞主体部分，细胞轮廓不精确，还需进一步处理；
(A4)对所述第三图像中细胞区域进行孔洞填充以及图像滤波，获得第四图像；
受亚细胞结构的影响，细胞区域强度不均匀，分割出的细胞区域内有孔洞。另外由于在细胞培养过程中，溶液存在杂质和组织碎屑会影响提取细胞区域，需要去除这些杂质。此步骤首先使用二值形态学算法进行孔洞填充，如图2(f)所示；其次，因杂质通常较小，故提出基于面积的图像滤波方法，将这些杂质错分割成细胞的区域滤除；图像滤波首先搜索阈值分割图中的所有连通域，并计算每个连通域面积，再通过测量数据集中典型杂质大小范围，将面积小于200的连通区域进行取反，实现杂质的滤除，如图2(g)所示；
经步骤(A2)-(A4)的处理，只提取到细胞主体部分，细胞轮廓不精确，如图2(g)所示，需要对细胞轮廓进行修正；
(A5)对所述第四图像进行修正，具体如下；
如图5所示，分析细胞图像中线段AB的像素强度分布表明：从点A移向点B，当接近细胞区域时，像素强度不断增大，移动到真实细胞边界时，像素强度梯度方向突然变化(由正变为负)，可利用局部像素强度梯度突然变化来修正细胞轮廓；
图2(h)和图2(i)是细胞轮廓修正的过程，图中绿色的线代表处理过程中得到的细胞区域的边缘轮廓线。修正具体步骤为：1)先对细胞区域进行形态学膨胀简单恢复细胞原始形状，解决部分细胞区域丢失问题，并确定细胞初始轮廓的位置，如图2(h)所示；2)再利用局部梯度信息来修正细胞初始轮廓。为减少噪声对梯度的影响，使用Kirsch算子与所述第一图像进行卷积，确定细胞初始轮廓内每个像素位置的梯度方向，将初始轮廓朝细胞真实边界方向移动，当梯度方向变为负，停止移动，此时得到的细胞轮廓更接近真实细胞边界，如图2(i)所示；
修正步骤还可以为：直接以对经过上述步骤处理得到的细胞区域为初始细胞轮廓的位置，使用Kirsch算子与所述第一图像进行卷积，确定图像中每个像素位置的梯度方向，若梯度方向为负，将细胞初始轮廓向外扩张移动，当强度梯度非负时，停止移动，此时得到的细胞轮廓更接近真实细胞边界。
对比例：
本文实验平台为：Inter(R)Core(TM)i3 6100CPU@3.70GHz，8.00GB内存，64位Win7操作系统，采用MATLAB R2014a实现本文算法。为了验证算法的性能，将本发明方法与现有在间充质干细胞相差显微图像分割领域中处理较高效、准确的方法(Jaccard算法、EGT算法)进行比较，并且对采集到的32幅细胞不同培养时期图像进行分割处理。
为展示图像处理结果，以20％和77％细胞汇合度的贴壁hMSCs相差显微图像为例，由于原图过大(分辨率2688×2200pixels)，从原图中截取局部图像进行结果展示，分别如图8(a1)和图8(a2)所示。图8(b1)和图8(b2)是Jaccard算法分割结果，图8(c1)和图8(c2)是EGT算法分割结果，图8(d1)和8(d2)是本发明方法结果；
Jaccard算法处理低汇合度细胞图像时，受对比度低和背景不均匀的干扰较小，能准确分割出细胞。多个细胞聚集时，容易将少量光晕误识别成细胞，倾向于识别成单个细胞区域，如图8(b1)红色方框标出所示。在高汇合度细胞图像中，这种情况尤其常见，如图8(b2)中红色方框标出所示；
EGT算法处理单个细胞区域时，其分割边缘略为粗糙，出现轻微锯齿状边缘，虽然能将细胞分割出来，但也将光晕包含在内，影响分割精度；在处理多个细胞聚集区域时，倾向于识别成单个细胞区域，造成部分背景被误识别成细胞，如图8(c1)和图8(c2)中红色方框标出所示。。
本发明方法深入分析了图像的特征，通过反背景差分法增强了细胞与背景的对比度，抑制细胞与背景强度重叠的干扰因素，提高了图像质量，同时充分利用了图像全局和局部信息，在微弱边缘部分能保留更多的细节信息，处理细胞不同培养时期的图像所得到结果更接近细胞真实情况，如图8(d1)和图8(d2)中红色方框标出所示。
