CN113155943A - 胰蛋白酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物分析方法，基于胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，包括以下步骤：步骤(1)、称取适量的炭黑样品；步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制一定浓度的分散液；步骤(3)、将炭黑分散液与胰蛋白酶溶液混合，保证胰蛋白酶与炭黑混合的质量比范围为0.0000001‑1000，将混合液用涡旋振荡器混匀；步骤(4)、将混合液放入隔水式培养箱中孵育。本发明首次提出在温和的条件下，炭黑颗粒可以被非常常见的消化酶——胰蛋白酶高效降解。
Description
技术领域
本发明属于生物降解及其分析方法领域，更具体地涉及一种基于胰蛋白酶诱导炭黑颗粒的生物降解及其产物分析方法。
背景技术
炭黑颗粒是碳氢化合物不完全燃烧或热分解的产物，已经被广泛应用于轮胎、橡胶、塑料、油墨等工业生产以及燃料电池和电池阴极组成中。这些颗粒被大量排放到环境中，它们的存在形式和大量的暴露也增加了人体的暴露风险。目前，已经有一些研究报道了炭黑颗粒对人体的潜在生物学效应。超细炭黑颗粒可通过体内氧化应激和维生素诱导细胞凋亡。它还表现出潜在的炎症风险、致突变性和致癌可能性。但在这方面仍存在许多挑战，如其潜在致癌性的机制尚不完全清楚，能否在体内转化(代谢或降解)，以及跟踪代谢转化过程和机制研究等。
胰蛋白酶是胰腺分泌的一种特异的蛋白水解酶，在食物消化和限制胰凝乳蛋白酶原分解方面起着重要作用。多种研究表明，胰蛋白酶及其抑制剂在诱导、支配和控制生物体内代谢方面的潜力和作用，如动物和微生物中的蛋白质和氨基酸代谢、花生四烯酸代谢、脂质代谢、氮代谢、葡萄糖在细胞和植物中的转运和代谢。例如，Sigaeva等人报道了用胰蛋白酶EDTA简单地处理细胞导致结肠癌细胞中纳米金刚石摄取的增强。
纳米颗粒在体内的生物转化或分布对研究其生物安全性、健康效应和疾病诊断等方面具有重要作用。它通常有两种方式，包括其在生物基质中的新陈代谢和降解。代谢降解一般是基于酶引导的生物转化过程。一般认为，炭黑的化学性质较为惰性，难以被生物降解。这归因于炭黑颗粒是由元素碳结构组成的，具有高稳定性，从而抑制了其在生物体内的转化。到目前为止，还从未有过炭黑颗粒能被酶降解的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对目前认为炭黑的化学性质较为惰性，难以被生物降解的问题，提供一种非常常见的消化酶在温和条件下高效降解炭黑颗粒的方法。本申请还利用了多种互补的技术，特别是质谱技术，确认了胰蛋白酶可以诱导炭黑颗粒的降解，并深入阐明炭黑颗粒生物降解的途径。
为实现上述目的，本发明提出以下技术方案：
一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取适量的炭黑样品；
步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制一定浓度的分散液；
步骤(3)、将炭黑分散液与胰蛋白酶溶液混合，保证胰蛋白酶与炭黑混合的质量比范围为0.0000001-1000，将混合液用涡旋振荡器混匀；
步骤(4)、将混合液放入隔水式培养箱中孵育。
进一步地，孵育时间设置为0-21天，炭黑分散液浓度范围为0.0000001-1000μg/mL。
进一步地，步骤(3)中胰蛋白酶酶来自于动物或植物。
进一步地，步骤(4)中孵育环境为黑暗或光照环境，温度适用范围为15℃-37℃。
进一步地，步骤(1)中的炭黑样品为环境或生物样品。
进一步地，步骤(4)孵育后的炭黑颗粒的降解率为50％-100％。
进一步地，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物范围在0～1000m/z内。
进一步地，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物在500m/z以下的小分子区域。
进一步地，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
进一步地，降解过程可通过SEM、FT-ICR MS、XPS、EDS或光学照片技术证明。
另一方面，本申请还请求保护前述之一所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法的产物分析方法，包括：
步骤(5)、取孵育一定时间的混合液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
步骤(6)、不额外添加基质，置于通风橱中，自然挥发；