从视觉效果上来判断分割结果的好坏易受人主观因素的影响。为了定量说明所提算法的有效性，引入准确率(Precision，P)、召回率(Recall，R)、F值(Fscore，F)三个指标来定量评价分割方法的性能，其计算公式如下：
其中：TP、TN、FP、FN分别为细胞像素正确分类数目、背景像素正确分类数目、背景像素错误分类数目、细胞像素错误分类数目。精确率越高，表示细胞像素被误检的概率越低；召回率越高，表示细胞像素被漏检的概率越低；F值衡量算法的整体性能，F值越高，算法检测效果越好。
不同方法的P、R、F值对比表：
通过与专家标注的结果进行比较，计算平均精确率P、召回率R和F值，其中平均精确率P、召回率R和F值分别达到了0.9557、0.8864和0.9197。EGT算法由于未消除光晕，分割效果略差。Jaccard算法利用局部对比阈值对细胞区域进行检测，但难以检测到较低对比度的细胞区域，本文方法与Jaccard算法相比，在各项性能指标上均有不同程度的提升，表明本文方法利用反背景差分法可以增强细胞区域与背景的对比度，并结合细胞局部梯度，能获得更多较低对比度细胞区域以及弱边缘细节信息。结合定量分析和定性分析的结果来看，总体上表明使用本文方法得到的分割结果更接近真实细胞。
Claims (7)
1.反背景差分的细胞图像分割方法，所述反背景差分的细胞图像分割方法包括以下步骤：
（A1）对获取的细胞原始图像进行降噪处理，获得第一图像；
（A2）对所述第一图像进行反背景差分处理：建立细胞背景图像模型，将背景图像与所述第一图像进行差分运算，获得第二图像；所述背景图像模型表达式为C(u,v)=k0+k1u+k2v+k3u2+k4uv+k5v2，C(u,v)表示在背景中坐标(u,v)处的像素强度；背景图像模型的建立方式为：
利用以下线性系统，得到背景：
，记为C=AK；
使用最小二乘法估算出多项式系数K的值，多次迭代完善背景估计值：
K=(ATA)-1ATg，g为所述第一图像的像素；
（A3）对所述第二图像进行全局阈值分割处理，使用Otsu阈值分割算法处理所述第二图像，将所述第二图像划分为细胞和背景两部分，从而获得第三图像，获取第三图像中细胞区域；
（A4）对所述第三图像中细胞区域进行孔洞填充以及图像滤波，获得第四图像。
2.根据权利要求1所述的反背景差分的细胞图像分割方法，其特征在于，所述细胞图像分割方法还包括以下步骤：
（A5）对所述第四图像进行修正，修正方式为：对所述第四图像中的细胞区域进行形态学膨胀简单恢复细胞原始形状，并确定细胞初始轮廓的位置，利用图像局部梯度信息修正细胞轮廓，得到最终分割结果。
3.根据权利要求1所述的反背景差分的细胞图像分割方法，其特征在于，所述细胞图像分割方法还包括以下步骤：
（A5）对所述第四图像进行修正，修正方式为：直接以所述第四图像中的细胞区域为初始细胞轮廓的位置，再利用图像局部梯度信息进行轮廓扩张演化，得到最终分割结果。
4.根据权利要求1所述的反背景差分的细胞图像分割方法，其特征在于，在步骤（A1）中，若所述原始图像是彩色图像，则对彩色图像做灰度化处理。
5.根据权利要求1所述的反背景差分的细胞图像分割方法，其特征在于，所述原始图像的获得方式为：
细胞复苏：取出冻存的细胞，加热冻存管，使所述冻存管内含物融化；
在无菌条件下打开冻存管，将细胞冻存悬液移入离心管中，细胞悬液与所述离心管内的完全培养基混合，并离心；
细胞培养：去除离心管内上清液，向细胞沉淀物加入完全培养基并混合；
将细胞接种到培养瓶中，并加入完全培养基；放入培养箱中培养；
图像采集：使用相差显微镜采集培养过程中不同时期的细胞图像。
6.根据权利要求1所述的反背景差分的细胞图像分割方法，其特征在于，在步骤（A4）中，使用形态学算法对所述第三图像中细胞区域进行孔洞填充，再对所述第三图像中连通域进行标记，计算每个连通域的面积，设定一个面积阈值，滤除错分割成细胞的区域。
7.根据权利要求1所述的反背景差分的细胞图像分割方法，其特征在于，所述细胞是间充质干细胞。
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