步骤(7)、样品干燥后，将所述靶板放置于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的靶托上，通过MALDI-TOF MS对降解后的炭黑样品直接进行质谱检测。
进一步地，步骤(7)的MALDI-TOF MS检测在反射模式下进行，并且在正离子模式和负离子模式下都适用，炭黑颗粒在MALDI-TOF MS中有特征的分子峰团簇，特征指纹峰的范围在0～1000m/z内，特别是在500m/z以下的小分子区域。
本发明提出的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法及其产物分析方法具有以下有益效果：
1.本发明发现在温和的条件下，炭黑颗粒可以被胰蛋白酶降解。通过质谱分析发现了多
2.本发明基于胰蛋白酶对炭黑的特殊降解能力，提出了一种新的去除炭黑污染的酶法。
3.本发明使用的炭黑颗粒本身就能够高效地吸收激光能量，从而促进自己的解吸与电离，因此使用本发明方法，在样品配置时不需要另外添加基质，就可以实现高灵敏度的质谱检测，从而简化了操作步骤、节省了样品准备时间且大大提高了检测效率。
4.本发明由于不需要额外的添加基质，减少了共结晶过程，也克服了传统基质中常遇到的热点问题，提高了分析的重现性，减少了成本。
5.本发明实现了复杂的植物和动物样品的检测，实现了快速高通量的质谱检测。
6.本发明的基于胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法体积极小，所需样品量极少，可以实现炭黑的高灵敏度质谱检测。
7.本发明的基于胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法具有快速、高效、灵敏、信号稳定、高通量、准确的特点，并且具有对炭黑颗粒进行定量的可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是采用本发明一实施例提出的胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法对2μL空白样品的MALDI-TOF MS检测结果。
图2是采用本发明一实施例提出的胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法对2μL炭黑样品MALDI-TOF MS检测结果。
图3是采用本发明一实施例提出的胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法对2μL炭黑样品置于黑暗环境37℃孵育5天后的MALDI-TOF MS检测结果。
图4是采用本发明一实施例提出的胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法对1μL片层的炭黑样品在负离子模式下的质谱检测结果。
图5是采用本发明一实施例提出的胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法对加入胰蛋白酶后，2μL炭黑样品置于黑暗环境37℃孵育5天后的MALDI-TOF MS检测结果。
图6是采用本发明一实施例提出的胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法对2μL图6为实际的废水加标样品没有孵育的MALDI-TOF MS检测结果。
图7是采用本发明一实施例提出的胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法对加入胰蛋白酶后，2μL实际的废水加标样品孵育的MALDI-TOF MS检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请发明人在研究中发现：
(1)在温和的条件下，炭黑颗粒可以被胰蛋白酶降解。
(2)炭黑颗粒的降解产物在0-1000m/z之间，尤其是在小于500m/z的小分子区域。
(3)炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
(4)炭黑颗粒的降解途径包括氮化途径和氧化途径。
因此，本发明提出了一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取适量的炭黑样品；
步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制一定浓度的分散液；
步骤(3)、将炭黑分散液与生物酶混合，保证胰蛋白酶与炭黑混合的质量比范围为0.0000001-1000，将混合液用涡旋振荡器混匀；
步骤(4)、将混合液放入隔水式培养箱中孵育，保持黑暗或光照环境，温度设置在，温度适用范围为15℃-37℃；
另一方面，本申请还提供一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法的产物分析方法，包括：
步骤(5)、取孵育一定时间的混合液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
步骤(6)、不额外添加基质，置于通风橱中，自然挥发；
步骤(7)、样品干燥后，将所述靶板放置于所述基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的靶托上，通过MALDI-TOF MS对所述炭黑样品直接进行质谱检测。
进一步地，本申请发明人进行了相关实验验证：
(1)所述分析方法炭黑颗粒在MALDI-TOF MS中有特征的分子峰，基于此发展了首个炭黑的质谱定量分析方法。
(2)炭黑颗粒的质谱指纹谱质量范围在0-1000m/z之间，尤其是在小于500m/z的小分子区域。
(3)所述分析方法配制的炭黑样品浓度范围为0.0000008-1000μg/mL，检测限在ppt水平甚至低于ppt水平。
(4)所述分析方法在正离子模式下，质谱的激光功率设置为5-60％，频率设置为100-200，shots设置为100-500；在负离子模式下，质谱的激光功率设置为15-55％，频率设置为100-200，shots设置为100-500。而在这两种模式下，Matrix Suppression Mode设置为Off，Detector Gain设置为4-8x，laser Attenuator范围为1-mini到5-ultra。
(5)所述分析方法的MALDI-TOF MS检测在反射模式下进行，并且在正离子模式和负离子模式下都适用。
(6)所述分析方法所述炭黑样品分散液配制成多份不同浓度的炭黑标液，将每份炭黑标液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
(7)所述分析方法的生物酶适用于植物和动物源的胰蛋白酶。
(8)所述分析方法的孵育环境适用于黑暗和光照环境，温度适用范围为25℃-37℃
(9)所述分析方法得到的炭黑颗粒的降解产物范围在0～1000m/z内，特别是在500m/z以下的小分子区域。
(10)所述分析方法得到的炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
(11)所述分析方法所用样品体积极小，在1-10μL范围内即可。
(12)所述分析方法可对环境水样、复杂的植物样品或动物组织样本进行检测。
实施例
配置一定浓度的炭黑颗粒的水分散液，将炭黑粒子与胰蛋白酶混合，然后放入隔水式培养箱孵育。混合物连续培养达21天。为了模拟生物环境，这些实验首先在37摄氏度的黑暗环境中进行。在我们发现炭黑颗粒可以被胰蛋白酶降解后，我们还进行了光辐照实验，以测试该技术在废水净化中的应用潜力。光强维持在550W/m2，温度设置在37℃，在一定时间间隔检测溶液，从而监测炭黑粒子的转化。所有实验重复三次(n＝3)。最后都用MALDI-TOF MS对所述样品直接进行质谱检测。为了进行LDI-TOF质谱测量，将2μL炭黑分散液直接投到不锈钢MTP 384靶框III(Bruker Daltonics)上。然后将目标物放置在通风柜中，样品在空气中干燥，然后使用的仪器型号为Bruker DaltonicsAutoflex III SmartbeanMALDI-TOF质谱仪，使用频率为200Hz的355nm Nd:YAG，在负离子模式下，激光功率设置为35％，质谱检测范围为0-2000；而在正离子模式下，激光功率设置为35％，质谱检测范围为m/z1-2000。LDI-FT-ICR质谱是在配备15.0T超导磁体(Bruker Daltonics,GmbH,Bremen,Germany)的SolariX FT-ICR质谱仪和Apollo II双离子源上进行的，以获得超高分辨率质谱。MS范围设置为90-1000,4M 32位数据格式。质谱用10mmol/L甲酸钠溶液和内部参考质谱表校准，准确度优于0.5ppm。测量和理论计算的质谱误差控制在1ppm以内。LDI-TOF质谱和LDI-FT-ICR质谱的数据处理分别使用FlexAnalysis 3.4软件和data Analysis 4.0(Bruker Daltonics,version 2.0)软件进行。空白样品通过相同的方法进行检测。测定结果如图1-图7所示，其中图1为空白样品的MALDI-TOF MS检测结果，图2为炭黑样品的MALDI-TOF MS检测结果，图3为炭黑样品置于黑暗环境37℃孵育5天后的MALDI-TOF MS检测结果，图4加入胰蛋白酶后，炭黑样品置于黑暗环境37℃孵育5天后的MALDI-TOF MS检测结果，图5炭黑样品的MALDI-FT-ICR MS检测结果，图6为实际的废水加标样品没有孵育的MALDI-TOFMS检测结果，图7为加入胰蛋白酶后，实际的废水加标样品孵育的MALDI-TOF MS检测结果。从图2可以看出，在无基质的情况下，我们所测的炭黑在MALDI-TOFMS中有特征的分子峰团簇，证明本实施例的分析方法在样品配备时，无需加入基质，既可直接用于炭黑样品的分析。从图2-4可以看出，胰蛋白酶使炭黑发生了代谢转化。转化产物主要分为两类，分别为氧化产物和氮化产物。通过不同时间的对比，发现，随着时间的延长，黑炭的代谢转化产物逐渐增加。从图6可以看出，该方法可适用于复杂样品的检测。从图6-7可以看出，该方法可用于复杂样品中炭黑的去除。一系列产物揭示了黑炭颗粒的氧化、氮化等转化途径，为追踪生物转化过程提供了指纹图谱，为清除炭黑颗粒，降低其环境和生物持久性提供了可用的途径。
从以上实施例可以看出，炭黑颗粒是一种由部分燃烧产生的常见材料，传统上被认为是惰性的，可以抵抗生物消化或降解。本申请发现在温和的条件下，炭黑颗粒可以被胰蛋白酶降解。通过质谱分析发现了多种降解产物。这些发现更新了现有技术对炭黑降解的认识。此外，基于胰蛋白酶对炭黑的特殊降解能力，提出了一种新的去除炭黑污染的酶法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (12)
1.一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)、称取适量的炭黑样品；
步骤(2)、将称取的炭黑样品用水分散并配制一定浓度的分散液；
步骤(3)、将炭黑分散液与胰蛋白酶溶液混合，保证胰蛋白酶与炭黑混合的质量比范围为0.0000001-1000，将混合液用涡旋振荡器混匀；
步骤(4)、将混合液放入隔水式培养箱中孵育。
2.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，孵育时间设置为0-21天，炭黑分散液浓度范围为0.0000001-1000μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，步骤(3)中胰蛋白酶酶来自于动物或植物。
4.根据权利要求1或2所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，步骤(4)中孵育环境为黑暗或光照环境，温度适用范围为15℃-37℃。
5.根据权利要求1或2所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，步骤(1)中的炭黑样品为环境或生物样品。
6.根据权利要求1或2所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，步骤(4)孵育后的炭黑颗粒的降解率为50％-100％。
7.根据权利要求1或2所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物范围在0～1000m/z内。
8.根据权利要求7所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物在500m/z以下的小分子区域。
9.根据权利要求1或2所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，步骤(4)孵育后得到的炭黑颗粒的降解产物包括氧化产物和氮化产物。
10.根据权利要求1或2所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法，其特征在于，降解过程可通过SEM、FT-ICR MS、XPS、EDS或光学照片技术证明。
11.根据权利要求1-10之一所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法的产物分析方法，其特征在于，包括：
步骤(5)、取孵育一定时间的混合液滴加在MTP 384不锈钢非抛光靶板上；
步骤(6)、不额外添加基质，置于通风橱中，自然挥发；
步骤(7)、样品干燥后，将所述靶板放置于基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的靶托上，通过MALDI-TOF MS对降解后的炭黑样品直接进行质谱检测。
12.根据权利要求11所述的一种胰蛋白酶诱导炭黑颗粒生物降解的方法的产物分析方法，其特征在于，步骤(7)的MALDI-TOF MS检测在反射模式下进行，并且在正离子模式和负离子模式下都适用，炭黑颗粒在MALDI-TOF MS中有特征的分子峰团簇，特征指纹峰的范围在0～1000m/z内，特别是在500m/z以下的小分子区域。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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